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具有不可逆硫酸和磺酸的半胱氨酸的心肌肽的全局分析翻译后修饰* [S]

  • Jana Paulech.
    隶属关系
    来自澳大利亚悉尼大学分子生物科学学院,澳大利亚2006年;
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  • 艾斯汀A. LIDDY.
    隶属关系
    来自澳大利亚悉尼大学分子生物科学学院,澳大利亚2006年;

    §CharlesPerkins中心,澳大利亚悉尼大学2006;
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  • Kasper Engholm-Keller
    隶属关系
    ¶Children的医学研究所,澳大利亚威斯特米德2145;

    ‖中心为临床蛋白质组学,欧登塞大学医院,欧登塞C,丹麦DK-5000;

    **丹麦南丹麦大学生物化学与分子生物学系,丹麦DK-5230;
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  • Melanie Y. White
    隶属关系
    来自澳大利亚悉尼大学分子生物科学学院,澳大利亚2006年;

    §CharlesPerkins中心,澳大利亚悉尼大学2006;

    澳大利亚悉尼大学医学院病理学学科,澳大利亚2006
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  • 斯图尔特J. Cordwell.
    一致
    应该解决对应的通信
    隶属关系
    来自澳大利亚悉尼大学分子生物科学学院,澳大利亚2006年;

    §CharlesPerkins中心,澳大利亚悉尼大学2006;

    澳大利亚悉尼大学医学院病理学学科,澳大利亚2006
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  • 作者脚注
    *这项工作是由国家卫生和医学研究委员会(NHMRC; 571002至S.J.C.)的补助金提供支持的澳大利亚和NSW州政府(NSW-中国协同研究项目(S.J.C.和M.Y.))。 J.P.和K.A.L.是澳大利亚研究生奖项的接受者(APA)。 M.Y.W.是澳大利亚研究委员会(ARC)发现早期职业研究奖(Decra)。 K.E.-K.丹麦独立研究和欧盟FP7 Marie Curie行动的丹麦独立研究和欧洲联盟委员会(MobileX Postdoctoral Courdowshhip DFF-1325-00154)提供支持。在生物医学蛋白质组学和澳大利亚癌症研究基金会(ACRF)的Kinomics,儿童医学研究院,Westmead,NSW 2145,澳大利亚的生物医学蛋白质组织和澳大利亚癌症研究基金会(ACRF)中心,获得了LTQ orbitrap velos和5600三重TOF仪器数据。我们感谢Valentina Valova博士进行仪器访问和帮助。
    1 使用的缩写是:CyscysteineBsabovine血清蛋白 - Sohsulfenic ate​​r-so-so2Hsulfinic acidcys-so3Hsulfonic aciddttttithiothreitolfaformic atchfdrfalse发现速率氟氯丙烯胺ontologyhilichydrophilic相互作用液相色谱/ rischemia / crefusionlc-ms / msliquid色谱串联质谱串N - 乙基马来酰亚胺NITCnonischemic时间controlPrxperoxiredoxinPSMpeptide光谱matchPTMpost翻译modificationRNSreactive氮speciesROSreactive氧speciesSPEsolid相extractionSrxsulfiredoxin。
    [S] 本文包含补充图。 S1至S3,数据S1和表S1至S4。
      半胱氨酸(CYS)氧化是与氧化还原信号传导和氧化应激相关的关键后修饰(PTM)。由于Cys对氧化剂具有高度反应性,它形成了一系列的翻译后修改,有些是生物学可逆的(例如二硫化物,Cys硫酸)和其他(Cys硫酸[Cys-So2h]和sulfonic [cys-so3H]酸)被认为是“irreversible.”我们开发了一种孤立CYS-SO的丰富方法2H / SO3来自复杂组织裂解物的含H肽,其与串联质谱(MS / MS)相容。这些翻译后修饰的酸度(PKacys-so3H <0)在酸性pH的胰蛋白酶pH上局部地造成独特的电荷分配,可用于其纯化。该方法是基于Cys-So的静电排斥2H / SO3含有阳离子树脂的H肽(IE。 “negative”选择)然后是“positive”采用亲水相互作用液相色谱选择。强阳离子交换方案的改性通过允许疏水保留中性肽来降低初始流动级分的复杂性。强阳离子交换和亲水性相互作用液相色谱的偶联使得Cys-So的富集增加2H / SO3H(高达80%)来自其他改性肽。我们确定了181名Cys-So2H / SO3H大鼠心肌组织的H位点经受生理相关浓度的H.2O2 (<100 μm)通过Langendorff灌注缺血/再灌注(I / R)损伤。 I / R显着增加了CYS-SO2H / SO3来自蛋白质的H-修饰的肽,参与能量利用和收缩性,以及参与氧化损伤和修复的蛋白质。
      半胱氨酸(Cys)

      使用的缩写是:

      Cys.
      半胱氨酸
      BSA.
      牛血清白蛋白
      cys-soh
      磺酸
      cys-so 2H
      磺酸酸
      cys-so 3H
      磺酸
      DTT.
      dithiothreitol.
      F A
      甲酸
      FDR.
      假发现率
      FT.
      流浪
      基因本体论
      HILIC.
      亲水性相互作用液相色谱
      I / R.
      缺血/再灌注
      LC-MS / MS
      液相色谱串联质谱法
      NEM.
      N - 乙基马来酰亚胺
      NITC.
      非缺血时间控制
      PRX.
      过氧杂志毒素
      PSM
      肽光谱匹配
      PTM.
      翻译后修改
      rns.
      反应氮物种
      罗斯
      反应性氧气
      SPE.
      固相提取
      SRX.
      苏氟毒素。
      是蛋白质翻译后修饰(PTM)的整体部位,响应生理和病理刺激。许多研究已经确定了生物可逆Cys PTM的作用,包括二硫化物, S - 在氧化还原信号期间蛋白质功能调节中的 - 硝基硫醇和亚硫酸(Cys-Soh)(审查(
      • Drögew.
      细胞功能生理控制中的自由基。
      ,
      • Valko M.
      • 莱布特蒂茨D.
      • Moncol J.
      • Cronin M.T.D.
      • Mazur M.
      • TELSER J.
      正常生理功能和人类疾病中的自由基和抗氧化剂。
      )))。此外,Cys可以在与氧化应激相关的病理学中氧化(例如 神经变性,癌症和心血管疾病(
      • Valko M.
      • 莱布特蒂茨D.
      • Moncol J.
      • Cronin M.T.D.
      • Mazur M.
      • TELSER J.
      正常生理功能和人类疾病中的自由基和抗氧化剂。
      )))。存在各种氧化还原蛋白质组学方法,用于富集这些可逆氧化的CYS,基于还原到硫醇,然后通过:1)用化学标签烷基化(例如 同位素编码的亲和标签)(
      • Gygi S.P.
      • rist b.
      • 格柏S.A.
      • Turecek F.
      • 凝胶M.H.
      • Aeberberold R.
      使用同位素编码亲和标记的复合蛋白混合物的定量分析。
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      • HägglundP.
      • Bunkenborg J.
      • Maeda K.
      • Svensson B.
      基于同位素编码的亲和标记的定量蛋白质组学方法鉴定硫氧脲靶靶。
      ,
      • 绢云母M.
      • McComb M.E.
      • Heibeck T.
      • Costello C.E.
      • 科恩r.a.
      同位素编码的亲和标签方法以鉴定和定量氧化剂敏感蛋白硫醇。
      ,
      • 绢云母M.
      • McComb M.E.
      • 黄鹤
      • 黄S.
      • Heibeck T.
      • Costello C.E.
      • 科恩r.a.
      同位素编码的亲和标签(ICAT)氧化还原蛋白质组学的方法:复合蛋白质混合物中氧化剂敏感半胱氨酸硫醇的鉴定和定量。
      ); 2)硫醇二硫化物交换(
      • Paulech J.
      • solis n.
      • Edwards A.v.
      • Puckeridge M.
      • 白色m.y.
      • Cordwell S.J.
      通过施加到心肌氧化还原蛋白质的硫醇二硫化物交换含有可逆氧化半胱氨酸的大规模捕获肽。
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      • 刘涛。
      • 钱W.J.
      • 营2nd,D.G.
      • 史密斯r.d.
      使用定量胱抑素富集技术进行高通量定量蛋白质组学。
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      • 刘涛。
      • 钱W.J.
      • strittmatter e.f.
      • 营地D.G.
      • 安德森G.A.
      • thrall b.d.
      • 史密斯r.d.
      高通量比较蛋白质组分析使用定量胱抑素富集技术。
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      • 郭杰。
      • 长边m.j.
      • 苏D.
      • 刘涛。
      • 营2nd,D.G.
      • 史密斯r.d.
      • 钱W.J.
      树脂辅助硫醇作为一种基于半胱氨​​酸的可逆修饰的蛋白质组学分析的一般策略。
      );或3)重金属离子螯合(
      • doulias p.t.
      • Greene J.L.
      • Greco T.M.
      • Tenopoulou M.
      • Seeholzer S.H.
      • Dunbrack R.L.
      • ischiropoulos H.
      内源性S-亚硝基过细胞内残留物的结构分析显示出独特的特征,适应蛋白质S-亚硝基化的各种机制。
      ,
      • doulias p.t.
      • Tenopoulou M.
      • Greene J.L.
      • Raju K.
      • ischiropoulos H.
      通过可逆蛋白质S-亚硝基化,一氧化氮调节线粒体脂肪酸代谢。
      )。还鉴定了氧化性Cys PTM,其主要没有已知的酶促还原手段。这些“过度”或“不可逆转”氧化Cys PTM(磺胺类[Cys-So2h]和sulfonic [cys-so3H]酸主要与氧化应激相关。只有一个可逆的cys-so的一个例子2通过ATP依赖性磺脲毒素(SRX)(SRX)(SRX)(PRX)的过氧毒素(PRX)进行了特征在于它们
      • 比特湾。
      • 拉布拉特J.
      • 托利坦诺M.B.
      通过依赖于半胱氨酸 - 磺酸的ATP依赖性减少 S. Cerevisiae. sulphiredoxin.
      );但是,SRX没有被认为减少CYS-SO2H在其他蛋白质中,没有发现Cys-So的机制3H减少。在基础水平,〜1-2%的Cys作为Cys-So2H / SO3 H (
      • 哈曼姆
      • 张T.
      • Hendrich S.
      • 托马斯J.A.
      蛋白质硫酸胍和磺酸的定量,细胞蛋白中不可逆转氧化的蛋白质半胱氨酸位点。
      )和rso2H修饰在一些蛋白质中具有功能性意义(例如 dj-1通过cys-so在阿尔茨海默病中激活2H在Cys-106处)(
      • BlackInton J.
      • Lakshminarasimhan M.
      • 托马斯K.J.
      • Ahmad R.
      • 格雷吉奥E.
      • 拉扎A.S.
      • COOKSON M.R.
      • 威尔逊M.A.
      稳定化的半胱氨酸硫酸的形成对于帕金森蛋白DJ-1的线粒体功能至关重要。
      )。
      cys-so 2H / SO3通过Cys-Soh的顺序氧化产生H,其本身是由电磁硫醇通过反应性氧和氮物质(ROS / RNS)的氧化(如过氧化氢(H.2O2)或过氧诺依物质。该反应相对效率,并且需要三当量的氧化剂,以及保护初始CYS-SOH免受亲核攻击。因此,形成这些PTM的CYS,特别是在生物上相关的氧化剂浓度下,可能具有高反应性或位于独特的微环境中,其在不需要提前减少CYS-SOH的情况下适应其生产( 例如 通过硫醇或胺攻击)。因此,这些部位可以是候选者作为氧化还原或监管传感器(审查(
      • lo conte m.
      • Carroll K.S.
      蛋白质硫酸和巯基的氧化还原生物化学。
      )))。或者,对Cys-So的过度氧化2H / SO3H升高期间H可用作氧化损伤的标志物,并用于降解的靶蛋白。
      关于Cys-So的信息2H / SO3迄今为止,HPTM在复杂样品中仅由氨基酸分析(水解裂解物)(
      • 哈曼姆
      • 张T.
      • Hendrich S.
      • 托马斯J.A.
      蛋白质硫酸胍和磺酸的定量,细胞蛋白中不可逆转氧化的蛋白质半胱氨酸位点。
      )或二维凝胶电泳(2-de),其中这些PTM导致酸性移位(
      • 瓦格纳E.
      • Luche S.
      • Penna L.
      • Chevallet M.
      • 范杜塞尔A.
      • leize-wagner E.
      • rabilloud t.
      一种检测半胱氨酸过氧化的方法:过氧化毒素被氧化 体内 在氧化应激期间在活性位点半胱氨酸。
      ,
      • 济东J.
      • j
      • na s.
      • 李娥。
      • 金马
      • 崔S.
      • Shin D.H.
      • PAEK E.
      • 李H.Y.
      • 李克..
      氧化还原活性半胱氨酸残基的新型氧化修饰。
      )。前者不提供有关特定蛋白质的信息,而后者依赖于改性群体是对蛋白质蛋白质的观察和/或抗体的可用性的充分强度。最近的一项研究确定了44个CYS-SO2H / SO3在非物质学上的H-修饰的肽2O2 oxidized (440 μm)利用长柱超高压液相色谱(LC)的细胞(
      • 李c.f.
      • Paull T.T.
      • 人M.D.
      使用长柱UPLC-PSRM的蛋白质组宽检测和定量分析不可逆半胱氨酸氧化。
      )。因此,对不可逆Cys-PTM的全局分析需要富集,其考虑:(1)Cys是蛋白质中的第二个最低丰富的氨基酸(~1.5%)(
      • pe'er i.
      • Felder C.E.
      • 男人o.
      • Silman I.
      • Sussman J.L.
      • Beckmann J.s.
      蛋白质组学签名:氨基酸和寡肽组合物分化在凹部之间。
      ),和(2)CYS-SO2H / SO3H预计在生理(甚至病理)条件下仅占这些CYS网站的1-2%。
      LC的特异性肽富集,然后是自下而上的蛋白质组学是许多PTMS成功使用的常见方法(
      • Beausoleil S.A.
      • jedrychowski m.
      • 施瓦茨D.
      • eliasj.e.
      • VillénJ.
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      Hela细胞核磷蛋白的大规模表征。
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      • Thingholm T.e.
      • Jensen O.N.
      • Roepstorff P.
      • jørgensent.j.d.
      使用二氧化钛微柱的肽混合物的高度选择性富集磷酸化肽。
      )。然而,有限的研究已经探索了CYS-SO的这种技术2H / SO3含H肽,没有检测复合裂解物的单纯度蛋白质(
      • 戴J.
      • 王J.
      • 张Y.
      • 卢Z.
      • 杨B.
      • 李X.
      • Cai Y.
      • 钱X.
      用强阳离子交换LC和MALDI-TOF / TOF MS从表演氧化蛋白的胰蛋白酶消化中富集和鉴定半胱氨酸肽。
      ,
      • 昌y.c.
      • 黄C.N.
      • 林C.H.
      • 常熟。
      • 吴C.C.
      用比富集和质谱法测定蛋白质半胱氨酸磺酸修饰:探索半胱氨酸氧化的综合方法。
      )。鉴于这些PTM是最酸性的修饰之一,平均pka of RSO2H < 2 and RSO3H〜-3,通过利用它们独特的电荷分布,与这些肽分离出这些肽有关。在酸性pH下,其中非含果胰蛋白肽将在一个和两个之间具有平均溶液电荷状态(取决于PKa 酸性残基和C末端),Cys-So2H / SO3含H肽的肽将具有额外的负电荷,因此,具有平均电荷分布≤1.因此,可以在正面或带负电荷的树脂上进行选择,以前是Cys-So的“阳性”选择2H / SO3含H肽(由树脂保留),而后者是“阴性”选择(Cys-So2H / SO3含H的肽不会被树脂保留)。已经使用了两种方法(
      • 戴J.
      • 王J.
      • 张Y.
      • 卢Z.
      • 杨B.
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      • Cai Y.
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      用强阳离子交换LC和MALDI-TOF / TOF MS从表演氧化蛋白的胰蛋白酶消化中富集和鉴定半胱氨酸肽。
      ,
      • 昌y.c.
      • 黄C.N.
      • 林C.H.
      • 常熟。
      • 吴C.C.
      用比富集和质谱法测定蛋白质半胱氨酸磺酸修饰:探索半胱氨酸氧化的综合方法。
      )通过表演酸氧化牛血清白蛋白(BSA)的肽 - 导致二硫键的裂殖和Cys转化为Cys-So-so3h,和甲硫氨酸(met)达到砜(o2)。研究给出了比较结果,阳性选择(
      • 昌y.c.
      • 黄C.N.
      • 林C.H.
      • 常熟。
      • 吴C.C.
      用比富集和质谱法测定蛋白质半胱氨酸磺酸修饰:探索半胱氨酸氧化的综合方法。
      )与负选择相比,增加Cys覆盖率(
      • 戴J.
      • 王J.
      • 张Y.
      • 卢Z.
      • 杨B.
      • 李X.
      • Cai Y.
      • 钱X.
      用强阳离子交换LC和MALDI-TOF / TOF MS从表演氧化蛋白的胰蛋白酶消化中富集和鉴定半胱氨酸肽。
      ) (60% 相对 45%)以牺牲特异性为代价,在洗脱中观察到更多的非Cys肽。
      最终,任何浓缩方法都必须能够净化CYS-SO2H / SO3来自细胞和组织的含H肽在生理和/或病理条件下,这两者都会产生相当低的Cys-So水平2H / SO3h也比表演酸。心肌缺血和再灌注(I / R)损伤的特征在于在再灌注时观察到的ROS / RNS的“爆发”(
      • Bolli R.
      • Patel B.S.
      • Jeroudi M.O.
      • 赖E.K.
      • 麦金P.B.
      用旋转捕获α-叔丁基硝基叔丁酯的完整犬“震惊”心肌恒定生成的自由基生成的示范。
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      • Bolli R.
      氧气衍生的自由基和发布的心肌功能障碍(“令人惊叹的心肌”)。
      )。这些ROS / RN压倒了心脏的天然抗氧化防御(
      • Dhalla N.S.
      • Elmoselhi A.B.
      • HATA T.
      • Makino N.
      心肌抗氧化剂在缺血再灌注损伤中的状态。
      )导致氧化应激,导致有助于收缩功能障碍(
      • Bolli R.
      • Jeroudi M.O.
      • Patel B.S.
      • 拜此c
      • 赖E.K.
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      直接证据表明氧气衍生的自由基有助于完整狗的缺血性心肌功能障碍。
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      • 朱W.X.
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      铁螯合螯合剂的螯合剂氧胺衰减后性心室功能障碍。
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      含有氧自由基清除剂的兔心肌缺血和再灌注损伤的蛋白质组学。
      )。几项研究观察到I / R以下可逆CYS PTM增加(
      • 伊顿P.
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      在缺血再灌注过程中的心脏蛋白S-硫化的检测,定量,纯化和鉴定。
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      心脏缺血和再灌注过程中甘油醛磷酸脱氢酶氧化。
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      硫酸丝蛋白巯基的氧化减少了收缩力及其CA.2+ 人体心肌细胞的敏感性。
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      用树脂辅助捕获在预处理和缺血/再灌注损伤期间同时测量蛋白质氧化和S-亚硝基化。
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      • verveva i.
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      分离大鼠心脏病患者诱导肌原纤维蛋白氧化的证​​据。
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      • 冬季冬季C.C.
      用ICAT试剂和质谱法测定小鼠心脏硫醇蛋白的氧化铈蛋白质组学。
      ),并增加了Cys-So2H / SO3H也可能有助于细胞功能障碍,最终导致延长I / R(心肌梗死)的细胞凋亡和坏死。鉴于强阳离子交换(SCX)作为自下而上蛋白质组学中的第一维肽分馏的常见做法,我们希望探讨其识别Cys-So的效用2H / SO3H个复杂样本的网站。性表演氧化BSA和心肌蛋白质提取物用于研究在该方法的每个步骤中发生的相互作用,然后将该方法应用于心肌蛋白提取物,其暴露于高效氧化剂的高浓度(H.2O2)。最后,该方法用于识别Cys-So2H / SO3含H衍生自生理相关H的H的肽2O2 (IE。 ≤100 μm,对可能的病理h的估计2O2 levels (
      • 石头J.R.
      • 杨科。
      过氧化氢:信号通信者。
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      • 施罗德E.
      • 伊顿P.
      作为内源介质的过氧化氢和心血管研究中的外源工具:问题和考虑。
      ))或来自对I / R损伤进行的大鼠心肌组织。

      实验步骤

       材料

      甲醇,氯仿,氯化钾(KCl)和钾/二氢磷酸钠(KH24 / Nah. 24)从Ajax Finechem(澳大利亚悉尼)购买。测序级猪胰蛋白酶来自Promega(麦迪逊,Wi)。除非另有说明,否则所有其他化学物质来自Sigma-Aldrich(圣路易斯,MO)。所有溶液均用超纯米兰水(Millipore,Billerica,MA)制备。

       表演氧化和BSA的胰蛋白酶消化

      进行表演氧化以产生CYS-SO3h如前所述(
      • 戴J.
      • 王J.
      • 张Y.
      • 卢Z.
      • 杨B.
      • 李X.
      • Cai Y.
      • 钱X.
      用强阳离子交换LC和MALDI-TOF / TOF MS从表演氧化蛋白的胰蛋白酶消化中富集和鉴定半胱氨酸肽。
      )。简而言之,通过混合1:19份H制备表现酸2O2 对于甲酸(FA),并在室温下混合1小时。将BSA(〜1mg / ml)重悬于Fa,加入三体积的表现酸,并在加入冰上孵育的反应2.5小时,然后在加入五个千里Q水并蒸发至干燥。将蛋白质溶解在0.1中 m NaH24,用1:25比率胰蛋白酶/ BSA在37℃下消化16小时的胰蛋白酶。然后通过固相萃取(SPE)在亲水性亲脂性平衡(HLB)盒(水杂志,Milford,MA)上的固相萃取(SPE)浓缩和脱盐,洗脱液蒸发至干。

       Langendorff灌注

      所有动物研究均经过悉尼大学动物护理和伦理委员会批准(参考:K20 / 4-2011 / 3/5517)。刘易斯大鼠(n 用戊巴比妥(200mg Kg)安乐死每组三个)−1),心脏迅速切除并进行Langendorff灌注20分钟(“基线”灌注),如前所述,具有非额定克雷斯缓冲液(
      • Parker B.L.
      • Palmisano G.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • 白色m.y.
      • Engholm-Keller K.
      • 李阿。
      • 斯科特N.E.
      • Kolarich D.
      • 保存B.D.
      • 包装机N.H.
      • Larsen M.R.
      • Cordwell S.J.
      定量 N - 心肌缺血和再灌注损伤的糖蛋白酶揭示了细胞外环境的早期重塑。
      ),其次是要么; 1)30分钟的灌注(非缺血时间控制,NITC)或2)全球无流量缺血15分钟和15分钟再灌注(15i / 15r)。基于速率压力产品的血流动力学数据(RPP; BPM×左心室发育压力的心率函数[LV 开发 ]表示为基线的百分比显示出的NITC心脏不受控制灌注的影响(RPP 105%±1%的基线),而那些对151 / 15R进行的,恢复至基线的66%±5%,与先前的研究一致(
      • Paulech J.
      • solis n.
      • Edwards A.v.
      • Puckeridge M.
      • 白色m.y.
      • Cordwell S.J.
      通过施加到心肌氧化还原蛋白质的硫醇二硫化物交换含有可逆氧化半胱氨酸的大规模捕获肽。
      ,
      • Parker B.L.
      • Palmisano G.
      • 爱德华兹A.V.G.
      • 白色m.y.
      • Engholm-Keller K.
      • 李阿。
      • 斯科特N.E.
      • Kolarich D.
      • 保存B.D.
      • 包装机N.H.
      • Larsen M.R.
      • Cordwell S.J.
      定量 N - 心肌缺血和再灌注损伤的糖蛋白酶揭示了细胞外环境的早期重塑。
      )。心脏在液氮中冷冻冷冻并储存在-80° C。

       心肌原生蛋白提取和h2O2 Oxidation

      冷冻组织(来自NITC心脏)均质(Omni International,Kennesaw,Ga)在0.1中 m NaH24,pH7,含有1米m 苯基甲基磺酰氟,1μm aprotinin, 20 μm leupeptin, and 2 mm 二亚乙基三胺丙酮酸在冰上。匀浆以13,000×离心 g 在4℃下15分钟并除去上清液。 H2O2 加入上清液中,得到100 n的最终浓度m, 10 μm,100μ.m或10米m 并在室温下温育1小时,然后用二硫噻唑醇(DTT)在室温下进行1小时。然后蛋白质接受氯仿/甲醇沉淀,以除去重新悬浮,胰蛋白酶消化和SPE清理前的蛋白酶抑制剂,如上所述。通过量子测定(Invitrogen,Carlsbad,Ca)量化肽/蛋白质。

       变性蛋白质从心肌组织提取

      冷冻组织均质(Omni International)0.1 m NaH24,pH 6,含有20米m N - 乙基马来酰亚胺(nem),1%(w / v)十二烷基硫酸钠,1米m 苯基甲基磺酰氟,1μm aprotinin, 20 μm leupeptin, and 2 mm 二亚乙基三胺戊酸酸。匀浆以13,000×离心 g 在4℃下15分钟并除去上清液。将另外的均化缓冲液加入颗粒中,颗粒接受了2×20次的尖端探针超声处理(Branson,Darbury,CT),然后以13,000×离心离心 g,15分钟,4°C,汇集上清液。 pH调整为>七和蛋白质减少了(20米m DTT,1 H室温)和可逆地用甲基甲烷硫代硫酸酯可逆地改性的游离硫醇(40米m 在乙腈[mecn])。然后,蛋白质在重悬浮之前接受氯仿/甲醇沉淀,胰蛋白酶消化和SPE清洁剂如上所述。通过量子测定量化肽或蛋白质。

       表演氧化心肌胰蛋白酶摘要

      如上所述,在不存在还原和烷基化步骤的情况下制备变性蛋白质提取物(IE。 在提取缓冲液中没有NEM,没有DTT还原)以保持二硫化物。蛋白质然后接受氯仿/甲醇沉淀,重刺,胰蛋白酶消化和SPE清理。如BSA所述,所得肽的性能氧化,并将混合物蒸发至干。

       强阳离子交换

      肽样品(5μgbsa/25μg性氧化提取物/75μg所有其他样品)在2ml SCX加载缓冲液中稀释(5米m KH24,pH 2.5)并加载到SCX盒(AB SCIEX,Framingham,MA)上,与相同的缓冲液(3mL)平衡。收集流通(FT),并用另外的1ml SCX加载缓冲液洗涤盒,用FT合并。然后用有机洗涤缓冲液洗涤盒(5米m KH24,pH 2.5,25%Mecn)和其单独收集(分数“Mecn”)。洗脱保留的肽(每1ml),不同浓度为100%KCl缓冲液(5米m KH24,pH 2.5,25%Mecn和0.5 m 在有机洗涤缓冲液中稀释至1,5,10,15,20,25,30,40,50,60,80和90%KCl中的KCl。将含有Mecn的所有级分通过〜1℃干燥以减少Mecn浓度,然后用0.1%TFA稀释至>如上所述,浓缩和脱盐前1mL。

       离线亲水性相互作用液相色谱(HILIC)

      在Agilent 1200系列毛细管LC系统(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)上进行分馏。在HILIC缓冲液B(90%MECN,0.1%三氟乙酸[TFA]中重新悬浮样品,并在家用填充柱(3μm,20cm×320μm,100孔径)的Tskgel酰胺-80珠子上分离( Tosoh Biosciences,日本)使用0-100%HILIC缓冲液A(0.1%TFA)的梯度以6μLmin的流速为29分钟−1。取决于通过分光光度吸光度判断的个体样本复杂性进行三到八个级分。

       LC-MS / MS

      SCX分级的BSA和表演氧化提取物的初步研究是在QSTAR Elite(Absciex,Foster City,CA)质谱仪上进行的,耦合到Agilent 1100系列纳米LC系统。在线耦合到Dionex Ultimate 3000 HPLC系统(Dionex,Sunnyvale,CA)或5600三倍的LTQ orbitrap Velos(Thermo Scientific,Weltham,MA)质谱仪上获得了后续研究(所有SCX-HILIC分级样品)的质谱仪。 -tof耦合到Eksigent Nanolc Ultra(Eksigent,Dublin,CA)。在缓冲液A(0.1%Fa)中重新悬浮样品,并在家用的反相柱(3μm,15cm×75μm,120埃孔径)上分离的Reprosil pur C.18 AQ珠子(Maisch GmbH博士,Ammerbuch-Rentringen,德国)使用以下渐变; (1)5-40%缓冲液B(100%Mecn,0.1%Fa),在300 nL min时105分钟−1 (QSTAR),(2)0-45%缓冲液B2(90%MECN,0.1%FA),50分钟,50分钟为50分钟−1 (LTQ orbitrap Velos),或(3)2-35%缓冲液B,45分钟,300 nl min−1 (5600)。所有MS仪器都以数据相关的正离子模式运行 m/z 范围为300-2000。对于QSTAR和5600,选择具有充电状态2+至4+的前五和15个最强烈的前体离子分别用于碰撞诱导的解离(CID)碎片。对于LTQ orbitrap velos,以交替的方式选择用于较高能量的碰撞解离(HCD)和CID碎片,选择具有充电状态2+至4+的最浓度的离子。IE。 对于四个前体,每毫秒八个MS / MS)。使用30 s(qstar和orbitrap)或10 s(5600)的Windows启用动态排除。原始数据在吉祥物蒸馏器(Vers.2.4.3.3; Matrix Science,伦敦,英国)中脚本到.mgf。

       数据分析

      对Uniprot数据库(BSA)或Uniprot进行搜查表演氧化肽数据 rattus norvegicus. 数据库(分类编号10116; 2013_11发布)使用内部吉祥物服务器(Vers.2.4)。参数是错过的切割,可变修改:满足(o2)和cys(o3),在Q / E,乙酰基(蛋白质N末端)的吡葡萄酒酯(Pyroglu)。用于初始表演氧化提取物的修饰磷酸(ST)用于判断HILIC污染磷酸肽的富集水平。 H2O2 氧化的心肌肽数据被搜查在uniprot上 R. norvegicus. 数据库,如上所述,添加变量修改; cys(o.2),cys(o3),在e和磷酸(st)的情况下遇到(o),而没有焦化(st),因为这些不是SCX-HILIC级分中的主要污染物。非氧化(变性蛋白质提取物)心肌肽数据(H.2O2,NITC和I / R样品被搜索为H.2O2 - 加入可变修饰的氧化肽:NEM(C)和甲基(C)。因为cys-so2h(+32 da)和cys-so3H(+48DA)修饰具有质量,可以与几种氧化氨基酸改性混淆(例如 羟脯氨酸, N-Formentnynynurenine等(
      • Mølleri.M.
      • Rogowska-wrzesinska A.
      • 饶科斯
      蛋白质羰基化和金属催化的蛋白质氧化在细胞的前景中。
      ))或在双重改性的肽等磷酸化(32 + 48 = 80Da)中,我们搜索了我们的数据,包括这些修改。在吉祥物离子评分中鉴定的肽等于或高于当包括Cys-So时获得的肽2h等等3H被排除在后续分析之外。仪器依赖性肽/片段的搜索差分是; 0.2DA / 0.2DA(QSTAR),10ppm / 0.1Da(orbitrap velos)和50ppm / 0.1da(5600)。来自H.的样品2O2 - 对蛋白质,NITC和15I / 15R心脏进行三种单独的SCX富集,然后进行HILIC分离。如上所述,通过LC-MS / MS分析所得的FT和MECN级分中的每一个。所有搜索都针对诱饵数据库进行,并过滤到a<2%虚假发现率(FDR)。基于显着的吉祥物评分,接受含有不可逆CYS修饰的肽。因为含有cys-so的肽的数量2H左右3H修改均相对较低,根据由(1)的标准,对仅单一复制仅识别的那些在其对应的MS / MS光谱的识别中进行了手动注释(
      • 陈Y.
      • kwon s.w.
      • 金S.C.
      • 赵玉。
      用串联质谱进行蛋白质序列数据库鉴定的肽的手动评估综合方法。
      ),确认吉祥物提供的识别。显示心肌肽的分馏技术的再现性 补充表S4A-4F。所识别的CYS的代表性MS / MS光谱 - 所以2h和-so3来自大鼠心肌组织的H含肽经受nitc,h2O2 治疗和151/15r含有 补充数据S1.

       生物信息学

      基因本体(GO)术语通过输入UNIPROT标识符进入David Bioinformatics工具(
      • 黄D.W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      )来自所有GO条款的背景参考 R. norvegicus.。获得折叠过度表示和修改的Fisher提取物计算的值(
      • Hosack D.A.
      • 丹尼斯G.
      • 谢尔曼B.T.
      • 车道H.C.
      • LEMPICKI R.A.
      易于识别基因名单中的生物主题。
      )并用于对功能聚类的结果进行排名。

      结果和讨论

       改进的SCX策略,用于表演氧化Cys的负面选择

      常见的SCX策略是将肽在含有低盐的低pH水性流动相中结合肽和百分比的有机溶剂,最典型的MECN为20-30%(v / v)。包括后一种条件以限制疏水性保留肽,因此在偶联与反相分离时增加正交性。然而,〜2.5-3(最常用的)的流动相pH在平均pk内a ASP(3.5±1.2)和蛋白质中的C末端(3.3±0.8)(
      • 格里姆斯利G.R.
      • Scholtz J.M.
      • 速度c.n.
      折叠蛋白质中可电离基团的测量PK值的概述。
      )。据估计,更多的肽不含Cys-So2H / SO3H将在此pH下保持比以前认为(
      • 戴J.
      • 王J.
      • 张Y.
      • 卢Z.
      • 杨B.
      • 李X.
      • Cai Y.
      • 钱X.
      用强阳离子交换LC和MALDI-TOF / TOF MS从表演氧化蛋白的胰蛋白酶消化中富集和鉴定半胱氨酸肽。
      ) - 即使在没有生物ptm的情况下(例如 胺乙酰化,蛋白质切割等)。通过疏水力通过SCX树脂保留中性肽将因此有利于增加Cys-So的阴性选择3H肽来自含有中性电荷的未改性肽的复杂混合物。
      在没有有机改性剂的情况下表演氧化BSA肽的SCX(pH 2.5)允许鉴定20个CYS-SO3在“流通”(FT)中的14个肽上的H位点,其中67%的这些肽含有CYS-SO3H(14/21肽)和剩余的构成非特性切割或蛋白质c末端(补充表S1)。当25%(v / v)mecn包含在流动阶段时,只有一个额外的cys-so3鉴定出H位点,但存在九种另外的未修饰的肽,并且仅含有〜30%的肽含有cys-so3这表明肽在水性缓冲液中初始结合,得到FT级分,然后用含有有机改性剂的缓冲液进行随后的洗涤,是有利于从FT中耗尽疏水/中性肽。额外的九个cys-so 3在15%(w / v)KCl洗涤中回收H BSA肽,其中含有改性的该级分中的48%肽。所有cys-so3这里观察到的H肽含有来自他(九个肽),错过的裂解(一种肽)或Arg / Lys之后的额外带电残余物,其接下来是Pro,(R / K)-P,其未被胰蛋白酶切割(四种肽)。在较高浓度的KCl下没有观察到其他位点。总体而言,BSA中的86%的CYS网站被确定为CYS-SO3h,这是对以前观察到45%的方法的改进(
      • 戴J.
      • 王J.
      • 张Y.
      • 卢Z.
      • 杨B.
      • 李X.
      • Cai Y.
      • 钱X.
      用强阳离子交换LC和MALDI-TOF / TOF MS从表演氧化蛋白的胰蛋白酶消化中富集和鉴定半胱氨酸肽。
      )和60%(
      • 昌y.c.
      • 黄C.N.
      • 林C.H.
      • 常熟。
      • 吴C.C.
      用比富集和质谱法测定蛋白质半胱氨酸磺酸修饰:探索半胱氨酸氧化的综合方法。
      ), 分别。
      为了研究复杂的生物样品中的方法,我们进行了心肌蛋白质消化的表现氧化。最初,扩展SCX梯度为16个步骤(补充表S2进行)以允许将类似的带电肽的聚类成馏分,从而避免稀释肽信号(补充图。S1)。然后可以对六个电荷分布进行分类(Fig. 1A)这些[KCl]用于所有进一步的SCX分级。 FT分布是偏置到左(负电荷)的唯一部分,其表明来自树脂的一些肽的静电排斥。主要是中性肽的有机洗涤(MECN)级分,最容易通过非充电介导的相互作用保留(IE。 Disperive)。 kyte-doolittle亲水性的计算(
      • Kyte J.
      • doolittle r.f.
      显示蛋白质水蛭特性的简单方法。
      )(估计Cys-So的亲水性值3H等同于Arg)显示FT中的肽比MECN洗涤剂(分别为-8.3和-2.3的平均亲水性)更亲水。鉴于两种级分显得相对亲水,我们试图通过将有机含量增加至50%来增加疏水肽的洗脱;然而,这并未增加在该级分中洗脱的肽的数量(数据未显示)。所有SCX洗脱步骤(1-100%KCl)可以细分为四个电荷分布(10%,25%,40和100%,反映了显示分布的最高KCl浓度; Fig. 1A)。 1-10%(“10%”)KCl分布含有几乎完全单电荷的肽,并且较高的[KCl]级分含有越来越多的带正电荷的肽。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1CYS-SO的解决方案3H肽来自表演氧化心肌提取物SCX。 A,六个总结SCX级分的肽的溶液中的溶液中的溶液分布绘制为每馏分的PSM的百分比; B,独特的肽作为所有级分中出现的总鉴定的百分比,绘制了总肽和Cys-so-so3H肽,遍布六个SCX分数; C,cys-so3H,焦蛋白,乙酰基改性和未修饰的肽,作为每馏分中鉴定的肽的百分比百分比。
      样品的复杂性,测量为每个分数中发现的总肽鉴定的百分比( Fig. 1B)表明,最复杂的是盐磨粒,这些级分具有84%的鉴定。然而,对于独特的Cys-so,它的类似图3H标识作为总数的百分比(Fig. 1B)表明初始分数含有71%的鉴定的CYS-SO3H肽 - 表明这些肽的良好选择进入相对较低的复杂性FT和MECN级分(补充表S2)。一般来说,我们观察到FT更丰富的Cys-So3h肽(Fig. 1C),含有72%的含有该修饰的标识,与MECN分数相比,具有43%的识别。所有盐部分都显示出较低的CYS-SO3H肽,含有含有改性的份数少于15%,其中大部分(〜55%)含有10%KCl级分。 FT和MECN级分中的许多非氧化肽含有PTM,例如胺乙酰化(蛋白N末端)和GLU和GLN的肽N末端的环化以形成Pyroglu。这些PTM减少了这些肽的溶液管料,并导致它们不受树脂保留。可以认为这些PTM还使肽更加疏水,这可能是为什么在MECN级分中观察到更大的百分比。因为甲硫氨酸也可以被氧化成甲硫氨酸亚砜(Metox)和甲硫氨酸砜(Meto2),我们检查了数据以确定是否使用我们的方法来富集这些蛋白肽。我们观察到没有证据表明其在SCX后的FT或Mecn分数中的富集,这是预期的,因为所遇到的氧化改性并不是理论上的电荷,因此,不会预期从SCX色谱中改变保留和洗脱。所有盐级分含有主要是未改性的胰蛋白酶肽。

       Hilic的正面选择改善了Cys-So3H肽鉴定

      鉴于FT和MECN级分中的主要污染肽是N-末端修饰,预期降低亲水性相互作用,我们探讨了HILIC的使用进一步丰富了CYS-SO3含有性氧化心肌提取物的H含肽(补充表S3)。 cys-so3通过SCX(FT,MECN)分级的H-修饰的肽在HILIC上保持良好,其通过增加含有增加的含水组合物的HILIC级分的肽光谱匹配(PSM)对这些肽表示(Fig. 2A),而其他肽相对耗尽。可能的例外是磷酸肽,其在早期SCX分数中是相对稀疏的污染物(<与N-末端改性和未改性的胰蛋白肽(〜20-30%的PSMS)相比,10%的PSMS)。用磷酸酶的样品进行预处理将减少这种效果;然而,我们选择限制考虑相对较小的磷酸肽对最终分析的样品处理步骤的数量(Fig. 2A)。有人指出,Cys-So的完整洗脱3 FT. 级分中的H肽需要比MECN级分的百分比百分比,需要使用48和43%H.2o分别。这再次突出了这两个SCX分数的群体的差异;即使在HILIC分级后,我们才观察到总数的15%和16%的CYS-SO3H肽与SCX FT和MECN分数之间的共享相匹配(补充表S3 )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2 HILIC. 分离积极选择CYS-SO3含H肽后SCX阴性选择。 A,来自未经修改/改性肽产生的总PSM百分比,随着水相增加; B,总Cys的百分比 - 所以3 HILIC. 富集后FT,MECN和10%KCl级分产生的H肽鉴定。插图显示在10%KCl部分中含有的肽细分,通过是否是含有他的含有遗漏的裂解/(R / K)-P位点。
      HILIC. 策略并不有助于进一步富集CYS-SO3H肽通过SCX分级成盐级分(补充图。S2A)。这些级分包含许多碱性肽,如Cys-So3H肽,将在HILIC上保留良好,并且在样品中具有更高的丰度。然而,色谱的额外尺寸会增加Cys-So的覆盖率3H位点在10%KCl级分中,包含〜10%的鉴定肽。这一部分包含~15%的独特Cys-So3H标识(Fig. 2B)这种肽种群几乎所有肽都含有额外的带正电荷的残留物。这是最常见的(58%),但也可能是错过的裂解(7%)或(r / k)-p网站(20%)的结果。随后的盐分形不那么少得多<1% of unique Cys-SO3在这些级分中观察到的H肽组合。鉴于这种缺乏额外的网站信息,决定进一步分析将集中于FT,MECN和10%KCL SCX分数。提出了开发方法的一般示意图 Fig. 3.
      图缩略图GR3.
      Fig. 3SCX-HILIC方法的示意图,用于富可逆氧化CYS(OXCYS)肽的富集。 肽样品通过SCX色谱法在水性缓冲液中初始结合允许含有Oxcys的肽的静电排斥和它们的阴性选择进入FT级分。随后用含有有机改性剂的水相洗涤将释放树脂保留的疏水性和中性氧化肽以及越来越多的中性非牛肽(例如 PTM肽)。低盐浓度的洗脱将洗脱含有碱性残基(H / K / R)的保留的oxcys肽,以及单电荷的胰蛋白肽,而增加的盐浓度将洗脱越来越阳性的胰蛋白肽。来自初始级分的牛蛋白肽可以通过HILIC色谱法呈正选择,其中它们在后后被保留而不是更疏水的PTM肽。

       富集cys-so2H / SO3h在h中的修改2O2 氧化心肌提取物

      表演酸是比蛋白质更强烈的氧化剂,其将在生物学上遇到,因此不仅导致硫醇的氧化,而且导致二硫化物的裂殖,否则相对惰性至氧化,因此完全反应Cys-So-So3 H。 一个更常见的CYS-SO3H通过Cys-Soh和Cys-So的顺序氧化2h,这是氧化剂如h的途径2O2。这是一个更少的效率反应,因此将形成更少的不可逆转修改,这些修改将包括CYS-SO2h和cys-so3 H。 因此,我们用高浓度H氧化的心肌蛋白质提取物测试了方案2O2 (10 mm)。选择天然蛋白质样品用于氧化,以:(1)保留由三维结构指定的任何Cys反应性(例如 PRX),这一旦变得变性; (2)防止氧化通常无法易于易用的位点2O2.
      以下SCX-HILIC分级和LC-MS / MS(Fig. 3),我们观察了119种含有不可逆转的氧化Cys的肽,其中14个观察到Cys-So2h,76作为cys-so3h,两种形式29(补充表S4)。 cys-so2H / SO3在10米以下观察到H肽m H2O2 与表演氧化肽类似氧化分馏,其中53%的独特CYS-SO2H / SO3H肽在FT中首先观察到,在MECN级分中观察到的另外的39%,并且在10%KCl馏分中仅为8%(Fig. 4A)尽管在尝试增加现场观察的10%KCl级分(与FT和MECN比较)的10%KCl级分(与FT和MECN相比)更广泛的分馏。 cys-so2H / SO3h肽从10米m H2O2-treated蛋白质也在HILIC上保持良好;然而,由于他们的丰富低,从来都不是多数人口,代表最多6-8%的独特PSM(Fig. 4B)。然而,这并不是估计这些PTM的富集程度的富集程度<2% of Cys residues (
      • 哈曼姆
      • 张T.
      • Hendrich S.
      • 托马斯J.A.
      蛋白质硫酸胍和磺酸的定量,细胞蛋白中不可逆转氧化的蛋白质半胱氨酸位点。
      ),而N-末端乙酰化例如发生在许多,如果不是大多数,蛋白质N末端。同样,最大的污染物是这些乙酰化蛋白N末端,以及N-末端焦蛋白和未改性的胰蛋白酶或非植物肽(例如 蛋白质c termini)。值得注意的是,随着观察CYS的总肽负载增加,即观察CYS-SO2H / SO3H在10米m H2O2-Treated样品(仍小于树脂的结合能力),观察到酸性肽的保留下降,特别是在MECN级分中,其中51%的未修饰的肽在其序列中含有两个或更多个酸性残基。减少加载和洗涤体积,以防止在较高载荷下增加亲水性分配,没有减少这种效果(数据未示出)。因此,最好利用具有更高负载能力的列(>100μg)由于它可能会降低这种效果并允许增加对低丰度点的观察。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4从心肌提取物产生的肽的分馏由10米氧化m H2O2. A,全部独特和独特的百分比 - 所以2H / SO3在每个部分中鉴定的H肽; B,psm与cys-so相对应2H / SO3 HILIC. 富含水相增加的H肽,总共百分比表示所有级分的平均值。
      h的生物范围2O2 concentration ([H2O2])是一个相当大的猜想的点,但是生理相关浓度的一般范围被认为是1-700 nm (
      • 石头J.R.
      • 杨科。
      过氧化氢:信号通信者。
      )上限为1-15μm 在某些组织中测量(
      • 施罗德E.
      • 伊顿P.
      作为内源介质的过氧化氢和心血管研究中的外源工具:问题和考虑。
      ),而病理浓度未被认为超过200μm (
      • 施罗德E.
      • 伊顿P.
      作为内源介质的过氧化氢和心血管研究中的外源工具:问题和考虑。
      )。因此,上述水平的测量不太可能在生理学上直接相关,并且可能导致相对不起的位点的氧化。更好地反映H的生理和病理范围2O2 浓度,从暴露于100n的大鼠心肌蛋白质中培养不可逆转氧化的Cys肽的分离m, 10 μm和100μm H2O2。在100 nm,观察到52个点(Fig. 5A补充表S4)有九个cys-so2h,27 cys-so3h和16 cys-so2H / SO3H网站。在更高的[h2O2]这种增加,72观察到10μm H2O2 (10 Cys-SO2H,35 Cys-So3h,和27个cys-so2H / SO3h)和86个位点100μm H2O2 (14 Cys-SO2h,49 cys-so3h,23 cys-so2H / SO3H)。总共观察到105个位点2O2 浓度,在所有三个中观察到大量(40个点)(Fig. 5B补充表S4)。在暴露于100μ的裂解物中也观察到许多独特的位点m H2O2 单独,或者在10μ之间共享m 和 100 μm concentrations.
      图缩略图GR5.
      Fig. 5 cys-so 2H / SO3含H氧化物肽的肽鉴定通过不同的氧化氧化[H.2O2]在对Langendorff灌注(NITC和I / R)进行的心肌组织中。 A,在每个样品中观察到的网站数,总网站,cys-so2h和cys-so3H网站表示; B,cys-so重叠2H / SO3H网站以100 n识别m, 10 μm和100μm H2O2.
      通过增加预提词步骤,即使在[h的测量位置,我们还能够观察不可逆Cys蛋白组的覆盖率增加2O2]少于四分之一的其他研究(
      • 李c.f.
      • Paull T.T.
      • 人M.D.
      使用长柱UPLC-PSRM的蛋白质组宽检测和定量分析不可逆半胱氨酸氧化。
      )。倡导没有预选的方法的主要原因是减少伪影,但随着所有色谱技术都在酸性pH下进行(<3)和在肽上,在提取和消化期间,伪像产生比预分泌物更容许发生。为了将该方法与外源氧化剂未治疗的组织中的现场测定,应注意,以避免在含有强达变性剂的溶液中进行萃取以在低pH下进行萃取来形成伪影(例如 洗涤剂),低pH烷基化试剂(
      • Paulech J.
      • solis n.
      • Cordwell S.J.
      肽基质谱法提供快速和特异性半胱氨酸烷基化的反应条件的表征。
      )和金属离子螯合剂。蛋白酶抑制性高度高,因为该方法对在方案中的任何阶段发生的非植物蛋白分解特别敏感。相反,该方法对不完全的胰蛋白酶切割也会敏感,这将增加CYS-SO的百分比2H / SO3H位于SCX盐级分的途径。为了确保低水平的错过胰蛋白酶切割,可以使用增加的胰蛋白酶/蛋白质比来消化。不幸的是,增加了pH,反应时间和消化的温度也将导致在N末端的焦蛋白的形成增加。通过昏指所可肽的FT / MECN级分的任何增加的污染应耐受腐蚀正确切割的CYS-SO2H / SO3 HILIC. 中这些部分中的来自Pygoglu的H远高于解决错过的切割CYS-SO2H / SO3H肽来自SCX盐级分中未改性的胰蛋白酶肽。

       富集cys-so2H / SO3心肌I / R损伤后的修饰

      用外源氧化剂治疗的蛋白质提取物/细胞仍然是病理学的可疑模型。因此,我们寻求破译方法是否可以通过Langendorff灌注将该方法应用于经受病理相关I / R损伤的心肌组织。 I / R损伤与急性氧化应激相关,特别是在早期再灌注期间,这被认为产生导致收缩功能障碍和最终凋亡和坏死的氧化蛋白损伤。我们对Cys的丰富进行了浓缩 - 所以2H / SO3来自大鼠心肌的含H肽对照灌注30分钟(“非缺血时间控制”NITC)或15分钟的无流缺血,15分钟再灌注(15i / 15r; I / R)。从NITC提取物中,我们观察到24个地点;五个cys-so2H,17个CYS-SO3h和两个cys-so2H / SO3H网站(Fig. 5A补充表S4)。在I / R之后,观测的网站的数量增加了>三倍(84个地方;八个CYS-SO2h,49 cys-so3h,和27个cys-so2H / SO3H网站)。在NITC样品中鉴定的24位点,在经过I / R的样品中鉴定为15。虽然我们没有进行定量分析(基于标签),但在这两种中,在I / R中观察到这些肽中的几个2h等等3H形式,可能表明较大比例的蛋白质池是不可逆转的氧化。此外,我们检查了FT,MECN和KCl级分的标识,以确定151/15R中不可逆的氧化性肽的增加也反映了NITC和15i之间未修饰/可逆的修饰性Cys-Peptides的比率的变化/ 15r。我们的样品制备方案使用NEM将NEM用于烷基化物未改性的CYS硫醇,然后使用随后的DTT / MMTS处理以以可逆改性的形式减少含有CYS的烷基化物肽。我们询问数据以检查含有Cys-Nem改性的肽(未修饰的Cys-poptides)和Cys-甲硫硫醚改性(可逆修饰的Cys-poptides)。在NITC心中,128(含有所有鉴定的Cys-Peptides的26.1%)可逆地改性含Cys的肽,339(69.0%)未修饰,而在15i / 15R之后,我们鉴定了243(38.0%)可逆修饰的Cys-paptides和313 (48.9%)未改性(数据未显示),其与I / R损伤期间的氧化环境一致。有人指出,在H中也观察到观察到作为不可逆地氧化的许多部位2O2 - 治疗提取物(62%重叠; 表I.)表示这些可能是病理学相关的,并且现场识别数与100μg观察到的那些非常相似m H2O2 sample (Fig. 5A)。在nitc组织中,重叠到h2O2-Treated提取物为42%,具有很大程度上代表丝丝/细胞骨架蛋白的独特肽,其在H中未观察到2O2 处理的样品,最有可能因为它们在没有变性剂的水溶液中的低溶解度。
      表I. Cys. -So的摘要2H / SO3与h相比,在Langendorff灌注心肌组织(NITC,I / R)中观察到H肽2O2 - 治疗的心肌样品。含有cys-so的蛋白质2H / SO3H PTM通过生物学功能聚集。如图所示观察到的位点,该数字表明观察:“2”硫酸“3”磺酸,“2,3”两种形式,“(2/3)”两种形式在同一肽上(双重改性肽)。 **表示在10米中观察到该网站m H2O2 只浓缩。所有识别都提供 补充表S4
      蛋白质标识符蛋白质描述肽序列 cys-so n H ( n = 2 or 3)
      NITC. I / R. H2O2
      糖酵解/葡萄糖新陈代谢
      Aldoa_rat.果糖 - 二磷酸醛糖酶a alanslacqgk.2,32,3
      TPIS_RAT.Triosephosphate异构酶clgelictlnaak.332,3
      IAVAAQNCYK.33
      IIYGGSVTGATCK.3
      g3p_rat.甘油醛-3-磷酸脱氢酶VPTPNVSVVDLTCR32,32,3
      f1m3e5_rat.无特征化蛋白质(甘油醛-3-磷酸脱氢酶家族)Ivsnasgitnclaplak.22,32
      m0r4q0_rat.无特征化蛋白质(甘油醛-3-磷酸脱氢酶家族)IIVSNASCTTNCLAPLAK.32,3
      Enob_rat.βenolase.vnqigsvtesiqack.2,32,3
      d4adu8_rat.丙酮酸激酶klhatcaegidvak.22
      kpym_rat.丙酮酸激酶PKM.aegsdvanavldgadcimlsgetak.33
      ldha_rat.l - 脱氢酶A链Vigsgcnldsar.2,32,3
      柠檬酸循环
      ODPB_RAT.丙酮酸脱氢酶E1组分亚单位βEgieFevinlr.33
      cisy_rat.柠檬酸合酶,线粒体LPCVAAK.2,32,3
      Acon_rat.贴氨酸水质酶,线粒体vgligsctnssyedmgr.32,32,3
      idhp_rat.异柠檬酸脱氢酶[NADP],线粒体CATITPDEAR.2,32,3
      vcvqtvesgamtk.2,32,3
      dhsa_rat.琥珀酸脱氢酶[泛醌]黄酮蛋白亚基vgsvlqegcek.33
      mdhc_rat.苹果酸脱氢酶,细胞质enfscltr.33
      vivvgnpantncltask.2,32,3
      mdhm_rat.苹果酸脱氢酶,线粒体EGVIECSFVQSK.32,32,3
      eattyfstplllllgk.2,32,3
      gcdvvvipagvpr.2,32,3
      gylgpeqlpdclk.32,3
      电子传输/ ATP合成
      ATP5H_RAT.ATP合成酶亚单位D,线粒体ncaqfvtgsqar.2,32,3
      ATP5E_RAT.ATP合成酶亚单位εε,线粒体FSQICAK3
      etfa_rat.电子转移黄酮蛋白亚基α,线粒体lggevsclvagtk.32,3
      qcr1_rat.细胞色素B-C1复杂亚基1,线粒体lctsatesevtr.32,32,3
      yfydqcpavagygpieqlsdynr.2,3**
      qcr2_rat.细胞色素B-C1复杂亚基2,线粒体 nalanplycpdyr.32,3
      COX5B_RAT.细胞色素C氧化酶亚单位5b,线粒体cpncgthyk.3
      b2ryw3_rat.NADH脱氢酶(Ubiquinone)1 beta子追容9afcappaylthr.33
      ndus1_rat.NADH泛醌氧化还原酶75 kda亚基avtegaqaveepsic.3
      脂肪酸/氨基酸代谢
      Acads_rat.短链特异性酰基-CoA脱氢酶,线粒体Igcfalsepgngsdagaasttar.333**
      igiasqalgiaqasldcavk.3
      Acadv_rat.非常长链特异性酰基 - COA脱氢酶ssavpspcgk.2,32,3
      Acadl_rat.长链特异性酰基-CoA脱氢酶cigaiamtepgagsdlqgvr.2,32,3
      Accm_rat.中链特异性酰基 - COA脱氢酶mteqpmmcaycvtepsagsdvagik.2,3
      echm_rat.Enoyl-CoA水解酶,线粒体tfqdcysgk.33
      Thil_rat.乙酰-CoA乙酰转移酶,线粒体qatlgaglpiatpcttvnk.33
      mcat_rat.肉碱/酰基碱载体蛋白cllqiqassgk.3
      aatc_rat.天冬氨酸氨基转移酶,细胞质scasqlvlgdnspalr.2,32,3
      aatm_rat.天冬氨酸氨基转移酶,线粒体tcgfdfsgaledisk.32,32,3
      vgaftvvck.33
      MMSA_RAT.甲基丙酸酯 - 半醛脱氢酶cmalstavlvgeak.22,32,3
      vcnlidsgak.32,3**
      dcmc_rat.Malonyl-CoA脱羧酶,线粒体tpapaegqcadfvsfygglaeaqr.3
      Aldh2_rat.醛脱氢酶,线粒体llcgggaaaadr.32
      Fabp4_rat.脂肪酸结合蛋白cdafvgtwk.32,3
      毫丝或细胞骨架
      ACTC_RAT.Actin,α心肌1cddeettalvcdngsglvk. 2,32
      Acta_rat.肌动蛋白,主动脉平滑肌MCEEDSTALVCDNGSGLCK.(2/3)
      Actb_rat.肌动蛋白,细胞质1dddiaalvvdngsgmck3
      Llcyvaldfeqemataasssslek.2,3
      actg_rat.肌动蛋白,细胞质2Eeeiaalvidngsgmck.33
      meeeiaalvidngsgmckagfagddapr.
      acth_rat.actin,γ肠道平滑肌ceeettalvcdngsglckagfagddapr.2
      mceeettalvcdngsglckagfagddapr.(2/2)
      CAPZB_RAT.F-肌动蛋白封蛋白亚单位βmsdqqldcaldlmr.3
      myl3_rat.肌球蛋白轻链3Itygqcgdvlr.333
      lmagqedsngcinyafvk.3
      myh10_rat.肌球蛋白10.Kdqsilctgesgagk.33
      myh6_rat.肌球蛋白6.CIIPNER.23
      CNGVLEGIR.2
      mypc_rat.肌苷结合蛋白C,心脏型dqavfkcevsdenvr.3
      myo1e_rat.非常常规的肌球蛋白ENQCVIISGESGAGK.3
      tpm1_rat.Tropomyosin alpha-1链caeleeelk.2,3
      vime_rat.vqvqsltcevdalk.3
      离子运输
      IRK11_RAT.ATP敏感的内整流钾通道11 lcfmlr. 3
      ADT1_RAT.ADP / ATP摇易氧电脑1efnglgdcltk.2,32,3
      gadimytgtvdcwr.32**,3
      ADT2_RAT.ADP / ATP易位态2YFAGNLASGGAAGATSLCFVYPLDFAR.3
      AT2A2_RAT.肌肉/内质网钙ATP酶2vgeatetaltclvesk.32**,3
      AT2A3_RAT.肌肉/内质网钙ATPase 3cgqfdglvelationalcndsaldeak.3
      MPCP_RAT.磷酸盐载体,线粒体gwaptligysmqlck.33
      反应压力/缺氧/罗斯
      hspb8_rat.热休克蛋白β8ADGQLPFPCSYPSR.3
      ch60_rat.60 KDA热休克蛋白,线粒体aaveegivlgggcallr.33
      prdx5_rat.过氧杂志5,线粒体GVLFGVPGAFTPGCSK.333
      prdx6_rat.过氧杂志6.dftpvcttelgr.332,3
      d4add7_rat.戊外毒毒素5同源物(预测),异紫杉CRAgtpeqpqcgfsnavvqilr.32**,3
      各种功能/功能未知
      rs28_rat.40s核糖体蛋白S28tgsqgqctqvr.3
      kcrm_rat.肌酸激酶m型FCVGLQK. 33
      KCRS_RAT.肌酸激酶S型,线粒体Lyyiltcpsnlgtglr.2,32,3
      cfai_rat.补充因子I.sgvcipnqr.33
      ES1_RAT.ES1蛋白质同源物,线粒体kpiglcciapvlaak.33
      muc2_rat.粘蛋白2.GRCVPLSK.22
      HBB1_RAT.血红蛋白亚基Beta 1eftpcaqaafqk.332,3
      d3za85_rat.组蛋白细胞周期调节缺陷相互作用蛋白5lqgsctscpssiitlk.3
      g3v8s8_rat.苏西醇结合蛋白dgfcmsgsitak.3
      nhrf2_rat. NA. +/ H +交换监管辅因子NHE-RF2qltctiemahr.2,33
      d3zqw1_rat.蛋白质BLMCSSMLKDLDDDSDK.2
      e9pt83_rat.蛋白质CENPF.Lecmlsectalcenk.(2/3)
      d3zse6_rat.蛋白质DFNB59.RETVYGCFQCSVDGVK.3
      E9PU13_RAT.蛋白质SNX4.Eylfyaealravcr.2
      f1lu05_rat.无表达蛋白质syeqqcieelr.2
      已经提出了不可逆的蛋白质氧化,尤其是丝丝蛋白,作为I / R后心肌收缩性降低的潜在原因(
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      (2006)冠状动脉微栓塞后对冠状阴性素和心肌功能障碍的氧化改性。
      )。丝丝或细胞骨架似乎是一个不可逆的Cys氧化的部位,有七个Cys-So2H / SO3H位丝丝/细胞骨骼蛋白质中包含的Nitc样品中含有,并在I / R之后的12个蛋白质上增加到17个位点(表I.补充表S4)。执行功能群集时(补充图S3),也观察到几种其他簇状物。最具代表性的群体含有线粒体蛋白,可能因为线粒体在氧化剂产生中的作用以及它们在心肌组织中的高丰度。第二个过度代表的簇是氧化还原酶,因为它们在电子传输中的作用可能使它们易于氧化,特别是那些含有金属中心的蛋白质或参与氧化剂排毒的蛋白质(例如 prx)。进一步的子聚类表明能量利用途径过度代表(表I.),包括参与糖酵解(6/9酶)的蛋白质,柠檬酸盐循环(6/7酶),电子传输链(ETC)/ ATP合酶(九种蛋白)和脂肪酸/氨基酸代谢(13个蛋白)。有趣的是,我们观察到他们的Cys氧化状态跨越NITC和I / R是完全不同的。虽然糖酵解酶含有cys-so 2H / SO3即使在NITC组织中,柠檬酸盐循环酶和电子传输/ ATP合酶酶也仅观察到含有CYS-SO2H / SO3h修改I / R(或H.2O2 治疗)。这可能是因为它们不同的亚细胞定位,即细胞质 相对 对于参与脂肪酸或氨基酸代谢的蛋白质没有观察到类似的趋势,其中许多也位于线粒体中,并且仍然观察到在NITC组织中氧化。
      在研究的所有条件下(NITC,I / R和H.2O2 治疗),181个CYS-SO2H / SO3观察到H站点,这构成了目前在文献中透露的最大不可逆转的CYS网站。有趣的是,每个条件下的总网站识别~30-50%含有Cys-So2h,而在cys-so中可以监测更多(70-80%)3h形式(Fig. 5A)。这可能是因为:(1)Cys-So2H更有效地氧化给Cys-So3h比cys-soh是cys-so2H;或(2)CYS-SO3h为分配提供更好的光谱特性。观察到Cys-So2H肽总Cys的百分比 - 所以2H / SO3h识别与[h]负相关2O2]可能表明前者是一种可能性(I / R坐在10到100μm之间m H2O2 样本)。虽然,随着NITC样本的最低CYS-SO2H%的CYS-SO2H / SO3H标识(类似于10米m H2O2)这可能表明,在低强度下的光谱分配可能更好的CYS-SO3 H。
      然而,我们的技术可能与ITRAQ / TANDEM MASS标签(TMT)兼容,因为这些标签为每个N个末端和LYS修改时增加了额外费用。这基本上将所有肽的溶液中的溶液态转移到两种以液体结尾的肽,以及一个用于arg的那些。这是这个因素(lys 相对 Arg肽电荷,导致Arg肽的共洗脱含有一些含有的Cys-so-so2H / SO3h(以百分比或含有他的那些),它将具有相同的溶液电荷,但具有巨大的丰度。因此,通过使用无标签定量的独立样本分析,对这些修改的定量分析可能是最成功的(例如 光谱计数),MS前体区域,或用于这些兼容细胞和组织类型,基于标记的量化,不会改变肽的电荷或亲水性(例如 细胞培养中氨基酸稳定同位素标记[硅胶])。另外,观察Cys-So2H / SO3H肽通过它们极低的丰度更加难以更加较大,因此可以通过诸如OXMRM等技术进行减少/可逆氧化/不可逆氧化形式的降低/可逆氧化/不可逆氧化形式的部位化学计量
      • 举行。
      • Danielson S.R.
      • Behring J.B.
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      • 布里顿D.J.
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      • 吉布森B.W.
      使用差分烷基化和多重反应监测质谱法对内源蛋白的位点特异性半胱氨酸氧化的靶向定量。
      ),专门针对无标签定量的小站点的小区,但需要先验的修改位的知识。最近的工作试图通过采用Cystmtraq来消除非型/可逆修改的氧化还原网站的一些问题(
      • 帕克J.
      • BANMANT K.
      • 朱F.
      • 朱恩
      • 陈S.
      Cys. tmtraq - 一种基于非偏析的硫醇的氧化还原蛋白质组学的一致方法。
      )确定关于蛋白质周转的氧化还原改性肽丰度的变化。
      为了我们的知识,这也是唯一的蛋白质组学学习,以丰富CYS-SO2H / SO3含H组织的肽,其尚未受到外源氧化剂的添加。观察到的网站对已知在各种条件下修改的逆转性Cys的地点很好(
      • Paulech J.
      • solis n.
      • Edwards A.v.
      • Puckeridge M.
      • 白色m.y.
      • Cordwell S.J.
      通过施加到心肌氧化还原蛋白质的硫醇二硫化物交换含有可逆氧化半胱氨酸的大规模捕获肽。
      ),表明在这些CYS网站上发生多种PTM,包括可逆和不可逆的形式。使用注释网站数据库(redoxdb(
      • 太阳m.a.
      • 王Y.
      • 程H.
      • 张Q.
      • GE W.
      • 郭D.
      RedoxdB - 用于实验验证蛋白氧化改性的策划数据库。
      ))来自多种生物的综合研究,我们观察到40%的CYS-SO2H / SO3h位点在先前识别的可逆修饰的Cys上发生,另外12%发生在先前已识别为在未知位点(以下)修饰的氧化还原(补充表S4)。扩展该分析,包括我们最近在心肌中的可逆修饰CYS的研究(
      • Paulech J.
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      • Edwards A.v.
      • Puckeridge M.
      • 白色m.y.
      • Cordwell S.J.
      通过施加到心肌氧化还原蛋白质的硫醇二硫化物交换含有可逆氧化半胱氨酸的大规模捕获肽。
      ),我们看到只有20%的CYS-SO2H / SO3H修改位于完全新颖的氧化还原网站的地点, IE。 尚不清楚可通过可逆Cys PTM占用(补充表S4 )。

      结论

      cys-so 2H / SO3H网站特别感兴趣,因为它们可能代表具有高反应性或独特的微环境的Cys残留物,促进Cys-Soh稳定和对更高氧化态的反应。我们利用含有Cys-So的胰蛋白酶肽的独特特征2H / SO3h基于顺序产生一种新方法:(1)使用SCX的静电排斥(其与大量胰蛋白肽分离)的静电排斥;然后(2)使用HILIC的亲水性相互作用的阳性选择(从SCX FT和MECN级分中增加了与含有其他PTM肽的分离)。增加的分馏允许观察更多的位点,而且还允许增加起始材料。这提高了MS数据/光谱分配的质量,并在识别低丰度网站方面具有潜在的帮助。利用这一战略,我们观察了181个Cys-So2H / SO3心肌组织提取物中的H位点,用生理到病理水平治疗H.2O2,或通过生物学相关生成 离体 Langendorff灌注。大多数cys-so2H / SO3H残留物位于先前被识别为可逆CYS修改的识别的网站,增加了这些网站上Cys PTM的多样性。此外,我们表明,即使是简短的I / R损伤也会诱导心肌蛋白质的显着过度氧化,这与I / R期间假定发生的氧化损伤一致。许多靶标的氧化蛋白损伤可能是对收缩功能障碍的重要因素,并且可能是导致肌细胞凋亡和坏死的途径的主要因素。该技术广泛适用于各种样品类型和生物处理,允许发现Cys-So的目标2H / SO3H PTM通过接触ROS / RNS引起的。

      补充材料

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