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酵母中的PHOX同源性(PX)域彩易福彩质相互作用网络*

      PHOX同源性(PX)结构域是磷酸阳性结合结构域,其从酵母中保守为人。在这里,我们首次通过基因组的双混合屏幕显示体外PX结构域是真正的彩易福彩质相互作用域的结合测定。仅酵母PX域彩易福彩彩易福彩GRD19P(YOR357C)和YPT35P(YHR105W),以及来自MVP1P(YMR004W),SNX42P / CVT20P / ATG20P(YDL113C),VAM7P(YL212W)和VPS17P(YOR132W)的分离的PX域,总共产生40个可重复的双杂化相互作用。发现了BEM1P(YBR200W),SNX42P,SNX4P / CVT13P(YJL036W),VAM7P,VPS5P(Yor069W)和VPS17P的全长彩易福彩的相互作用,但这些似乎不需要PX域,因为这些交互无法用PX-oply诱饵再现。将始终检测GRD19P,VAM7P,VPS5P,VPS17P和YPT35P与YIP1P系列彩易福彩质成员的相互作用进行验证,并通过体外结合测定。 YIP1P和YIF1P的N-末端细胞质结构域介导与PX结构域的这些相互作用。 YPT35P的脂质结合袋中的突变,其降低了显着的脂质结合并不影响这些PX结构域彩易福彩质相互作用,认为脂质结合使用不同的相互作用表面而不是彩易福彩质结合。
      磷酸钠(PIS)
      使用的缩写是:pi,磷肌; ptdins,磷脂酰肌醇; PX,PHOX同源域; SH3,SRC同源3; ER,内质网。
      1使用的缩写是:pi,磷肌; ptdins,磷脂酰肌醇; PX,PHOX同源域; SH3,SRC同源3; ER,内质网。
      充当各种细胞过程中的信号分子,包括覆膜贩运和细胞运动(
      • 西蒙森A.
      • 巫术A.E.
      • EMR S.D.
      • 捷卡H.
      磷酸阳性在膜运输中的作用..
      ,
      • TOKER A.
      磷酸阳性和信号转导。
      ,
      • Gruenberg J.
      在内吞膜输送和分选中的脂质..
      )。 PI信号传导由彩易福彩质介导的彩易福彩质,其含有一种或几个脂质结合结构域,例如pH,Fyve,焓,炎症,蒽,孔,Phd,Tubby和C2结构域,其所有这些都据报道用于结合PIS。最近,显示PX域表示另一个PI绑定域(在refs中审查。
      • Hurley J.H.
      • 迈耶T.
      通过膜脂质的亚细胞靶向..
      ,
      • Itoh T.
      • Caurerawa T.
      磷酸阳性结合结构域:用于细胞内信号的时间和空间调节的功能单元。
      ,
      • LEMMON M.A.
      磷酸钠识别域名..
      ,
      • Dinitto J.P.
      • Cronin T.C.
      • Lambright D.G.
      膜识别和脂质结合域的靶向..
      )。
      PHOX同源性(PX)结构域最初被鉴定为在P40中发现的约120个氨基酸的常见主题Phox. 和 p47Phox. 中性粒细胞NADPH氧化酶(PHOX)复合物的亚基(
      • 分割C.P.
      NADPH氧化酶亚基的新型结构域,分选nexins和ptdins 3-kinases:SH3域的结合伴侣?
      )。该域名从酵母到人类保存,超过400个示例在序列数据库中注释(例如 SMART (
      • Leatunic I.
      • copley r.r.
      • 施密特S.
      • ciccarelli f.d.
      • Doerks T.
      • Schultz J.
      • 分割C.P.
      • Bork P.
      SMART 4.0:走向基因组数据集成..
      )))。含PX域域的彩易福彩质涉及高度多样化的功能,例如细胞信号传导,浆囊贩运,彩易福彩质分选和脂质改性(在refs中审查。
      • Odorizzi G.
      • Babst M.
      • EMR S.D.
      磷酸亚膦酸信号传导与酵母膜贩运的调控..
      • Worby C.a.
      • 迪克森J.E.
      排除排序Nexins的蜂窝功能..
      )。
      PX域显示相对较少的序列保护,但它们的结构似乎是高度保守的。所有已发布的晶体结构表现出明确定义的Pi绑定口袋(
      • 布拉沃J.
      • Karathanassis D.
      • 皮卡尔德下午
      • Pacold M.E.
      • 埃尔逊C.D.
      • 安德森K.E.
      • 巴特勒P.J.
      • Lavenir I.
      • 仔细审查
      • 霍金斯P.T.
      • Stephens L.
      • 威廉姆斯r.l.
      从P40(PHOX)的PX结构域的晶体结构与磷脂酰肌醇3-磷酸盐结合。
      ,
      • Hiroaki H.
      • 以前t.
      • ITO T.
      • Sumimoto H.
      • Kohda D.
      PX域的解决方案结构,SH3域的目标。
      ,
      • 卢杰。
      • 加西亚J.
      • Dulubova I.
      • SUDHOF T.C.
      • rizo J.
      VAM7P PX域的解决方案结构..
      ,
      • 周C.Z.
      • de la sierra-gallay i.l。
      • Quevillon-Cheruel S.
      • Collinet B.
      • 小柱P.
      • Blondeau K.
      • H恩克斯G.
      • Aufrere R.
      • Leulliot N.
      • 格局M.
      • Sorel I.
      • Savarin P.
      • de la Torre F.
      • Poupon A.
      • Janin J.
      • van tilbeurgh H.
      酵母Phox同源性(PX)域彩易福彩彩易福彩GRD19p络合至磷脂酰肌醇-3-磷酸酯的晶体结构。
      )。虽然磷脂酰肌醇-3-磷酸(PTDINS(3)P)是PX结构域的主要靶标,与磷脂酸的结合,磷脂酰肌醇-3,4-双磷酸(PTDINS(3,4)p2),磷脂酰肌醇-3,5-双磷酸(PTDINS(3,5)p2),磷脂酰肌醇-4,5-双磷酸(PTDINS(4,5)p2)和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(Ptdins(3,4,5)p3)已经报告了(
      • Karathanassis D.
      • Stahelin R.V.
      • 布拉沃J.
      • 仔细审查
      • 皮卡尔德下午
      • CHO W.
      • 威廉姆斯r.l.
      P47(PHOX)的PX结构域与磷脂酰肌醇3,4-双磷酸盐和磷脂酸的结合被分子内相互作用掩盖。
      ,
      • 徐Y.
      • seet l.f.
      • 汉森B.
      • 洪W.
      PHOX同源性(PX)域,磷酸亚肌腱信号的新手。
      )。
      酵母基因组编码含15个PX结构域的彩易福彩质,这些彩易福彩质涉及囊泡运输,细胞信号传导,芽源性和细胞极性的控制,或者具有很大程度上的功能(表I.)。所有酵母PX域(序列异常ypr097p除外)与不同的亲和力的ptdins(3)p特别结合(
      • yu J.W.
      • LEMMON M.A.
      所有Phox同源性(PX)域来自 酿酒酵母酿酒酵母 具体识别磷脂酰肌醇3-磷酸酯..
      )。
      虽然大多数PX结构域含有额外的结构域 - 或至少额外的彩易福彩质序列 - 两个酵母彩易福彩,GRD19P和YPT35P,几乎完全由PX域组成(表I.)。假设信号传导彩易福彩不太可能与其自身结合膜,表明这些PTDINS(3)特异性PX结构域彩易福彩也必须参与彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用以便将信号从膜中转换为一些效应器。通过几种遗传观察进一步支持这一点。例如,酵母菌株缺失其GRD19基因将TGN膜彩易福彩A-ALP,PEP12P和KEX2P删除为液泡(
      • voos w.
      • 史蒂文斯T.H.
      从预遗传池隔室检索常驻晚牙龈膜彩易福彩 酿酒酵母酿酒酵母 取决于GRD19P的功能..
      ,
      • HETTEMA E.H.
      • 刘易斯M.J.
      • 黑色m.W.
      • Pelham H.R.
      回报器和分拣Nexins SNX4 / 41/42介导来自酵母内体的不同检索途径..
      )。
      在P47中观察到PX结构域在彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用中的直接参与Phox. 中性粒细胞NADPH氧化酶复合物的亚基。 P47.Phox. 通过其C末端SRC同源性3(SH3)结构域及其PX结构域之间的分子内相互作用保持不存在的状态。通过侵入微生物激活,P47Phox. 变得磷酸化,PX-SH3相互作用被破坏(
      • Sumimoto H.
      • Kage Y.
      • nunoi h.
      • Sasaki H.
      • 鼻子T.
      • Fukumaki Y.
      • ohno m.
      • Minakami S.
      • TakeShige K.
      SRC同源性3结构域在组装和激活吞噬细胞NADPH氧化酶的作用..
      ,
      • Leto T.L.
      • 亚当斯艾..
      • de Mendez I.
      组装吞噬细胞NADPH氧化酶:SRC同源性3个域与富含脯氨酸的靶标的结合..
      )。 C末端SH3结构域与P47的富含脯氨酸的区域相互作用Phox.-px域(
      • Hiroaki H.
      • 以前t.
      • ITO T.
      • Sumimoto H.
      • Kohda D.
      PX域的解决方案结构,SH3域的目标。
      )。
      此外,最近的大规模两杂交筛表明,来自酵母,YPT35P(YHR105W)的仅一种PX彩易福彩,与几种彩易福彩质相互作用(
      • Uetz P.
      • 爱情L.
      • Cagney G.
      • Mansfield T.A.
      • 犹太森r.s.
      • 骑士J.R.
      • 洛克森D.
      • Narayan V.
      • Srinivasan M.
      • Pochart P.
      • Qureshi-Emili A.
      • 李Y.
      • Godwin B.
      • Conover D.
      • kalbfleisch t.
      • Vijayadamodar G.
      • 杨米
      • 约翰斯顿M.
      • 领域S.
      • Rothberg J.M.
      综合分析彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用 酿酒酵母酿酒酵母..
      )。为了探讨PX结构域作为真正的彩易福彩质相互作用模块的可能作用,我们使用PX-域的仅诱饵彩易福彩(对于所有酵母PX结构域的彩易福彩质)在基因组的双杂交屏中以寻找绑定这个领域的合作伙伴。我们的结果认为,PX结构域是真彩易福彩 - 彩易福彩质相互作用模块,主要与膜彩易福彩粘合,涉及凹凸彩易福彩质。

      实验步骤

       质粒和菌株 -

      pobd2和poad(
      • Cagney G.
      • Uetz P.
      • 领域S.
      使用双杂交测定的彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用的高通量筛选..
      )低拷贝质粒分别用作双杂交诱饵和猎物载体。对于GRD19P,SPO14P和SNX42P / CVT20P诱饵,高拷贝质粒PGBD(
      • 詹姆斯P.
      • Halladay J.
      • 克雷格e.a.
      基因组图书馆和宿主菌株设计用于酵母中高效的双杂化选择。
      )已被使用(请由E. Canibear提供)。这些载体表达了Gal4彩易福彩的融合,Gal4广告 -orf(猎物矢量)和gal4达德-orf(诱饵载体)。
      盖尔4的建设达德 - 通过PCR和重组进行抵御融合(
      • 马蹄
      • Kunes S.
      • Schatz P.J.
      • Botstein D.
      酵母中同源重组的质粒结构..
      )如参考文献所述。
      • Uetz P.
      • 爱情L.
      • Cagney G.
      • Mansfield T.A.
      • 犹太森r.s.
      • 骑士J.R.
      • 洛克森D.
      • Narayan V.
      • Srinivasan M.
      • Pochart P.
      • Qureshi-Emili A.
      • 李Y.
      • Godwin B.
      • Conover D.
      • kalbfleisch t.
      • Vijayadamodar G.
      • 杨米
      • 约翰斯顿M.
      • 领域S.
      • Rothberg J.M.
      综合分析彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用 酿酒酵母酿酒酵母..
      。使用乙酸锂程序进行转化(
      • ITO H.
      • Fukuda Y.
      • 穆塔塔克。
      • kimura a。
      用碱阳离子处理完整酵母细胞的转化..
      )。诱饵构建体被转化为酵母菌株PJ69-4α(
      • Uetz P.
      • 爱情L.
      • Cagney G.
      • Mansfield T.A.
      • 犹太森r.s.
      • 骑士J.R.
      • 洛克森D.
      • Narayan V.
      • Srinivasan M.
      • Pochart P.
      • Qureshi-Emili A.
      • 李Y.
      • Godwin B.
      • Conover D.
      • kalbfleisch t.
      • Vijayadamodar G.
      • 杨米
      • 约翰斯顿M.
      • 领域S.
      • Rothberg J.M.
      综合分析彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用 酿酒酵母酿酒酵母..
      )和留到pj69-4a(
      • 詹姆斯P.
      • Halladay J.
      • 克雷格e.a.
      基因组图书馆和宿主菌株设计用于酵母中高效的双杂化选择。
      )。
      对于表达Gal4的菌株达德-orf融合,通过DNA测序证实了成功的克隆。
      PX.域克隆到pgstag中(
      • 罗恩
      • 德莱德H.
      PGSTAG-一种多功能细菌表达质粒,用于重组彩易福彩的酶标。
      )作为表达他们的GST融合,由Jong W. Yu和Mark A. Lemmon(
      • yu J.W.
      • LEMMON M.A.
      所有Phox同源性(PX)域来自 酿酒酵母酿酒酵母 具体识别磷脂酰肌醇3-磷酸酯..
      )。
      质粒pGSTAG-YPT35Y123A 使用以下引物使用Quick-Change™站点定向诱变套件(Stratagene,La Jolla,CA)构建:CCA AAC CTA TAA ACG A.GC CTC CGA TTT CGT CAG(前进),CTG ACG AAA TCG GG GCT CG.T TTA标签GTT TGG(反向),具有以粗体显示的突变基座。

       双杂交屏和重新测试 -

      包含大多数〜6,000的数组 酿酒酵母酿酒酵母 ORF表示为GAL4广告 融合用于筛选彩易福彩质(
      • Uetz P.
      • 爱情L.
      • Cagney G.
      • Mansfield T.A.
      • 犹太森r.s.
      • 骑士J.R.
      • 洛克森D.
      • Narayan V.
      • Srinivasan M.
      • Pochart P.
      • Qureshi-Emili A.
      • 李Y.
      • Godwin B.
      • Conover D.
      • kalbfleisch t.
      • Vijayadamodar G.
      • 杨米
      • 约翰斯顿M.
      • 领域S.
      • Rothberg J.M.
      综合分析彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用 酿酒酵母酿酒酵母..
      )。单倍体转化体表达全长GAL4达德-orf融合彩易福彩或gal4达德-PX-Domain--仅融合彩易福彩与阵列配合。由此产生的二倍体与生物群照片2000实验室自动化工作站(Beckman-Coulter,Fullerton,CA)固定在选择性介质上。来自第一圆形屏幕的正面捕食克隆被重新排列为四份副本并再次测试以进行再现性。所有重新测试至少进行了八次,它们的结果用于为我们的阳性分配“质量”分数:在12个或更多测试中至少八个测试中可重现的阳性是3,所发现的阳性12个(或更多)测试中的至少四次被分配2的分数,并且分配了两到三次的阳性,分配了1.如果结果难以引起的结果难以解释,则将一些高度可重复的阳性归类为1。背景或其他原因。由基因本体描述符进行分类为双杂交阳性 酿酒酵母 Genome Database (www.yeastgenome.org.)。

       彩易福彩质表达和GST-下拉 -

      之前描述了PGSTAG-GST-PX结构域融合彩易福彩的表达克隆(
      • yu J.W.
      • LEMMON M.A.
      所有Phox同源性(PX)域来自 酿酒酵母酿酒酵母 具体识别磷脂酰肌醇3-磷酸酯..
      ,
      • 罗恩
      • 德莱德H.
      PGSTAG-一种多功能细菌表达质粒,用于重组彩易福彩的酶标。
      )。融合到GST的PX结构域对应于以下碎片:Bem1p-(氨基酸269-418),BEM3P-(502-637),GRD19P-(1-162),MDM1P-(776-908),MVP1P-(121 -258),SNX4P-(20-170),SNX42P-(150-316),VPS5P-(271-397),VPS17P-(88-234)和YPT35-(65-214)。彩易福彩质被表达 大肠杆菌 根据制造商推荐的(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)上的谷胱甘肽-Sepharose纯化。
      用于YIP1P,YIF1P和YIP4P的改性引物,含有T7启动子和真核转换初期序列,用于 体外 使用T的转录和翻译nT™ - 在[中的存在下耦合的网状细胞系统35S]甲硫氨酸(Promega,Madison,Wi)。 PCR引物如下:向前,GGA TCC TCA TAC GAC TCA CTA标签GGA ACA GCC ACTG TCT TTC TAC AAT AGT; yip1p反向,tca gac aaa aat tac cat gag; yip1p-n terminus反向,gat ccc cgg gaa ttg cca tgc cca gcc aaa tct gaa tcg tt; YIF1P前进,GGA TCC TAA TAC GAC TCA CTA标签GGA ACA GCC ACT ATG TCT TAT AAT CCG TAC GCA; yif1p反向,tca acc cat taa cca cat标签; yif1p-n terminus反向,gat ccc cgg gaa ttg cca tgg tcc ata att cgt tgc cag tt; yip4p前进,gga tcc taa tac gac tca cta标签gga aca gcc acc Atg tca tac gga aga gac; YIP4P反向,TCA GAA CTT TCT GCC GTG GCT。
      单独的GST-PX结构域融合彩易福彩或GST偶联与谷胱甘肽 - 琼脂糖珠(Amersham Pharmacia Biotech),并与5μl温育 体外 - 下拉缓冲液中的翻译彩易福彩(20米m Tris pH 7,6; 1 mm mercaptoethanol; 3 mm EDTA, 150 mm NACL; 1%Nonidet P-40)在旋转下4℃下2小时。用下拉缓冲液(1×1%,4×0.1%和1×0%),在SDS样缓冲液中收获,用下拉缓冲液洗涤结合的彩易福彩质(在4℃下旋转10分钟)。 SDS-PAGE和AutorAcroadography分析。

       脂质覆盖测定 -

      如前所述进行彩易福彩质 - 脂质覆盖测定(
      • Dowler S.
      • Kular G.
      • Alessi D.R.
      彩易福彩质脂质覆盖试验..
      )。简而言之,发现含有6.5至200pmol溶解在氯仿/甲醇/水(1:2:0.8)的混合物中溶解的1μl脂质溶液,并在杂交-C额外的膜上,使其在室温下干燥1小时。在TBST中以3%(w / v)脂肪酸的无酸Bsa封闭膜[50米m Tris / HCl,pH 7.5,150米m NaCl,0.1%(v / v)吐温20] 1小时。然后将膜在4℃下在4℃温育过夜,在含有5μg所示的GST-融合彩易福彩的相同溶液中温和搅拌。将膜在TBST中六次洗涤30分钟,然后用1:1,000稀释的小鼠抗GST单克隆抗体(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo)温育1小时,再次洗涤,然后孵育1小时,1:5,000稀释的抗小鼠辣根过氧化物酶缀合物(Bio-rad,Hercules,CA)。最后,在TBST中洗涤膜12次,通过ECL(Amersham)检测膜结合的GST-融合彩易福彩。

       交互可视化软件 -

      用Cytoscape进行相互作用(www.cytoscape.org.)(
      • IDEKER T.
      • ozier O.
      • Schwikowski B.
      • Siegel A.F.
      发现分子交互网络中的调节和信号电路..
      )。

       详细的协议 -

      更详细的协议可用 Itgmv1.fzk.de/www/itg/uetz/protocols/.

      结果

      我们之前的双混合数据(
      • Uetz P.
      • 爱情L.
      • Cagney G.
      • Mansfield T.A.
      • 犹太森r.s.
      • 骑士J.R.
      • 洛克森D.
      • Narayan V.
      • Srinivasan M.
      • Pochart P.
      • Qureshi-Emili A.
      • 李Y.
      • Godwin B.
      • Conover D.
      • kalbfleisch t.
      • Vijayadamodar G.
      • 杨米
      • 约翰斯顿M.
      • 领域S.
      • Rothberg J.M.
      综合分析彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用 酿酒酵母酿酒酵母..
      表明PX结构域可以充当彩易福彩质相互作用域,但是应该注意,即使酵母“Px结构域的彩易福彩质彩易福彩GRD19P和YPT35P也包含除PX结构域本身之外的一些附加序列。为了扩展我们之前的发现,我们筛选了所有含酵母PX结构域的彩易福彩质及其隔离的PX域反对a S. Cerevisiae. 全基因组二杂化阵列含有大多数酵母ORF作为GAL4激活域融合(
      • Uetz P.
      • 爱情L.
      • Cagney G.
      • Mansfield T.A.
      • 犹太森r.s.
      • 骑士J.R.
      • 洛克森D.
      • Narayan V.
      • Srinivasan M.
      • Pochart P.
      • Qureshi-Emili A.
      • 李Y.
      • Godwin B.
      • Conover D.
      • kalbfleisch t.
      • Vijayadamodar G.
      • 杨米
      • 约翰斯顿M.
      • 领域S.
      • Rothberg J.M.
      综合分析彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用 酿酒酵母酿酒酵母..
      )。由于双杂交的相互作用经常遭受不完全不完全的再现性,因此我们重新分析了四肢副本中的所有阳性相互作用,以确保其中没有随机激活事件出现。这些屏幕的代表性结果显示在 Fig. 1。所有互动的摘要都显示在 Fig. 2表二, 分别。我们将三个“S”值中的一个分配给我们数据集中的交互,以反映各种重复性(表二,有关详细信息,请参阅“实验程序”)。我们发现27个高度可重复的相互作用,表示为3英寸的S值 表二,18个可重复的相互作用(S = 2)和30个相互作用,其再现几次,但不一致(s = 1)。该分类是我们相互作用可靠性的粗略指示,并且可以与其相互作用强度大致相关。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1酵母双杂交屏幕和结果。A,使用YPT35P作为诱饵的双混合阵列屏幕。显示仅是板12(16个),具有一个正,RBD2P(参见“实验程序”的详细信息)。 B,用每份猎物重保持板。请注意,基因组屏幕如图所示 A 重复两次,但只有两个屏幕上积极的射精被重新测试以确保可重复性(详见文本)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2酵母中的PX域交互网络。 px-结构域的彩易福彩质(厚边)和孤立的px域(红色箭头)在酵母中。箭头的厚度代表了相互作用的再现性(IE。 分数1-3 in. )。颜色代表彩易福彩质的定位和它们的基因本体论(GO)术语(参见“实验程序”)。
      T有能力的 II酵母Px彩易福彩的两杂合物相互作用
      PX彩易福彩质PX Domain.
      a 没有符号,仅使用全长彩易福彩获得相互作用,但注意到GRD19P和YPT35P基本上仅为PX彩易福彩; o,用全长彩易福彩质及其PX结构域获得的相互作用; PX,仅使用其PX域获得交互。
      猎物双混合质量分数
      b 3,高度可重复,具有强信号; 2,可重复; 1,再现多次但不一致。
      go关键词
      c 星号(*)表示具有多种功能的彩易福彩质。
      参考。
      d 我,ITO. 等等。 2001 (
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      • 威廉姆斯H.P.
      鉴定酵母vps5p和vps17p的酵母函数域。
      )。
      Bem1pCdc24p2细胞极性*I
      Grd19pAdh1p1发酵
      Akr2p1未知
      Apg17p1自噬
      Rbd2p3未知
      RVS167P.1内吞作用*
      Sec15p1细胞极性*
      Yif1p3er-golgi运输
      Yip1p3尿布运输
      Yip5p3尿布运输
      YLR031P.1未知
      YLR424P.1拼接
      Ypt53p2真空瞄准*
      Mvp1pPX.Std1p1Pol II成绩单。*
      PX.Yra2p2MRNA出口
      Snx42pPX.Rrn10p2Pol I转录U
      Snx4p3肤质运输*U
      Yip1p1尿布运输
      Snx4pApg17p1自噬I
      Ask10p2转录
      Cog2p3呃到高尔基运输*
      Cog6p3内部车内运输
      Dam1p1主轴组件
      Ecm11p3细胞壁生物发生
      Lcp5p1rRNA修改*
      nip100p.3有丝分裂的Anaphase B.
      Sds3p3组彩易福彩脱乙酰化*
      Sec15p3细胞极性*
      Sgt1p1复杂装配*
      Snx41p3彩易福彩质运输I
      Snx42p3真空瞄准*
      Swf3p1线粒体
      Vma8p1真空酸化
      Vps17p3内体组-GOLGI TR。
      YLR031P.3未知
      YLR424P.1mRNA拼接
      YNL086P.3未知
      YPL201P.1未知
      Vam7poAkr2p1未知
      Avt2p2运输
      oBsp1p3肌动彩易福彩细胞骨架*
      Ecm11p2细胞壁生物发生
      oRbd2p1未知U
      Rpt5p2彩易福彩质分解代谢
      Spc72p2Chromos。隔离*U
      Vps21p1真空瞄准*
      YGR223P.3未知
      oYif1p3呃到高尔基运输U
      oYip1p3尿布运输
      Yip5p2尿布运输U
      Vps17pPX.Akr2p1未知
      PX.Bsp1p1肌动彩易福彩细胞骨架*
      Vps5p3Golgi保留*U
      PX.Yif1p2呃到高尔基运输
      PX.Yip1p2尿布运输
      PX.Ypt53p1真空瞄准*
      Vps5pBub1p1彩易福彩质磷素。*
      Vps17p2内体 - > GolgiU
      Vps35p2Golgi保留*S
      YNL086P.1未知
      Ypt35pAkr2p3未知U
      Atr1p1多药运输
      Bet1p1呃到高尔基运输*
      Bos1p2呃到高尔基运输
      Ktr3p1细胞壁生物生成*U
      Pep12p1Golgi-VACUOLE运输
      Rbd2p3未知U
      Sps18p1孢子化
      Tvp23p2未知
      Yif1p3呃到高尔基运输U
      Yip1p3尿布运输
      Yip4p3尿布运输
      Yip5p3尿布运输U
      Ymd8p2核苷酸 - 糖转发。
      Yor292P.2未知
      a 没有符号,仅使用全长彩易福彩获得相互作用,但注意到GRD19P和YPT35P基本上仅为PX彩易福彩; o,用全长彩易福彩质及其PX结构域获得的相互作用; PX,仅使用其PX域获得交互。
      b 3,高度可重复,具有强信号; 2,可重复; 1,再现多次但不一致。
      c 星号(*)表示具有多种功能的彩易福彩质。
      d 我,ITO. 等等。 2001 (
      • ITO T.
      • 千叶T.
      • ozawa R.
      • Yoshida M.
      • Hattori M.
      • Sakaki Y.
      全面的双杂化分析探索酵母彩易福彩彩易福彩酶..
      ); U,Uetz. 等等。 2000 (
      • Uetz P.
      • 爱情L.
      • Cagney G.
      • Mansfield T.A.
      • 犹太森r.s.
      • 骑士J.R.
      • 洛克森D.
      • Narayan V.
      • Srinivasan M.
      • Pochart P.
      • Qureshi-Emili A.
      • 李Y.
      • Godwin B.
      • Conover D.
      • kalbfleisch t.
      • Vijayadamodar G.
      • 杨米
      • 约翰斯顿M.
      • 领域S.
      • Rothberg J.M.
      综合分析彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用 酿酒酵母酿酒酵母..
      ); S,Seaman. 等等。 1998 (
      • Seaman M.N.
      • 威廉姆斯H.P.
      鉴定酵母vps5p和vps17p的酵母函数域。
      )。
      在列出的75个互动中 表二,17岁以前发表过。其中大部分人,14岁属于我们的课程2和3,这证实了他们的有效性。

       全长与域交互 -

      在酵母中的15个PX结构域彩易福彩质中,当它们被筛选为全长彩易福彩质时,九个总共有67个双杂交相互作用(表二)。我们没有发现五种彩易福彩质(BEM3P,MDM1P,SPO14P,YKR078P和YPR097P)的任何可重复的相互作用。不进一步研究SNX41P,因为它表明它是一个非常强烈的转录激活剂,即使在高3at浓度下也是如此。
      当我们使用隔离的PX域作为诱饵时,只有来自MVP1P,SNX42P,VAM7P和VPS17P的那些,总共有13个可重复的相互作用(表二)。
      BEM1P,SNX4P和VPS5P在我们的测定中仅作为全长彩易福彩质相互作用,即它们的PX结构域与任何其他彩易福彩质不相互作用。这表明这些诱饵的其他域介导其相互作用。 GRD19P和YPT35P仅作为全长彩易福彩测试,因为它们几乎完全由其PX域组成。但是,它们的双杂交相互作用用PX-ock-opplance确认 体外 (见下文)。在一种情况下,MVP1P,我们没有找到全长彩易福彩的任何相互作用,而其PX结构域令人惊讶地与两种核彩易福彩质,STD1P和YRA2P相互作用。
      最后,对于SNX42P,VAM7P和VPS17P,我们发现与全长彩易福彩和孤立的域不同但具体,相互作用。有趣的是,只有VAM7P产生了全长彩易福彩质和其PX结构域发现的相互作用。
      由于我们发现仅与PX结构域而不是相应的全长彩易福彩质的相互作用,我们得出结论,全长彩易福彩通常会防止相互作用,可能是由于它们与GAL4结构域融合的融合。无论机械原因可能是什么,这表明我们可能已经错过了大量的互动,尽管我们的综合方法。通过将域作为诱饵的更广泛使用可能会阻止这种假否定。

       PX彩易福彩互动者的性质 -

      从预期的许多含Px结构域的彩易福彩质的作用如分类Nexins,我们鉴定的术前富含彩易福彩质,已知植入囊泡转运(36%的捕发物,而全基因组的5%)。有趣的是,相对大的相互作用剂是无表称彩易福彩质(20 相对 30.5%)。所有其他功能课程组合的所有捕食物的44%(全基因组,64%)均占。
      类似地,当分析定位数据而不是功能注释时,大多数(49%)的毛绒已局限于分泌或内吞途径,即对内质网(ER),高尔基,底体或液泡。因此,53%的捕食器代表膜或膜相关彩易福彩质,这有点意外,因为通常据说膜彩易福彩在双杂交筛网中抵抗检测。另一个意外发现是SNX4P,SNX42P和MVP1P都与大量的核彩易福彩相互作用。
      在我们的猎物中没有单一域或主题是常见的。然而,一些域名被显着富集。含有四种PX结构域的彩易福彩质与另一个PX结构域彩易福彩质结合,导致四对:VPS17P-VPS5P,VPS17P-SNX4P,SNX4P-SNX42P和SNX42P-SNX41P。然而,因为仅PX域的诱饵不再现这些相互作用,所以这反映了这些分选Nexins的其他部分的特性 - 特别是它们的卷绕线圈区域,这已被证明在其他研究中驱动均外和杂寡聚化。在VPS17P-VPS5P互动的研究中,此发现已独立确认(
      • Seaman M.N.
      • 威廉姆斯H.P.
      鉴定酵母vps5p和vps17p的酵母函数域。
      )。
      一类显着的射击赛包括YIP1彩易福彩质(
      • Calero M.
      • Winand N.J.
      • 柯林斯r.n.
      鉴定新型彩易福彩质YIP4P和YIP5P作为RAB GTP酶的相互作用因子。
      )。九个生产性Px彩易福彩(YPT35P,VAM7P,GRD19P,VPS17P,SNX42P)中的五个与YIP1家族的至少一个成员相互作用,并且这些相互作用由PX域定义,如使用PX域的诱饵和/或经过 体外 互动研究(见下文)。
      在Px彩易福彩交互运动中反复发现的其他结构域是圈套结构域(在与bet1p,bos1p和pep12p的ypt35p相互作用中,rab结构域(vps17p-ypt53p,grd19p-ypt53p,Vam7p-vps21p)和pH结构域(SNX4P- Ask10P,BEM1P-CDC24P)。但是,这些交互都不是涉及PX域,只有全长诱饵,而不是PX域,而不是PX-Only BAITS检测这些毛绒。

       PX域名与yip1家族成员互动 -

      鉴于PX域与高度疏水的yip1家族成员在我们的双混合屏幕中令人惊讶的强烈相互作用,我们想验证这些结果 体外 结合测定。我们的双杂交屏中阳性阳性的所有酵母px结构域都表示为GST融合彩易福彩 大肠杆菌 并纯化在谷胱甘肽 - 琼脂糖珠珠。请注意,无法测试MVP1P和VAM7P PX域,因为它们是不稳定或不溶性的。 yip1p,yip4p和yif1p被翻译和 35标签 体外 并与GST-PX融合彩易福彩孵育。 yip5p无法测试,因为它是它的 体外 翻译反复失败。我们的 体外 绑定测定清楚地表明,YIP1家族成员特别结合某些PX域(Fig. 3)。显示最强的相互作用为YPT35-PX,它与YIF1P强烈相互作用,yip1p和yip4p略微少。 VPS17-PX显示出类似的结合图案,尽管总体绑定强度似乎较弱。 SNX4-PX仅限于YIP4P。来自SNX42P优选YIP1P OVER YIF1P的PX域,而VPS5P PX域似乎最强烈地绑定到YIF1P。综述了孤立的PX域与YIP1家族成员的相互作用 表III.
      图缩略图GR3.
      Fig. 3PX.域与yip1家庭成员绑定 体外. 测试各种GST-PX结构域融合彩易福彩,用于YIP1P,YIF1P和YIP4P结合 体外。图片上 最佳 每个面板显示Coomassie蓝染色的GST融合彩易福彩,而且 底部行 显示绑定叶彩易福彩的放射自显影(参见“实验程序”了解详情)。 YIP1P和YIF1P与YPT35-PX域同样强,而YIP4P仅限于弱。 YIF1P和YIP1P也受VPS17-和VPS5-PX域的约束,并且通过SNX42-PX域弱。 YIP4P另外受Px域SNX4和VPS17的约束。 I, 输入; L,梯子(分子量标记)。
      T有能力的 IIIGST.-下拉实验的结果
      GST.毛皮
      Yip1pYip4pYif1p
      YPT35-PX.+++++
      vps17-px.+(+)+
      SNX4-PX.++
      MDM1-PX.
      Grd19p( - )
      SNX42-PX.+(+)
      vps5-px.( - )(+)
      BEM1-PX.
      BEM3-PX.

       两种杂种和体外绑定数据的比较 -

      体外 绑定数据呈现 Fig. 3 在很大程度上支持了我们的双杂交结果。但是,有一些显着的差异:yif1p明确绑定到vps5-px 体外,而我们的双混合动力屏幕没有将任何与vps5p作为诱饵的yip1家族互动。同样,SNX4-PX似乎与YIP4相互作用 体外,但不在我们的双混合屏幕中。
      相比之下,GRD19P用yif1p,yip1p和yip5p在双杂交测定中强烈相互作用,但结合几乎无法检测到 体外 (yip5没有测试)。
      最后,我们观察了一个双混合交互,SNX42P-yip1p,只有全长诱饵(但不是PX-ONLES诱饵),尽管SNX42-PX与YIP1P和YIF1P弱互动 体外.

       ypt35-px绑定到yip1和yif1 n termini-

      YIP1家族成员是极其疏水的彩易福彩质,有两到五个预测的跨膜域(
      • Calero M.
      • Winand N.J.
      • 柯林斯r.n.
      鉴定新型彩易福彩质YIP4P和YIP5P作为RAB GTP酶的相互作用因子。
      )。唯一显着的细胞质部分是叶彩易福彩之间的〜100-150氨基酸的N-末端结构域。我们想知道此域是否与PX域交互。 体外-Translated yif1p和yip1p n termini确实绑定到gst-ypt35-px(Fig. 4)。与剩余的C末端半部的结合测定也显示出一些弱结合,但不确定(数据未显示)。因此,如果YIP1P和YIF1P的C Termini中的小型细胞质环,则仍然不清楚是否有助于PX结合。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4yip1p和yif1p n末端碎片绑定 体外 to Ypt35-PX. YPT35-PX域绑定 体外 到YIP1P(1-112AA)和YIF1P(1-138AA)的N-末端结构域。 I, 输入; L,梯子(分子量标记); fl,全长彩易福彩质; n-term.,n末端片段。

       PI结合不是必需的彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用 -

      接下来询问PTDINS(3)P结合位点是否有助于我们对PX结构域观察到的彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用。我们通过将点突变(Y123A)引入YPT35-PX的脂质结合口袋来解决这种可能性,我们预测应该基于VAM7P,SNX3P,CVT20P和CVT13P中的类似突变的结果损害PTDINS(3)P结合(
      • Cheever M.L.
      • 佐藤T.K.
      • 德啤酒T.
      • Kutateladze T.G.
      • EMR S.D.
      • 过量泛
      PHOX结构域与PTDINS(3)p靶向VAM7 T-SNARE以储液膜。
      ,
      • 徐Y.
      • Hortsman H.
      • SEET L.
      • 黄S.H.
      • 洪W.
      SNX3通过与PTDINS(3)P的PX-域介导的相互作用来调节内体功能。
      ,
      • 很好的D.C.
      • 佐藤T.K.
      • stromhaug p.e.
      • EMR S.D.
      • Klionsky D.J.
      在预自噬体结构中需要对液体靶向靶向途径彩易福彩,CVT13和CVT20的合作结合,对磷脂酰肌醇3-磷酸酯进行选择性自噬。
      )。 Y123A突变未完全取代PTDINS(3)p结合YPT35P,如彩易福彩质 - 脂质覆盖测定所示,尽管其结合亲和力显着降低(图5A)。重要的是,这种突变并没有阻止 体外 YPT35-PX与任何YIP1家族成员的绑定(图5B.),尽管与野生型彩易福彩质相比,结合彩易福彩的量似乎略微减少。因此,脂质结合可能不会干扰PX结构域中的彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用(尽管两个配体可以合作)。此外,这表明相互作用彩易福彩也使用不同的相互作用表面而不是脂质,或者至少不需要临界酪氨酸-123,其参与结合PIS的磷酸盐头组。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5彩易福彩质 - 彩易福彩质相互作用与PX结构域磷脂结合无关。A,YPT35-PX结构域对PTDINS(3)p及其突变ypt35p的亲和力Y123A通过彩易福彩质 - 脂质覆盖测定评估-PX。在不同浓度下发现PTINS在硝酸纤维素膜上,并用5μg的GST-融合彩易福彩以及单独的GST孵育(数据未示出)。用抗GST抗体检测彩易福彩质的结合。 YPT35P.Y123A-PX突变体表现出明显减少的结合亲和力,因为与仍然以6.25pm​​ol浓度浓度纳入的野生型彩易福彩质相比,在12.5μmol的脂质浓度下没有检测到结合。因此,突变体的突变体(3)p的总结合减少了约3倍。 B,突变体GST-YPT35PY123A 用部分废除的PTDINS(3)P结合与YIP1P,YIF1P和YIP4P相似的相互作用,如野生型YPT35-PX。 I, 输入; L,梯子(分子量标记)。

      讨论

       PI结合结构域作为彩易福彩质相互作用域 -

      我们在这里描述了与其他彩易福彩质的PX结构域相互作用的第一系统研究。我们的PX域两种混合屏幕最引人注目的结果是YIP1家族彩易福彩的重复外观(表二)。 yif1p,yip1p和yip5p始终用px结构域彩易福彩grd19p和ypt35p作为诱饵和vam7p(单独px结构域和全长彩易福彩)。 yip1p和yif1p另外用来自vps17p的px域发现。
      据报道,yif1p和yip1p将本地化为golgi(
      • 杨X.
      • 母系。
      • 加尔维茨D.
      特异性结合新颖的和必需的高尔基膜彩易福彩(YIP1P)功能性地将传输GTP酶YPT1P和YPT31P联系起来..
      ,
      • 母源H.
      • 杨X.
      • Andrulis E.
      • Sternglanz R.
      • 渗透H.H.
      • 加尔维茨D.
      一种新的Golgi膜彩易福彩是参与囊泡靶向的GTPase结合彩易福彩复合物的一部分。
      ),两种彩易福彩质已被假设为复合物的一部分(
      • 母源H.
      • 杨X.
      • Andrulis E.
      • Sternglanz R.
      • 渗透H.H.
      • 加尔维茨D.
      一种新的Golgi膜彩易福彩是参与囊泡靶向的GTPase结合彩易福彩复合物的一部分。
      )。最近,几项研究表明,来自ER膜的Copii囊泡萌芽是必要的yip1p / yif1p彩易福彩(
      • Heidtman M.
      • 陈C.Z.
      • 柯林斯r.n.
      • Barlowe C.
      在Copii囊泡生物发生中的yip1p作用..
      )和膜融合与高尔基(
      • 巴罗曼J.
      • 王W.
      • 张Y.
      • Ferro-Novick S.
      yip1p.yif1p复合物是内质网衍生囊泡的融合能力所必需的。
      )。 yip1p被认为是在er和golgi隔间之间循环(
      • Heidtman M.
      • 陈C.Z.
      • 柯林斯r.n.
      • Barlowe C.
      在Copii囊泡生物发生中的yip1p作用..
      )。
      因此,它令人惊讶的是,YIF1P / YIP1P的最强且最一致的PX结构域交流仪是已局限于内吞途径的彩易福彩质。例如,YPT35P主要发现与内体相关(
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      萌芽酵母彩易福彩质定位的全局分析..
      ),GRD19P局部化为真空膜(
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      )和细胞溶胶(
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      从预遗传池隔室检索常驻晚牙龈膜彩易福彩 酿酒酵母酿酒酵母 取决于GRD19P的功能..
      ),但它变得与前遗传厅相关联 Δvps27 null mutant cells (
      • voos w.
      • 史蒂文斯T.H.
      从预遗传池隔室检索常驻晚牙龈膜彩易福彩 酿酒酵母酿酒酵母 取决于GRD19P的功能..
      )。 VPS17P还通过C末期标记的GFP融合彩易福彩报道(
      • 嗯w.k.
      • Falvo J.v.
      • Gerke L.C.
      • 卡罗尔A.S.
      • 豪森·克林。
      • Weissman J.s.
      • o'shea e.k.
      萌芽酵母彩易福彩质定位的全局分析..
      )以及前遗料舱(
      • Burda P.
      • Padilla S.M.
      • Sarkar S.
      • EMR S.D.
      内部组到高尔基逆行传输中的回力函数由酵母VPS34 ptdins 3-激酶调节。
      )。 SNX42P和SNX4P也已归入后Golgi内体和预自血管瘤(
      • HETTEMA E.H.
      • 刘易斯M.J.
      • 黑色m.W.
      • Pelham H.R.
      回报器和分拣Nexins SNX4 / 41/42介导来自酵母内体的不同检索途径..
      )。 SNX42P也被发现在PerivaOLAR结构(
      • 很好的D.C.
      • 佐藤T.K.
      • stromhaug p.e.
      • EMR S.D.
      • Klionsky D.J.
      在预自噬体结构中需要对液体靶向靶向途径彩易福彩,CVT13和CVT20的合作结合,对磷脂酰肌醇3-磷酸酯进行选择性自噬。
      )。最后,VAM7P通常与真空膜相关联(
      • Boeddinghaus C.
      • Merz A.J.
      • 拉辛r.
      • Ungermann C.
      均型液泡融合需要从和PTDINS 3-P-DE PEND ENT重新旋转酵母液体的循环。
      ,
      • 佐藤T.K.
      • Darsow T.
      • EMR S.D.
      VAM7P,卡扣25样分子和VAM3P,一个语法同源物,在酵母血泡彩易福彩贩运中一起起作用。
      )。
      我们的发现有三种可能的解释,即一组ER / GOLGI彩易福彩(YIP1家族)与内体/真空彩易福彩相互作用(含PX结构域的彩易福彩质)。首先,在细胞质中可以发现至少一些Px彩易福彩的显着分数,并且可以少量募集到ER膜中,并在Copii囊泡形成期间作用。虽然没有直接证据,但5%的VAM7P与真空膜相关联,其余的是可溶的(
      • 佐藤T.K.
      • Darsow T.
      • EMR S.D.
      VAM7P,卡扣25样分子和VAM3P,一个语法同源物,在酵母血泡彩易福彩贩运中一起起作用。
      )。如果存在至少一种其他相关的本地化,则溶于溶于和因此衍射PX彩易福彩的细胞质级分。此外,Copii囊泡形成的位点似乎不易通过光学显微镜可见,也不是涉及这种高动态膜斑的彩易福彩质。其次,yif1p / yip1p彩易福彩仍然可能具有其他但不受注意的函数(独立于Copii囊泡形成)在后GOLGI分选或内吞作用。该思想得到了对接和运输囊泡的融合中的yip1p / yif1p结合rab gtb gtp gtp酶的要求支持,但不是萌芽(
      • Heidtman M.
      • 陈C.Z.
      • 柯林斯r.n.
      • Barlowe C.
      在Copii囊泡生物发生中的yip1p作用..
      )。此外,Sivars. 等等。 2003 (
      • Sivars U.
      • Aivazian D.
      • pfeffer s.r.
      YIP3催化内体Rab-GDI复合物的解离。
      )显示YIP3,哺乳动物YIP家族成员可以作为RAB GTP酶,特别是RAB9的靶向GDI - 位移因子。确定PX彩易福彩对招募GDF,他们的活动或一些下游事件,如GEFS的招募,可能有趣。第三,我们不能完全排除至少一些相互作用的可能性是没有生理相关性的实验伪影。然而,相互作用的特异性,表观优势,独立方法的确认争论这种可能性。
      有趣的是,在某些情况下,yif1p已被证明在某些情况下定位于液泡,例如在BTN2突变突变体中,这似乎不会破坏囊泡传输 本身 (
      • Chattopadhyay S.
      • 罗伯茨下午
      • Pearce D.A.
      黄抗疾病酵母模型:BTN2P在贩运Golgi相关的脉冲靶标彩易福彩中的作用,YIF1P ..
      )。此外,yif1p被定位于细胞质,并且可以自由地扩散到除er之外的位置(
      • Kumar A.
      • agarwal s.
      • 嘿曼J.A.
      • 马德森S.
      • Heidtman M.
      • Piccirillo S.
      • umansky l.
      • 绘图A.
      • Jansen R.
      • 刘Y.
      • 张克夫。
      • 米勒P.
      • Gerstein M.
      • 罗德尔G.S.
      • 斯奈德米
      酵母彩易福彩质组的亚细胞定位..
      )。
      即使YIF1P和YIP1P没有内吞作用或后GOLGI分类,也可以通过YIP4P和YIP5P接管这种功能,因为它们的定位仍然不清楚。 YIP5P定位于细胞质,如C末端标记的GFP融合彩易福彩(
      • 嗯w.k.
      • Falvo J.v.
      • Gerke L.C.
      • 卡罗尔A.S.
      • 豪森·克林。
      • Weissman J.s.
      • o'shea e.k.
      萌芽酵母彩易福彩质定位的全局分析..
      ),而YIP4P似乎在任何研究中都没有本地化。

       核PX互动 -

      我们惊讶地发现含几种含PX结构域的彩易福彩质显示出与核彩易福彩相互作用。虽然这是最初的意想不到的,但很明显存在肌醇磷酸盐与核职能的几种关系(参考文献审查。
      • 琼斯D.E.
      • Divecha N.
      将脂质与染色质联系起来..
      )。 MVP1P,将彩易福彩质的彩易福彩质分选到储液中,与STD1P弱,TBP缺失的抑制剂较小,因此可能是转录因子(尽管其生化功能未知)。 MVP1P还与YRA2P相互作用,该彩易福彩质涉及来自细胞核的mRNA。虽然两个相互作用的重要性尚不清楚,但值得注意的是,这两种MVP1P交互式互动剂都已在细胞核中以及细胞质中发现。 STD1P也已定位于质膜(
      • Schmidt M.C.
      • McCartney R.R.
      • 张X.
      • Tillman T.S.
      • SOLIMEO H.
      • Wolfl S.
      • Almonte C.
      • Watkins S.C.
      STD1和MTH1彩易福彩与葡萄糖传感器相互作用以控制葡萄糖调节的基因表达 酿酒酵母酿酒酵母..
      )。 VPS5P和SNX42P还具有与核彩易福彩的相互作用,其中SNX42P与RRN10P的相互作用显着,因为它似乎是SNX42P的PX结构域的特异性。对SNX42P-RRN10P相互作用的额外支持来自观察结果,即RRN10空突变体对Wortmannin的过敏,PI3激酶的抑制剂(
      • Zewail A.
      • 谢米尔。
      • 兴Y.
      • 林L.
      • 张P.F.
      • 邹W.
      • Saxe J.P.
      • 黄杰。
      用Wortmannin发现的化学基因组筛网发现的磷脂酰肌醇代谢途径的新功能..
      )。
      用SNX4P观察到核彩易福彩质相互作用最显着的含有七种与核彩易福彩的相互作用。其中两种是高度可重复的,即ECM11P和SDS3P。 ECM11p是一种不寻常的彩易福彩质,其突变体表现出与细胞外基质功能相关的表型,例如Zymolulate超敏反应。然而,彩易福彩质已局限于细胞核。它的分子功能仍然模糊不清。另一个核SNX4P互动仪SDS3P是抑制沉默的抑制器, IE。 它涉及沉默HMR配合盒基因座。其精确的生化活性也是未知的,但有趣的是,它结合磷酸肌醇4-磷酸盐 体外 (
      • 朱H.
      • Bilgin M.
      • Bangham R.
      • 大厅D.
      • Casamayor A.
      • Bertone P.
      • LAN N.
      • Jansen R.
      • BidlingMaier S.
      • Houfek T.
      • 米切尔T.
      • 米勒P.
      • Dean R.A.
      • Gerstein M.
      • 斯奈德米
      使用彩易福彩质组芯片的全局分析彩易福彩质活性..
      )。 RRN10和SDS3是38个基因中的两种,其缺失导致过敏的雾化活性,但仍有待确定的作用方式。
      在本文中,我们已经表明PX域可以与许多不同的彩易福彩质相互作用。最引人注目的是他们对YIP1家族的膜彩易福彩偏好。鉴于脊椎动物基因组中的叶斑和px彩易福彩的多样性更大,我们希望我们的调查结果鼓励对这些彩易福彩质的进一步研究,从而提高我们对它们的多样性,特异性和最终,生物学功能的理解。

      致谢

      我们要感谢Tanja Kuhn为优秀的技术援助,Sebastian Heuucke帮助双杂交测定,Jong W. Yu和Mark A. PX Domain GST融合构建体和对稿件的非常有用的评论,以及xiaoping yang刺激讨论和YIP1突变菌株。 Massimiliano Mazza和Michael Knop可帮助脂质覆盖实验。 Elizabeth Conibear提供了MVP1,GRD19,SPO14和VPS5诱饵构建体。 Ben Chun最初帮助构建和排序一些PX诱饵。在斯坦田的实验室首先进行了几种PX屏幕。

      补充材料

      参考

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