一个增强的 体内 细胞培养物(Silac)模型中氨基酸的稳定同位素标记用于量化药物代谢酶的量化*

      涉及异丙酚代谢的许多酶保持在低基础水平,并且仅响应上游传感器/效应蛋白的激活而合成。该诱导可以在各种情况下具有影响,特别是在研究药代动力学,药效学和候选治疗化合物的药物 - 药物相互作用分布期间。以前,我们合作体内具有目标高分辨率单离子监测(THR / SIM)LC-MS / MS接种的硅胶材料,用于定量197个肽对,代表小鼠肝脏中的51种药物代谢酶(DME)。然而,作为重要的酶(例如,1A和2B亚壳的细胞色素P450(CYP)在未刺激的代谢标记小鼠的肝脏中保持低或未可检测的水平,这些蛋白质的定量不可靠。在本研究中,我们通过同步配体介导的多个上游核受体的活化诱导标记的小鼠中的DME表达,从而增强了包括CYPS 1A,2A,2B,2C和3A的蛋白质的信号。利用这种增强,在单个动物的肝脏中检测到115个独特的赖氨酸,Cyp衍生的肽,而不是来自三种未受作因的动物的合并样品中的56。通过THR / SIM量化386个肽对,代表68阶段I,30期和8个对照蛋白质。采用该方法量化肝细胞色素P450还原酶核(HRN)小鼠中DME表达的变化。我们观察到几种酶的补偿诱导,包括Cyps 2b10,2c29,2c37,2c54,2c55,2e1,3a11和3a13,羧酸酯酶(CES)2a和谷胱甘肽s-转移酶(GST)M2和M3以及下调羟类脱氢酶(HSD)11B1和17B6。使用DME增强体内因此,硅酸盐材料具有Thr / SIM,允许对多种DME重视异黄素代谢的鲁棒分析,以及改善药物药代动力学,药效学和化学处理和基因改性小鼠模型的效用。
      新陈代谢被列为大约四分之三的规定药物的主要清除机制(
      • Wienkers L.C.
      • 希思蒂。
      预测 体内 药物相互作用 体外 drug discovery data.
      )。在这种新陈代谢中,三个季度由CYP Superfamily的酶进行(
      • Wienkers L.C.
      • 希思蒂。
      预测 体内 药物相互作用 体外 drug discovery data.
      )。美国食品和药物管理局和欧洲药物局建议在新型治疗剂的临床前开发期间尽早评估CYP1A2,CYP2B6,CYP2C8,CYP2C9,CYP2C19,CYP2D6和CYP3A的代谢评估(

      http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm292362.pdf.

      ,

      http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2012/07/WC500129606.pdf.

      )。作为大多数这些CYP同种型的表达(以及其他DMES(药物代谢酶)和转运蛋白)可以响应化学攻击而诱导,其对所施用的药代动力学和药物动力学性质的潜在影响,以及其它因此,药物(药物 - 药物相互作用),也建议在早期阶段评估候选剂诱导DME表达的容量(

      http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm292362.pdf.

      ,

      http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2012/07/WC500129606.pdf.

      )。
      已知大多数临床相关的药物介导的CYP诱导通过激活两个密切相关的核受体;妊娠X受体(PXR)和本构androstane受体(汽车)。这些受体高度混杂,介导多相I和II期酶的诱导,以应对不同的外源和内源性刺激(
      • 徐C.
      • 李C.Y.
      • 孔A.N.
      异丙虫病诱导阶段I,II和III药物代谢/运输。
      ,
      • 托尔森A.H.
      • 王H.
      异骨受体调节药物代谢酶:PXR和轿车。
      ,
      • Maglich J.M.
      • stoltz c.m.
      • Goodwin B.
      • 霍金斯棕色D.
      • 摩尔J.T.
      • kliewer s.a.
      核妊娠X受体和组成型androstane受体调节重叠但涉及异卵戒毒的不同基因。
      ,
      • 威尔逊下午
      • kliewer s.a.
      PXR,汽车和药物代谢。
      ,
      • Hrycay e.g.
      • Bandiera S.M.
      小鼠细胞色素P450酶的表达,功能和调节:与人P450酶的比较。
      )。通过测量特定下游靶标的水平,主要是CYP3A和CYP2B6(

      http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm292362.pdf.

      ,

      http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2012/07/WC500129606.pdf.

      )。第三受体,芳基烃受体(AHR)的混杂性较差,靶电池与PXR和汽车的靶电池更截然不同(
      • 徐C.
      • 李C.Y.
      • 孔A.N.
      异丙虫病诱导阶段I,II和III药物代谢/运输。
      ,
      • Hrycay e.g.
      • Bandiera S.M.
      小鼠细胞色素P450酶的表达,功能和调节:与人P450酶的比较。
      ),但是Cyp1a诱导的中央介体,其活性可以从这些酶的水平推断出来(

      http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm292362.pdf.

      ,

      http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2012/07/WC500129606.pdf.

      )。 CYP蛋白直接测量的替代方法是特定探针基材代谢转化的测定(例如 Midazolam的1-羟基化用于CYP3A),通常在存在或不存在特定抑制剂(例如 酮康唑)或诱导剂(例如 利福平)。这种方法是效用 体内,但仅限于这些特定药剂的少量CYP,并且通常不适用于其他DME,尽管识别对UDP葡萄糖糖基转移酶(UGT)亚家族的特异性特异性的探针(UGT)亚家族的努力(
      • Streetman D.S.
      • Bertino Jr.,J.S.
      • nafziger a.n.
      成人药物代谢酶的表型:对体内细胞色素P450表型探针的综述。
      ,
      • 法庭M.H.
      同种型选择性探针基板 体外 人UDP-葡糖醛糖基转移酶的研究。
      )。
      除CYP外,大多数剩余的阶段I反应由醇脱氢酶(ADH),醛脱氢酶(ALDH),Aldo-keto还原酶(AKR),羰基还原酶(CBR),环氧化物水解酶(Ephx),酯酶(例如 CES),含有黄素的单氧化酶(FMO),以及羟类醇/类视黄醇脱氢酶(HSD / RDH)Superfamilies(
      • Wienkers L.C.
      • 希思蒂。
      预测 体内 药物相互作用 体外 drug discovery data.
      ,
      • 埃文斯W.E.
      • 伸展M.V.
      药物替昔科:将功能基因组学转换为合理治疗方法。
      )。随后的第二阶段(缀合)反应通过包括UGT,GST,磺基转移酶(SULT)和甲基转移酶(例如 COMT) (
      • Wienkers L.C.
      • 希思蒂。
      预测 体内 药物相互作用 体外 drug discovery data.
      ,
      • 埃文斯W.E.
      • 伸展M.V.
      药物替昔科:将功能基因组学转换为合理治疗方法。
      )。在药物发育的背景下,更加重视了解非CYP介导的相互作用,例如使用FMO,ADH和ALDH,但特别是UGT(

      http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm292362.pdf.

      )。目前,美国食品和药物管理局建议评估与UGTS 1A1,1A1,1A3,1A4,1A6,1A9,2B7和2B15的相互作用的评估(

      http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm292362.pdf.

      )。
      由于特定探针底物的不可用,通常通过蛋白质印迹和微阵列/​​ RT-PCR评估DME水平。然而,涉及高度同源蛋白质亚壳内的抗体的交叉反应性以及mRNA和蛋白质水平之间的潜在不等调(
      • ohtsuki s。
      • Schaefer O.
      • Kawakami H.
      • in
      • Liehner S.
      • 锡达A.
      • Ishiguro N.
      • Kishimoto W.
      • Ludwig-Schwellinger E.
      • Ebner T.
      • Terasaki T.
      同时的绝对蛋白质定量转运蛋白,细胞色素P450和UDP-葡糖醛糖基三转移酶作为表征个体人肝的新方法:与mRNA水平和活性进行比较。
      ),导致对基于LC-MS / MS的方法的发展的兴趣日益增长,以便定量DMES(
      • 迈克尔斯S.
      • 王米..
      经修订的人肝细胞色素P450“饼”:使用靶向定量蛋白质组学的CYP4F和CYP3A酶的绝对蛋白质定量。
      ,
      • 赫斯曼伊米。
      • 杜峰N.N.
      谱分析鼠细胞色素P450表达的靶向蛋白质组学方法。
      ,
      • Achour B.
      • 罗素M.R.
      • 理发师J.
      • Rostami-Hodjegan A.
      使用多重靶向蛋白质组学同时定量几种细胞色素P450和尿苷5'-二磷嘌呤醇糖基转移酶的富含性。
      ,
      • Shrivas K.
      • mindaye s.t.
      • Getie-Kebtie M.
      • Alterman M.A.
      基于质谱的人肝细胞色素蛋白质组学分析P450。
      ,
      • Karlsen O.A.
      • PunterVoll P.
      • Goksoyr A.
      β-萘酮治疗的大西洋鳕鱼(GADUS MORHUA)肝脏分离微粒体细胞色素P450同工酶的质谱分析,肝脏探讨了COD Cypome的见解。
      ,
      • 威廉姆森B.L.
      • Purkayastha S.
      • 猎人C.L.
      • Nuwaysir L.
      • 希尔J.
      • Easterwood L.
      通过LC-MS / MS的CYP诱导的定量蛋白质测定。
      )药物转运蛋白(
      • 邱X.
      • 张H.
      • 赖Y.
      膜转运蛋白的定量靶向蛋白质组学:方法和应用。
      ,
      • Jani M.
      • Ambrus C.
      • magn
      • jakab k.t.
      • 烤饼E.
      • Zollerciks J.K.
      • krajcsi p.
      BCRP的结构和功能,Xenobiotics和Endobiotics的广泛特异性转运蛋白。
      ,
      • 缩合C.
      • 布鲁克S.
      • 赖Y.
      • 鲍里克A.
      • Busemann A.
      • Heidecke C.D.
      • Siegmund W.
      • 奥斯瓦尔德S.
      基于LC-MS / MS的临床相关肠道吸收和流出转运蛋白的定量。
      ,
      • Sakamoto A.
      • Matsumaru T.
      • yamamura n。
      • Uchida Y.
      • Tachikawa M.
      • ohtsuki s。
      • Terasaki T.
      肺组织中人体药物转运蛋白的定量表达:液相色谱 - 串联质谱法分析区域,性别和间接差异。
      )在各种物种中。在这些技术中,最常见的是基于多重反应监测(MRM)的绝对量化(AQUA)(
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • STEMMAN O.
      • Kirschner M.W.
      • Gygi S.P.
      通过串联MS从细胞裂解物中绝对定量蛋白质和磷蛋白。
      )。该方法的主要缺点是在添加稳定同位素肽之前的样品处理步骤期间能够控制肽的回收,可能导致定量不准确。当遵循凝胶或滤波器辅助协议时,这种偏差可能是严重的(
      • Liebler D.C.
      • 火腿A.J.
      霰弹枪蛋白质组学的旋转滤光片样品制备。
      )。为了规避这个问题,我们以前开发了DME针对性的 体内 基于硅酸基的方法,其中表示51dmes的肽对在单个样品中量化(两个LC-MS / MS分析)(
      • Macleod A.K.
      • 臧T.
      • 富人Z.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      • 黄杰特。
      一个目标 体内 氧化铝代谢酶的定量方法:由本构androstane受体调节。
      )。工作流程遵循稳定同位素稀释LC-MS的原理,通常用于小分子分析的分析实验室,具有 体内 萨拉克 material (13C6标记为肝裂解物)用作控制恢复和电离效率的内标。定义保留时间和m / z窗口中的光与重肽的比例用于定量蛋白质表达。该方法用于规避在Aqua中样品制备过程中产生的不确定性,因为光和重分析物都有近相同的化学性质,环境和加工。测量的肽数,因此蛋白质量化的置信度大于典型的Aqua分析。此外,稀释线性等压力测试使得分析性能差的除去肽,提供高水平的一致性和再现性(
      • Macleod A.K.
      • 臧T.
      • 富人Z.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      • 黄杰特。
      一个目标 体内 氧化铝代谢酶的定量方法:由本构androstane受体调节。
      )。然而,它指出,由于其重型内标肝中的较低的组成表达水平,因此该工作流程省略了密钥CYP。因此,目前研究的目的是产生代谢标记的小鼠模型,其允许直接定量诱导诱导和基本表达的多种DME,尽可能与异叶代谢相关。这个“DME增强” 体内 硅酸型模型详细表征,其效用于蛋白质组学表征在肝细胞特异性P450还原酶NULL(HRN)小鼠中的P450还原酶缺失后发生的补偿效果(
      • 亨德森C.J.
      • otto d.m.
      • 携带的。
      • magnuson m.a.
      • 麦克拉伦A.W.
      • 罗斯韦尔我
      • 狼C.R.
      肝细胞色素P450还原酶条件缺失肝细胞色素P450系统的灭活。
      )。

      实验步骤

       试剂

      5孕-3β-OL-20-116α-碳腈(PCN),苯巴罗布比(PB),β-萘洛伐克(βNF),利福平(RIF),1,4-BIS- [2-(3,5-二氯吡啶氧基)]苯,3,32,5,52-四氯-1,4-双(吡啶氧基)苯(TCPOBOP),乙氧基喹(EQ),玉米油(CO), DL.-Dithiothreitol(DTT)和碘乙酰胺(IAA)购自Sigma(海塞特,英国)。从多伦多研究化学品(加拿大多伦多)购买了2,3,7,8-四氯氯-P-二恶英(TCDD)。胰蛋白酶黄金购自Promega(麦迪逊,Wi)。

      畜牧业

      所有未标记的小鼠在标准的动物房屋状况下维持,可免费获得食物和水,12-H光/ 12-H暗循环。根据动物科学程序法(1986年)和当地伦理审查后,所有动物工作都在男性8周龄C57BL / 6J小鼠上进行。将小鼠以10μl/ g体重的最终体积施用化合物(或相应的车辆),如 补充表S1。在PCN / PB /βNF混合液的情况下,PCN和βNF在玉米油中悬浮在2×浓度下,并且在2×浓度下溶解PB。然后将每种制剂以5μl/ g体重施用,15分钟间隔以允许分散的第一溶液。牺牲后,切除肝组织并在液氮中冷冻在-80℃下储存。

      苏克拉动物

      通过喂养产生硅酸标记的C57BL / 6J小鼠 13C6 如上所述,赖氨酸饮食(Silantes GmbH,德国)超过四代(
      • 克鲁格米
      • Moser M.
      • USSAR S.
      • Thievessen I.
      • Luber C.a.
      • Forner F.
      • 施密特S.
      • Zanivan S.
      • Fassler R.
      用于定量蛋白质组学的氧化硅鼠揭开了Kindlin-3作为红细胞功能的必要因素。
      )。成年女性小鼠在硅酸盐饮食中进行20天,在雄性添加到生成F1后代之前。 F1女性后代保持在氧化糖饮食上,并为F2标记为幼崽。这是四代重复的。 F5雄性和雌性小鼠在氧化饮食上保持并在6-8周龄时使用。在正压下,动物在单独通风和过滤的笼中容纳在特定的病原体设施中。所有动物实验均符合爱尔兰药物董事会规定,并由三位一体学院都柏林的生物资源道德审查委员会批准。

      样品制备

      对于LC-MS / MS,将冷冻肝组织分解为9体积的SDT裂解缓冲液(4%SDS,0.1 m DTT, and 100 mm 然后Tris-HCl,PH7.6)通过转子定子(2×5s以20k转的旋转)匀浆。将匀浆在95℃下加热5分钟,然后简单地超声处理(2×5秒)。通过以16,000×离心沉淀碎片 g 10分钟。除去含有用于分析的蛋白质的上清液,等分,并在-80℃下储存直至使用。通过SDS-PAGE分离蛋白质样品,在摩托车运行缓冲液中的12%BIS-TRIS凝胶分析中分离,补充有抗氧化剂(Invitrogen,Paisley,UK)。分别将总共30和20μg蛋白质加载到每个孔中,分别为10和三个级分分析。凝胶用Coomassie Blue R250染色,饮用,然后再水化。将每个凝胶泳道切成两个带(带1:80-40kDa,带2:40-0kDA),具有干净的手术刀。这些切片精细(约1×1mm立方体)并收集在1.5ml蛋白质LOBPENDORF管(EPPENDORF,汉堡,德国)。凝胶胰蛋白酶介导的蛋白质消解和肽的提取根据雪佛考科和同事的方法进行(
      • 舍甫琴科A.
      • Tomas H.
      • Havlis J.
      • 奥尔森J.V.
      蛋白质和蛋白质蛋白质谱位的质谱表征的凝胶分解。
      )。通过在纳米玻璃分光光度计(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)上测量A280测定肽样品浓度,并在含有0.1%(v / v)三氟乙酸的水中的0.2mg / ml和2%(v / v)乙腈中。对于蛋白质印迹,如前所述制备和分析微粒体和细胞溶质级分(
      • meehan r.r.
      • Forrester l.m.
      • Stevenson K.
      • 哈斯蒂N.D.
      • Buchmann A.
      • kunz h.w.
      • 狼C.R.
      地塞米松施用术后大鼠大鼠肝脏诱导性细胞色素P-450s的调节。
      ,
      • Forrester l.m.
      • 亨德森C.J.
      • 瞥一眼M.J.
      • 返回D.J.
      • 公园B.K.
      • 球S.E.
      • kitteringham n.r.
      • 麦克拉伦A.W.
      • 里程J.s.
      • Skett P.
      • 等等。
      细胞色素P450同工酶在人肝中的相对表达与药物和异种症代谢的关系。
      )。简而言之,肝组织在三个体积的KCl缓冲液中均质化(1.15%w / v氯化钾和10米m 通过转子定子(2×5s在20k转的型钾),ph7.4)。匀浆以11,000×离心 g 颗粒碎片15分钟,上清液以100,000×超速离心 g 1小时。保留上清液(细胞溶质级分),而所得颗粒(微粒体馏分)重新悬浮在含有0.25的KCl缓冲液中 m 蔗糖。通过Bradford测定法测定蛋白质浓度并在LDS样品缓冲液(Invitrogen)中调节至1mg / ml。通过电泳通过电泳通过10%丙烯酰胺凝胶分离样品,在200V的100%中,然后在100V的100V中转移到硝酸纤维素膜上1小时。先前已经总结了用于CYP检测的抗体(
      • 芬恩r.d.
      • McLaughlin L.A.
      • Ronseaux S.
      • 罗斯韦尔我
      • 休斯顿J.B.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      定义 体内 通过细胞体细胞体细胞色素B5的条件性肝缺失,细胞色素P450在细胞色素P450中的作用。
      )。 GST的抗体是John Hayes教授,邓迪大学教授的礼物(
      • Mclellan L.I.
      • Hayes J.D.
      抗胆抗氧化丁基羟基吲哚小鼠肝脏在小鼠肝脏中α谷胱甘肽S转移酶的差异诱导。谷胱甘肽S转移酶Ya1ya1的纯化与表征。
      )。兔抗GAPDH购自SIGMA(产品编号G9545)。

      液相色谱和质谱

      使用LTQ-Orbitrap XL(Thermo Fisher Scientific)的纳米液相色谱仪(Agilent 1200,Agilent,Santa Clara,CA)分析蛋白质消化。将大约0.4μg的总肽以10μl/ min的流速加载到捕集塔上,然后将流量倒转至安槽Zorbex纳米C18柱(0.0075mM; 15cm;3μm粒径)。用300nl / min的流速将肽用3小时二进制梯度分解:0%缓冲液B 5分钟,然后进行2-30%缓冲液B,持续140分钟,30-90%缓冲液B 15分钟,90-0%缓冲液B 10分钟,0%缓冲液B 10分钟。缓冲剂A含有2%乙腈和0.1%甲酸在水中,缓冲液B含有0.1%甲酸在乙腈中。将柱定期用2μL注入含有50%乙腈和0.1%甲酸在水中的缓冲液清洗。使用不锈钢发射器(Thermo Fisher Scientific)的Proxeon纳米普通源用于接口安捷伦纳米和LTQ-甲壁。喷射电压设定为1.8kV。使用Glu-Fibrinogen B肽调节嵌合。对于蛋白质/肽鉴定,一种由330-1500 A.M.U(在orbitrap)之间的全部扫描和具有前六个前体离子的数据依赖性MS / MS的方法(2+ to 4+ 在LTQ中被带电。在30,000或60,000的分辨率下以30,000或60,000的分辨率在445.1200(多环二甲基硅氧烷(
      • 奥尔森J.V.
      • De Godoy L.M.
      • 李G.
      • MACEK B.
      • Mortensen P.
      • PESCH R.
      • Makarov A.
      • lange O.
      • 角horn
      通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
      )),LTQ以孤立宽度= 1(m/z),归一化碰撞能量= 0.25,激活时间= 30毫秒。 orbitrap和LTQ的最大填充时间分别设置为500 ms和50 ms。动态排除30秒用于最大化具有较低强度肽的MS2的获取。对于THR / SIM分析,采用了一种由330-1500 A.M.U(在orbitrap)之间的完全扫描和数据相关的MS / MS扫描组成的方法,其中包含或没有定义的前体。对于MS / MS扫描,还施加了30秒的动态排除和500计数的阈值,用于MS / MS扫描。当在MS扫描中没有发现目标前体时,执行不确定的数据相关的MS / MS。进一步的详细信息可以在提交以骄傲的方法和调谐文件中找到 补充文件S1和S2.

      数据分析

      使用峰值6(BioInformatics Solutions,Waterloo,Canada)进行蛋白质和肽数据库搜索与Uniprotkb Mus Musculus(TaxID:10090)参考蛋白质组合(43,238条目,下载25.02.14)。前体质量耐受性在7ppm设定为7ppm,并设定在0.5 amu时的片段离子质量耐受性。选择半胱氨酸氨基甲酰化作为固定改性。当在研究中,选择硅酸硅酸赖氨酸K6作为固定改性。选择甲硫氨酸作为可变改性。最多允许两种切片。使用两个种子文件使用筛网2.0(Thermo Fisher Scientific)进行预定靶向肽的定量,这取决于分析凝胶的分子量区域,含有保留时间和 m/z 信息。前体质量耐受设定为5ppm,并自动设定对准的最小强度,其强度来自第一单同步率峰。来自筛子的数据被出口到Excel 2010(Microsoft,Redmond,WA),以计算光线到重肽比率。在每次光/重比较之前,应用基线校正。这涉及从代谢标记的肝脏的光信号的减法,通过分析单独的筛子中的具有完整种子缺陷的筛子来确定。这种使蛋白质在内标中不完全标记的效果的校正。平均减法为〜2%(IE。 平均标记效率为98%)。对于蛋白质定量,通过对每种蛋白质的所有光肽的平均强度值求和,在样品中计算光对重蛋白质比率,然后除以相应的重值。然后通过将中值值调节到一种,单独地归一化每个样品中的重蛋白质比。在计算折叠变化之前,将生物复制标准化为对照的平均值。在从HRN分析的筛子输出的手动策序期间,由于软件的充电状态分配不正确,删除了九个肽对。为了计算统计显着性,标准化值是对转换的,然后通过未配对分析 t 使用Prism 6(GraphPad,La Jolla,CA)对多项比较(Alpha = 0.05)进行多重比较(Alpha = 0.05)的测试。

      结果

       途径的概念 - 增强体内硅胶

      途径增强的原理图概念 体内 硅胶与常规相比 体内 塞拉克显示在 Fig. 1。在典型的“穗状花序”工作流程中,代谢标记的小鼠肝组织裂解物组合1:1,具有实验样品的肝裂解物,其次是蛋白质提取,分馏和LC-MS / MS分析。针对单位素缺点的每种肽对单个样品的每种肽计算重度比率,使用比率计算的样品折叠变化:比例值(例如 Silac对1, Fig. 1A)。在检测到实验动物的光肽信号但是来自尖刺式裂解物的相应重肽的情况下不存在,使用典型的氧化硅酸的这两个样品的比较是不可能的(Silac对2, Fig. 1A)。通过将代谢标记的小鼠与选择的化合物一起注射以引发特定反应,该响应在组织收获之前升压蛋白质的蛋白质,可以解决这个问题( Fig. 1B)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1途径增强 体内 SILAC. A,一个典型的“穗in” 体内 Silac工作流程。代谢标记的小鼠肝组织裂解液组合1:1,实验样品(对照处理),其次是蛋白质提取,分馏和LC-MS / MS分析。当存在光和重肽种类时,可以在实验样品(Silac对1)之间进行折叠变化。当没有沉重的物种时,比较是不可行的(Silac对2)。 B,针对代谢标记的小鼠感兴趣的蛋白质的诱导诱导这个问题。

      鉴定DME诱导剂混合物

      为了实现小鼠肝中DME表达的广泛诱导,我们试图识别同时激活PXR,CAR和AHR的化学物质的组合(Fig. 2A)。在分离,PXR配体,PCN,强烈诱导CYP3A蛋白的表达,中等诱导的CYP2C蛋白,但未诱导CYP1A,CYP2B或CYP4A蛋白(Fig. 2B)。 RIF,其作为研究的用作鼠PXR的配体(60mg / kg(
      • 舍尔N.
      • 罗斯J.
      • 骑行A.
      • Zevnik B.
      • Niehaves S.
      • 浮士福队
      • 狼C.R.
      一种新型小鼠模型面板,以评估人妊娠X受体和组成型androstane受体在药物反应中的作用。
      )),如PCN,诱导CYP3A和CYP2C,但也诱导CYP4A。与PCN一样,RIF无法诱导CYP1A和CYP2B。汽车活化剂,TCPOBOP,强诱导的CYP2B,CYP2C和CYP3A蛋白,弱诱导的CYP1A和CYP4A,以及弱抑制CYP2E表达。当TCPOBOP与AHR配体组合时,TCDD,维持TCPOBOP型响应,具有额外的CYP1A和CYP4A诱导。替代汽车/ AHR活化剂组合,PB /βNF,诱导类似的响应,但不抑制CYP2E。添加PCN至这种组合增加了CYP3A诱导的水平。诱导所有组合,诱导细胞溶质GSTA和GSTM酶(Fig. 2B)。因此,通过Western印迹评估,PCN,PB和βNF的组合提供了DME表达的平衡增强。选择该组合用于刺激代谢标记的小鼠。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2用诱导剂混合物给药增强药物代谢途径中的蛋白质表达。 A,在Cytosol中的配体的结合后,受体向细胞核堆叠并与RXR(PXR和CAR)或ARNT(AHR)形成异二聚体。下游基因转录的诱导是通过二聚体与其特异性启动子区的结合介导的介导,例如,PXR / RXR在CYP3A11的启动子中结合,CAR / RXR与CYP2B10和AHR / ARNT与CYP1A1结合结合。 XREM,XENobiotic响应增强剂模块; PBREM,苯巴比妥反应增强剂模块; AHRE,芳基烃响应元件。 B,用PXR /型汽车诱导剂,PCN,RIF或TCPOBOP的雄性小鼠或单独服用的雄性小鼠的CYP和GST蛋白的蛋白质印迹,或用诱导剂的组合给药,如详细的“实验程序”。

      体内硅胶小鼠混合给药的表征

      将代谢标记的小鼠用PCN,PB和βNF的混合物给药,如“实验程序”所详细的。将一种这样的“DME增强”硅酸模型的肝蛋白质组与年龄和性匹配的未刺激小鼠(10波段SDS-PAGE分馏进行比较)进行比较。通过数据库搜索进行定性,用DME增强的氧化氧砂小鼠观察到蛋白质鉴定(FDR = 0.1%)的偏移,所述DME增强硅胶小鼠检测593个蛋白质基团,同时在未经处理的小鼠中丧失564个蛋白质基团(Fig. 3A)。检测到的独特CYP衍生肽的总数,从未治疗的小鼠中的56个增加到混合物剂量的小鼠中的56%(Fig. 3A)。对于由两个或多个独特肽鉴定的CYP蛋白,增强模型显示肽数的增加,包括1A1,1A2,2A4 / 2A5,2A12,2B10,2C29,2C54,2J5,3A11,3A13,17A1和51A1(Fig. 3B)。 2B9,2C37,2C44,2D10和2E1观察到降低。其他DME Superfamilies的表达并不像受到深刻的影响(见提交给骄傲的数据)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3DME.增强的肝蛋白质组 体内 Silac鼠标及其用于量化CYP2B10诱导。 A,比较蛋白总数和含有未处理的肝蛋白质组中鉴定的含有含赖氨酸的含CYP衍生肽的总数和含有DME增强的肝脏蛋白质组 体内 硅胶小鼠。进一步的细节可以找到 . B,对未处理和DME增强的肝脏蛋白质组中CYP衍生的独特肽的比较 体内 硅胶小鼠。 C,通过常规硅胶与未经处理的未标记小鼠的常规硅胶测量CYP2B10衍生的肽的光和重物的测量, D,tcpobop注重未标记的小鼠和 E,EQ-DES-DELEDBELED MICE。 F,通过DME增强硅胶与未经处理的未标记小鼠测量的相同肽, G,tcpobop注重未标记的小鼠和 H,EQ-DES-DELEDBELED MICE。
      为了测试这种硅胶材料的效用,在原则上的研究中,我们研究了已知的两种化合物刺激CYP2B10表达到不同程度,TCPOBOP和EQ(
      • 郑X.
      • maher J.
      • Dieter M.Z.
      • Klaassen C.D.
      通过原型微粒体酶诱导剂激活不同转录因子途径的肝脏在肝脏中调节小鼠有机阴离子输送多肽(OATP)。
      )。从CYP2B10独特的肽,NLQELLDYIGHSVEK衍生的信号被观察到刺激与TCPOBOP的未标记的“轻”小鼠(Fig. 3D3G)和eq(Fig. 3EH),但不在对照动物(Fig. 3C3F)。由于不刺激的“重”肝脏样品作为内标,由于缺乏参考信号,不可能在这两种化合物之间的刺激效力之间的比较(Fig. 3C, 3D和3.E)。用PXR / CAR / AHR激活剂刺激的“重”肝脏样品作为内标,可以比较CYP2B10的CYP2B10诱导(Fig. 3F, 3G, 和 3H)。我们发现,在CYP2B10诱导中,TCPOBOBOP比表达的效力比表达更高的效率,与先前的mRNA水平的观察结果一致(

      Ahn,Mj,Tsai,Cm,Hsia,Tc,Wright,E.,Chang,JW,Kim,HT,Kim,JH,Kang,JH,Kim,SW,Bae,EJ,Kang,M.,Lister,J. ,瓦尔策,S。,基于Bevacizumab的治疗的成本效益与Cisplatin Plus Pemetrexed用于韩国和台湾先进的非洲NSCLC的一线治疗。亚洲PAC。 J. Clin。 oncol。 7,22-33。

      )。

      过滤可靠的肽,用于通过THR / SIM定量DME

      我们之前描述了用于识别和表征小鼠肝裂解物中的肽的THR / SIM工作流程(
      • Macleod A.K.
      • 臧T.
      • 富人Z.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      • 黄杰特。
      一个目标 体内 氧化铝代谢酶的定量方法:由本构androstane受体调节。
      )。随着DME增强的氧化硅胶材料,我们采用了相同的方法,并采取了一系列措施,仅保留具有高识别置信度评分和良好分析特征的肽。 DME增强肝裂解物通过SDS-PAGE分离,两份和跨越定义的分子量范围的两个带 - 带1:80-40kDa,带2:40-0kDa - 被LC-MS / MS分析。原始数据被提交给峰软件进行蛋白质识别(见 补充表S6-S9补充文件S5和S6)。 “蛋白蛋白.CSV”和“蛋白质肽。”输出文件的每个定义的分子量带(补充表S6-S9)被合并,适当的-10LoGP值施用,以引入0.1%的肽FDR(带1:20.9,带2:22.9)。从肽序列中除去侧翼氨基酸,并且没有赖氨酸的肽(1),(2)不是独特的,(3)来自重复条目,(4)来自在靶向的分子量范围之外的蛋白质被弃去。然后将重复的肽列表含有每种肽的相应的未标记版本,具有 m/z 适当调整,标记和未标记的列表被合并。附加到每个列表是一个相同的壬尼克肽组。通常,这些来自两个高度同源蛋白质(例如CYP2A4 / 2A5或AKR1C12 / 1C13),但是一些存在于两个以上的蛋白质中(例如UGT2B5 / 2B17 / 2B38)。每个分子量范围的列表被转换为筛选兼容的种子文件格式,保留时间窗口为±3分钟,真实(标记)和理论(未标记) m/z ratios.
      硅酸肽对的分析性能以两种方式进行胁迫测试。首先,DME增强标记的肝裂解物在三个比例(1:1,1:0.25和1:0.0625)中合并(n = 2)从年龄,性别和药物剂量匹配的小鼠中解别的肝裂解物,一式两份。在筛子中分析了原料MS数据,并且在基线校正步骤(如“实验程序”下描述),用于计算每种肽的光比率对重的信号强度的平均强度值。然后将技术复制的平均比率LOG4转换为均匀分布三个数据点,允许计算同样加权的计算 R2 价值。只有线性的肽对 R2>0.9(输出强度比率的分布与样本输入的比例紧密匹配,并且保留了样品输入的样品,并且被任何背景或污染信号充分地禁止)( Fig. 4A)。显示了CYP1A1独特的肽的示例 Fig. 4B,所有九个都遇到了这个标准。 CYP1A2,CYP2B10和CYP2C29的其他示例如图所示 补充图。S1。其次,将DME增强标记的肝裂解物合并1:1,具有相同的合并未标记的肝裂解物,并在连续三天中以三份分析。肽对没有展示的(Fig. 4C)和/或日内(Fig. 4D)从种子文件中取出变异性(CV)≤20%。筛分输出数据以及线性和精确计算 补充表S10和S11)。提供了含有赖氨酸的肽数量的概述,并进行过滤后剩余 表I.。 DME增强肝脏样品中这些肽的标记效率平均为98%(补充图S2)。最终的种子文件,过滤 R2 和简历,提供为 补充表S12和S13.
      图缩略图GR4.
      Fig. 4过滤肽显示出高分析性能。 A,线性度(R2 分布)在1:1,1:0.25和1:0.0625样品输入范围内计算光对硅酸肽对的重比率的重量。 489的571(86%)≥0.9。 B,CYP1A1的肽的线性度。所有肽 R2 值≥0.9。 C,所有肽对的日期变异性。保留CV≤20%的对; 433的571(76%)。 D,所有肽对的日间变异性。保留CV≤20%的对; 465的571(81%)。
      表I.过滤过程选择种子肽对的概述。在最初通过峰,3856的这些含有赖氨酸鉴定的6348肽。这些肽的571衍生自DME和感兴趣的对照蛋白质。 386肽最终符合THR / SIM的所有必需标准的DME量化
      2分数峰分析种子文件
      (#peptides)(#peptide对)
      确定,FDR = 0.1%包含K.第一个种子文件第二个种子文件(过滤 R2 和 CV)
      Band 13306(-10logp = 20.9)1979417287
      Band 23042(-10logp = 22.9)187715499
      全部的63483856571386

      DME.增强体内硅胶的HRN鼠标线的表征

      在我们的实验室开发,HRN小鼠系列具有肝脏特异性条件缺失的细胞色素P450还原酶(p),CYP的主要电子给体(
      • 亨德森C.J.
      • otto d.m.
      • 携带的。
      • magnuson m.a.
      • 麦克拉伦A.W.
      • 罗斯韦尔我
      • 狼C.R.
      肝细胞色素P450还原酶条件缺失肝细胞色素P450系统的灭活。
      )。由此产生的肝P450活性的近消融使得该效用模型在研究CYP介导的代谢在定义药物处理中的作用。早期表征工作揭示了血清丙氨酸氨基转移酶的增加,以及HRN线中循环胆固醇和甘油三酯的降低(
      • 亨德森C.J.
      • otto d.m.
      • 携带的。
      • magnuson m.a.
      • 麦克拉伦A.W.
      • 罗斯韦尔我
      • 狼C.R.
      肝细胞色素P450还原酶条件缺失肝细胞色素P450系统的灭活。
      )。肝脏患有肝肿大和胆汁酸生产受损,导致胆固醇积累和高脂血症。此外,观察到总P450蛋白的五倍增加,诱导属于1A,2B,2C,3A和4A SubFilies的CYP(
      • Chanas S.A.
      • 江Q.
      • McMahon M.
      • McWalter G.K.
      • Mclellan L.I.
      • elcombe c.r.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      • Moffat G.J.
      • Itoh K.
      • Yamamoto M.
      • Hayes J.D.
      NRF2转录因子的损失导致肾小瓣肝胰岛转移酶GSTA1,GSTA2,GSTM1,GSTM2,GSTM3和GSTM4基因的结构型和诱导型表达的显着降低。
      )。这种五倍的增加没有通过伴随的mRNA水平的增加来反映,这保持不变(
      • 王X.J.
      • 张伯伦米
      • vassieva o.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      细胞色素P450还原酶(POR)含氟小鼠肝脏表型与基因表达变化的关系。
      )。微阵列和RT-PCR分析检测到的2A4,2C29,3A11,3A16,4A10,4A41,7A1,8B1和26A1同种型在1.5和3.7折之间,CYP2B10诱导超过三十倍(
      • 王X.J.
      • 张伯伦米
      • vassieva o.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      细胞色素P450还原酶(POR)含氟小鼠肝脏表型与基因表达变化的关系。
      )。 CYP2C70,2D26,2F2,4V3和7B1下调30-50%。对于非CYP DME,ALDH1A7和3A2和GSTM2和M3被上调,而HSD3B2,3B5和11B1和GSTA4被下调(
      • 王X.J.
      • 张伯伦米
      • vassieva o.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      细胞色素P450还原酶(POR)含氟小鼠肝脏表型与基因表达变化的关系。
      )。在本研究中,我们使用来自DME增强的氧化硅鼠的肝裂解物,以量化HRN线中DME表达的蛋白质水平变化。
      分析了来自三只雄性HRN小鼠和三次/性别匹配的野生型小鼠的肝脏样本(补充表S14)。使用thr / sim-体内 Silac工作流程,在数据分析期间,3分钟保留时间窗口,我们证实了POR蛋白被删除(Fig. 5A)。有趣的是,我们还观察到替代电子给体细胞色素B5表达的增加,尽管这并不统计学意义(Fig. 5A)。我们观察到CYP2B10(16.8倍),CYP2B10 / 2B23(7.1倍),CYP2C29(6.6倍),CYP2C37(2.8倍),CYP2C54(2.7倍),CYP2C55(20.0倍),CYP2C55 / 2G1(17.1-折叠),CYP2E1(4.4倍),CYP3A11(8.2倍),CYP3A11 / 44(4.7倍)和CYP3A13(2.8倍)(Fig. 5A)。这些结果与以前的研究(以前的研究)完全一致,并提供了增加的细节水平(
      • 亨德森C.J.
      • otto d.m.
      • 携带的。
      • magnuson m.a.
      • 麦克拉伦A.W.
      • 罗斯韦尔我
      • 狼C.R.
      肝细胞色素P450还原酶条件缺失肝细胞色素P450系统的灭活。
      ,
      • 王X.J.
      • 张伯伦米
      • vassieva o.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      细胞色素P450还原酶(POR)含氟小鼠肝脏表型与基因表达变化的关系。
      )。唯一显示统计上显着增加的其他酶是CES2A(2.4倍),而HSD11b1(0.4倍)和HSD17b6(0.3倍)的表达减少(Fig. 5B)。对于II期,上调GSTM2(3.1倍)和GSTM3(18.1倍)(Fig. 5C)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5DME.增强了THR / SIM 体内 HRN鼠标线的补偿变化氧化硅酸盐分析。 A,cyp和相关蛋白质, B,另外的i阶段和 C,量化II酶量化。灰色棒:野生型,黑条:HRN。灰色中的文本是指用于量化的独特肽对的数量。数据显示为平均折叠变化±s.D。每个组内的三只小鼠,具有以下例外; CYP2B0,CYP2C55和CYP2C55 / 2G1仅在三种野生型小鼠中,仅量化值CYP2B10 / 2B23,其中值仅在一个野生型和两个HRN小鼠中量化,以及SULT2A1的值仅量化两种野生型和一个HRN鼠标。
      要提供额外的信心,即THR / SIM方法是可靠的,我们提取了八个蛋白质的数据,表达的表达认为不太可能发生显着变化 p 删除; β-肌动蛋白样蛋白2(ACTBL2),肌动蛋白相关蛋白3(ACTR3),血清白蛋白(ALB),CalreteLIN(CALR),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),管蛋白α-4a,(Tuba4a),管蛋白β-2a(Tubb2a)和微管蛋白β-4b(tubb4b)。有边缘变化,最值得注意的是,CALR增加,但这些都不是统计学意义(补充图S3)。

      讨论

      Spike-in Silac,其中来自单一代谢标记的小鼠的组织可用作多个实验中的内标(
      • 盖尔特T.
      • wisniewski J.R.
      • Cox J.
      • Zanivan S.
      • 克鲁格米
      • Ishihama Y.
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记用作定量蛋白质组学中的穗标准标准。
      ),允许对蛋白质组的大规模分析,而无需昂贵的维持标记的小鼠殖民地的要求。然而,只有当这些蛋白质在该动物中的可检测水平表达时,才能实现感兴趣蛋白的相对定量。我们在这里寻找一个通用 体内 适用于定量多种DME的硅酸盐材料,两者都可以尽可能地表达和需要诱导。在同时激活PXR,CAR和AHR后,我们观察到多种CYP的广泛上调,从未治疗的小鼠中的56个独特的CYP衍生肽增加到115个独特的肽后混合物剂量( Fig. 3A)。至关重要的是,在1A,2B,2C和3A Subfamilies的“Xenobiotic-Metabolization”Cyps中可以看到最大的诱导( Fig. 3A),而不是那些在这个过程中具有较小角色的超级家庭成员(
      • Hrycay e.g.
      • Bandiera S.M.
      小鼠细胞色素P450酶的表达,功能和调节:与人P450酶的比较。
      ,
      • 纳尔逊D.R.
      • Zeldin D.C.
      • 霍夫曼三
      • Maltais L.J.
      • 你是
      • Nebert D.W.
      细胞色素P450(CYP)基因从小鼠和人类基因组的比较,包括用于基因,假生素和替代 - 剪接变体的命名建议。
      )。因此,证明了同步核受体活化是一种适当的方法,即增强代谢标记的肝脏在代谢标记的肝脏中的DME衍生肽表达的方法。
      CYP / CYP 1a / a,2b / b,2c / c,2d / d和3a / a Xenobiotic代谢亚壳的功能作用和转录调节在小鼠和男性之间高度保守(
      • Hrycay e.g.
      • Bandiera S.M.
      小鼠细胞色素P450酶的表达,功能和调节:与人P450酶的比较。
      ,
      • 纳尔逊D.R.
      • Zeldin D.C.
      • 霍夫曼三
      • Maltais L.J.
      • 你是
      • Nebert D.W.
      细胞色素P450(CYP)基因从小鼠和人类基因组的比较,包括用于基因,假生素和替代 - 剪接变体的命名建议。
      )。这些基因簇被淘汰的小鼠,在某些情况下,敲入的原始人类基因已经存在了多年(
      • 张建
      • Gonzalez F.J.
      人源化的小鼠线及其预测人类药物代谢和毒理风险评估的应用。
      )。最近,多个集群的同时敲除/人性化以及核受体监管机构的淘汰,带来了有效的前景 体内 PK. / PD关系更接近实现的临床前建模(
      • Hafegawa M.
      • Kapelyukh Y.
      • Tahara H.
      • Seibler J.
      • 骑行A.
      • Krueger S.
      • 李D.N.
      • 狼C.R.
      • 舍尔N.
      人妊娠X受体的定量预测和细胞色素P450 3A4新型多种人源化小鼠线中的药物 - 药物相互作用。
      ,
      • 舍尔N.
      • McLaughlin L.A.
      • 骑行A.
      • Macleod A.K.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      缺失30只鼠细胞色素P450基因导致具有损害药物代谢的可行性小鼠。
      )。为了最大化这些模型的效用,全面了解其代谢能力至关重要。我们设想这种DME增强了 体内 硅酸盐材料将用于这些动物的表征,两者在其基础状态和化学或病理挑战下。此外,它将支持这些和其他模型中候选治疗化合物的PK,Pd和药物 - 药物相互作用特征的更完整的临床前评价。
      在使用THR / SIM工作流程的HRN鼠标线的表征中,我们在此证明DME-增强型硅胶材料允许通过Western印迹或常规可执行的细节水平定量蛋白质组学定量 体内 Silac,在水上不切实际的规模上。同意mRNA分析(
      • 王X.J.
      • 张伯伦米
      • vassieva o.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      细胞色素P450还原酶(POR)含氟小鼠肝脏表型与基因表达变化的关系。
      ),我们观察了诱导多种CYP,GSTM和HSD的镇压(Fig. 5),加强在先前研究中进行的观察,即CYP功能的消融改变了多种代谢途径的平衡。应该强调与微阵列数据的两个值对比。首先,虽然在mRNA水平上未检测到(
      • 王X.J.
      • 张伯伦米
      • vassieva o.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      细胞色素P450还原酶(POR)含氟小鼠肝脏表型与基因表达变化的关系。
      ),我们能够证明CYP1A1蛋白质水平保持不变(IE。 删除后,较低而未诱导 p (Fig. 5A)。其次,虽然CYP2E1 mRNA水平未被改变(
      • 王X.J.
      • 张伯伦米
      • vassieva o.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      细胞色素P450还原酶(POR)含氟小鼠肝脏表型与基因表达变化的关系。
      ),我们在蛋白质水平中鉴定了统计上显着的4.4倍诱导该酶( Fig. 5A),表示迄今为止无表达翻译后的监管事件。在一起,我们的结果暗示了PXR / CAR激活之后 p 缺失,诱导这些受体的许多目标DME(
      • Maglich J.M.
      • stoltz c.m.
      • Goodwin B.
      • 霍金斯棕色D.
      • 摩尔J.T.
      • kliewer s.a.
      核妊娠X受体和组成型androstane受体调节重叠但涉及异卵戒毒的不同基因。
      ,
      • Tojima H.
      • Kakizaki S.
      • Yamazaki Y.
      • Takizawa D.
      • Horiguchi N.
      • 佐藤K.
      • 森林
      核受体汽车和PXR的配体依赖性肝基因表达谱。
      )。这一结论支持芬恩的调查结果 等等。,显示HRN肝中不饱和脂肪酸的积累,显示在较小程度上,PXR(
      • 芬恩r.d.
      • 亨德森C.J.
      • 斯科特C.L.
      • 狼C.R.
      通过依赖途径通过CoCochrome P450表达的不饱和脂肪酸调节。
      )。我们目前正在测试DME增强型Silac的应用,促进复杂人源化小鼠模型的全面表征。
      DME.-Enhanced Silac提供了两个主要优点;它能够定量通常在极低的水平下表达的DME,并且它通过增加测量的肽的数量来提高对基本量化的那些DME的定量置信度。后一种效应对于可靠的蛋白质量化是重要的,因为氨基酸取代(通过例如突变)或翻译后修饰可以影响胰蛋白酶肽的M / Z比,从而影响定量结果。通过DME-Enhanced Silac包含更多的靶向肽,可以减轻这种潜在的批判性尚未预测的效果,而不是与其他蛋白质组学策略不太问题,其中监测每种蛋白质每种蛋白质的一个或两种蛋白质。
      尽管在诱导化合物靶向的途径中具有DME增强的增益,但在初始表征实验中未检测到CYP 2B9,2C44,2C69,2C70,2D10和20A1(Fig. 3B)。这可以指示其表达的下调,因为细胞资源从内源性转移到外源代谢(例如,CYP2C44参与七氧己类代谢(
      • Delozier T.C.
      • Tsao C.C.
      • Coulter S.J.
      • Foley J.
      • Bradbury J.A.
      • Zeldin D.C.
      • Goldstein J.A.
      CYP2C44,一种新的鼠CYP2C,即代谢arachidonic酸以独特的立体特异性产品。
      )))。然而,应该需要定量这些酶,但是一种解决方案是将非刺激和DME增强标记的肝裂解物组合用作内标。由于“抑制”蛋白质的表达趋于低于诱导剂-NAïve肝脏(如检测到的少量肽所证明的(Fig. 3B然而,“然而,我们不会预期检测的显着提高,而不严重降低来自诱导酶的信号。替代解决方案是将丢失的信号的肽特异性信息附加到种子缺陷中,然后以相对于具有相似性质的杂种重肽计算它们的强度。
      我们利用先前描述的THR / SIM工作流程来证明DME增强型Silac的应用,因为可以显着简化下游数据分析。替代数据分析软件,例如maxquant(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )或天际线(
      • 麦克莱恩B.
      • Tomazela d.m.
      • 舒尔曼N.
      • Chambers M.
      • 芬尼G.L.
      • Frewen B.
      • 肯尼尔·
      • Tabb D.L.
      • Liebler D.C.
      • maccoss m.j.
      天际线:用于创建和分析目标蛋白质组学实验的开源文档编辑器。
      ),可以使用。理论上也可以施加血管(
      • Gillet L.C.
      • Navarro P.
      • 塔特S.
      • 罗斯特H.
      • selevsek n。
      • 重新勒
      • Bonner R.
      • Aeberberold R.
      由数据独立获取产生的MS / MS光谱的有针对性的数据提取:一致和准确的蛋白质组分析的新概念。
      )或并联反应监测(
      • 加利斯S.
      • Duriez E.
      • Crone C.
      • Kellmann M.
      • Moehring T.
      • Domon B.
      靶向蛋白质组学定量对四轴 - 眶谱法质谱仪。
      )工作流程,基于MS1或MS2信号的量化。此外,使用更新,更先进的仪器也将显着改善使用这些工作流程中的任何蛋白质的数量。已知通过PXR,轿厢和AHR调节的许多蛋白质尚未在本研究中检测到,这意味着DME-增强的益处将以更大的分析敏感性与这些靶蛋白的不同子集重新携带。
      先前报告的THR / SIM种子肽过滤工作流程
      • Macleod A.K.
      • 臧T.
      • 富人Z.
      • 亨德森C.J.
      • 狼C.R.
      • 黄杰特。
      一个目标 体内 氧化铝代谢酶的定量方法:由本构androstane受体调节。
      ),这里我们改进了一个更严格的选择过程,从生物分析验证程序中进行了以下原则(

      http://www.fda.gov/downloads/AnimalVeterinary/GuidanceComplianceEnforcement/GuidanceforIndustry/ucm052379.pdf.

      )。我们包括在日内和日间变异性和稀释线性度测试,以滤除初始靶向种子清单中的分析性能差的肽。在该过程中排除大约三分之一(571个)原种肽,因此消除了可能导致数据中的可变性的大部分不精确来源。剩余的潜在可变性来源,其仍然包括低(和因此可变的)目标信号(如HRN分析中的CYP2B10所示),凝胶切割中的不精确和伪影/污染物信号。尽管如此,我们认为这里应用的过滤过程是必要的并且足以确保数据质量。
      总之,我们设计并验证了蛋白质组学策略,用于定量386硅胶肽对,代表小鼠肝脏的所有主要超级套管的98次DMES。至关重要的是,通过同时激活DME表达,PXR,CAR和AHR的三种最生理上重要的调节剂,在代谢标记的小鼠中,我们能够使酶定量保持在非常低的基础表达水平并且否则将具有不可检测,同时增加可用于定量在基础水平下可检测到可检测的诱导酶的肽数。该途径增强促进了在通用背景下蛋白质水平在蛋白质水平上的整体评估,并将是识别和理解药物处理临床前模型中发生的变化的效用。

      致谢

      我们感谢Julia Carr夫人为抗GST抗体的动物工作和John Hayes教授提供帮助。

      补充材料

      参考

        • Wienkers L.C.
        • 希思蒂。
        预测 体内 药物相互作用 体外 drug discovery data.
        NAT。 Rev.药物讨论。 2005; 4: 825-833
      1. http://www.fda.gov/downloads/Drugs/GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm292362.pdf.

      2. http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2012/07/WC500129606.pdf.

        • 徐C.
        • 李C.Y.
        • 孔A.N.
        异丙虫病诱导阶段I,II和III药物代谢/运输。
        拱。药。 res。 2005; 28: 249-268
        • 托尔森A.H.
        • 王H.
        异骨受体调节药物代谢酶:PXR和轿车。
        adv。毒品混合。录 2010; 62: 1238-1249
        • Maglich J.M.
        • stoltz c.m.
        • Goodwin B.
        • 霍金斯棕色D.
        • 摩尔J.T.
        • kliewer s.a.
        核妊娠X受体和组成型androstane受体调节重叠但涉及异卵戒毒的不同基因。
        摩尔。药学。 2002; 62: 638-646
        • 威尔逊下午
        • kliewer s.a.
        PXR,汽车和药物代谢。
        NAT。 Rev.药物讨论。 2002; 1: 259-266
        • Hrycay e.g.
        • Bandiera S.M.
        小鼠细胞色素P450酶的表达,功能和调节:与人P450酶的比较。
        Curr。药物元。 2009; 10: 1151-1183
        • Streetman D.S.
        • Bertino Jr.,J.S.
        • nafziger a.n.
        成人药物代谢酶的表型:对体内细胞色素P450表型探针的综述。
        药物发生。 2000; 10: 187-216
        • 法庭M.H.
        同种型选择性探针基板 体外 人UDP-葡糖醛糖基转移酶的研究。
        方法酶。 2005; 400: 104-116
        • 埃文斯W.E.
        • 伸展M.V.
        药物替昔科:将功能基因组学转换为合理治疗方法。
        科学。 1999; 286: 487-491
        • ohtsuki s。
        • Schaefer O.
        • Kawakami H.
        • in
        • Liehner S.
        • 锡达A.
        • Ishiguro N.
        • Kishimoto W.
        • Ludwig-Schwellinger E.
        • Ebner T.
        • Terasaki T.
        同时的绝对蛋白质定量转运蛋白,细胞色素P450和UDP-葡糖醛糖基三转移酶作为表征个体人肝的新方法:与mRNA水平和活性进行比较。
        药物元。 Dimos。 2011; 40: 83-92
        • 迈克尔斯S.
        • 王米..
        经修订的人肝细胞色素P450“饼”:使用靶向定量蛋白质组学的CYP4F和CYP3A酶的绝对蛋白质定量。
        药物元。 Dimos。 2014; 42: 1241-1251
        • 赫斯曼伊米。
        • 杜峰N.N.
        谱分析鼠细胞色素P450表达的靶向蛋白质组学方法。
        J. Pharmacol。 Exp。它。 2014; 349: 221-228
        • Achour B.
        • 罗素M.R.
        • 理发师J.
        • Rostami-Hodjegan A.
        使用多重靶向蛋白质组学同时定量几种细胞色素P450和尿苷5'-二磷嘌呤醇糖基转移酶的富含性。
        药物元,dispos。 2014; 42: 500-510
        • Shrivas K.
        • mindaye s.t.
        • Getie-Kebtie M.
        • Alterman M.A.
        基于质谱的人肝细胞色素蛋白质组学分析P450。
        毒素。苹果。药学。 2013; 267: 125-136
        • Karlsen O.A.
        • PunterVoll P.
        • Goksoyr A.
        β-萘酮治疗的大西洋鳕鱼(GADUS MORHUA)肝脏分离微粒体细胞色素P450同工酶的质谱分析,肝脏探讨了COD Cypome的见解。
        aquat。毒素。 2012; 108: 2-10
        • 威廉姆森B.L.
        • Purkayastha S.
        • 猎人C.L.
        • Nuwaysir L.
        • 希尔J.
        • Easterwood L.
        通过LC-MS / MS的CYP诱导的定量蛋白质测定。
        蛋白质组学。 2010; 11: 33-41
        • 邱X.
        • 张H.
        • 赖Y.
        膜转运蛋白的定量靶向蛋白质组学:方法和应用。
        AAPS J. 2014; 16: 714-726
        • Jani M.
        • Ambrus C.
        • magn
        • jakab k.t.
        • 烤饼E.
        • Zollerciks J.K.
        • krajcsi p.
        BCRP的结构和功能,Xenobiotics和Endobiotics的广泛特异性转运蛋白。
        拱。毒素。 2014; 88: 1205-1248
        • 缩合C.
        • 布鲁克S.
        • 赖Y.
        • 鲍里克A.
        • Busemann A.
        • Heidecke C.D.
        • Siegmund W.
        • 奥斯瓦尔德S.
        基于LC-MS / MS的临床相关肠道吸收和流出转运蛋白的定量。
        J. Pharm。生物化。肛门。 2013; 85: 253-261
        • Sakamoto A.
        • Matsumaru T.
        • yamamura n。
        • Uchida Y.
        • Tachikawa M.
        • ohtsuki s。
        • Terasaki T.
        肺组织中人体药物转运蛋白的定量表达:液相色谱 - 串联质谱法分析区域,性别和间接差异。
        J. Pharm。 SCI。 2013; 102: 3395-3406
        • 格柏S.A.
        • 赶紧J.
        • STEMMAN O.
        • Kirschner M.W.
        • Gygi S.P.
        通过串联MS从细胞裂解物中绝对定量蛋白质和磷蛋白。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2003; 100: 6940-6945
        • Liebler D.C.
        • 火腿A.J.
        霰弹枪蛋白质组学的旋转滤光片样品制备。
        NAT。方法。 2009; 6: 785-786
        • Macleod A.K.
        • 臧T.
        • 富人Z.
        • 亨德森C.J.
        • 狼C.R.
        • 黄杰特。
        一个目标 体内 氧化铝代谢酶的定量方法:由本构androstane受体调节。
        J.蛋白质组。 2014; 13: 866-874
        • 亨德森C.J.
        • otto d.m.
        • 携带的。
        • magnuson m.a.
        • 麦克拉伦A.W.
        • 罗斯韦尔我
        • 狼C.R.
        肝细胞色素P450还原酶条件缺失肝细胞色素P450系统的灭活。
        J. Biol。化学。 2003; 278: 13480-13486
        • 克鲁格米
        • Moser M.
        • USSAR S.
        • Thievessen I.
        • Luber C.a.
        • Forner F.
        • 施密特S.
        • Zanivan S.
        • Fassler R.
        用于定量蛋白质组学的氧化硅鼠揭开了Kindlin-3作为红细胞功能的必要因素。
        细胞。 2008; 134: 353-364
        • 舍甫琴科A.
        • Tomas H.
        • Havlis J.
        • 奥尔森J.V.
        蛋白质和蛋白质蛋白质谱位的质谱表征的凝胶分解。
        NAT。 protoc。 2006; 1: 2856-2860
        • meehan r.r.
        • Forrester l.m.
        • Stevenson K.
        • 哈斯蒂N.D.
        • Buchmann A.
        • kunz h.w.
        • 狼C.R.
        地塞米松施用术后大鼠大鼠肝脏诱导性细胞色素P-450s的调节。
        生物学习。 j。 1988; 254: 789-797
        • Forrester l.m.
        • 亨德森C.J.
        • 瞥一眼M.J.
        • 返回D.J.
        • 公园B.K.
        • 球S.E.
        • kitteringham n.r.
        • 麦克拉伦A.W.
        • 里程J.s.
        • Skett P.
        • 等等。
        细胞色素P450同工酶在人肝中的相对表达与药物和异种症代谢的关系。
        生物学习。 j。 1992; 281: 359-368
        • 芬恩r.d.
        • McLaughlin L.A.
        • Ronseaux S.
        • 罗斯韦尔我
        • 休斯顿J.B.
        • 亨德森C.J.
        • 狼C.R.
        定义 体内 通过细胞体细胞体细胞色素B5的条件性肝缺失,细胞色素P450在细胞色素P450中的作用。
        J. Biol。化学。 2008; 283: 31385-31393
        • Mclellan L.I.
        • Hayes J.D.
        抗胆抗氧化丁基羟基吲哚小鼠肝脏在小鼠肝脏中α谷胱甘肽S转移酶的差异诱导。谷胱甘肽S转移酶Ya1ya1的纯化与表征。
        生物学习。 j。 1989; 263: 393-402
        • 奥尔森J.V.
        • De Godoy L.M.
        • 李G.
        • MACEK B.
        • Mortensen P.
        • PESCH R.
        • Makarov A.
        • lange O.
        • 角horn
        通过锁定谱位注入C-Trap零件在横向质谱仪上的百万百万质量准确度。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2005; 4: 2010-2021
        • 舍尔N.
        • 罗斯J.
        • 骑行A.
        • Zevnik B.
        • Niehaves S.
        • 浮士福队
        • 狼C.R.
        一种新型小鼠模型面板,以评估人妊娠X受体和组成型androstane受体在药物反应中的作用。
        J. Clin。投资。 2008; 118: 3228-3239
        • 郑X.
        • maher J.
        • Dieter M.Z.
        • Klaassen C.D.
        通过原型微粒体酶诱导剂激活不同转录因子途径的肝脏在肝脏中调节小鼠有机阴离子输送多肽(OATP)。
        药物元。 Dimos。 2005; 33: 1276-1282
      3. Ahn,Mj,Tsai,Cm,Hsia,Tc,Wright,E.,Chang,JW,Kim,HT,Kim,JH,Kang,JH,Kim,SW,Bae,EJ,Kang,M.,Lister,J. ,瓦尔策,S。,基于Bevacizumab的治疗的成本效益与Cisplatin Plus Pemetrexed用于韩国和台湾先进的非洲NSCLC的一线治疗。亚洲PAC。 J. Clin。 oncol。 7,22-33。

        • Chanas S.A.
        • 江Q.
        • McMahon M.
        • McWalter G.K.
        • Mclellan L.I.
        • elcombe c.r.
        • 亨德森C.J.
        • 狼C.R.
        • Moffat G.J.
        • Itoh K.
        • Yamamoto M.
        • Hayes J.D.
        NRF2转录因子的损失导致肾小瓣肝胰岛转移酶GSTA1,GSTA2,GSTM1,GSTM2,GSTM3和GSTM4基因的结构型和诱导型表达的显着降低。
        生物学习。 j。 2002; 365: 405-416
        • 王X.J.
        • 张伯伦米
        • vassieva o.
        • 亨德森C.J.
        • 狼C.R.
        细胞色素P450还原酶(POR)含氟小鼠肝脏表型与基因表达变化的关系。
        生物学习。 j。 2005; 388: 857-867
        • 盖尔特T.
        • wisniewski J.R.
        • Cox J.
        • Zanivan S.
        • 克鲁格米
        • Ishihama Y.
        细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记用作定量蛋白质组学中的穗标准标准。
        NAT。 protoc。 2011; 6: 147-157
        • 纳尔逊D.R.
        • Zeldin D.C.
        • 霍夫曼三
        • Maltais L.J.
        • 你是
        • Nebert D.W.
        细胞色素P450(CYP)基因从小鼠和人类基因组的比较,包括用于基因,假生素和替代 - 剪接变体的命名建议。
        药物发生。 2004; 14: 1-18
        • 张建
        • Gonzalez F.J.
        人源化的小鼠线及其预测人类药物代谢和毒理风险评估的应用。
        J. Pharmacol。 Exp。它。 2008; 327: 288-299
        • Hafegawa M.
        • Kapelyukh Y.
        • Tahara H.
        • Seibler J.
        • 骑行A.
        • Krueger S.
        • 李D.N.
        • 狼C.R.
        • 舍尔N.
        人妊娠X受体的定量预测和细胞色素P450 3A4新型多种人源化小鼠线中的药物 - 药物相互作用。
        摩尔。药学。 2011; 80: 518-528
        • 舍尔N.
        • McLaughlin L.A.
        • 骑行A.
        • Macleod A.K.
        • 亨德森C.J.
        • 狼C.R.
        缺失30只鼠细胞色素P450基因导致具有损害药物代谢的可行性小鼠。
        药物元。 Dimos。 2014; 42: 1022-1030
        • Tojima H.
        • Kakizaki S.
        • Yamazaki Y.
        • Takizawa D.
        • Horiguchi N.
        • 佐藤K.
        • 森林
        核受体汽车和PXR的配体依赖性肝基因表达谱。
        毒素。吧。 2012; 212: 288-297
        • 芬恩r.d.
        • 亨德森C.J.
        • 斯科特C.L.
        • 狼C.R.
        通过依赖途径通过CoCochrome P450表达的不饱和脂肪酸调节。
        生物学习。 j。 2009; 417: 43-54
        • Delozier T.C.
        • Tsao C.C.
        • Coulter S.J.
        • Foley J.
        • Bradbury J.A.
        • Zeldin D.C.
        • Goldstein J.A.
        CYP2C44,一种新的鼠CYP2C,即代谢arachidonic酸以独特的立体特异性产品。
        J. Pharmacol。 Exp。它。 2004; 310: 845-854
        • Cox J.
        MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
        NAT。 Biotechnol。 2008; 26: 1367-1372
        • 麦克莱恩B.
        • Tomazela d.m.
        • 舒尔曼N.
        • Chambers M.
        • 芬尼G.L.
        • Frewen B.
        • 肯尼尔·
        • Tabb D.L.
        • Liebler D.C.
        • maccoss m.j.
        天际线:用于创建和分析目标蛋白质组学实验的开源文档编辑器。
        生物信息学。 2010; 26: 966-968
        • Gillet L.C.
        • Navarro P.
        • 塔特S.
        • 罗斯特H.
        • selevsek n。
        • 重新勒
        • Bonner R.
        • Aeberberold R.
        由数据独立获取产生的MS / MS光谱的有针对性的数据提取:一致和准确的蛋白质组分析的新概念。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2012; 11 (O111 016717.)
        • 加利斯S.
        • Duriez E.
        • Crone C.
        • Kellmann M.
        • Moehring T.
        • Domon B.
        靶向蛋白质组学定量对四轴 - 眶谱法质谱仪。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2012; 11: 1709-1723
      4. http://www.fda.gov/downloads/AnimalVeterinary/GuidanceComplianceEnforcement/GuidanceforIndustry/ucm052379.pdf.

        • VizCaino J.A.
        • 德意曲e.w.
        • 王R.
        • Csordas A.
        • Reinger F.
        • 里奥斯D.
        • 戴安斯J.A.
        • 太阳Z.
        • Farrah T.
        • Bandeira N.
        • binz p.a.
        • Xenarios I.
        • 艾森凯母线
        • Mayer G.
        • Gatto L.
        • 坎波奥A.
        • Chalkley R.J.
        • Kraus H.J.
        • Albar J.P.
        • 马丁内斯 - Bartolome S.
        • APWEILER R.
        • OPENN G.S.
        • 玛特L.
        • 琼斯A.R.
        • Hermjakob H.
        Proteomexchange提供全球协调的蛋白质组学数据提交和传播。
        NAT。 Biotechnol。 2014; 32: 223-226