通过膜蛋白质组学分析发现结肠直肠癌生物标志物候选和随后使用所选反应监测(SRM)和组织微阵列(TMA)分析的验证*

      定量蛋白质组学技术的最新进展使得生物标志物的大规模验证。我们在这里进行了从结肠直肠癌组织的膜馏分进行定量蛋白质组学分析,发现生物标志物候选物,然后广泛地验证鉴定的候选蛋白质。在六个组织样品中鉴定了总共5566个蛋白质,每个蛋白质从息肉和癌症中获得,没有转移。 GO细胞成分分析预测,这些蛋白质的3087是膜蛋白,而TMHMM算法预测1567个蛋白质具有跨膜结构域。在没有转移的息肉和癌症之间的表达和55个细胞外蛋白的表达中观察到差异,而32个膜蛋白和17个细胞外蛋白的表达在癌症之间存在和无转移。使用具有稳定的合成同位素标记的肽作为内部对照,使用所选(或多个)反应监测(SRM / MRM)来定量总共105种这些生物标志物候选物。得到的结果揭示了这些蛋白质中69例的表达的差异,随后在一组独立的患者样品(息肉(息肉)中验证了这一点n = 10),没有转移的癌症(n = 10),癌症与转移(n = 10)))。在这些蛋白质中的44个表达中观察到显着差异,包括ITGA5,GPRC5A,PDGFRB和TFRC,其已经显示在结肠直肠癌中过表达,以及具有未知功能的蛋白质,例如C8ORF55。 C8ORF55的表达也显示出高于结肠直肠癌,而且在几种癌症组织中使用多血管组织微阵列,其包括来自14个癌组织的1150个核心。这是迄今为止对生物标志物候选膜蛋白的最大验证研究;我们使用SRM / MRM的生物标志物发现和随后验证的方法将有助于鉴定各种癌症的有用的生物标志物候选者。数据可通过Proteomexchange提供标识符PXD000851。
      蛋白质组学技术的最新进展促进了鉴定各种疾病的生物标志物。 LC-MS技术的改进导致已识别的蛋白质数量增加。此外,使用iSobaric标签的稳定同位素标记方法,用于相对和绝对定量(ITRAQ)
      使用的缩写是:ITRAQ,相对和绝对量定量的ISObaric标签; SRM,选定的反应监测; MRM,多次反应监测; PTS,相转移表面活性剂; Si-肽,稳定同位素标记的肽; CID,碰撞诱导的解离; HCD,能量碰撞诱导的解离; IHC,免疫组化; LC-MS / MS,液相色谱串联质谱; CE,碰撞能量; LTQ,线性离子阱; FDR,虚假发现率; TMA,组织微阵列。
      1使用的缩写是:ITRAQ,相对和绝对量定量的ISObaric标签; SRM,选定的反应监测; MRM,多次反应监测; PTS,相转移表面活性剂; Si-肽,稳定同位素标记的肽; CID,碰撞诱导的解离; HCD,能量碰撞诱导的解离; IHC,免疫组化; LC-MS / MS,液相色谱串联质谱; CE,碰撞能量; LTQ,线性离子阱; FDR,虚假发现率; TMA,组织微阵列。
      细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记使得多个样品的定量分析(
      • 罗斯P.L.
      • 黄玉。
      • Marchese J.N.
      • 威廉姆斯B.
      • 帕克克。
      • 哈桑斯。
      • Khainovski N.
      • Pillai S.
      • 丹尼尔斯S.
      • Purkayastha S.
      • Juhasz P.
      • 马丁斯。
      • Bartlet-Jones M.
      • 雅各布森A.
      • Pappin D.J.
      多路复用蛋白质定量 酿酒酵母酿酒酵母 使用胺反应性的等离性标记试剂。
      ,
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      )。因此,已经将大量蛋白质被鉴定为生物标志物候选者;然而,只有少数人已经在实际应用中使用,因为大多数尚未进入验证阶段,其中潜在的生物标志物候选量大规模定量。如果可获得这些候选物的特异性和特征良好的抗体,通常使用蛋白质印迹和酶联免疫吸附测定(ELISA)来完成生物标志物候选的验证。然而,对于大多数新的生物标志物候选蛋白,目前具有高度特异性抗体目前不可用,并且需要大量的时间和金钱来获得这些抗体,并优化许多候选者的ELISA测定系统;因此,需要开发另一个验证测定系统。选定(或多个)反应监测(SRM或MRM)预先显示是验证生物标志物候选者的潜在有效方法(
      • Whiteaker J.R.
      • 张H.
      • 赵L.
      • 王P.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • 艾迪r.g.
      • Piening B.D.
      • 冯L.C.
      • Kasarda E.
      • Gurley K.E.
      • ENG J.K.
      • Chodosh L.A.
      • Kemp C.J.
      • McIntosh M.W.
      • Paulovich A.G.
      乳腺癌小鼠模型中显示了基于质谱的发现和生物标志物的确认的集成管道。
      ,
      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • MANI D.R.
      • 施X.
      • Kuhn E.
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      靶向质谱与稳定同位素稀释患者血浆中心血管生物标志物的定量。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 林C.
      • 肯尼迪J.
      • 侯L.
      • tr
      • Sokal I.
      • 闫诗
      • Schoenherr r.m.
      • 赵L.
      • Voytovich U.J.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • Krasnoselsky A.
      • Gafken P.R.
      • Hogan J.M.
      • 琼斯L.A.
      • 王P.
      • Amon L.
      • Chodosh L.A.
      • 尼尔森第3升
      • McIntosh M.W.
      • Kemp C.J.
      • Paulovich A.G.
      基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
      )。 SRM / MRM测定可以在没有抗体的高灵敏度和吞吐量下测量多个靶标;因此,对于初始定量评估和生物标志物候选的大规模验证是有用的,其定义了数百种生物标志物候选蛋白的验证。
      除了这些技术改进之外,分馏过程还在生物标志物发现的蛋白质组分析中起着重要作用。该过程非常有效地详细分析特定细胞室或细胞器的蛋白质体,这降低了样品复杂性。膜馏分的制备先前被证明可用于鉴定通常在相对较低水平的膜蛋白蛋白。膜蛋白在许多生物学功能中起重要作用,例如信号转导,细胞 - 细胞相互作用和离子转运,占哺乳动物基因组编码的所有蛋白质的约38%,也是超过三分之一的生物标志物候选者,也是如此药物治疗的潜在目标(
      • Ahram M.
      • Litou Z.I.
      • 方罗。
      • Al-Tawallbeh G.
      人蛋白质组中膜蛋白的估计。
      ,
      • 霍普金斯A.L.
      • 新郎C.R.
      可毒性基因组。
      )。因此,膜蛋白质组分析对于生物标志物发现是重要的。然而,困难已经与提取和溶解膜蛋白和随后的蛋白酶消化有关。因此,已经开发了许多程序以改善膜蛋白的溶解和消化(
      • 陈娥。
      • Cociorva D.
      • Norris J.L.
      • YALES 3RD。,J.R.
      霰弹枪蛋白质组学质谱相容表面活性剂的优化。
      ,
      • Mitra S.K.
      • 甘特J.A.
      • 红宝石J.f.
      • Clouse S.D.
      • Goshe M.B.
      膜蛋白质组学分析 拟南芥蒂利亚纳 使用替代溶解技术。
      ,
      • 张恩。
      • 陈R.
      • 年轻人。
      • 愿望D.
      • 冬季P.
      • Weiner J.H.
      • Li L.
      SDS-和甲醇辅助蛋白溶解和消化方法的比较 大肠杆菌 膜蛋白质组分析2-D LC-MS / MS。
      ,
      • 周J.
      • 周T.
      • Cao R.
      • 刘Z.
      • 沉J.
      • 陈P.
      • 王X.
      • 梁S.
      脱氧胆酸钠施用对大鼠海马膜膜蛋白质组学分析的评价。
      )和使用相转移表面活性剂(PT)的方案显示使用LC-MS / MS适用于膜蛋白质组学(
      • Masuda T.
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      相转移表面活性剂助剂胰蛋白酶消化用于膜蛋白质组分析。
      ,
      • Masuda T.
      • 锡达尔
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      无偏见的定量 大肠杆菌 使用相转移表面活性剂的膜蛋白质组。
      )。
      对比较的选择对于识别潜在的生物标志物也很重要。来自癌症患者的组织样本已被用于许多研究中通过蛋白质组学分析发现生物标志物候选者。以前的研究包括我们自己,试图将癌症组织与匹配的正常组织进行比较(
      • 汤汤汤
      • 松下K.
      • yamaguchi s.
      • OH-ISHI M.
      • Kodera Y.
      • Maeda T.
      • Shimada H.
      • Ochiai T.
      • 野村F.
      用琼脂糖二维凝胶电泳鉴定原发性结肠直肠癌中改变的蛋白质表达和翻译后修饰。
      ,
      • Nishimori T.
      • 汤汤汤
      • 松下K.
      • OH-ISHI M.
      • Kodera Y.
      • Maeda T.
      • 野村F.
      • Matsubara H.
      • Shimada H.
      • Ochiai T.
      原发性食管鳞状细胞癌的蛋白质组学分析显示细胞粘附蛋白,细胞粘附蛋白的下调。
      ,
      • Seimiya M.
      • 汤汤汤
      • 松下K.
      • Sunaga M.
      • OH-ISHI M.
      • Kodera Y.
      • Maeda T.
      • Takano S.
      • Togawa A.
      • yoshitomi h.
      • Otsuka M.
      • Yamamoto M.
      • NA.kano M.
      • Miyazaki M.
      • 野村F.
      鉴定原发性肝细胞癌的新型免疫组织化学肿瘤标志物; Clathrin重链和离氨基转移酶环糊氨基酶。
      ,
      • 卡塔达K.
      • 汤汤汤
      • 砂浆M.
      • 松下K.
      • Tonoike Y.
      • Kodera Y.
      • Hanazawa T.
      • 野村F.
      • 好的amoto Y.
      Plectin促进癌细胞的迁移和侵袭,是头部和颈部鳞状细胞癌的新型预后标志物。
      )。然而,在正常和癌组织的组织学,遗传学和蛋白质组学中报道了显着的差异,并且通过使得难以缩小更可靠的候选者进行进一步验证的更难以缩小许多生物标志物候选者。 Lazebnik最近强调的是恶性的特征,但不是良性肿瘤可以用作癌症的标志(
      • Lazebnik Y.
      癌症的标志是什么?
      ),并且还使癌前病变更适合癌组织比正常组织对癌症进展鉴定的癌症组织更适合癌症组织。此外,癌症与癌症的比较也可以有助于发现参与癌症转移的生物标志物候选者。因此,通过比较不同阶段的癌组织,包括良性肿瘤,可以使用用于诊断和确定癌症预后的生物标志物候选者的鉴定应更有效。
      我们在本研究中进行了由结直肠癌组织和良性息肉中制备的膜级分的霰弹枪蛋白质组学分析,以鉴定癌症诊断和治疗的生物标志物候选者。我们通过使用膜蛋白萃取与PTS的膜蛋白提取,鉴定了与结肠癌进展相关的大量生物标志物候选蛋白,其次是ITRAQ标记。 SRM / MRM证实了这些生物标志物候选物的改变表达,并且使用独立的组织样品进一步验证了这些结果。还验证了一种具有非特异性功能的蛋白质,C8ORF55,用组织微阵列验证,其中包括各种类型的癌症。

      实验步骤

       组织样本

      手术切除33例原发性结直肠癌的组织。通过内窥镜膜切除术获得总共16种结肠息肉。在手术前从每位患者获得书面知情同意书。千叶大学医学院伦理委员会及其研究所批准了“议定书”。切除的样品在手术一小时内从息肉和癌组织获得。将所有切除的组织立即置于液氮中并储存在-80℃下进行进一步分析。

       膜级分的制备

      如前所述制备膜级分(
      • 穆拉奥卡斯。
      • kume h.
      • Watanabe S.
      • adachi J.
      • Kuwano M.
      • 佐藤M.
      • 川崎N.
      • Kodera Y.
      • Ishitobi M.
      • Inaji H.
      • Miyamoto Y.
      • kato k。
      • 汤汤汤
      基于SRM基于SRM验证的策略在有限乳腺癌组织样品中发现的ITRAQ方法发现的生物标志物候选。
      ,
      • 穆拉奥卡斯。
      • kume h.
      • adachi J.
      • Shiromizu T.
      • Watanabe S.
      • Masuda T.
      • Ishihama Y.
      • 汤汤汤
      乳腺癌组织的深入膜蛋白质组学研究染色体蛋白质清单。
      )。将组织样品用冰冷的PBS洗涤两次,然后用含有蛋白酶抑制剂混合物(罗氏诊断,德国)的冰冷PBS在冰冷的PBS中均化。匀浆以1000×离心 g 在4°C下10分钟,核核上清液以100,000×离心 g 在4°C下1小时。将沉淀悬浮在冰冷0.1中 m Na2CO.3 解决方案并以100,000×离心 g 在4°C下1小时。重新悬浮和离心后,将沉淀物作为膜馏分收集。在95°C下,使用MPEX PTS试剂溶液(GL Science,Tokyo,Japan)溶解该级分5分钟,然后使用Bioruptor Sonicator(Cosmo Bio,Tokyo,Japan)超声处理5分钟。以100,000×离心后 g 在4℃下30分钟,获得上清液作为膜馏分提取物,并使用DC蛋白质测定试剂盒(Bio-rad,Hercules,Ca,USA)定量。通过混合由患者组织组织制备的相等量(40μg)的18个膜馏分提取物来安排参考池。

       用Itraq试剂标记肽标记

      itraq标签如前所述进行(
      • 穆拉奥卡斯。
      • kume h.
      • Watanabe S.
      • adachi J.
      • Kuwano M.
      • 佐藤M.
      • 川崎N.
      • Kodera Y.
      • Ishitobi M.
      • Inaji H.
      • Miyamoto Y.
      • kato k。
      • 汤汤汤
      基于SRM基于SRM验证的策略在有限乳腺癌组织样品中发现的ITRAQ方法发现的生物标志物候选。
      ,
      • 穆拉奥卡斯。
      • kume h.
      • adachi J.
      • Shiromizu T.
      • Watanabe S.
      • Masuda T.
      • Ishihama Y.
      • 汤汤汤
      乳腺癌组织的深入膜蛋白质组学研究染色体蛋白质清单。
      ,
      • NA.rumi R.
      • Murakami T.
      • Kuga T.
      • adachi J.
      • Shiromizu T.
      • 穆拉奥卡斯。
      • kume h.
      • Kodera Y.
      • Matsumoto M.
      • NA.kayama K.
      • Miyamoto Y.
      • Ishitobi M.
      • Inaji H.
      • kato k。
      • 汤汤汤
      大规模磷脂蛋白质和基于SRM的人乳腺癌组织样本验证的策略。
      ,
      • Shiromizu T.
      • adachi J.
      • Watanabe S.
      • Murakami T.
      • Kuga T.
      • 穆拉奥卡斯。
      • 汤汤汤
      鉴定NextProt数据库中缺失的蛋白质,磷酸盐数据库中未注册的磷酸肽作为染色体的人类蛋白质组项目的一部分。
      )。 ITRAQ标记的膜馏分提取物(90μg)减少1/20体积100米m DTT in 50 mm NaHCO3 在加入牛血清白蛋白(BSA)(0.45μg)作为内标后30分钟。根据添加到每个样品的BSA的ITRAQ比,将BSA掺入每个样品中,115:114,116:114,117:114,每个实验中的每个实验中的每个实验归一化,以便纠正实验误差,例如胰蛋白酶消化效率和乐器错误。 1/20体积为550米m 碘乙酸在50米处m NaHCO3 然后在室温下用于烷基化30分钟。将烷基化样品用1%胰蛋白酶消化在37℃下用1%胰蛋白酶消化过夜,并使用PTS法处理(
      • Masuda T.
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      相转移表面活性剂助剂胰蛋白酶消化用于膜蛋白质组分析。
      ,
      • Masuda T.
      • 锡达尔
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      无偏见的定量 大肠杆菌 使用相转移表面活性剂的膜蛋白质组。
      )除去MPEX PTS试剂。使用c淡化的胰蛋白酶摘要18 stage Tips (
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
      )。使用PTS方法除去干扰ITRAQ标记的DTT,下一阶段涉及尖端净化。然后将脱盐肽悬浮在30μL的ITRAQ溶解缓冲液中,并用Itraq试剂(施用生物系统,培养城,CA)标记为RT。参考池的胰蛋白酶消化,癌症,没有转移,具有转移的癌症,以及分别用ITRAQ试剂114,115,116和117标记息肉(补充表S2)。 115:114,116:114和117:114:114:114比率表明,癌症中蛋白质的相对丰度,而不相对于共同参考池分别具有转移的癌症和息肉。因此,即使在不同的实验之间也可以比较所有样品。然后使用C合并标记的样品并脱沉18 舞台提示。共进行总共六个4-Plex Itraq实验。

       与SCX列分馏

      将标记的肽标记为缓冲液A(10米m KH24 (pH 3)和25%乙腈)和使用HPLC系统(Shimadzu突出UFLC)分馏,SCX柱(50×2.1mm,5μm,300,Zorbax 300scx; Agilent Technology,Santa Clara,CA)。缓冲A和缓冲b(10米m KH24 (pH 3),25%乙腈,1 m KCL)用于流动阶段。将负载肽以200μl/ min的流速分离,梯度为0%b,在15分钟内为0%B,0%至10%B,10分钟内10%至25%B,25%至40% B在5分钟内,5分钟内为40%至100%B,100%B 10分钟。每1分钟收集洗脱并使用C脱盐18 舞台提示。通过SCX柱色谱法将标记标记的肽分为80分。我们通过UV光谱检测这些级分的浓度,然后组合低浓度级分,从而导致36个级分。使用C18阶段尖端脱盐,并溶解在20μl2%乙腈和0.1%三氟乙酸中的SCX分级肽。

       LC-MS / MS

      使用LTQ-Orbitrap XL(Thermo Fisher Scienctific,Bremen,Bremen)的Nano-LC-MS / MS分析SCX分级肽,其中纳米LC接口(AMR,东京,日本),范式MS2(Michrom Bioresources,Auburn ,加利福尼亚州)和HTC Pal AutoSAMPLER(CTC Analytics,瑞士Zwingen)。将每个SCX分数的四分之一或五分之一注入陷阱柱(0.3×5mm, l-Column ODS;化学品评估和研究所(Ceri),东京,日本)并在分析栏中分开(0.1×200毫米内部开发的尖塔填充 l-Column2 C.18 粒子; Ceri)。在流动相中使用(2%乙腈,0.1%甲酸)和缓冲剂B(90%乙腈,0.1%甲酸),使用从5%至30%缓冲液B的梯度洗脱注射肽145分钟的流速为500 nl / min。应用了2000V的喷射电压。 MS扫描范围是 m/z 350-1500。通过在自动增益控制(AGC)模式下,选择通过离子阱(CID)和orbitrap(HCD)的后续MS / MS扫描的MS扫描中的前三个前体离子,其中AGC值为5.00E + 05,1.00为全MS,CID MS / MS和HCD MS / MS设置E + 04和2.00E + 04。

       蛋白质的鉴定和定量

      使用蛋白质组发现者Ver.1.3(Thermo Fisher Scientific)与吉祥物V2.3.1(Matrix Science,UK)对UniProt / Swissprot(Release-2010_05)进行癌症的原始数据进行检查,其中包含20,295个序列 Homo sapiens, 在LC-MS / MS分析之后。搜索参数如下:7ppm的前体质量耐受性,片段离子质量耐受0.6Da(CID)和0.01Da(HCD),并允许一个错过的切割。选择半胱氨酸,ITRAQ(k)和Itraq(N-末端)的羧甲基化用于固定改性。选择ITRAQ(Y)和氧化(M)用于可变修饰。通过使用渗滤器使肽序列分析能够计算假发现率(FDR)。通过设定目标FDR阈值获得高置信肽鉴定<肽水平1.0%。蛋白质鉴定需要满足标准的至少两种肽。使用蛋白质组发现者Ver.1.3进行蛋白质定量,使用尖刺BSA的定量值进行标准化。使用蛋白酶发现者Ver.1.1(Thermo Fisher Scientific)对MSIPI-LUBS 3.67的含有BSA序列进行了独特的BSA肽。

       SRM / MRM分析

      我们使用SRM / MRM确认并进一步验证从ITRAQ获得的生物标志物候选人。我们首先使用与ITRAQ Discovery实验中使用的相同的单独组织样本进行了两种技术重复的SRM / MRM进行确认。构建测定以测量每种蛋白质的两个不同的肽,并且每个两种肽中的各个测定标记为SRM-1和SRM-2。然后,我们用每种蛋白质靶标进行两种技术复制,每种蛋白质靶标,用于使用从发现实验中使用的单独的组织样品进行验证。组织样品混合物的五种技术复制用于评估SRM / MRM的再现性。在我们的实验中,技术复制如下进行;将单个样品完全加工至肽,并通过LC-SRM / MRM方法分析两次或五次。我们没有分析过程重复,其中包括胰蛋白酶消化和其他样品处理步骤,在本研究中。
      如前所述进行SRM / MRM(
      • 穆拉奥卡斯。
      • kume h.
      • Watanabe S.
      • adachi J.
      • Kuwano M.
      • 佐藤M.
      • 川崎N.
      • Kodera Y.
      • Ishitobi M.
      • Inaji H.
      • Miyamoto Y.
      • kato k。
      • 汤汤汤
      基于SRM基于SRM验证的策略在有限乳腺癌组织样品中发现的ITRAQ方法发现的生物标志物候选。
      ,
      • NA.rumi R.
      • Murakami T.
      • Kuga T.
      • adachi J.
      • Shiromizu T.
      • 穆拉奥卡斯。
      • kume h.
      • Kodera Y.
      • Matsumoto M.
      • NA.kayama K.
      • Miyamoto Y.
      • Ishitobi M.
      • Inaji H.
      • kato k。
      • 汤汤汤
      大规模磷脂蛋白质和基于SRM的人乳腺癌组织样本验证的策略。
      )。用C末端15N-和13C标记的精氨酸或赖氨酸残基(同位素纯度)稳定的合成同位素标记的肽(Si肽)(Si肽)(同位素纯度)>99%)购自Greiner Bio One(Frickenhausen,德国)(粗纯度)。肽序列选自ITRAQ实验中鉴定的独特肽序列。还使用含有半胱氨酸残基(Cys)的肽,如果不能检测到另一种足够的序列肽,则使用含有半胱氨酸残基(Cys)。如果Si肽含有Cys,则肽减少,烷基化,然后使用。将Si肽分成四组,然后混合,并分别用于Srm / mRM的四种混合物。
      使用LTQ orbitrap-XL通过上述LC-MS / MS方法分析Si肽混合物以获取MS数据。从使用Pinpoint Ver.1.0(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)获取的MS数据创建了SI肽的初步SRM / MRM转换列表。然后使用TSQ - Vantage三重全谱仪(Thermo Fisher Sciencific,Bremen),与纳米LC接口(AMR,Tokyo,Japan),范式MS2(Michrom Bioresources,Auburn,CA)进行分析Si肽混合物,和HTC Pal AutoSAMPLER(CTC Analytics,Zwingen,瑞士)。使用PinPoint软件分析所获得的数据以优化诸如碰撞能量的参数,并获取每个Si肽的保留时间。使用这些参数创建定时-SRM / MRM方法(±2分钟的保留时间窗口),然后优化。最后,选择使用SRM / MRM定量的每种肽的四种最佳转变。
      用组织样品制备的膜馏分提取物(2μg)用碘乙酰胺烷基化,然后如上所述用SRM / MRM进行测量。将消化的肽溶解在2%乙腈和0.1%三氟乙酸中,并使用上述最佳定时-SRM / MRM方法与TSQ vantage分析。我们在每个LC MS / MS分析之间进行了洗涤步骤以最小化携带。将Si肽混合物加入到胰蛋白酶消化的样品中,使用用PINPOINT软件测量的过渡峰面积计算内源肽与Si肽的面积比。调节每个Si肽的量以类似于由由样品混合物的初步Srm / mRM获得的峰面积估计的内源肽。首先计算这些比例多于两个转变的比率的平均值,然后将单个样品的两种技术复制的平均比例确定为靶肽的相对定量值。使用该比例的统计分析 t test.
      我们排除了具有信噪比的过渡峰<10,已被用作经验LOQ(

      Selevsek,N.,Matondo,M.,Sanchez Carbayo,M.,Aebberold,R.,Domon,B。,使用所选反应监测系统定量尿液中尿苷/蛋白的定量。蛋白质组学11,1135-1147,

      ),然后比较Si肽和内源肽之间的剩余过渡峰的轮廓和比例,以选择适当的定量分析峰。使用Pinpoint软件识别信噪比。删除由于非特异性背景的干扰或共同洗脱而转型的转型异常值对于提高准确性和可靠性至关重要。样品中的每种转变必须与Si肽的转变表现出类似的峰形状,这导致最小的CV面积比(CV<过渡之间的35%)。我们通过手动检查确认了每个过渡峰,并移除了没有满足上述标准的峰值。

       数据分析

      使用TMHMM程序预测所识别的蛋白的跨膜结构域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。使用蛋白质蛋白来分析候选蛋白质进​​行细胞组分注释(Thermo Fisher Scientific)。

       蛋白质提取和蛋白质印迹

      将冷冻组织样品在裂解缓冲液中溶解(7 m 尿素,2 m 硫脲,4%CHAPA,1%DTT,蛋白酶抑制剂混合物; Roche Diagnostics,曼海姆,德国)在以100,000×离心后,使用Bioruptor Sonicator(Cosmo Bio,东京,日本) g 在4°C下30分钟。通过电泳分离上清蛋白在5%至20%预制梯度凝胶(DRC Co.,Tokyo,Japan)。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore,Bedford,MA)中,然后用免疫块(DS Pharma BioMeDical,Osaka,Japan)封闭膜。抗ITGA5抗体(R.&D系统; 1:1000)和抗C8ORF55抗体(Sigma-Aldrich; 1:1000)用作一抗抗体。用增强的化学发光检测试剂(GE Healthcare,Little Chalfont,Buckinghamshire,英国)检测膜上的抗原。

       免疫组织化学

      将组织固定在载玻片上,在4%多聚甲醛在4℃下10分钟固定。用PBS洗涤三次洗涤后,用0.5%Triton X-100在PBS中处理样品,然后在含有0.1%Tween-20(PBST)的PBS中封闭3%牛血清白蛋白1小时。然后将样品与抗C80RF55(1:1000)温育1小时。用PBST洗涤三次后,用辣根过氧化物酶 - 缀合的抗兔IgG(GE Healthcare)处理样品1小时。在另外三次用PBST洗涤PBST,Dako Envision / HRP套件(Dako Japan,Kyoto,日本)用于根据制造商的说明来可视化组织抗原。将组织切片用苏木精染色30s,用100%乙醇和二甲苯脱水,盖玻片用麦芽酚(Mito Pure Chemicals,Tokyo,Japan)安装。
      本研究中使用的组织微阵列(TMA1150)来自14种常见癌症类型1150核心(每种肺(鳞状细胞癌),肺(腺癌),乳腺癌,肾,胆道,甲状腺,肝脏,结肠和胃癌症;和50例前列腺,胰腺,膀胱,卵巢和子宫身体癌症)(
      • Kitano H.
      • Kageyama S.
      • 呵呵
      • Hayashi R.
      • Doki Y.
      • ozaki Y.
      • 富吉诺S.
      • Takikita M.
      • kubo h.
      • 福冈J.
      癌基质的泛骨蛋白表达诱导淋巴管发生,预测淋巴蔓延和患者存活。
      )。这里使用的正常组织阵列包含来自13个正常组织的280个核心(每种肺,乳腺癌,肾脏,胆道,甲状腺,肝脏,结肠,胃,前列腺,胰腺,膀胱,卵巢和子宫身体癌症) 。这些组织阵列购自病理研究所公司(日本富山)。在替代叶片化和水合后,使用压力室(Pascal; Dako Japan)进行抗原检索,其中将组织加热至125℃,在该温度下保持1分钟,然后冷却至90℃。冲洗后,将幻灯片放在自动驾驶员(Dako Japan)中,并按制造商协议(Dako Japan)的建议使用Envision +检测系统。用抗C8ORF55染色的核心被三个作者检查。使用以下规模记录染色强度:0,无染色或细胞质染色<10%的肿瘤细胞; 1,微弱/几乎可察觉的细胞质染色>10%的肿瘤细胞(细胞表现出不完全细胞质染色); 2,弱或中度细胞质染色>10%的肿瘤细胞或强细胞质染色<30%;和3,强细胞质染色>30% of tumor cells.

      结果

       ITRAQ由结直肠癌组织和息肉制备的膜蛋白分析

      我们使用ITRAQ进行了结直肠癌组织的霰弹枪蛋白质组学和过血管病变,以鉴定用于结直肠癌的生物标志物候选蛋白。每种组织各自从患有结肠直肠息肉和癌症的患者收集,并且没有转移,以检查与癌症进展相关的蛋白质表达的变化( 补充表1)。我们对膜蛋白的变化特别感兴趣;因此,从这些样品制备的膜级分溶于PTS溶液中并用胰蛋白酶消化,然后去除洗涤剂(Fig. 1)。将所有样品的萃取物的部分以相等的量混合并以相同的方式处理以获得参考池。胰蛋白酶消化的参考池,没有转移的癌症,癌症与转移,息肉分别用Itraq试剂114,115,116和117标记(补充表S2)。将标记标记的肽在每种实验组中合并,通过SCX色谱法分馏,并使用LC-MS / MS分析。比率115:114,116:114和117:114表明,在没有转移的癌症中较高丰富的蛋白质,分别比在相同的参考池中的转移,癌症和息肉。 itraq比率115:114,116:114和117:114使用添加到每个样品的BSA的ITRAQ比率进行标准化,以便校正实验误差,例如胰蛋白酶消化效率和仪器错误(补充表S3)。
      通过从同一组织标记膜级分来证明样品制剂的再现性(补充图。S1)。添加的BSA的ITRAQ比率116:114都接近1,这表明了最小的技术误差,包括用胰蛋白酶消化蛋白质(补充图。S1)。使用六个ITRAQ分析集(每个实验中的独特蛋白质,共鉴定了总共5566个独特的蛋白质; 补充表S2-S4)。但是,在此列表中删除了第6 ITRAQ集中没有转移的癌症的数据,因为我们无法获得该组的足够数据,这归因于ITRAQ标签的失败。预计总共1567个蛋白质(28.2%)通过TMHMM计划进行跨膜域(表I.)。此外,5566鉴定的蛋白质中的5287通过Go细胞成分分析注释:3087(58.4%)和652(12.3%)分别是膜蛋白和细胞外蛋白( 表I.)。在六个分析集中的至少两种中,在ITRAQ中量化了4747个蛋白质(补充表S3);因此,我们调查了这些4747个蛋白质表达的变化与癌症进展。在息肉和癌症之间的表达和癌症之间的表达中观察到差异,没有转移,癌症,或没有转移的癌症,或息肉和癌症(比率)>2.0, p 价值 <0.1; ratio <0.5, p 价值 <0.1) (表二)。在没有转移,癌症的息肉和癌症之间的表达和癌症之间的表达,癌症分别分别具有转移,癌症,或没有转移的转移,分别具有转移,癌症,或息肉和癌症,也注意到差异。然后我们专注于细胞外蛋白,因为它们被从癌细胞分泌或脱落,并且可能是有用的标记。
      表I.预测膜蛋白的数量
      总鉴定的蛋白质5566
      数字%
      跨膜结构域的蛋白质数量1567
      a TM值HMM算法预测的跨膜域的蛋白质数。
      28.2
      Go-Annotated.5287100
      308758.4
      公元前 膜或细胞外蛋白与去注释蛋白的比例。
      细胞外65212.3
      公元前 膜或细胞外蛋白与去注释蛋白的比例。
      a TM值HMM算法预测的跨膜域的蛋白质数。
      公元前 膜或细胞外蛋白与去注释蛋白的比例。
      表二表达差异有显着差异的蛋白质数。 C / P,癌症的比例没有转移到息肉。 CM / C,癌症比率转移到癌症而不转移。 cm / p,癌症与息肉转移的比例。 TM + MEM,具有预测的跨膜结构域的蛋白质数量或作为膜蛋白的注释。额外的蛋白质数量作为细胞外蛋白注释
      比率p valueC / P.CM / C.CM / P.
      TM值 + MEM.额外的TM值 + MEM.额外的TM值 + MEM.额外的
      > 2.0< 0.1108342187921
      < 0.5< 0.151211192016
      全部的1595532179937

       SRM / MRM确认生物标志物候选人

      使用蛋白质组学分析鉴定了许多生物标志物候选蛋白质;然而,由于以下原因,大多数未经验证:(a)候选蛋白的数量大,(b)对于大多数这些候选者的特异性和特征良好的抗体不可用Western印迹,免疫染色和ELISA验证,( c)优化这些测定需要太多时间和金钱,并且(D)只有少量蛋白质可用于验证蛋白质从患者组织,尤其是膜级分制备蛋白质时验证生物标志物候选物。最近使用SRM / MRM测定克服了这些困难,这证明是可用于验证生物标志物候选者的验证,因为可以在单次运行中分析小样本中的多个靶蛋白(
      • Whiteaker J.R.
      • 张H.
      • 赵L.
      • 王P.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • 艾迪r.g.
      • Piening B.D.
      • 冯L.C.
      • Kasarda E.
      • Gurley K.E.
      • ENG J.K.
      • Chodosh L.A.
      • Kemp C.J.
      • McIntosh M.W.
      • Paulovich A.G.
      乳腺癌小鼠模型中显示了基于质谱的发现和生物标志物的确认的集成管道。
      ,
      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • MANI D.R.
      • 施X.
      • Kuhn E.
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      靶向质谱与稳定同位素稀释患者血浆中心血管生物标志物的定量。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 林C.
      • 肯尼迪J.
      • 侯L.
      • tr
      • Sokal I.
      • 闫诗
      • Schoenherr r.m.
      • 赵L.
      • Voytovich U.J.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • Krasnoselsky A.
      • Gafken P.R.
      • Hogan J.M.
      • 琼斯L.A.
      • 王P.
      • Amon L.
      • Chodosh L.A.
      • 尼尔森第3升
      • McIntosh M.W.
      • Kemp C.J.
      • Paulovich A.G.
      基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
      )。因此,我们使用SRM / MRM方法确认在ITRAQ实验中获得的结果,并优先进一步验证研究。
      在本研究中,我们选择了基于以下标准鉴定的生物标志物候选物的105个蛋白质(表III):(a)候选蛋白在六个ITRAQ实验中的至少两个中量化。 (b)预测蛋白质是膜或细胞外蛋白(人白细胞抗原被排除在候选名单中,因为蛋白质系统性地表达。也排除蛋白质如核或线粒体蛋白质。),(C)观察到的蛋白质,(C)在候选人的表达(比率>2.0, p 价值 <0.1; ratio <0.5, p 价值 <0.1)在没有转移的息肉和癌症之间,癌症有和没有转移的癌症,或息肉和癌症的转移。在选定的候选者中,在非负载性癌中,66个蛋白质比息肉更强烈地表达,而10种蛋白质在转移性癌中比在非负癌症中更强烈地表达(表3.AB)。在非负载性癌中,十三个蛋白质在非息肉中表达了更弱的表达,而六种蛋白质在转移性癌中表达六种蛋白质比在非负癌症中(表3.CD)。十种蛋白质在转移性癌症中更强烈地表达于息肉(表3E)。
      表III通过SRM / MRM分析的蛋白质清单及其使用ITRAQ的定量数据。通过T检验计算P值。 TM,跨膜域的数量。 C / P,癌症的平均比率没有转移到息肉。 CM / C,癌症与癌症转移的平均比率,无转移。 cm / p,癌症的平均比率转移到息肉
      A.蛋白质列表在息肉和癌症之间表达而没有转移(n = 66)
      加入蛋白质名称基因名称TM值去(mem)去(额外)C / P.p valueCM / C.p valueCM / P.p value
      Q12884Seprase.FAP.1MEM.5.98<0.010.670.1904.030.029
      P32926Desmoglein-3.DSG30MEM.4.54<0.010.410.0831.870.323
      Q6P5W5锌运输车ZIP4SLC39A47MEM.4.350.0750.420.1891.840.217
      Q8NFJ5视黄酸诱导的蛋白3GPRC5A7MEM.3.99<0.010.770.3593.060.012
      P40199癌丙烯镁抗原相关细胞粘附分子6Ceacam6.0MEM.3.690.0290.850.6903.120.031
      O95832Claudin-1CLDN14MEM.3.470.0540.510.1801.770.127
      Q8TF66含亮氨酸的含重复蛋白15LRRC151MEM.3.400.0320.580.1931.960.060
      P24158骨髓细胞PRTN30MEM.额外的3.350.0980.380.1341.280.526
      P50150鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)/ g(s)/ g(o)亚单位γ-4GNG40MEM.3.310.0740.770.5702.560.051
      P80511蛋白质S100-A12S100A12.0MEM.额外的3.280.0681.060.8573.460.070
      P06731癌胚均抗原相关细胞粘附分子5Ceacam5.0MEM.3.27<0.010.790.2752.57<0.01
      Q9UKX5整合inalla-11ITGA111MEM.3.23<0.010.620.0812.000.016
      Q10588ADP-核糖基环酶2BST11MEM.3.160.0230.550.1021.750.033
      P0825372 kda型IV型胶原酶MMP20MEM.额外的3.02<0.010.39<0.011.190.599
      Q9H6X2炭疽毒素受体1ANTXR11MEM.2.98<0.010.700.0272.09<0.01
      Q9Y6I8过氧化合物血型膜蛋白4PXMP40MEM.2.97<0.010.740.0842.19<0.01
      Q12805含EGF的纤维素样细胞外基质1EFEMP10MEM.额外的2.97<0.010.570.0371.710.040
      Q14767潜在转化的生长因子β结合蛋白2LTBP20MEM.额外的2.91<0.010.690.1822.010.141
      P16444二肽酶1DPEP10MEM.2.850.0331.060.8543.02<0.01
      P84157基质重塑相关蛋白7MXRA71MEM.2.820.0690.450.1121.260.569
      P11169溶质载体家族2,促进葡萄糖转运蛋白3SLC2A310MEM.2.740.0510.580.1811.600.064
      P08648整合inalla-5ITGA51MEM.2.59<0.010.660.0561.700.044
      P55001Microfibrillar相关蛋白2MFAP20额外的2.56<0.010.46<0.011.160.322
      Q9ULK5vang样蛋白2VANGL24MEM.2.550.0980.390.0861.000.989
      Q5BJF2跨膜蛋白97TM值EM974MEM.2.54<0.010.730.2501.850.040
      Q07075戊二醇氨基肽酶enpep.1MEM.2.53<0.010.700.2011.770.104
      Q9UGT4含寿司域的蛋白2SUSD21MEM.2.460.0130.580.0661.430.062
      Q8N6Q3CD177抗原CD1770MEM.2.450.0310.500.0551.230.378
      P07093Glia衍生的NexinSerpine2.0MEM.额外的2.430.0590.850.6992.060.132
      Q96KR6跨膜蛋白C200RF108C20ORF1083MEM.2.390.0200.730.2871.750.041
      P09619β型血小板衍生的生长因子受体PDGFRB.1MEM.2.38<0.010.850.4232.010.014
      Q7L4E1蛋白质FAM73B.FAM73B0MEM.2.34<0.010.50<0.011.170.289
      O75954Tetraspanin-9.TSPAN94MEM.2.31<0.010.700.0881.61<0.01
      Q9Y625甘锡-6GPC60MEM.额外的2.31<0.010.630.0551.450.179
      Q8IUS5环氧化物水解酶4.EPHX41MEM.2.290.0431.130.6142.59<0.01
      P36269γ-戊二基转移酶5GGT51MEM.2.28<0.010.710.1721.630.047
      Q8IWU6细胞外磺酸糖酶SULF-1SULF10额外的2.28<0.010.820.4451.880.074
      Q6ZMP0血小板素型含有1个域蛋白4THSD40额外的2.260.0420.590.2781.350.656
      P21730C5a过敏毒素趋化受体C5AR17MEM.2.220.0900.420.0650.930.776
      P35555Fiblillin-1FBN10MEM.额外的2.220.0390.380.0220.840.363
      P98095菲比林-2.FBLN20额外的2.20<0.010.680.2061.490.300
      P31997癌丙烯镁抗原相关细胞粘附分子8Ceacam8.0MEM.额外的2.200.0900.510.1181.110.592
      Q14766潜在转化的生长因子β结合蛋白1LTBP10MEM.额外的2.19<0.010.620.0151.350.087
      Q99720Sigma非阿片类药物细胞内受体1Sigmar1.1MEM.2.19<0.010.860.4391.88<0.01
      P50281基质金属蛋白酶-14MMP141MEM.额外的2.19<0.010.700.0961.530.078
      P02786转移素受体蛋白1TFRC.1MEM.额外的2.18<0.011.090.5792.38<0.01
      P31431Syndecan-4.SDC41MEM.额外的2.160.0820.550.1431.200.172
      Q9UBG0C型甘露糖受体2MRC21MEM.2.15<0.010.680.0781.470.230
      Q9P121神经丙蛋白NTM.0MEM.2.150.0580.560.0821.200.368
      P09486SPARC.SPARC.0额外的2.14<0.010.850.3211.810.025
      P05106整合丁基-3ITGB31MEM.2.130.0230.700.2451.490.165
      P04792热休克蛋白Beta-1HSPB10MEM.2.11<0.011.340.4212.830.035
      Q9NVM1蛋白质FAM176B.FAM176B.1MEM.2.080.0461.030.9512.130.276
      P08514整合inalla-IIBITGA2B1MEM.2.080.0830.880.7591.830.130
      Q8WUY1UPF0670蛋白C8ORF55C8ORF55.1额外的2.07<0.011.400.1582.90<0.01
      P12314高亲和力免疫球蛋白γFc受体IFCGR1A1MEM.2.07<0.010.680.1051.410.149
      P04216Thy-1 mem糖蛋白THY10MEM.2.06<0.010.770.0921.590.023
      P08174补体衰减加速因素CD550MEM.额外的2.05<0.011.040.8792.130.020
      Q96HV5跨膜蛋白41atmem41a.6MEM.2.04<0.010.760.0601.54<0.01
      Q9ULS5跨膜和卷绕式线圈域蛋白3TM值CC32MEM.2.040.0400.610.1951.250.434
      Q01628干扰素诱导的跨膜蛋白3IFITM32MEM.2.040.0211.070.7702.18<0.01
      P04920阴离子交换蛋白2SLC4A211MEM.2.040.0440.820.4411.66<0.01
      Q9Y289钠依赖性多种维生素转运蛋白SLC5A614MEM.2.03<0.010.650.0301.310.086
      P30273高亲和力免疫球蛋白Epsilon受体亚单位γFCER1G1MEM.2.02<0.010.710.1401.430.141
      P08473nepilysinMME.1MEM.2.010.0970.870.6261.740.030
      P13688癌丙烯镁抗原相关细胞粘附分子1Ceacam1.1MEM.额外的2.000.0140.740.1691.480.173
      B.蛋白质清单增加了癌症的表达,没有转移(n = 10)
      加入蛋白质名称基因名称TM值去(mem)去(额外)C / P.p valueCM / C.p valueCM / P.p value
      Q96HR9受体表达增强蛋白6REEP62MEM.1.130.6513.180.0703.610.035
      P05451Lithostathine-1-alphaREG1A0额外的0.200.1643.08<0.010.600.379
      Q8N323蛋白质FAM55AFAM55A1额外的0.220.1022.980.0570.650.416
      O95395β-1,3-半乳糖基-O-糖基 - 糖蛋白β-1,6- N-乙酰葡糖蛋白酶3GCNT31MEM.0.820.5952.850.0862.330.089
      O95994前梯度蛋白2同源物AGR20额外的0.440.0122.560.0941.120.727
      Q9NRD8双氧化酶2DUOX26MEM.0.430.0812.510.0451.070.843
      Q8TD06前梯度蛋白3同源物AGR30额外的0.510.0282.490.0171.260.301
      Q09327β-1,4-甘露糖基 - 糖蛋白4-β-n-乙酰葡糖胺氨基苯基转移酶MGAT31MEM.0.890.6942.240.0461.990.024
      Q9Y5L3烯核苷三磷酸二磷酸二磷酸酶2ENTPD22MEM.额外的1.360.3692.090.0282.83<0.01
      Q8NCC5糖磷酸盐交换器3SLC37A312MEM.0.940.8382.060.0161.920.030
      C.息肉和癌症之间表达的蛋白质清单减少(没有转移)(n = 13)
      加入蛋白质名称基因名称TM值去(mem)去(额外)C / P.p ValueCM / C.p ValueCM / P.p Value
      A8K7I4钙活化氯化物通道调节器1CLCA10MEM.额外的0.14<0.010.850.6730.12<0.01
      Q01524防御 - 6.DEFA60额外的0.180.0530.690.4280.120.043
      Q9Y6R7IgGFC结合蛋白FCGBP.0MEM.额外的0.23<0.011.120.8300.25<0.01
      Q6ZMB0UDP-GLCNAC:BetAgalbeta-1,3-N-乙酰甘氨酸氨基氨基转移酶6B3GNT61MEM.0.26<0.011.100.7130.29<0.01
      Q02817粘蛋白2MUC20额外的0.26<0.011.310.5370.34<0.01
      Q07654三叶子因子3.TFF30额外的0.32<0.011.140.6510.37<0.01
      Q9HC84粘蛋白-5B.MUC5B0额外的0.360.0381.290.3520.470.042
      P27216Annexin A13ANXA130MEM.0.37<0.011.240.5740.460.018
      P24588A-kinase锚蛋白5AKAP50MEM.0.430.0171.120.6060.480.011
      Q7Z3J2UPF0505蛋白C16ORF62C16ORF620MEM.0.46<0.011.390.0720.65<0.01
      P13727骨髓蛋白多糖PRG20额外的0.480.0450.890.6950.430.021
      Q6UXG2UPF0577蛋白质KiaA1324Kiaa13241MEM.0.490.0511.250.3900.610.085
      Q9Y2J2带4.1样蛋白3EPB41L3.0MEM.0.490.0621.350.0860.660.167
      D.蛋白质清单减少癌症的表达没有,癌症与转移(n = 6)
      加入蛋白质名称基因名称TM值去(mem)去(额外)C / P.p ValueCM / C.p ValueCM / P.p Value
      P08123胶原醛alpha-2(i)链CO.L1A20MEM.1.870.0860.340.0100.630.213
      O75015低亲和力免疫球蛋白γFc区受体III-BFCGR3B1MEM.2.140.2360.340.0570.730.673
      P02452胶原醛alpha-1(i)链CO.L1A10MEM.额外的1.860.1090.360.0250.660.252
      P02461胶原醛alpha-1(iii)链CO.L3A10MEM.1.700.1820.390.0390.660.152
      Q15063Periostinpost0MEM.1.570.2140.43<0.010.670.406
      O43934UNC93样蛋白MFSD11MFSD1110MEM.1.270.4340.450.0670.580.110
      E.蛋白质列表在息肉和癌症与转移之间的表达增加(n = 10)
      加入蛋白质名称基因名称TM值去(mem)去(额外)C / P.p ValueCM / C.p ValueCM / P.p Value
      P215895'-核苷酸NT5E2MEM.1.690.1041.410.4472.390.082
      Q92968过氧化合物血型膜蛋白PEX13PEX130MEM.1.350.0121.730.0312.340.012
      O43291Kunitz型蛋白酶抑制剂2SPINT21MEM.额外的1.63<0.011.390.4192.270.087
      Q8N4S7普利克斯汀和adipoq受体家庭成员4PAQR43MEM.1.82<0.011.230.3422.250.019
      Q8NBM4泛素相关的含域的蛋白2UBAC24MEM.1.95<0.011.140.4412.22<0.01
      Q96CP7含有TLC域域的蛋白质1TLCD15MEM.1.330.2881.670.2262.210.100
      P05546肝素Cofactor 2.Serpind1.0额外的2.150.1240.990.9782.130.024
      P11166溶质载体家族2,促进葡萄糖转运蛋白1SLC2A112MEM.1.92<0.011.100.7162.110.031
      Q9BQD7蛋白质FAM173AFAM173A1MEM.1.55<0.011.360.2362.110.050
      Q96B21跨膜蛋白45B.TM值EM45B.5MEM.1.290.1321.610.1002.070.018
      选择对应于105个候选蛋白的一种或两种肽序列作为SRM / MRM的靶序列。我们对每个分析进行了两种技术复制。合成Si肽(补充表S5)以SRM / MRM中的内标掺入样品中。根据前体和产品离子强度选择每种肽的四种过渡,并优化碰撞能量(如碰撞能)(补充表S6)。
      我们排除了具有信噪比的过渡峰<10,已被用作经验LOQ(

      Selevsek,N.,Matondo,M.,Sanchez Carbayo,M.,Aebberold,R.,Domon,B。,使用所选反应监测系统定量尿液中尿苷/蛋白的定量。蛋白质组学11,1135-1147,

      ),然后比较Si肽和内源肽之间的剩余过渡峰的轮廓和比例,以选择适当的定量分析峰。由于干扰或共同化的非特异性背景而删除过渡的异常值对于提高准确性和可靠性至关重要。样品中的每种转变必须与Si肽的转变表现出类似的峰形状,这导致最小的CV面积比(CV<过渡之间的35%)。我们通过手动检查确认了每个过渡峰,并删除了不符合上述标准的峰值,这导致了准确和显着的定量(补充图S2)。
      我们获得了超过两种过渡的这些比率的平均值作为靶肽的相对定量值。使用该比例的统计分析 t 测试。另外,如果样品基团之间的两种蛋白质的两种肽中的一种显着不同,则认为蛋白质差异表达。使用SRM / MRM方法,在来自98个蛋白质的172个肽在来自息肉和癌症的三种样品中量化,或没有转移(补充表S7)。显着差异(比例>2.0, p 价值 <0.1; ratio <0.5, p 价值 <在69个蛋白中检测到至少一种靶向肽中的0.1)(补充图S3, 补充表S7)。
      ITGA5,GPRC5A,PDGFRB和TFRC的表达显示在结肠直肠或其他癌症组织中不同(
      • 杨B.
      • 高J.
      • Rao Z.
      • 沉问:
      结直肠癌α5β1-整合素和MMP-14表达的临床病理和预后意义。
      ,
      • 邹格曼A.
      • Hutchins G.G.
      • 凯恩斯D.A.
      • verghese E.
      • 佩里S.L.
      • Jayne D.G.
      • Selby P.J.
      • 银行R.E.
      视黄酸诱导的蛋白3:一种新型预后结肠癌生物标志物的鉴定和表征。
      ,
      • sillars-hardebol a.h.
      • Carvalho B.
      • de wit m.
      • 邮箱C.
      • Delis-van Diemen下午
      • Mongera S.
      • Ylstra B.
      • Van de Wiel M.A.
      • meijer g.a.
      • Fijneman R.J.
      鉴定与结肠直肠腺瘤与癌进展相关的致癌途径的关键基因。
      ,
      • Prutki M.
      • Poljak-Blazi M.
      • jakopovic m.
      • 托马斯D.
      • 静止的I.
      • Zarkovic N.
      结肠癌患者的铁代谢,转铁素受体1和铁蛋白改变。
      )。显示在这些蛋白质上的ITRAQ和SRM / MRM的结果 Fig. 2A。这些蛋白质的表达在ITRAQ和SRM / MRM上显示出非常相似的模式(补充图S4)。此外,通过Western Blotting确认ITGA5表达的变化(Fig. 2B)。通过蛋白质印迹进一步验证了通过SRM / MRM和ITRAQ获得的类似结果,表明SRM / MRM测定可用于确认在发现阶段中鉴定的候选者。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2在发现和确认步骤中使用ITRAQ和SRM / MRM获得的代表性结果. A,示出了ITGAQ和SRM / MRM数据,显示了ITGA5,GPRC5A,PDGFRB和TFRC。 P,息肉。 C,癌症没有转移。 cm,癌症转移。面积比,内源肽的峰面积与Si肽的比率。构建测定以测量列出的两个不同肽 并且,两种肽中的每种的个体测定标记为SRM-1和SRM-2。 B,使用抗ITGA5抗体的息肉和癌息肉和癌症的蛋白质印迹分析。

       SRM / MRM验证生物标志物候选人

      我们在独立的患者样品组中验证了69例确诊的蛋白质(息肉(息肉)n = 10),没有转移的癌症(n = 10),和转移癌症(n = 10)) (表IV., 补充表S1,S9, 补充图S5)。我们使用从患者组织样品制备的样品混合物进行了五种技术复制,以评估我们SRM / MRM测定的再现性,并获得高再现性(CV<11%) (补充表S8)。我们没有分析过程重复,因此由于消化和其他样品处理步骤的可变性,实际实验变异性可能高于技术复制性能。总共20种蛋白质的表达水平:GPRC5a,prtn3,ceacoC5,antxr1,pxmp4,slc2a3,eNPEP,PDGFRB,GGT5,MMP14,TFRC,MRC2,SPARC,HSPB1,FCGR1A,THY1,TMEM41A,SLC4A2,FCER1G和CEACAM1在没有转移的癌症中显着高于息肉(比率>2.0, p 价值 <0.05)。此外,10蛋白的表达水平:ITGA11,BST1,LTBP2,ITGA5,TMEM97,TSPAN9,Sigmar1,C8ORF55,UBAC2和Serpind1在没有或转移的癌症中显着高于息肉(比率>1.7, p 价值 <0.05)。另外五种蛋白质的表达水平:CEACAM6,LRRC15,GPC6,C5AR1和TLCD1在癌组织中显着高于息息酸。八种蛋白质的表达水平:CLCA1,FCGBP,B3GNT6,MUC2,ANXA13,AKAP5,PRG2和KIAA1324在癌症中较低,并且没有转移,而不是息肉(比率>0.5, p 价值 <0.05)。 EPB41L3的表达也显示出癌组织中的癌症组织较低。该验证步骤以及发现步骤揭示了ITGA5,GPRC5a,PDGFRB和TFRC的表达水平在癌组织中显着高于息肉(Fig. 3)。总体而言,在确认和验证分析之间存在69例确诊的蛋白质中的47个表达模式。
      表IV.生物标志物候选蛋白的SRM / MRM分析。通过T检验计算P值。 C / P,癌症的平均比率没有转移到息肉。 CM / C,癌症与癌症转移的平均比率,无转移。 cm / p,癌症的平均比率转移到息肉
      基因名称C / P.p ValueCM / C.p ValueCM / P.p Value
      FAP.1.590.5152.210.0523.520.198
      GPRC5A4.310.0401.300.5145.59<0.01
      Ceacam6.13.410.0960.870.82211.61<0.01
      LRRC152.510.0841.830.2374.590.037
      PRTN32.680.0141.670.0984.47<0.01
      Ceacam5.7.290.0440.850.7376.22<0.01
      ITGA111.900.0190.820.4081.550.066
      BST11.930.0121.840.0643.55<0.01
      MMP21.180.6011.110.7611.300.396
      ANTXR13.23<0.011.080.8183.48<0.01
      PXMP42.29<0.010.800.3851.820.025
      EFEMP11.300.4781.040.9001.350.358
      LTBP21.830.0361.100.6762.02<0.01
      SLC2A33.560.0300.920.8173.28<0.01
      ITGA51.83<0.011.790.1623.280.031
      MFAP21.410.3941.170.4961.650.128
      TM值EM972.00<0.010.830.4111.670.064
      enpep.3.83<0.011.130.4454.32<0.01
      CD1771.170.5811.420.2241.660.144
      C20ORF1081.230.3680.940.8231.160.560
      PDGFRB.2.22<0.011.000.9952.22<0.01
      FAM73B1.220.2070.51<0.010.620.013
      TSPAN91.75<0.010.990.9681.74<0.01
      GPC61.890.0721.200.6142.260.044
      GGT52.060.0341.240.4322.56<0.01
      C5AR11.480.1201.490.1672.210.016
      FBN11.370.4431.340.2571.840.072
      FBLN21.750.1021.020.9461.790.087
      Sigmar1.1.74<0.010.980.9141.710.013
      MMP142.43<0.011.000.9882.42<0.01
      TFRC.2.320.0181.010.9732.350.027
      MRC22.09<0.011.130.6312.36<0.01
      SPARC.2.49<0.010.820.3172.030.027
      HSPB12.730.0161.500.2314.10<0.01
      C8ORF55.1.92<0.010.740.1231.420.024
      FCGR1A2.47<0.011.400.2773.45<0.01
      THY12.14<0.011.000.9832.15<0.01
      tmem41a.2.04<0.010.900.5931.84<0.01
      SLC4A22.41<0.010.920.7462.210.014
      FCER1G2.23<0.010.970.8882.17<0.01
      MME.5.210.0580.970.9595.050.058
      Ceacam1.5.950.0250.830.6464.92<0.01
      REEP61.210.5090.970.9341.180.608
      GCNT31.750.0781.460.3062.550.063
      AGR30.20<0.011.890.0730.380.021
      ENTPD21.110.8000.880.7780.980.942
      CLCA10.170.0221.320.7390.220.019
      FCGBP.0.22<0.011.150.7820.25<0.01
      B3GNT60.32<0.011.480.3590.480.036
      MUC20.14<0.012.020.2790.290.013
      TFF30.332.800.93
      ANXA130.23<0.011.410.2590.32<0.01
      AKAP50.190.0160.830.4870.160.013
      C16ORF620.760.4420.590.45
      PRG20.340.0181.100.7440.380.021
      Kiaa13240.32<0.011.130.6570.36<0.01
      EPB41L3.0.550.0600.670.1420.37<0.01
      CO.L1A21.550.4381.220.6501.900.031
      CO.L1A11.390.5901.190.7371.650.093
      CO.L3A11.240.6421.340.5171.670.212
      post0.900.6871.940.0181.750.033
      NT5E1.050.8021.210.4731.270.329
      PEX131.73<0.010.810.2241.400.025
      UBAC21.87<0.010.950.8341.780.044
      TLCD12.13<0.010.760.3351.630.113
      Serpind1.1.570.0181.210.3711.90<0.01
      SLC2A12.570.1751.180.7583.030.051
      FAM173A1.180.4330.810.2590.960.860
      TM值EM45B.1.350.2550.970.9181.300.400
      图缩略图GR3.
      Fig. 3SRM / MRM在验证步骤中的代表​​结果。显示ITGA5,GPRC5A,PDGFRB和TFRC的SRM / MRM数据。 P,息肉。 C,癌症没有转移。 cm,癌症转移。面积比,内源肽的峰面积与Si肽的比率。

       通过蛋白质印迹和免疫组化进一步验证C8ORF55

      我们专注于生物标志物候选中的C8ORF55,其在SRM / MRM中显示出显着差异,因为它之前未作为癌症的生物标志物候选者,并且可以获得针对该蛋白质的特异性抗体。 C8ORF55(也称为HOM6)是208-氨基酸蛋白,其在N末端区域中具有一个预测的跨膜结构域;但是,它的功能是未知的。 ITRAQ和随后使用SRM / MRM测定的确认显示C8ORF55的表达以癌症进展上调(Fig. 4A)。此外,在验证步骤中,癌症的表达在没有转移的癌症中比以息肉(比率= 1.92, p value<0.01)。还进行了Western Blotting以验证表达水平的这些变化(Fig. 4B)。结直肠癌组织的免疫组织化学分析表明,C8ORF55的表达在癌细胞中高,但在正常细胞中可忽略不计(Fig. 4C)。这些结果表明C8ORF55的表达以逐步的方式增加癌症进展。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4验证生物标志物候选C8ORF55. A,ITRAQ和C8ORF55的SRM / MRM数据。 P,息肉。 C,癌症没有转移。 cm,癌症转移。面积比,内源肽的峰面积与Si肽的比率。构建测定以测量列出的两个不同肽 并且,两种肽中的每种的个体测定标记为SRM-1和SRM-2。 B,使用抗C8ORF55抗体的息肉和癌息肉和癌症的蛋白质印迹分析。 C,使用抗C80RF55抗体的结直肠癌组织免疫组织化学染色。 剩下 面板:放大率降低。 正确的 面板:放大倍数。箭头显示染色肿瘤细胞的区域,箭头显示正常的结肠上皮腺。棒,100μm。

       使用组织微阵列检查各种癌组织中C8ORF55的表达

      临床实践中使用的肿瘤标志物的表达,如CEA和CA19-9,在多种癌症类型中显示出更高。因此,我们研究了使用组织微阵列(TMA)在各种癌组织中表达C8ORF55,其从相应的正常组织(补充图S6)。 TMA揭示了C8ORF55的表达在来自结肠癌组织制备的许多核中,但在来自正常结肠组织的那些中可以忽略不计( Fig. 5)。 TMA还表明,结肠癌组织中C8ORF55的表达显着高于正常组织。 C8ORF55的免疫染色在癌组织中较强,例如那些形成胃和乳腺的癌症组织比正常组织(Fig. 5)。这些结果表明C8ORF55可以是用于结直肠,胃和乳腺癌的潜在生物标志物。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5C8ORF55的组织微阵列。 C8ORF55在正常和癌组织之间的免疫组化评分(染色强度)。使用Wilcoxon试验进行统计分析。

      讨论

      据报道,许多大规模蛋白质组学对生物标志物发现的大规模蛋白质组学分析(
      • 罗y.
      • 王L.
      • 王J.
      开发基于蛋白质组学的生物标志物,用于临床实践中的结直肠肿瘤:机遇和挑战。
      ,
      • Lehtio J.
      • de petris l.
      肺癌蛋白质组学,临床和技术考虑因素。
      ,
      • kalinina J.
      • 彭J.
      • 里奇J.C.
      • van meir e.g.
      胶质瘤的蛋白质组学:初始生物标志物发现与技术演化。
      );然而,很少有研究由于没有适当的验证方法,验证了所识别的候选蛋白质。 SRM / MRM最近显示为一个有效的验证方法(
      • Whiteaker J.R.
      • 张H.
      • 赵L.
      • 王P.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • 艾迪r.g.
      • Piening B.D.
      • 冯L.C.
      • Kasarda E.
      • Gurley K.E.
      • ENG J.K.
      • Chodosh L.A.
      • Kemp C.J.
      • McIntosh M.W.
      • Paulovich A.G.
      乳腺癌小鼠模型中显示了基于质谱的发现和生物标志物的确认的集成管道。
      ,
      • Keshishian H.
      • addona t.
      • Burgess M.
      • MANI D.R.
      • 施X.
      • Kuhn E.
      • Sabatine M.S.
      • Gerszten r.e.
      • carr s.a.
      靶向质谱与稳定同位素稀释患者血浆中心血管生物标志物的定量。
      ,
      • Whiteaker J.R.
      • 林C.
      • 肯尼迪J.
      • 侯L.
      • tr
      • Sokal I.
      • 闫诗
      • Schoenherr r.m.
      • 赵L.
      • Voytovich U.J.
      • Kelly-Spratt K.S.
      • Krasnoselsky A.
      • Gafken P.R.
      • Hogan J.M.
      • 琼斯L.A.
      • 王P.
      • Amon L.
      • Chodosh L.A.
      • 尼尔森第3升
      • McIntosh M.W.
      • Kemp C.J.
      • Paulovich A.G.
      基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
      )几个研究包括我们自己的研究报告了使用ITRAQ标记方法和SRM / MRM验证的定量霰弹枪蛋白质组学鉴定生物标志物候选者(
      • 穆拉奥卡斯。
      • kume h.
      • Watanabe S.
      • adachi J.
      • Kuwano M.
      • 佐藤M.
      • 川崎N.
      • Kodera Y.
      • Ishitobi M.
      • Inaji H.
      • Miyamoto Y.
      • kato k。
      • 汤汤汤
      基于SRM基于SRM验证的策略在有限乳腺癌组织样品中发现的ITRAQ方法发现的生物标志物候选。
      ,
      • NA.rumi R.
      • Murakami T.
      • Kuga T.
      • adachi J.
      • Shiromizu T.
      • 穆拉奥卡斯。
      • kume h.
      • Kodera Y.
      • Matsumoto M.
      • NA.kayama K.
      • Miyamoto Y.
      • Ishitobi M.
      • Inaji H.
      • kato k。
      • 汤汤汤
      大规模磷脂蛋白质和基于SRM的人乳腺癌组织样本验证的策略。
      ,
      • Thingholm T.e.
      • 巴克斯。
      • Beck-Nielsen H.
      • Jensen O.N.
      • 加气器M.
      使用互补定量质谱法从2型糖尿病和非糖尿虱中的人体肌管的表征。
      )。在本研究中,我们进行了由结直肠癌组织制备的膜级分的蛋白质组学分析,以鉴定用于诊断和/或治疗靶标的新型生物标志物候选者。我们鉴定了膜蛋白,其表达水平随着与ITRAQ的综合定量分析而改变了结直肠癌的开发和进展。本研究中最重要的成就是使用独立组织样本的SRM / MRM的确认和同时进行大规模验证。在由ITRAQ鉴定的105个生物标志物候选蛋白质中,通过SRM / MRM证实了69种蛋白质表达的变化,在组中44个蛋白质中验证了显着差异。这种发现确认验证工作流程应该能够识别更可靠的生物标志物,用于结肠癌的临床诊断。据我们所知,我们迄今为止对生物标志物候选膜蛋白进行了最大的验证。使用SRM / MRM的此验证过程使我们能够选择更多潜在的候选者并优先考虑后续验证,并且可以代表识别新型生物标志物的快速有效方法。
      我们能够在本研究中鉴定5566个蛋白质中的膜馏分,预计将预测3087(58.4%)是膜蛋白。这个数字明显高于先前报告的(
      • josic d.
      • Clifton J.G.
      哺乳动物血浆膜蛋白质组学。
      ,
      • 陈继夫
      • 陈K.T.
      • 风扇C.W.
      • 韩C.L.
      • 陈Y.J.
      • yu J.s.
      • 常年。
      • Chien C.W.
      • wu c.p.
      • 挂r.p.
      • 陈英。
      凝胶辅助消化和ITRAQ标记质谱法中正常和癌性人结晶组织膜馏分蛋白质组学谱的比较。
      ,
      • 韩C.L.
      • 陈继夫
      • 陈英。
      • wu c.p.
      • yu K.H.
      • 陈K.T.
      • Tsou C.C.
      • Tsai c.f.
      • Chien C.W.
      • Kuo Y.B.
      • 林P.Y.
      • yu J.s.
      • Hsueh C.
      • 陈米。
      • Chan C.C.
      • 常年。
      • 陈Y.J.
      个性化组织膜蛋白质组学的信息辅助标签方法:结直肠癌案例研究。
      ,
      • Besson D.
      • Pavageau A.H.
      • valo i.
      • Bourreau A.
      • 贝兰杰A.
      • eymerit-morin c。
      • Mouliere A.
      • Chassevent A.
      • Boisdron-Celle M.
      • 莫雷尔A.
      • Solassol J.
      • Campone M.
      • 赌博e。
      • 巴雷B.
      • Coecreet O.
      • Guette C.
      结直肠癌不同阶段的定量蛋白质组学方法建立了OLFM4作为新的非负偶瘤标志物。
      ,
      • Polisetty R.v.
      • 豪达佩
      • Sharma R.
      • Harsha H.C.
      • NA.ir S.C.
      • Gupta M.K.
      • Uppin M.S.
      • 挑战S.
      • Puligopu A.K.
      • Ankathi P.
      • Purohit A.K.
      • Chandak G.R.
      • Pandey A.
      • sardeshmukh r.
      差异表达胶质母细胞瘤膜膜蛋白质组的LC-MS / MS分析显示出改变的钙信号传导和其他调节功能蛋白质组。
      );然而,除膜蛋白外,还鉴定了非膜蛋白,并且这归因于使用简单方法制备粗膜级分。膜蛋白质鉴定率增加的原因之一是膜蛋白的PTS法分离(
      • Masuda T.
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      相转移表面活性剂助剂胰蛋白酶消化用于膜蛋白质组分析。
      ,
      • Masuda T.
      • 锡达尔
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      无偏见的定量 大肠杆菌 使用相转移表面活性剂的膜蛋白质组。
      )。 PTS方法能够有效地分离膜蛋白,并允许使用高洗涤剂浓度,以在膜蛋白的切割过程中实现非常疏水膜蛋白的有效溶解。因此,该方法可以为鉴定组织膜蛋白提供更深的蛋白质组覆盖。
      我们专注于本研究中的膜蛋白,因为膜蛋白不仅涉及细胞信号传导和细胞 - 细胞相互作用的调节,而且还是癌症的合适治疗靶标(
      • rucevic m.
      • 赫克森D.
      • josic d.
      哺乳动物血浆膜蛋白质作为潜在的生物标志物和药物靶标。
      )。近年来癌症治疗的最大进展之一是发现分子靶向药物的发现,这导致了许多抗体药物的发展。膜蛋白显然是抗体药物的最佳靶标。在这项研究中,我们确定了许多先前未报告的膜蛋白,其表达随着结直肠癌的开发和进展而变化。这些膜蛋白可以是抗体药物发现的新疗法靶标。
      膜蛋白也是合适的生物标志物,用于筛查和诊断各种癌症。理想地检测诊断生物标志物,并在诸如血浆和/或尿液的生物流体中定量和量化;然而,来自组织泄漏的可溶性蛋白通常很难检测,因为很少有,它们是不稳定的。相反,膜蛋白和细胞外蛋白是可能脱落并从细胞分泌到循环中;有些是积极分泌的作为微泡,例如外来体,其非常稳定并且可能是潜在的生物标志物。以前的几项研究报告说,通过分析外泌体蛋白(以下)通过分析外渗蛋白(
      • Choi D.S.
      • 公园J.O.
      • jang s.c.。
      • yoon y.j.
      • Jung J.W.
      • choi d.y.
      • kim J.W.
      • 康J.s.
      • 公园J.
      • Hwang D.
      • 李克。
      • 公园S.H.
      • kim y.k.
      • desiderio d.m.
      • Kim K.P.
      • Gho Y.S.
      源自人结直肠癌腹水的微膜蛋白质组学分析。
      ,
      • Peinado H.
      • 阿切罗夫M.
      • Lavotshkin S.
      • Matei I.
      • Costa-Silva B.
      • 莫雷诺布耶G.
      • Hergueta-Redondo M.
      • 威廉姆斯C.
      • 加西亚 - 圣诞老人G.
      • Ghajar C.
      • Nitadori-Hoshino A.
      • 霍夫曼C.
      • 糟糕的K.
      • 加西亚B.A.
      • Callahan M.K.
      • 元J.
      • 马丁斯v.r.
      • 天花J.
      • Kaplan r.n.
      • Brady M.S.
      • Wolchok J.D.
      • 查普曼P.B.
      • 康Y.
      • Bromberg J.
      • Lyden D.
      黑色素瘤外索瘤通过MET朝向骨髓祖细胞朝向Pro-MetaTeatic表型。
      ,
      • 邵h
      • Chung J.
      • Balaj L.
      • 托尔斯特A.
      • Bigner D.D.
      • 卡特B.S.
      • Hochberg F.H.
      • Breakefield X.O.
      • Weissleder R.
      • 李H.
      循环微泡蛋白键入允许实时监测胶质母细胞瘤治疗。
      )。因此,本研究中鉴定的膜蛋白可能是对诊断结直肠癌的生物标志物候选者。
      我们观察到从ITRAQ和SRM获得的定量结果的变化。用于ITRAQ的样品用SCX柱分离,而SRM的分级不是。因此,由于分析的样本的复杂性差异,可以在从ITRAQ和SRM获得的定量结果中发生变化。拼接同种型或翻译后修饰也可能参与这些变化,因为通过测量靶肽获得了ITRAQ比例,因为通过测量靶肽来获得所有有助于肽ITRAQ测量和SRM比率的平均值。
      我们研究了使用蛋白质组学分析在本研究中没有转移的息肉和癌组织之间表达水平的差异,以鉴定癌症中的特征表达谱。尽管通过将癌组织与匹配的正常组织的比较,许多先前的生物标志物研究鉴定了数百名候选蛋白,但是许多与恶性性质不相关的蛋白质也可以包括,因为癌症通常不直接来自正常组织。因此,最好的阴性对照将是良性肿瘤,理想的肠道病变。在这方面,结直肠息肉被认为是对结肠直肠癌的最佳控制。此外,癌组织的不同阶段与包括良性肿瘤的不同阶段的比较是鉴定更有用的生物标志物候选者的最佳过程。
      在我们的研究中,C8ORF55通过SRM / MRM和Western印迹确认,其结果通过多种癌组织微阵列(TMA1150)进一步验证。 TMA1150具有来自50或100例14种癌症类型的1150个核心,并且先前被证明可用于评估多种癌症中蛋白质表达的变化(
      • Kitano H.
      • Kageyama S.
      • 呵呵
      • Hayashi R.
      • Doki Y.
      • ozaki Y.
      • 富吉诺S.
      • Takikita M.
      • kubo h.
      • 福冈J.
      癌基质的泛骨蛋白表达诱导淋巴管发生,预测淋巴蔓延和患者存活。
      )。 TMA1150还可用于检查各种癌症组织中靶蛋白的表达,以及数十个结直肠癌病例。在各种类型的癌组织中鉴定候选表达的广泛验证是重要的,以确定其作为各种癌症的生物标志物的有用性。在这方面,多癌TMA是一种非常有效的方法,可用于迅速,简单地评估各种癌症的表达模式。 TMA1150揭示了C8ORF55的表达不仅在结肠癌组织中较高,而且还含有其他癌症组织,这表明这些蛋白质有可能成为胃和乳腺癌以及结肠癌的生物标志物。
      总之,我们成功地进行了基于SRM / MRM的大规模验证了结直肠癌组织的生物标志物候选膜蛋白。这里描述的方法可以容易地应用于任何类型的癌症组织,并且可以有助于鉴定新型生物标志物,用于诊断和治疗疾病的治疗目标。

      致谢

      质谱蛋白质组学数据已经沉积在Proteomexchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过自豪的合作伙伴存储库(
      • VizCaino J.A.
      • 科特兰特。
      • Csordas A.
      • 戴安斯J.A.
      • Fabregat A.
      • 抚养金。
      • 怜悯J.
      • alpi E.
      • Birim M.
      • Contell J.
      • o'kelly g.
      • SchoEnegger A.
      • Ovelleiro D.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • 里奥斯D.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      蛋白质组学标识(骄傲)数据库和相关工具:2013年的状态。
      )使用DataSet标识符PXD000851。

      补充材料

      参考

        • 罗斯P.L.
        • 黄玉。
        • Marchese J.N.
        • 威廉姆斯B.
        • 帕克克。
        • 哈桑斯。
        • Khainovski N.
        • Pillai S.
        • 丹尼尔斯S.
        • Purkayastha S.
        • Juhasz P.
        • 马丁斯。
        • Bartlet-Jones M.
        • 雅各布森A.
        • Pappin D.J.
        多路复用蛋白质定量 酿酒酵母酿酒酵母 使用胺反应性的等离性标记试剂。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2004; 3: 1154-1169
        • ong s.e.
        • Blagoev B.
        • Kratchmarova I.
        • 克里斯滕森D.B.
        • 斯丁H.
        • Pandey A.
        细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2002; 1: 376-386
        • Whiteaker J.R.
        • 张H.
        • 赵L.
        • 王P.
        • Kelly-Spratt K.S.
        • 艾迪r.g.
        • Piening B.D.
        • 冯L.C.
        • Kasarda E.
        • Gurley K.E.
        • ENG J.K.
        • Chodosh L.A.
        • Kemp C.J.
        • McIntosh M.W.
        • Paulovich A.G.
        乳腺癌小鼠模型中显示了基于质谱的发现和生物标志物的确认的集成管道。
        J.蛋白质组。 2007; 6: 3962-3975
        • Keshishian H.
        • addona t.
        • Burgess M.
        • MANI D.R.
        • 施X.
        • Kuhn E.
        • Sabatine M.S.
        • Gerszten r.e.
        • carr s.a.
        靶向质谱与稳定同位素稀释患者血浆中心血管生物标志物的定量。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2009; 8: 2339-2349
        • Whiteaker J.R.
        • 林C.
        • 肯尼迪J.
        • 侯L.
        • tr
        • Sokal I.
        • 闫诗
        • Schoenherr r.m.
        • 赵L.
        • Voytovich U.J.
        • Kelly-Spratt K.S.
        • Krasnoselsky A.
        • Gafken P.R.
        • Hogan J.M.
        • 琼斯L.A.
        • 王P.
        • Amon L.
        • Chodosh L.A.
        • 尼尔森第3升
        • McIntosh M.W.
        • Kemp C.J.
        • Paulovich A.G.
        基于靶蛋白质组学的管道,用于验证血浆中的生物标志物。
        NAT。 Biotechnol。 2011; 29: 625-634
        • Ahram M.
        • Litou Z.I.
        • 方罗。
        • Al-Tawallbeh G.
        人蛋白质组中膜蛋白的估计。
        在硅Biol。 2006; 6: 379-386
        • 霍普金斯A.L.
        • 新郎C.R.
        可毒性基因组。
        NAT。 Rev.药物发现。 2002; 1: 727-730
        • 陈娥。
        • Cociorva D.
        • Norris J.L.
        • YALES 3RD。,J.R.
        霰弹枪蛋白质组学质谱相容表面活性剂的优化。
        J.蛋白质组。 2007; 6: 2529-2538
        • Mitra S.K.
        • 甘特J.A.
        • 红宝石J.f.
        • Clouse S.D.
        • Goshe M.B.
        膜蛋白质组学分析 拟南芥蒂利亚纳 使用替代溶解技术。
        J.蛋白质组。 2007; 6: 1933-1950
        • 张恩。
        • 陈R.
        • 年轻人。
        • 愿望D.
        • 冬季P.
        • Weiner J.H.
        • Li L.
        SDS-和甲醇辅助蛋白溶解和消化方法的比较 大肠杆菌 膜蛋白质组分析2-D LC-MS / MS。
        蛋白质组学。 2007; 7: 484-493
        • 周J.
        • 周T.
        • Cao R.
        • 刘Z.
        • 沉J.
        • 陈P.
        • 王X.
        • 梁S.
        脱氧胆酸钠施用对大鼠海马膜膜蛋白质组学分析的评价。
        J.蛋白质组。 2006; 5: 2547-2553
        • Masuda T.
        • Tomita M.
        • Ishihama Y.
        相转移表面活性剂助剂胰蛋白酶消化用于膜蛋白质组分析。
        J.蛋白质组。 2008; 7: 731-740
        • Masuda T.
        • 锡达尔
        • Tomita M.
        • Ishihama Y.
        无偏见的定量 大肠杆菌 使用相转移表面活性剂的膜蛋白质组。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2009; 8: 2770-2777
        • 汤汤汤
        • 松下K.
        • yamaguchi s.
        • OH-ISHI M.
        • Kodera Y.
        • Maeda T.
        • Shimada H.
        • Ochiai T.
        • 野村F.
        用琼脂糖二维凝胶电泳鉴定原发性结肠直肠癌中改变的蛋白质表达和翻译后修饰。
        临床。癌症res。 2004; 10: 2007-2014
        • Nishimori T.
        • 汤汤汤
        • 松下K.
        • OH-ISHI M.
        • Kodera Y.
        • Maeda T.
        • 野村F.
        • Matsubara H.
        • Shimada H.
        • Ochiai T.
        原发性食管鳞状细胞癌的蛋白质组学分析显示细胞粘附蛋白,细胞粘附蛋白的下调。
        蛋白质组学。 2006; 6: 1011-1018
        • Seimiya M.
        • 汤汤汤
        • 松下K.
        • Sunaga M.
        • OH-ISHI M.
        • Kodera Y.
        • Maeda T.
        • Takano S.
        • Togawa A.
        • yoshitomi h.
        • Otsuka M.
        • Yamamoto M.
        • NA.kano M.
        • Miyazaki M.
        • 野村F.
        鉴定原发性肝细胞癌的新型免疫组织化学肿瘤标志物; Clathrin重链和离氨基转移酶环糊氨基酶。
        肝脏。 2008; 48: 519-530
        • 卡塔达K.
        • 汤汤汤
        • 砂浆M.
        • 松下K.
        • Tonoike Y.
        • Kodera Y.
        • Hanazawa T.
        • 野村F.
        • 好的amoto Y.
        Plectin促进癌细胞的迁移和侵袭,是头部和颈部鳞状细胞癌的新型预后标志物。
        J.蛋白质组学。 2012; 75: 1803-1815
        • Lazebnik Y.
        癌症的标志是什么?
        NAT。癌症。 2010; 10: 232-233
        • 穆拉奥卡斯。
        • kume h.
        • Watanabe S.
        • adachi J.
        • Kuwano M.
        • 佐藤M.
        • 川崎N.
        • Kodera Y.
        • Ishitobi M.
        • Inaji H.
        • Miyamoto Y.
        • kato k。
        • 汤汤汤
        基于SRM基于SRM验证的策略在有限乳腺癌组织样品中发现的ITRAQ方法发现的生物标志物候选。
        J.蛋白质组。 2012; 11: 4201-4210
        • 穆拉奥卡斯。
        • kume h.
        • adachi J.
        • Shiromizu T.
        • Watanabe S.
        • Masuda T.
        • Ishihama Y.
        • 汤汤汤
        乳腺癌组织的深入膜蛋白质组学研究染色体蛋白质清单。
        J.蛋白质组。 2013; 12: 208-213
        • NA.rumi R.
        • Murakami T.
        • Kuga T.
        • adachi J.
        • Shiromizu T.
        • 穆拉奥卡斯。
        • kume h.
        • Kodera Y.
        • Matsumoto M.
        • NA.kayama K.
        • Miyamoto Y.
        • Ishitobi M.
        • Inaji H.
        • kato k。
        • 汤汤汤
        大规模磷脂蛋白质和基于SRM的人乳腺癌组织样本验证的策略。
        J.蛋白质组。 2012; 11: 5311-5322
        • Shiromizu T.
        • adachi J.
        • Watanabe S.
        • Murakami T.
        • Kuga T.
        • 穆拉奥卡斯。
        • 汤汤汤
        鉴定NextProt数据库中缺失的蛋白质,磷酸盐数据库中未注册的磷酸肽作为染色体的人类蛋白质组项目的一部分。
        J.蛋白质组。 2013; (DOI 10.1021 / PR300825V)
        • Rappsilber J.
        • Ishihama Y.
        蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
        肛门。化学。 2003; 75: 663-670
      1. Selevsek,N.,Matondo,M.,Sanchez Carbayo,M.,Aebberold,R.,Domon,B。,使用所选反应监测系统定量尿液中尿苷/蛋白的定量。蛋白质组学11,1135-1147,

        • Kitano H.
        • Kageyama S.
        • 呵呵
        • Hayashi R.
        • Doki Y.
        • ozaki Y.
        • 富吉诺S.
        • Takikita M.
        • kubo h.
        • 福冈J.
        癌基质的泛骨蛋白表达诱导淋巴管发生,预测淋巴蔓延和患者存活。
        拱。 Pathol。实验室med。 2010; 134: 1520-1527
        • 杨B.
        • 高J.
        • Rao Z.
        • 沉问:
        结直肠癌α5β1-整合素和MMP-14表达的临床病理和预后意义。
        肿瘤。 2013; (DOI 10.4149 / neo_2013_034)
        • 邹格曼A.
        • Hutchins G.G.
        • 凯恩斯D.A.
        • verghese E.
        • 佩里S.L.
        • Jayne D.G.
        • Selby P.J.
        • 银行R.E.
        视黄酸诱导的蛋白3:一种新型预后结肠癌生物标志物的鉴定和表征。
        欧元。 J.癌症。 2013; 49: 531-539
        • sillars-hardebol a.h.
        • Carvalho B.
        • de wit m.
        • 邮箱C.
        • Delis-van Diemen下午
        • Mongera S.
        • Ylstra B.
        • Van de Wiel M.A.
        • meijer g.a.
        • Fijneman R.J.
        鉴定与结肠直肠腺瘤与癌进展相关的致癌途径的关键基因。
        肿瘤Biol。 2010; 31: 89-96
        • Prutki M.
        • Poljak-Blazi M.
        • jakopovic m.
        • 托马斯D.
        • 静止的I.
        • Zarkovic N.
        结肠癌患者的铁代谢,转铁素受体1和铁蛋白改变。
        癌症吧。 2006; 238: 188-196
        • 罗y.
        • 王L.
        • 王J.
        开发基于蛋白质组学的生物标志物,用于临床实践中的结直肠肿瘤:机遇和挑战。
        蛋白质组学临床。苹果。 2013; 7: 30-41
        • Lehtio J.
        • de petris l.
        肺癌蛋白质组学,临床和技术考虑因素。
        J.蛋白质组学。 2010; 73: 1851-1863
        • kalinina J.
        • 彭J.
        • 里奇J.C.
        • van meir e.g.
        胶质瘤的蛋白质组学:初始生物标志物发现与技术演化。
        神经肉瘤。 2011; 13: 926-942
        • Thingholm T.e.
        • 巴克斯。
        • Beck-Nielsen H.
        • Jensen O.N.
        • 加气器M.
        使用互补定量质谱法从2型糖尿病和非糖尿虱中的人体肌管的表征。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10 (DOI 10.1074 / MCP.M110.006650)
        • josic d.
        • Clifton J.G.
        哺乳动物血浆膜蛋白质组学。
        蛋白质组学。 2007; 7: 3010-3029
        • 陈继夫
        • 陈K.T.
        • 风扇C.W.
        • 韩C.L.
        • 陈Y.J.
        • yu J.s.
        • 常年。
        • Chien C.W.
        • wu c.p.
        • 挂r.p.
        • 陈英。
        凝胶辅助消化和ITRAQ标记质谱法中正常和癌性人结晶组织膜馏分蛋白质组学谱的比较。
        FEBS J. 2010; 277: 3028-3038
        • 韩C.L.
        • 陈继夫
        • 陈英。
        • wu c.p.
        • yu K.H.
        • 陈K.T.
        • Tsou C.C.
        • Tsai c.f.
        • Chien C.W.
        • Kuo Y.B.
        • 林P.Y.
        • yu J.s.
        • Hsueh C.
        • 陈米。
        • Chan C.C.
        • 常年。
        • 陈Y.J.
        个性化组织膜蛋白质组学的信息辅助标签方法:结直肠癌案例研究。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10 (DOI 10.1074 / MCP.M110.003087)
        • Besson D.
        • Pavageau A.H.
        • valo i.
        • Bourreau A.
        • 贝兰杰A.
        • eymerit-morin c。
        • Mouliere A.
        • Chassevent A.
        • Boisdron-Celle M.
        • 莫雷尔A.
        • Solassol J.
        • Campone M.
        • 赌博e。
        • 巴雷B.
        • Coecreet O.
        • Guette C.
        结直肠癌不同阶段的定量蛋白质组学方法建立了OLFM4作为新的非负偶瘤标志物。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10 (DOI 10.1074 / MCP.M111.009712)
        • Polisetty R.v.
        • 豪达佩
        • Sharma R.
        • Harsha H.C.
        • NA.ir S.C.
        • Gupta M.K.
        • Uppin M.S.
        • 挑战S.
        • Puligopu A.K.
        • Ankathi P.
        • Purohit A.K.
        • Chandak G.R.
        • Pandey A.
        • sardeshmukh r.
        差异表达胶质母细胞瘤膜膜蛋白质组的LC-MS / MS分析显示出改变的钙信号传导和其他调节功能蛋白质组。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2012; 11 (DOI 10.1074 / MCP.M111.013565)
        • rucevic m.
        • 赫克森D.
        • josic d.
        哺乳动物血浆膜蛋白质作为潜在的生物标志物和药物靶标。
        电泳。 2011; 32: 1549-1564
        • Choi D.S.
        • 公园J.O.
        • jang s.c.。
        • yoon y.j.
        • Jung J.W.
        • choi d.y.
        • kim J.W.
        • 康J.s.
        • 公园J.
        • Hwang D.
        • 李克。
        • 公园S.H.
        • kim y.k.
        • desiderio d.m.
        • Kim K.P.
        • Gho Y.S.
        源自人结直肠癌腹水的微膜蛋白质组学分析。
        蛋白质组学。 2011; 11: 2745-2751
        • Peinado H.
        • 阿切罗夫M.
        • Lavotshkin S.
        • Matei I.
        • Costa-Silva B.
        • 莫雷诺布耶G.
        • Hergueta-Redondo M.
        • 威廉姆斯C.
        • 加西亚 - 圣诞老人G.
        • Ghajar C.
        • Nitadori-Hoshino A.
        • 霍夫曼C.
        • 糟糕的K.
        • 加西亚B.A.
        • Callahan M.K.
        • 元J.
        • 马丁斯v.r.
        • 天花J.
        • Kaplan r.n.
        • Brady M.S.
        • Wolchok J.D.
        • 查普曼P.B.
        • 康Y.
        • Bromberg J.
        • Lyden D.
        黑色素瘤外索瘤通过MET朝向骨髓祖细胞朝向Pro-MetaTeatic表型。
        NAT。 Med。 2012; 18: 883-891
        • 邵h
        • Chung J.
        • Balaj L.
        • 托尔斯特A.
        • Bigner D.D.
        • 卡特B.S.
        • Hochberg F.H.
        • Breakefield X.O.
        • Weissleder R.
        • 李H.
        循环微泡蛋白键入允许实时监测胶质母细胞瘤治疗。
        NAT。 Med。 2012; 18: 1835-1840
        • VizCaino J.A.
        • 科特兰特。
        • Csordas A.
        • 戴安斯J.A.
        • Fabregat A.
        • 抚养金。
        • 怜悯J.
        • alpi E.
        • Birim M.
        • Contell J.
        • o'kelly g.
        • SchoEnegger A.
        • Ovelleiro D.
        • Perez-Riverol Y.
        • Reinger F.
        • 里奥斯D.
        • 王R.
        • Hermjakob H.
        蛋白质组学标识(骄傲)数据库和相关工具:2013年的状态。
        核酸RES。 2013; 41: D1063-D1069