微粒蛋白质组学与氧化硅酸盐量化(PROMIS-QUAN):一种新型血浆生物标志物定量蛋白质组学方法* [S]

  • 米奇哈尔
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    来自人类分子遗传学和生物化学系,Sackler医学系,特拉维夫大学,特拉维夫,以色列;
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    §分子药理学,rappaport医学研究所,Technion,Haifa,以色列;
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    §分子药理学,rappaport医学研究所,Technion,Haifa,以色列;
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  • 泰勒·莱格尔
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    来自人类分子遗传学和生物化学系,Sackler医学系,特拉维夫大学,特拉维夫,以色列;
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  • 作者脚注
    *这项工作由以色列科学基金会资助(授予1617/12),并由以色列研究卓越计划(I-Core,复杂人类疾病中心的基因调节中心第41/11号)。
    [S] 本文包含补充图。 S1至S4和表S1至S6。
      “微粒的蛋白质组学,具有超稳定同位素标记的细胞培养物(Silac)定量中的氨基酸,一种新型质谱基的血浆微粒蛋白质量化。 PROMIS-QUAN启用两步相对和绝对的SILAC量化。首先,相对于由不同起源组成的细胞系组成的超硅酸混合物量化等离子体微粒蛋白质蛋白质。接下来,相对于超硅酸混合物量化感兴趣的所选蛋白质的绝对量。我们向前列腺癌应用了ProMis-Quan,并比较了健康个体和前列腺癌患者的血浆微粒样本。我们在总共5374个血浆微粒蛋白中鉴定,并揭示了在患者衍生的血浆微粒中升高的三种蛋白质的预测标志。最后,PROMIS-QUAN能够在治疗时确定前列腺特异性抗原(PSA)的绝对定量变化。我们向普鲁逊 - 泉作为生物医学研究和临床世界中的生物标志物发现,验证和量化的创新平台。
      血浆中的生物标志物发现是蛋白质组学领域的神圣制剂之一,朝着非侵入性诊断/预后测试的发育(
      • 汉尚三
      • Pitteri S.J.
      • Faca v.m.
      采矿血浆蛋白质组癌生物标志物。
      )。为实现这一目标,蛋白质组学需要综合血浆蛋白质组,精确的蛋白质组定量,结合相对较短的分析时间来实现多种样本比较。然而,基于MS的生物标志物发现受到等离子体的庞大动态范围的限制,超过11个数量级(
      • 安德森N.L.
      • 安德森N.G.
      人血浆蛋白质组:历史,性格和诊断前景。
      ,
      • 张Q.
      • Faca V.
      • 汉尚S.
      在七种蛋白质丰富日志中挖血蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质组。
      ),其导致掩盖核心血浆蛋白含有潜在的生物标志物的“组织泄漏”蛋白质。已经使用两种主要的互补策略来达到低丰度蛋白质:(i)靶向蛋白质组学,其中MS仅识别和量化预定的肽,从而避免了系统的固有趋势,优先检测丰富的蛋白质的固有趋势。这种方法用于验证预选的候选标记(
      • kuzyk m.a.
      • 史密斯D.
      • 杨杰。
      • 十字架。
      • 杰克逊上午
      • Hardie D.B.
      • 安德森N.L.
      • 博赫斯C.H.
      基于多重反应监测,多路复用,人血浆中45个蛋白的绝对定量。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 林C.
      • 肯尼迪J.
      • 侯L.
      • tr
      • Sokal I.
      • 闫诗
      • Schoenherr r.m.
      • 赵L.
      • Voytovich U.J.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • Krasnoselsky A.
      • Gafken P.R.
      • Hogan J.M.
      • 琼斯L.A.
      • 王P.
      • Amon L.
      • Chodosh L.A.
      • 尼尔森第3升
      • McIntosh M.W.
      • Kemp C.J.
      • Paulovich A.G.
      基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
      ,
      • Burgess M.W.
      • Keshishian H.
      • MANI D.R.
      • Gillette M.A.
      • carr s.a.
      通过靶向质谱法在非常高的多重低丰度蛋白质的简化有效地定量。
      )。 (ii)血浆分馏,其生物化学降低了蛋白质谱的复杂性,并能够发现新的生物标志物(
      • OPENN G.S.
      • 国家D.J.
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      • APWEILER R.
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      • SIMPSON R.J.
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      • Speicher D.W.
      • 汉尚三
      Hupo等离子蛋白质组项目的概述:试验阶段的结果与35个合作实验室和多个分析组,产生3020蛋白的核心数据集,以及公开的数据库。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 张H.
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      • 方罗。
      • Piening B.D.
      • 冯L.C.
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      • 营2nd,D.G.
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      • 瓦特J.
      • 史密斯r.d.
      • McIntosh M.W.
      • Paulovich A.G.
      血清分馏技术的头部比较。
      )。
      靶向的MS分析由所选反应监测方法主导,通常与抗体的蛋白质或肽的富集组合,稳定同位素标记的定量标准(
      • 安德森N.L.
      • 安德森N.G.
      • 海南L.R.
      • Hardie D.B.
      • Olafson R.W.
      • Pearson T.W.
      使用稳定同位素标准品和抗肽抗体捕获(SISISCAPA)的肽和蛋白质的质谱定量。
      )。这种方法受益于三级 - 四极乐器的灵敏度和定量能力。其主要限制是,它依赖于使用基于广泛的组织/细胞线的分析和潜在生物标志物的预测来依赖于血浆样品内的候选物的发现。分馏策略通过耗尽最丰富的血浆蛋白质,和/或通过蛋白质和肽的广泛生化分离来降低血浆的复杂性和动态范围。虽然这些分馏方法能够识别成千上万的血浆蛋白质(
      • OPENN G.S.
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      • Speicher D.W.
      • 汉尚三
      Hupo等离子蛋白质组项目的概述:试验阶段的结果与35个合作实验室和多个分析组,产生3020蛋白的核心数据集,以及公开的数据库。
      ),显着降低了该方法的吞吐量,从而降低了对临床研究的适用性。
      一个不同的分馏方法涉及分离血浆微粒和外泌体。微粒是大的囊泡(100nm-1μm),其直接从质膜突出,而外泌体较小(40-100nm)并且源自称为多重内体的内吞室。这些微铅由所有细胞类型组成落入血液中,携带其原产地的蛋白质组签名(
      • voloshin t.
      • 颤抖E.
      • sh
      小但强大:微粒作为肿瘤进展的介质。
      )。微粒在各种条件下介导局部和全身沟通,特别是在癌症中,他们可以促进转移,免疫疾病的癌细胞和血管生成(
      • voloshin t.
      • 颤抖E.
      • sh
      小但强大:微粒作为肿瘤进展的介质。
      ,
      • Iero M.
      • Valenti R.
      • Huber V.
      • Filipazzi P.
      • 巴黎加
      • 芬士州S.
      • Rivoltini L.
      肿瘤释放的外泌体及其对癌症免疫的影响。
      ,
      • Somasundaram R.
      • her
      黑色素瘤外泌体:转移信使。
      ,
      • C.
      • Zitvogel L.
      • Amigorena S.
      外泌体:组成,生物发生和功能。
      ),但也在其他条件下包括自身免疫性疾病(
      • Buzas e.i.
      • Gyorgy B.
      • NAGY G.
      • FALUS A.
      • 同性恋者。
      细胞外囊泡在炎症性疾病中的新兴作用。
      )和心血管障碍(
      • loyer x。
      • VION A.C.
      • Tedgui A.
      • 伯兰杰下午
      微胶囊作为心血管疾病中的细胞 - 细胞信使。
      )。因此,循环血浆微粒蛋白质组学可以揭示各种疾病的生物标志物作为进一步诊断测试发育的基础。
      血浆微粒蛋白质蛋白酶的分析 等等。 2005年,通过使用二维(2D) - 凝胶的分析,然后进行基质辅助激光解吸电离 - 飞行时间(MALDI-TOF)MS分析,导致鉴定83个蛋白质(
      • j
      • Drwal G.
      • Bourgeois T.
      • Saltz J.
      • 吴h
      不同血浆微粒的不同蛋白质组特征。
      )。在接下来的几年中,血浆微粒的低分辨率MS分析达到229个血浆微粒蛋白和高分辨率MS分析达到458个蛋白质(所有没有虚假发现率(FDR)
      使用的缩写是:
      FDR.
      假发现率
      PROMIS-QUAN.
      具有超级硅酸量化的微粒的蛋白质组学
      萨拉克
      稳定同位素用细胞培养中的氨基酸标记
      clmp.
      细胞系微粒
      PSA.
      前列腺特异性抗原
      DMEM.
      Dulbecco的改良鹰媒体
      RPMI.
      罗斯威尔公园纪念研究所
      FBS.
      胎牛血清
      UHPLC
      超高效液相色谱
      FWHM
      半最大宽度。
      1使用的缩写是:FDR.
      假发现率
      PROMIS-QUAN.
      具有超级硅酸量化的微粒的蛋白质组学
      萨拉克
      稳定同位素用细胞培养中的氨基酸标记
      clmp.
      细胞系微粒
      PSA.
      前列腺特异性抗原
      DMEM.
      Dulbecco的改良鹰媒体
      RPMI.
      罗斯威尔公园纪念研究所
      FBS.
      胎牛血清
      UHPLC
      超高效液相色谱
      FWHM
      半最大宽度。
      correction)(
      • smalley d.m.
      • 根K.E.
      • 町H.
      • 罗斯m.m.
      • ley k。
      在人血浆衍生但不是血小板衍生的微粒中表达21种蛋白质的蛋白质组学发现。
      ,
      • 小西
      • smalley d.m.
      • 哈敦N.L.
      • ley k。
      血浆微粒蛋白质组。
      )。最新,最全面的血浆微粒蛋白质剖面研究于2012年由Ostergaard发表 等等。,在LTQ orbitrap XL质谱仪上分析了12个样品,并在1%FDR校正后,总共鉴定了536个蛋白质(
      • Ostergaard O.
      • 尼尔森C.T.
      • Iversen L.v.
      • 雅各布森S.
      • Tanassi J.T.
      • Heegaard N.H.
      正常人循环微粒的定量蛋白质组分析。
      )。其他研究已经突出了衍生自血浆以外的各种体液的微粒和外泌体的蛋白质组,包括尿液(
      • Pisitkun T.
      • 沉R.F.
      • Knepper M.A.
      人类尿液中外来体的鉴定和蛋白质组学分析。
      ), 唾液 (
      • Gonzalez-Begne M.
      • 卢B.
      • 汉X.
      • Hagen F.K.
      • 手A.R.
      • Melvin J.E.
      • yates j.r.
      多维蛋白质识别技术(Mudpit)人腮腺外来蛋白质组学分析。
      ),脑脊髓液(
      • 街道街。
      • 巴兰P.E.
      • Mackay C.L.
      • Weidt S.
      • Balmforth C.
      • 沃尔斯。
      • Chalmers R.T.
      • 韦伯D.J.
      • 亲爱的J.W.
      人脑脊髓液中外来体的鉴定和蛋白质组学分析。
      ),母乳(
      • Admyre C.
      • 约翰逊三世
      • QAZI K.R.
      • Filen J.J.
      • Lahesmaa R.
      • 诺曼姆
      • Neve E.P.
      • Scheynius A.
      • 加布里尔森S.
      具有免疫调节特征的外泌体存在于人母乳中。
      ), 羊水 (
      • 凯勒斯。
      • RUPP C.
      • 斯托克A.
      • runz s.
      • Fogel M.
      • 卢特S.
      • HAGER H.D.
      • Abdel-Bakky M.S.
      • Gutwein P.
      • Altevogt P.
      CD24是分泌到尿液和羊水中的外泌体的标记物。
      ), 精液 (
      • 波利亚科夫A.
      • Spilman M.
      • Dokland T.
      • amling c.l.
      • Mobley J.A.
      人体精液中外渗囊泡(前列腺囊泡)的结构异质性和蛋白质组成。
      ), 和更多。然而,尽管分析物的动态范围急剧减少,但到目前为止,它还没有提供足够的生物标志物发现深度。尽管如此,它对发现生物标志物有很好的前景。例如,乳腺癌患者的生化分析患者白细胞衍生的微粒在增加的肿瘤大小和癌胚 - 抗原(CEA)和癌症抗原水平增加之间相关,其用于结肠癌和乳腺癌的两种众所周知的预后标志物(CA15-3) , 分别 (
      • B.
      • Nieuwland R.
      • Liebhardt S.
      • DITCH N.
      • Steinig K.
      • 斯德伯P.
      • 排名A.
      • Gohring P.
      • thaler c.j.
      • 弗里斯克。
      • Bauerfeind I.
      乳腺癌患者中的循环微粒:具有成立生物标志物的对比分析。
      )。
      结合上述所有等离子体蛋白质组学方法,已经报道了人血浆蛋白质组的几种显着的调查。第一个大规模的协作研究由人蛋白质组织(HUPO)组进行,其中集体鉴定了3020个蛋白质(
      • OPENN G.S.
      • 国家D.J.
      • Adamski M.
      • Blackwell T.W.
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      • eddes J.S.
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      • 莫里茨R.L.
      • Chan D.W.
      • rai a.j.
      • Admon A.
      • Aeberberold R.
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      • 浩秀S.A.
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      • ping p.
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      • Adkins J.
      • 钱X.
      • 王R.
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      • wu c.y.
      • 赵X.
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      • Archakov A.
      • Tsugita A.
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      • Pandey A.
      • Pisano M.
      • 安德鲁斯P.
      • 夯实H.
      • Speicher D.W.
      • 汉尚三
      Hupo等离子蛋白质组项目的概述:试验阶段的结果与35个合作实验室和多个分析组,产生3020蛋白的核心数据集,以及公开的数据库。
      )。在考虑到多个假设控制后,这些后来缩合到889个非冗余蛋白的列表中,在蛋白质识别中至少有95%的置信度(
      • 国家D.J.
      • OPENN G.S.
      • Blackwell T.W.
      • 费尔明D.
      • ENG J.
      • Speicher D.W.
      • 汉尚三
      从Hupo血浆蛋白质组织协作研究中收集的数据衍生高信心蛋白质标识的挑战。
      )。肽阿特拉斯团队最初组合了91项研究,包括由Hupo进行的研究,并完全制作了1929年蛋白质的列表(
      • Farrah T.
      • 德意曲e.w.
      • OPENN G.S.
      • 坎贝尔D.S.
      • 太阳Z.
      • Bletz J.A.
      • Mallick P.
      • 凯茨J.E.
      • Malmstrom J.
      • Ossola R.
      • 瓦特J.D.
      • 林B.
      • 张H.
      • 莫里茨R.L.
      • Aeberberold R.
      具有估计含量浓度的高信心人血浆蛋白质组参考。
      )。最近,这支球队通过组装127项研究制定了调查(
      • Farrah T.
      • 德意曲e.w.
      • OPENN G.S.
      • 太阳Z.
      • 瓦特J.D.
      • Yamamoto T.
      • Shteynberg D.
      • 哈里斯米。
      • 莫里茨R.L.
      通过PeptidAtlas观察的2013年人类蛋白质组的状态:将肾脏,尿液和血浆蛋白质组比较生物和疾病驱动的人蛋白质组项目。
      )到目前为止,达到了总体3677年血浆蛋白的最大的高信N信任名单。
      在目前的工作中,我们应用了艺术蛋白质组学的状态,以研究微粒蛋白质组,并用超级硅酸量化(PROMIS-QUAN)方法开发了微粒的蛋白质组学,它将超过3200个蛋白质的深血浆微粒覆盖在一次运行中结合,用细胞培养(硅酸)定量氨基酸与双模相对稳定同位素标记。我们证明了其对前列腺癌患者样品的利用,并计算了众所周知的前列腺癌生物标志物的PSA绝对量。

      实验步骤

       血浆微粒萃取

      从健康的男性供体和前列腺癌患者中收集血液样品,该癌症患者在放射治疗治疗前两个月开始激素抗雄激素(GNRH激动剂)治疗。在放射治疗前服用每位患者的第一个血液样品;在第一次辐射处理后24小时进行第二次血液试验;第三次辐射处理后2周进行第三种测试。与放射疗法平行,患者随着荷尔蒙治疗恢复。在制度伦理批准时收集所有样品。
      通过以1500×离心离心分离血浆 g 在4℃下10分钟,然后在-80℃下对上清液和储存等离子体上清液的第二离心。为了将微粒分离,血浆样品在冰上中被解冻,以避免在它们与等离子体样品中分离之前裂解微粒,然后在400℃下以4000rpm离心20分钟。上清液在冰冷的PBS中双重稀释,并以20,000×离心 g 在4℃下1小时。用冰冷的PBS洗涤颗粒并再次以20,000×再离心 g 在4℃下1小时。微粒颗粒的溶解是在含有6的裂解缓冲液中进行的 m 尿素,2 m thiourea in 50 mm 碳酸氢铵。从健康供体中的每种微粒样品从〜3ml等离子体中提取。来自前列腺癌患者的微粒和该实验的健康对照中提取0.5mL等离子体。

       超级硅酸混合物的制备

      通过培养MDA-MB-231,Hela,HepG2,RKO和U2OS细胞在硅酸盐-DMEM中进行硅酸盐标记,即DMEM缺乏天然赖氨酸和精氨酸并补充 13C615N2-Lysine, 13C615N4-Arguginine,透析的FBS和抗生素。 LNCAP和Jurkat细胞以硅酸rpmi标记,具有相同的补充剂。标记为氨基酸购自Cambridge Isotope实验室。将细胞培养超过10个在氧化硅酸介质中的倍增,以获得完全标记,并通过单独的LCS / MS分析检查该掺入。通过裂解细胞颗粒在6中获得裂解物超硅酸混合物 m 尿素,2 m thiourea in 50 mm 碳酸氢铵。对于沉淀和CLMP萃取,将细胞在无碱性无血清培养基中培养48小时,然后在室温下以4000rpm离心20分钟。克切片样品的上清液在8中稀释1:1 m 胰蛋白酶消化前的尿素。对于CLMP萃取,培养基在冰冷的PBS中稀释,然后高速离心(1小时为20,000× g 在室温下)。然后将微粒粒料溶解在6中 m 尿素,2 m thiourea in 50 mm 碳酸氢铵。在初步实验中使用Bradford蛋白质测定,并显示出1ml血浆导致〜10μg微粒蛋白。超级硅胶和微粒蛋白(1:1比率)的组合基于该计算。

       胰蛋白酶消化和LC-MS / MS分析

      所有样品(带有或没有超级硅胶标准标准的微粒蛋白,PSA校准曲线样本)减少1米m DTT,然后用5米烷基化m 碘乙酰胺和随后的3H消化用内蛋白酶Lys-C(Wako Chemicals,Osaka,Japan; 1:100酶至蛋白质比)。裂解物在50米处稀释四倍m 用测序级改性胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi; 1:50给蛋白质比例,用序列碳酸氢铵和消化过夜。得到所得肽用TFA酸化,随后在C-18颗粒上纯化(
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      使用缘物的微纯化,富集,预分化和肽的肽储存的方案。
      )。
      对易于Q-辐射或Q-辐射加质谱仪(Thermo Scientific)(Thermo Scientific)(Thermo Scientific)(Thermo Scientive)进行LC-MS / MS分析进行了分析
      • Michalski A.
      • 达莫e.
      • Hauschild J.P.
      • lange O.
      • Wieghaus A.
      • Makarov A.
      • Nagaraj N.
      • Cox J.
      • 角horn
      基于质谱的蛋白质组学使用Q辐射,高性能台式四轴锻体质谱仪。
      )通过易喷雾电离源。肽加载到75μmi.d. ×50厘米长的易于喷涂薄膜柱(Thermo Scientific)填充2μmc18 颗粒100孔径,使用300nl / min的流速使用4小时梯度,用缓冲液A(0.1%甲酸)并使用7-28%缓冲液B(80%乙腈,0.1%甲酸)分离。使用前10个方法以数据相关模式获取MS数据。 MS Spectra以70,000分辨率获得, m/z 范围为300-1700,目标值为3e + 06离子,最大喷射时间为20 ms。在HCD碎片后获得MS / MS光谱,常规碰撞能量(NCE)为17,500分辨率1E + 05离子的目标值和100ms的最大喷射时间。使用5E + 05离子和60 ms的最大喷射时间进行超硅酸型型的比较。动态排除设置为20或30秒。所有MS测量都在正离子模式下进行。列出了基于单肽的蛋白质鉴定 补充表S1。这些肽的MSMS光谱被上传到骄傲(下面的链接)。

       计算分析

      使用maxquant进行分析原始MS文件(
      • Cox J.
      MaxQuant使高肽识别率,个性化p。 p。 B.范围质量精度和蛋白质全组蛋白质量化。
      )(1.5.0.36和1.4.3.2)和Andromeda搜索引擎(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      andromeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )集成到同一版本中。搜索MS / MS Spectra以与UNIPROTKB数据库版本11014进行搜索,其中包括140,992个条目,诱饵数据库,其中所有序列逆转,每种赖氨酸和精氨酸均用其前一氨基酸交换,以及普通污染物列表(247个条目)。搜索包括具有可变修饰N-末端乙酰化(+ 42.0106DA)和甲硫氨酸氧化(+15.99491Da)的胰蛋白酶肽(+15.99491Da)和固定改性氨基甲酰甲基半胱氨酸(+ 57.02146Da)。最大次数的切片次数被设置为两个,并将最大数量的修改设置为五个。 MaxQuant分析包括两个搜索引擎步骤。首先用于质量重新校准,并以20ppm的肽质量耐受引发。将主要数据库搜索肽初始质量耐受设定为4.5ppm,并且将片段离子的质量耐受设定为20ppm。将数据库结果过滤以在肽和蛋白质水平上具有0.01的最大FDR。最小的肽长度为7个氨基酸,并将每种蛋白质的最小数量的肽设定为一个。使“第二肽搜索”选项能够允许鉴定两种Cofragmented肽。对于蛋白质组件,将基于所鉴定的肽的所有不能区分的蛋白质组装成单一蛋白质基团。 Silac实验的分析包括Lys-8和Arg-10作为重标签,并启用了RESENTIFY选项。对于氧化硅比例测定,需要硅酸肽对之间的至少两种比率。仅在前列腺癌分析和PSA校准曲线中启用“运行之间的匹配”选项,用于在单独的LC-MS / MS之间传输识别,基于其精确的质量和保留时间,保留时间后1分钟匹配窗口。结盟。在过滤在逆向数据库中鉴定的蛋白质的蛋白质过滤后进行数据分析,该蛋白质仅基于其可变修饰和潜在的污染物(而不排除潜在的血浆蛋白,例如白蛋白,肝细胞生长因子。活化剂,角蛋白和血压素)。
      在LOG2或LOG10尺度上进行所有生物信息分析。使用强度值进行非标记样品的定量。通过减去每个样品中的中值值(以确保样品的总体相当的蛋白质分布),将硅酸标记的样品基于归一化比率的归一化在重度(L / h)进行标准化后进行分析。使用Perseus程序和Matlab完成统计测试和计算。使用机器学习算法来获得可测量的预测签名,可以区分来自源自前列腺癌患者的健康供体和样品。过滤数据以仅在28个样品中至少19个样品中仅保留具有数值的蛋白质。然后通过用随机值替换缺失值来施加朝向超级硅酸混合物的比率值,该值产生正常分布,其下降1.0标准偏差和原始分布的0.3的宽度。支持向量机算法用于使用线性内核和基于ANOVA的特征排序的分类。对于交叉验证,随机采样算法用于15%的样本用作测试用例,并重复计算250次。基于最低误差百分比选择特征数。使用与前三个排名特征相同的参数进行分类,以计算真正的正,真实,误报和假负率。韦尔奇 t 进行基于置换的FDR 0.05和S0 = 0.5进行测试(
      • Tusher V.G.
      • Tibshirani R.
      • 楚G.
      微阵列施加到电离辐射响应的显着性分析。
      )。在蛋白质的z评分标准化之后完成分层聚类,并且基于平均值之间的欧几里德距离。通过比较三次重复的蛋白质比率来确定变异系数。

       PSA.浓度测定

      对于基于MS的微粒PSA定量,将相等量的超级硅酸混合物与0.5,2,10,50和200ng / mL纯化的PSA(前列腺特异性抗原; Merck Millipore)组合。通过从LOG2规模的校准曲线外推完成PSA浓度的计算。 PSA ELISA KIT(R&D Systems,Minneapolis,Mn)根据制造商的说明来确定等离子体PSA浓度。

      结果

       深度覆盖血浆微粒蛋白质组

      血浆样品中的无偏见生物标志物发现需要足够的深度来实现“组织泄漏”蛋白质鉴定,高再现性和短暂的分析持续时间。因此,我们避免了蛋白质和肽分馏,而是使用单个LC-MS / MS运行检查血浆微粒蛋白质组覆盖。此外,我们优化了分析过程,以最小化样品损失,并最大限度地减少核心血浆蛋白的污染,预计将减少可观察的动态范围。通过高速等离子体离心进行微粒隔离(20,000× g),其沉淀微粒(100nm-1μm),但不是外泌体(40-100nm)。为了消除可以连接到囊泡的大量核心血浆蛋白,我们加入了随后的PBS洗涤颗粒,然后进行了额外的离心步骤。对于蛋白质消化,我们选择了溶液的过程,确保了最小的样品损失。微粒溶解在尿素基缓冲液中进行,然后进行过夜胰蛋白酶消化。单4 H LC-MS / MS在平均3294个蛋白质(肽和蛋白FDR = 0.01)上鉴定的Q-辐射质谱仪运行。三份单次分析确定了28,409肽和3689蛋白(Fig. 1A; 补充表S2A; 补充表S3A)。相比之下,类似于未分压血浆的类似分析鉴定仅451个蛋白质(Fig. 1B; 补充表S2A; 补充表S3A)。值得注意的是,由127项研究组成的肽阿特拉斯数据库(
      • Farrah T.
      • 德意曲e.w.
      • OPENN G.S.
      • 太阳Z.
      • 瓦特J.D.
      • Yamamoto T.
      • Shteynberg D.
      • 哈里斯米。
      • 莫里茨R.L.
      通过PeptidAtlas观察的2013年人类蛋白质组的状态:将肾脏,尿液和血浆蛋白质组比较生物和疾病驱动的人蛋白质组项目。
      ),包括类似数量的蛋白质。此外,这些实验将2074个血浆衍生的蛋白质加入注释的蛋白质(Fig. 1C)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1血浆微粒蛋白质蛋白质的深度分析。 A,三份单次单次微粒蛋白质蛋白质鉴定了3689种蛋白质,从白蛋白到细胞因子。 B,单一运行的未分叉血浆鉴定451个蛋白质。选定的组织泄漏蛋白标记为蓝点;核心血浆蛋白标记为红色点。 C,不同方法之间的数字比较。显示在单个LC-MS / MS运行中鉴定的蛋白质之间的重叠,三份单次运行和包含在肽ATLAS中的血浆蛋白质(127项研究)(
      • Farrah T.
      • 德意曲e.w.
      • OPENN G.S.
      • 太阳Z.
      • 瓦特J.D.
      • Yamamoto T.
      • Shteynberg D.
      • 哈里斯米。
      • 莫里茨R.L.
      通过PeptidAtlas观察的2013年人类蛋白质组的状态:将肾脏,尿液和血浆蛋白质组比较生物和疾病驱动的人蛋白质组项目。
      )。
      从白蛋白和血红蛋白中跨越的血浆微粒蛋白质组的动态范围,这些蛋白质是一种最丰富的血浆蛋白质,细胞因子和其他分泌因子,例如CCl5(趋化因子配体5),MANF(中脑星形星座衍生的神经营养因子),GMFG (Gamia成熟因子,γ),PDGFA(血小板衍生的生长因子A),IGF2(胰岛素样生长因子2)和MIF(巨噬细胞迁移抑制因子),其中最低(Fig. 1A)。检查这些蛋白质的血浆浓度,如血浆蛋白质组数据库(PPD)报道(
      • 南jappa五。
      • 托马斯J.K.
      • Marimuthu A.
      • Muthusamy B.
      • radhakrishnan A.
      • Sharma R.
      • Ahmad Khan A.
      • Balakrishnan L.
      • sahasrabuddhe n.a.
      • Kumar S.
      • jhaveri b.n.
      • Sheth K.v.
      • Kumar Khatana R.
      • Shaw P.G.
      • srikanth s.m.
      • Mathur P.P.
      • Shankar S.
      • Nagaraja D.
      • 克里斯托弗R.
      • Mathivanan S.
      • Raju R.
      • sardeshmukh r.
      • Chatterjee A.
      • SIMPSON R.J.
      • Harsha H.C.
      • Pandey A.
      • Prasad T.S.
      等离子体蛋白质组数据库作为蛋白质组学研究的资源研究:2014年更新。
      )显示微粒分析达到蛋白质,血浆浓度为11pg / ml(ImPh2,平均PPD浓度,三种肽),2.9ng / ml(GRB2,平均PPD浓度,15个肽)和额外的生长因子/细胞因子无法在未分叉的血浆样品中鉴定(补充图。S1;所选的例子是给出的 补充表S4)。据鉴定了据报道的276个蛋白质的浓度低于10ng / ml,而另一方面,未分配的血浆,在该范围内仅鉴定了14个蛋白质(Fig. 2A)。有趣的是,我们发现蛋白质的强度与微粒的强度和可溶性蛋白质的浓度之间的低相关,这表明分馏分离了血浆蛋白的不同亚蛋白质组。由于丰富的蛋白质分数的剧烈降低,实现了达到这些低丰度蛋白的能力。在未分压的等离子体中,43%的整体强度对应于白蛋白,而在微粒蛋白质蛋白蛋白中占总强度的5%。类似地,来自前10个微粒蛋白的总强度的36%,而相同数量的蛋白质负责血浆蛋白质组强度的76%(Fig. 2B)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2蛋白质在血浆中丰富。 A,鉴定蛋白质作为血浆/血清中浓度的函数的强度(报告的PPD浓度的平均值(
      • 南jappa五。
      • 托马斯J.K.
      • Marimuthu A.
      • Muthusamy B.
      • radhakrishnan A.
      • Sharma R.
      • Ahmad Khan A.
      • Balakrishnan L.
      • sahasrabuddhe n.a.
      • Kumar S.
      • jhaveri b.n.
      • Sheth K.v.
      • Kumar Khatana R.
      • Shaw P.G.
      • srikanth s.m.
      • Mathur P.P.
      • Shankar S.
      • Nagaraja D.
      • 克里斯托弗R.
      • Mathivanan S.
      • Raju R.
      • sardeshmukh r.
      • Chatterjee A.
      • SIMPSON R.J.
      • Harsha H.C.
      • Pandey A.
      • Prasad T.S.
      等离子体蛋白质组数据库作为蛋白质组学研究的资源研究:2014年更新。
      )))。 B,累积蛋白质强度分级和未分压等离子体蛋白质组。蛋白质从最多到最少的排名。蓝色,血浆微粒衍生蛋白质;绿色,未分配的血浆蛋白。
      在鉴定的蛋白质中,微粒蛋白质组提供了丰富的潜在生物标志物来源,如Httenhain所定义 等等。 (
      • Huttenhain R.
      • SOSTE M.
      • selevsek n。
      • 罗斯特H.
      • Sethi A.
      • Carapito C.
      • Farrah T.
      • 德意曲e.w.
      • Kusebauch U.
      • 莫里茨R.L.
      • Nimeus-Malmstrom E.
      • rinner o.
      • Aeberberold R.
      使用靶向蛋白质组学的体液中癌症相关蛋白的可再现量化。
      )。这些的强度是可重复的,并且没有集中在较低的强度范围内,而是表现出广泛的范围(Fig. 3A)。此外,涉及单独的微粒分离和LC-MS / MS分析的技术三次含量显示,在重复之间的0.93和91%重叠的平均相关性(Fig. 3B),展示该方法的高技术再现性。总体而言,这些结果表明微粒分析作为非偏见生物标志物发现的平台的潜力。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3微粒蛋白质组提取的再现性。 A,潜在的生物标志物(
      • Huttenhain R.
      • SOSTE M.
      • selevsek n。
      • 罗斯特H.
      • Sethi A.
      • Carapito C.
      • Farrah T.
      • 德意曲e.w.
      • Kusebauch U.
      • 莫里茨R.L.
      • Nimeus-Malmstrom E.
      • rinner o.
      • Aeberberold R.
      使用靶向蛋白质组学的体液中癌症相关蛋白的可再现量化。
      )是蓝色的。 B,技术复制之间的高相关性。图根据密度着色。

       基于SILAC的相对量化使用PROMIS-QUAN

      生物标志物的临床评估需要它们准确的定量和测定它们的绝对量。微粒蛋白质具有已知量的重质标准的组合可以使得能够定量测量这些特定蛋白质,但需要对每个生物标志物进行临床样本的重估。为了获得更全面的量化潜力,我们建立了ProMIS-Quan作为两步方法:首先,将微粒蛋白质蛋白质蛋白蛋白质定量用作内标的超级硅酸混合物(
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • ostasiewicz p.
      • wisniewski J.R.
      用于人肿瘤组织的定量蛋白质组学的超级硅酸混合物。
      )。接下来,相对于感兴趣的纯化蛋白质量化超硅酸混合物,具有已知的绝对量(Fig. 4)。该双模氧化铝量化方法提供了较大比例的微粒蛋白质组的相对定量,并且可以仅相对于超级硅胶标准来回顾性地确定绝对量化。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4PROMIS-QUAN使亲属和绝对微粒蛋白质组定量。 PROMIS-QUAN工作流包括相对于超硅酸混合物的多个样品的微粒定量,然后在超级硅胶标准中绝对定量候选蛋白质。
      为了开发硅胶内标,我们组装了七种癌细胞系的面板,其代表各种组织和癌症类型作为定量参考。与以前建立的超级硅酸混合物相反,用于组织量化(
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • ostasiewicz p.
      • wisniewski J.R.
      用于人肿瘤组织的定量蛋白质组学的超级硅酸混合物。
      ,
      • Shenoy A.
      • 盖尔特T.
      超级氧化品:当前的趋势和未来的观点。
      ),目前的超级硅胶旨在表示分泌的微粒蛋白质蛋白。因此,我们检查了三种类型的超级硅酸混合物:(1)细胞裂解物。 (2)细胞培养基(秘切)。 (3)细胞系微粒(CLMP),即与细胞培养基中分离的微粒。我们将这些标准中的每一个与血浆微粒组合并如上所述分析它们。单个LC-MS / MS运行导致分别为2473,1992和910个裂解物,CLMP和秘密的量化量的量化( 补充表S2B和S3B)。对于裂解物和CLMPS的裂解物和CLMPS和乳蛋白的〜60%,总鉴定的蛋白质的分数为70%。在下一个步骤中,我们专注于两种最优质的方法,即CLMP和裂解物标准。它们的比较显示出类似的总体分布,其中包括裂解物和CLMP标准宽度相同的主要分布(FWHM = 2.8)。额外的小分布高度富集核心血浆蛋白(FDR = 10−30 and 10−6 对于裂解物和CLMPS,分别在我们的标准中没有代表,但它们不太可能包括候选生物标志物(Fig. 5; 补充图S2; 补充表S3A;核心血浆蛋白质名单取自 Fig. 1B)。我们进一步确定了比率测量的再现性,并分别发现裂解物和CLMP标准的0.25和0.26的中值系数(补充图S3; 补充表S2C和S3C)。基于这两种标准类型的高相似性,并给出从裂解物中提取的蛋白质量的显着差异 相对 CLMPS,我们使用基于裂解物的超级硅酸混合物进行。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5两种超级硅胶标准类型。 直方图显示裂解物和CLMP的超硅酸混合物中标准化比的类似分布。核心血浆蛋白,如所定义的 B,显示出高比率朝向超级硅胶混合物。

       选定蛋白的绝对定量

      相对量化使得能够在任何数量的样本之间直接比较。这种比较可以产生各种潜在的生物标志物,但必须确定它们的绝对水平以进一步临床评估。双模氧化铝方法需要仅在超级硅胶标准中测定绝对蛋白质,并且每种样品中的量可以回顾性地推断。我们研究了Promis-Quan在前列腺癌患者中癌样品中癌症生物标志物定量的适用性。作为概念证明,我们量化了前列腺癌标志物前列腺特异性抗原(PSA / KLK3)(
      • Lilja H.
      • 乌尔默特D.
      • 维克斯A.J.
      前列腺特异性抗原和前列腺癌:预测,检测和监测。
      ,
      • Makarov D.v.
      • LOEB S.
      • getzenberg r.h.
      • partin a.w.
      前列腺癌的生物标志物。
      ),并比较治疗前后的微粒。 LC-MS / MS分析患者衍生的微粒与超级硅酸裂解物的定量相结合的3076蛋白,并特别鉴定了两种肽的肽和0.24-倍和0.17倍的比例,分别在治疗之前和之后。为了确定超级硅胶混合物中PSA的绝对量,我们创建了稀释系列的未标记纯化PSA与超级硅酸混合物相结合(Fig. 6A)。从校准曲线外推显示,在处理时,微粒PSA水平从2.3ng / ml降至1.5ng / ml(Fig. 6B)。为了验证MS结果,我们使用ELISA测定检查了同一患者的血浆中的绝对PSA量。尽管可溶性血浆和微粒中的绝对PSA水平之间存在差异(如预期的) Fig. 2A),我们发现治疗时的相同减少了35%(Fig. 6B)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6PSA.的相对和绝对量化。 A,稀释系列纯化的未标记蛋白在超级硅胶标准中提供绝对的PSA水平。 B,使用PROMIS-QUAN的治疗诱导的治疗诱导的微粒-PSA的量化,以及ELISA的血浆PSA定量。

       生物标志物发现使用PROMIS-QUAN

      我们检查了Promis-Quan是否可以揭示患者衍生的微粒中的新型生物标志物。为此,我们将12个健康供体的血浆微粒蛋白质组进行了比较了在放射治疗的前2周内衍生自七个前列腺癌患者的16个样品(补充表S2D和S3D)。鉴定了5374个不同的蛋白质基团,在每个样品中平均鉴定3231个蛋白质,并用超级硅酸混合物量化了2167个。我们表演了一个韦尔奇 t 测试鉴定健康和前列腺癌样品之间的显着变化的蛋白质。我们提取了132名蛋白质的签名,其在前列腺癌患者微粒和46例蛋白质在健康供体样品中的46例蛋白质(FDR< 0.05, S0=0.5; 补充图S4; 补充表S5)。为了进一步评估这些蛋白质的预测值,我们使用支持向量机分类算法,ANOVA特征对方法和随机采样进行交叉验证,并获得包含三种蛋白质可以区分患者和健康衍生的样品的签名,如显示在主成分分析(PCA; Fig. 7A)。接收器操作特性分析导致曲线下的面积为0.84(Fig. 7B)。预测签名包括PTPN1,SFXN3和LPP(p 1.36E-05,3.12E-06和7.1E-06的值分别为1.36E-05,7.1E-06; Fig. 7C)。 PTPN1(蛋白质酪氨酸磷酸酶非反对剂型1)先前发现与前列腺癌进展相关(
      • 留意L.
      • Labbe D.P.
      • Deblois G.
      • 开始L.R.
      • 哈迪斯。
      • MES-MASSON上午
      • Saad F.
      • 托特曼L.C.
      • Giguere V.
      • Tremblay M.L.
      PTP1B是一种雄激素受体调节的磷酸酶,其促进前列腺癌的进展。
      ); LPP(Lim蛋白)参与细胞粘附; SFXN3(Sideroflexin-3)之前提出为口腔鳞状细胞癌的血清肿瘤标志物(
      • 羽毛r.
      • 阿布y.
      • Takeuchi T.
      • Nabeta M.
      • Imai Y.
      • Kamei Y.
      • Kagawa-Miki L.
      • UEDA N.
      • Sumida T.
      • 哈巴瓦H.
      • Kito K.
      血清Autoantibody到Sideroflexin 3作为口腔鳞状细胞癌的新型肿瘤标志物。
      )。总共使用Promis-Quan,我们能够捕获健康和前列腺癌血浆微粒蛋白质之间的显着差异并确定了疾病的候选标志物。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7基于血浆微粒的前列腺癌患者的蛋白质组学特征。 A,健康供体样品的主要成分分析(PCA)和源自前列腺癌患者的样品在两组之间进行隔离。 B,接收器操作特征曲线显示出用于前列腺癌诊断的生物标志物的所选蛋白质特征的高预测力。 C,三种包含预测生物标志物的三种蛋白质的折叠变化。值在log2归一化比例L / h中。

      讨论

      生物制药分析生物标本主要依赖于配体结合测定(LBA)作为标准分析技术。 LBA利用抗体抑制患者蛋白质,提供非常敏感和选择性结果(
      • Bronsema K.J.
      • Bischoff R.
      • Van de Merbel N.C.
      用液相色谱偶联与质谱法定量测定蛋白质生物制药的内部标准。
      )。虽然LBA需要降低分析设备的投资,但具有直接/高通量协议(
      • van den Broek I.
      • niessen w.m.
      • 范东根W.D.
      生物分析LC-MS / MS蛋白质的生物制药。
      ),近年来越来越多的LC-MS(/ MS)技术,主要是基于目标的方法,开始替换传统的LBA方法。这些基于MS的技术改善了比基于抗体的方法的选择性和线性动态范围,并且内部标准的使用可以校正不同的分析变异来源。在目前的工作中,我们提出了一种新的高吞吐量,无偏见,简单,具有成本效益的生物标志物发现和量化平台。与大多数替代技术相比,PROMIS-QUAN使生物标志物在等离子体样本本身中发现,并且不依赖于基于细胞系或组织分析的仅仅是预测。为了比较,确定了从血浆免疫沉淀的候选肽的绝对措施的良好的SISCAPA技术需要对每种蛋白质的多种方法开发步骤。这些包括基于广泛组织分析和计算预测的候选选择,肽特异性抗体的开发,重肽标准的合成以及靶向MS-方法的发育(
      • 安德森N.L.
      • 安德森N.G.
      • 海南L.R.
      • Hardie D.B.
      • Olafson R.W.
      • Pearson T.W.
      使用稳定同位素标准品和抗肽抗体捕获(SISISCAPA)的肽和蛋白质的质谱定量。
      )。因此,在鉴定蛋白质之前需要大规模投资 善意 生物标志物。 PROMIS-QUAN提供了血浆亚颗粒的特殊覆盖,从而能够在血液中进行全面的组织泄漏蛋白质。单次运行中达到的高覆盖率提供了分析大型患者队列所需的吞吐量。这种高覆盖率可以通过未来肽/蛋白质分级进一步升高。
      目前的工作鉴定了六倍的蛋白质,而不是到目前为止报道的最大研究,只有单个LC-MS / MS在一个整个数据集中的单一LC-MS / MS中,以及10倍的蛋白质(5374蛋白;前列腺癌患者)。这种戏剧性改善在于优化几种分析步骤:(1)等离子体分离涉及两种10 10分钟的离心步骤,1500× g 在4°C。更高的速度(超过2000× g)通常在各种研究中使用的,显示出导致相当大的微粒丧失(
      • Dinkla S.
      • 布洛克R.
      • jooosten我。
      • Bosman G.J.
      理解微粒的门户:标准化分离和质鉴定血浆膜衍生的囊泡。
      )。 (2)使用较长的高速离心实现从等离子体的有效微粒分离(1小时 相对 20-30分钟)。 (3)另外的PBS洗涤微粒颗粒降低了掩盖低丰度蛋白的高度丰富血浆蛋白的水平。与此一致,Ostergaard 等等。 显示微粒颗粒的多个洗涤减少了白蛋白的信号,从而影响微粒蛋白质产量(
      • Ostergaard O.
      • 尼尔森C.T.
      • Iversen L.v.
      • 雅各布森S.
      • Tanassi J.T.
      • Heegaard N.H.
      正常人循环微粒的定量蛋白质组分析。
      )。 (4)使用LOBIND EPPENDORF管用于微粒萃取,与大容量圆形管相比,每次起始体积的屈服率高提供了更高的产量( 补充表S6)。 (5)溶液蛋白质消化显着降低了样品损失。替代的微沉肠萃取方案包括去除细胞的蔗糖梯度或过滤步骤,其可能导致大的微囊泡损失。另外,最先前的研究使用凝胶消化处理了微粒蛋白质蛋白质,这进一步降低了与此处使用的溶液中的溶液过程相比的产率。 6)高分辨率MS和高分辨率色谱的组合显着增加了鉴定的蛋白的数量。
      可能影响所识别的蛋白质数量的另一个因素是微泡细分。在这里,我们选择使用微粒而不是外泌体,因为:(1)微粒蛋白不限于分泌途径,因为它们源自细胞质,因此,更好地反映了原产地的细胞蛋白质的各种蛋白质。 (2)实验,微粒萃取比外泌体更简单,因为它需要高速离心而不是超速离心。此外,一些研究将血浆微泡种群分为特定的起源(血小板,红细胞,白细胞等)。例如,最近的研究重点是血浆微粒,血小板衍生的微粒的子集。它们使用溶液消化协议,然后在杂交LTQ orbitrap XL中进行分析,并在九个样品中鉴定了603个蛋白质(
      • Capriotti A.L.
      • Caruso G.
      • Cavaliere C.
      • Piovesana S.
      • Samperi R.
      • 拉格纳A.
      人血小板衍生微粒的蛋白质组学特征。
      )。因此,将分析定向朝向微泡的子集导致较少鉴定的蛋白质。
      作为一个概念证明,我们在分析血浆微粒蛋白质组学谱时,我们检查了我们在分析血浆微粒蛋白质组学谱时成功捕获潜在生物标志物的能力。为此,我们在前列腺癌样品上测试了Promis-Quan,并将那些对健康供体进行了比较。我们鉴定了一种包括三种蛋白质的预测签名,所有这些蛋白质在患者样品中均高于健康样品。有趣的是,其中一种蛋白质PtPN1是酪氨酸磷酸酶和雄激素受体的直接靶。 PTPN1经常在转移性肿瘤和高风险原发性肿瘤中扩增(
      • 吴C.
      • 张L.
      • Bourne P.A.
      • 雷德尔J.E.
      • di sant'agnese p.a.
      • 姚J.L.
      • na y。
      • 黄杰。
      蛋白质酪氨酸磷酸酶PTP1B参与前列腺癌的神经内分泌分化。
      )。 PTPN1的下调与延迟肿瘤发生,降低肿瘤生长率和抑制细胞迁移,与更好的预后相关(
      • 留意L.
      • Labbe D.P.
      • Deblois G.
      • 开始L.R.
      • 哈迪斯。
      • MES-MASSON上午
      • Saad F.
      • 托特曼L.C.
      • Giguere V.
      • Tremblay M.L.
      PTP1B是一种雄激素受体调节的磷酸酶,其促进前列腺癌的进展。
      )。预测签名包括另外两种蛋白质,LPP和SFXN3,我们的知识以前没有与前列腺癌相关联。未来的研究可以研究这些潜在的生物标志物对前列腺癌诊断的广泛适用性。
      ProMIS-Quan的独特优势是双模超硅胶标准的使用,它提供了相对和绝对量化。与使用具有重标记标准的选定候选的选定候选的定量相反,超级硅酸量量化了每种样品中的数千个蛋白质,因此可以提取蛋白质的组合作为生物标志物签名。在使用未标记的标准的超硅蛋白定量的第二步中实现了绝对量化。这种方法的主要益处是相对于标准进行绝对量化,因此它不需要对每个生物标志物的临床样本的重估,但是一旦候选者建立为有价值的生物标志物,就可以回顾性地进行。此外,绝对量化不涉及重度标准的合成,而是利用非标记的纯化蛋白质。作为内标的超级硅胶混合物的使用提供比无标记量化或化学标记方法更高的精度和稳定性,因此相同的标准可用于多项研究,实验室和诊所,可以作为基础大型生物标志物Meta分析。最后,因为微粒来自所有细胞和组织,所以Promis-Quan可以应用于各种疾病状态。我们设想该技术将用于常规血液测试,并将在单一测试中揭示多种生物标志物。
      通过具有数据集标识符PXD001194的骄傲伙伴存储库,通过骄傲的伙伴存储库沉积了质谱蛋白质组学数据。
      要访问数据,请访问: http://tinyurl.com/mv35xpk.

      致谢

      我们感谢Geiger实验室的成员,富有成效的讨论和批判性阅读手稿。我们感谢Juergen Cox进行统计建议。我们感谢Ella Fremder在微粒提取中的帮助下。

      补充材料

      参考

        • 汉尚三
        • Pitteri S.J.
        • Faca v.m.
        采矿血浆蛋白质组癌生物标志物。
        自然。 2008; 452: 571-579
        • 安德森N.L.
        • 安德森N.G.
        人血浆蛋白质组:历史,性格和诊断前景。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2002; 1: 845-867
        • 张Q.
        • Faca V.
        • 汉尚S.
        在七种蛋白质丰富日志中挖血蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质组。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 46-50
        • kuzyk m.a.
        • 史密斯D.
        • 杨杰。
        • 十字架。
        • 杰克逊上午
        • Hardie D.B.
        • 安德森N.L.
        • 博赫斯C.H.
        基于多重反应监测,多路复用,人血浆中45个蛋白的绝对定量。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2009; 8: 1860-1877
        • Whiteaker J.R.
        • 林C.
        • 肯尼迪J.
        • 侯L.
        • tr
        • Sokal I.
        • 闫诗
        • Schoenherr r.m.
        • 赵L.
        • Voytovich U.J.
        • Kelly-Spratt K.S.
        • Krasnoselsky A.
        • Gafken P.R.
        • Hogan J.M.
        • 琼斯L.A.
        • 王P.
        • Amon L.
        • Chodosh L.A.
        • 尼尔森第3升
        • McIntosh M.W.
        • Kemp C.J.
        • Paulovich A.G.
        基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
        NAT。 Biotechnol。 2011; 29: 625-634
        • Burgess M.W.
        • Keshishian H.
        • MANI D.R.
        • Gillette M.A.
        • carr s.a.
        通过靶向质谱法在非常高的多重低丰度蛋白质的简化有效地定量。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2014; 13: 1137-1149
        • OPENN G.S.
        • 国家D.J.
        • Adamski M.
        • Blackwell T.W.
        • Menon R.
        • Hermjakob H.
        • APWEILER R.
        • Haab B.B.
        • SIMPSON R.J.
        • eddes J.S.
        • kapp e.a.
        • 莫里茨R.L.
        • Chan D.W.
        • rai a.j.
        • Admon A.
        • Aeberberold R.
        • ENG J.
        • 汉考克W.S.
        • 浩秀S.A.
        • 迈耶H.
        • Paik Y.K.
        • yoo J.s.
        • ping p.
        • 磅J.
        • Adkins J.
        • 钱X.
        • 王R.
        • Wasinger V.
        • wu c.y.
        • 赵X.
        • 曾R.
        • Archakov A.
        • Tsugita A.
        • 啤酒我
        • Pandey A.
        • Pisano M.
        • 安德鲁斯P.
        • 夯实H.
        • Speicher D.W.
        • 汉尚三
        Hupo等离子蛋白质组项目的概述:试验阶段的结果与35个合作实验室和多个分析组,产生3020蛋白的核心数据集,以及公开的数据库。
        蛋白质组学。 2005; 5: 3226-3245
        • Whiteaker J.R.
        • 张H.
        • ENG J.K.
        • 方罗。
        • Piening B.D.
        • 冯L.C.
        • Lorentzen T.D.
        • Schoenherr r.m.
        • keane J.F.
        • 霍尔茨曼T.
        • Fitzgibbon M.
        • 林C.
        • Cooke K.
        • 刘涛。
        • 营2nd,D.G.
        • 安德森L.
        • 瓦特J.
        • 史密斯r.d.
        • McIntosh M.W.
        • Paulovich A.G.
        血清分馏技术的头部比较。
        J.蛋白质组。 2007; 6: 828-836
        • 安德森N.L.
        • 安德森N.G.
        • 海南L.R.
        • Hardie D.B.
        • Olafson R.W.
        • Pearson T.W.
        使用稳定同位素标准品和抗肽抗体捕获(SISISCAPA)的肽和蛋白质的质谱定量。
        J.蛋白质组。 2004; 3: 235-244
        • voloshin t.
        • 颤抖E.
        • sh
        小但强大:微粒作为肿瘤进展的介质。
        癌细胞。 2014; 7: 11-21
        • Iero M.
        • Valenti R.
        • Huber V.
        • Filipazzi P.
        • 巴黎加
        • 芬士州S.
        • Rivoltini L.
        肿瘤释放的外泌体及其对癌症免疫的影响。
        细胞死亡差异。 2008; 15: 80-88
        • Somasundaram R.
        • her
        黑色素瘤外泌体:转移信使。
        NAT。 Med。 2012; 18: 853-854
        • C.
        • Zitvogel L.
        • Amigorena S.
        外泌体:组成,生物发生和功能。
        NAT。 Rev.Immunol。 2002; 2: 569-579
        • Buzas e.i.
        • Gyorgy B.
        • NAGY G.
        • FALUS A.
        • 同性恋者。
        细胞外囊泡在炎症性疾病中的新兴作用。
        NAT。 Rev. Rheumatol。 2014; 10: 356-364
        • loyer x。
        • VION A.C.
        • Tedgui A.
        • 伯兰杰下午
        微胶囊作为心血管疾病中的细胞 - 细胞信使。
        CIRC。 res。 2014; 114: 345-353
        • j
        • Drwal G.
        • Bourgeois T.
        • Saltz J.
        • 吴h
        不同血浆微粒的不同蛋白质组特征。
        蛋白质组学。 2005; 5: 1940-1952
        • smalley d.m.
        • 根K.E.
        • 町H.
        • 罗斯m.m.
        • ley k。
        在人血浆衍生但不是血小板衍生的微粒中表达21种蛋白质的蛋白质组学发现。
        血栓。批发。 2007; 97: 67-80
        • 小西
        • smalley d.m.
        • 哈敦N.L.
        • ley k。
        血浆微粒蛋白质组。
        Semin。血栓。缝。 2010; 36: 845-856
        • Ostergaard O.
        • 尼尔森C.T.
        • Iversen L.v.
        • 雅各布森S.
        • Tanassi J.T.
        • Heegaard N.H.
        正常人循环微粒的定量蛋白质组分析。
        J.蛋白质组。 2012; 11: 2154-2163
        • Pisitkun T.
        • 沉R.F.
        • Knepper M.A.
        人类尿液中外来体的鉴定和蛋白质组学分析。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2004; 101: 13368-13373
        • Gonzalez-Begne M.
        • 卢B.
        • 汉X.
        • Hagen F.K.
        • 手A.R.
        • Melvin J.E.
        • yates j.r.
        多维蛋白质识别技术(Mudpit)人腮腺外来蛋白质组学分析。
        J.蛋白质组。 2009; 8: 1304-1314
        • 街道街。
        • 巴兰P.E.
        • Mackay C.L.
        • Weidt S.
        • Balmforth C.
        • 沃尔斯。
        • Chalmers R.T.
        • 韦伯D.J.
        • 亲爱的J.W.
        人脑脊髓液中外来体的鉴定和蛋白质组学分析。
        J.翻译。 Med。 2012; 10: 5
        • Admyre C.
        • 约翰逊三世
        • QAZI K.R.
        • Filen J.J.
        • Lahesmaa R.
        • 诺曼姆
        • Neve E.P.
        • Scheynius A.
        • 加布里尔森S.
        具有免疫调节特征的外泌体存在于人母乳中。
        J.Immunol。 2007; 179: 1969-1978
        • 凯勒斯。
        • RUPP C.
        • 斯托克A.
        • runz s.
        • Fogel M.
        • 卢特S.
        • HAGER H.D.
        • Abdel-Bakky M.S.
        • Gutwein P.
        • Altevogt P.
        CD24是分泌到尿液和羊水中的外泌体的标记物。
        肾脏int。 2007; 72: 1095-1102
        • 波利亚科夫A.
        • Spilman M.
        • Dokland T.
        • amling c.l.
        • Mobley J.A.
        人体精液中外渗囊泡(前列腺囊泡)的结构异质性和蛋白质组成。
        前列腺。 2009; 69: 159-167
        • B.
        • Nieuwland R.
        • Liebhardt S.
        • DITCH N.
        • Steinig K.
        • 斯德伯P.
        • 排名A.
        • Gohring P.
        • thaler c.j.
        • 弗里斯克。
        • Bauerfeind I.
        乳腺癌患者中的循环微粒:具有成立生物标志物的对比分析。
        抗癌es。 2008; 28: 1107-1112
        • 国家D.J.
        • OPENN G.S.
        • Blackwell T.W.
        • 费尔明D.
        • ENG J.
        • Speicher D.W.
        • 汉尚三
        从Hupo血浆蛋白质组织协作研究中收集的数据衍生高信心蛋白质标识的挑战。
        NAT。 Biotechnol。 2006; 24: 333-338
        • Farrah T.
        • 德意曲e.w.
        • OPENN G.S.
        • 坎贝尔D.S.
        • 太阳Z.
        • Bletz J.A.
        • Mallick P.
        • 凯茨J.E.
        • Malmstrom J.
        • Ossola R.
        • 瓦特J.D.
        • 林B.
        • 张H.
        • 莫里茨R.L.
        • Aeberberold R.
        具有估计含量浓度的高信心人血浆蛋白质组参考。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10 (M110 006353)
        • Farrah T.
        • 德意曲e.w.
        • OPENN G.S.
        • 太阳Z.
        • 瓦特J.D.
        • Yamamoto T.
        • Shteynberg D.
        • 哈里斯米。
        • 莫里茨R.L.
        通过PeptidAtlas观察的2013年人类蛋白质组的状态:将肾脏,尿液和血浆蛋白质组比较生物和疾病驱动的人蛋白质组项目。
        J.蛋白质组。 2014; 13: 60-75
        • Rappsilber J.
        • Ishihama Y.
        使用缘物的微纯化,富集,预分化和肽的肽储存的方案。
        NAT。 protoc。 2007; 2: 1896-1906
        • Michalski A.
        • 达莫e.
        • Hauschild J.P.
        • lange O.
        • Wieghaus A.
        • Makarov A.
        • Nagaraj N.
        • Cox J.
        • 角horn
        基于质谱的蛋白质组学使用Q辐射,高性能台式四轴锻体质谱仪。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10 (M111 011015)
        • Cox J.
        MaxQuant使高肽识别率,个性化p。 p。 B.范围质量精度和蛋白质全组蛋白质量化。
        NAT。 Biotechnol。 2008; 26: 1367-1372
        • Cox J.
        • Neuhauser N.
        • Michalski A.
        • 施泰米r.a.
        • 奥尔森J.V.
        andromeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 1794-1805
        • Tusher V.G.
        • Tibshirani R.
        • 楚G.
        微阵列施加到电离辐射响应的显着性分析。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2001; 98: 5116-5121
        • 南jappa五。
        • 托马斯J.K.
        • Marimuthu A.
        • Muthusamy B.
        • radhakrishnan A.
        • Sharma R.
        • Ahmad Khan A.
        • Balakrishnan L.
        • sahasrabuddhe n.a.
        • Kumar S.
        • jhaveri b.n.
        • Sheth K.v.
        • Kumar Khatana R.
        • Shaw P.G.
        • srikanth s.m.
        • Mathur P.P.
        • Shankar S.
        • Nagaraja D.
        • 克里斯托弗R.
        • Mathivanan S.
        • Raju R.
        • sardeshmukh r.
        • Chatterjee A.
        • SIMPSON R.J.
        • Harsha H.C.
        • Pandey A.
        • Prasad T.S.
        等离子体蛋白质组数据库作为蛋白质组学研究的资源研究:2014年更新。
        核酸RES。 2014; 42: D959-D965
        • Huttenhain R.
        • SOSTE M.
        • selevsek n。
        • 罗斯特H.
        • Sethi A.
        • Carapito C.
        • Farrah T.
        • 德意曲e.w.
        • Kusebauch U.
        • 莫里茨R.L.
        • Nimeus-Malmstrom E.
        • rinner o.
        • Aeberberold R.
        使用靶向蛋白质组学的体液中癌症相关蛋白的可再现量化。
        SCI。翻译。 Med。 2012; 4: 142RA194
        • 盖尔特T.
        • Cox J.
        • ostasiewicz p.
        • wisniewski J.R.
        用于人肿瘤组织的定量蛋白质组学的超级硅酸混合物。
        NAT。方法。 2010; 7: 383-385
        • Shenoy A.
        • 盖尔特T.
        超级氧化品:当前的趋势和未来的观点。
        专家Rev.蛋白质组学。 2014; 12: 13-19
        • Lilja H.
        • 乌尔默特D.
        • 维克斯A.J.
        前列腺特异性抗原和前列腺癌:预测,检测和监测。
        NAT。癌症。 2008; 8: 268-278
        • Makarov D.v.
        • LOEB S.
        • getzenberg r.h.
        • partin a.w.
        前列腺癌的生物标志物。
        安努。 Rev. Med。 2009; 60: 139-151
        • 留意L.
        • Labbe D.P.
        • Deblois G.
        • 开始L.R.
        • 哈迪斯。
        • MES-MASSON上午
        • Saad F.
        • 托特曼L.C.
        • Giguere V.
        • Tremblay M.L.
        PTP1B是一种雄激素受体调节的磷酸酶,其促进前列腺癌的进展。
        癌症res。 2012; 72: 1529-1537
        • 羽毛r.
        • 阿布y.
        • Takeuchi T.
        • Nabeta M.
        • Imai Y.
        • Kamei Y.
        • Kagawa-Miki L.
        • UEDA N.
        • Sumida T.
        • 哈巴瓦H.
        • Kito K.
        血清Autoantibody到Sideroflexin 3作为口腔鳞状细胞癌的新型肿瘤标志物。
        蛋白质组学临床。苹果。 2008; 2: 517-527
        • Bronsema K.J.
        • Bischoff R.
        • Van de Merbel N.C.
        用液相色谱偶联与质谱法定量测定蛋白质生物制药的内部标准。
        J.Chromatogr。 B分析。技术。生物化。生活SCI。 2012; 893-894: 1-14
        • van den Broek I.
        • niessen w.m.
        • 范东根W.D.
        生物分析LC-MS / MS蛋白质的生物制药。
        J.Chromatogr。 B分析。技术。生物化。生活SCI。 2013; 929: 161-179
        • Dinkla S.
        • 布洛克R.
        • jooosten我。
        • Bosman G.J.
        理解微粒的门户:标准化分离和质鉴定血浆膜衍生的囊泡。
        纳米医生。 2013; 8: 1657-1668
        • Capriotti A.L.
        • Caruso G.
        • Cavaliere C.
        • Piovesana S.
        • Samperi R.
        • 拉格纳A.
        人血小板衍生微粒的蛋白质组学特征。
        肛门。 ch acta。 2013; 776: 57-63
        • 吴C.
        • 张L.
        • Bourne P.A.
        • 雷德尔J.E.
        • di sant'agnese p.a.
        • 姚J.L.
        • na y。
        • 黄杰。
        蛋白质酪氨酸磷酸酶PTP1B参与前列腺癌的神经内分泌分化。
        前列腺。 2006; 66: 1125-1135