广告

使用定量蛋白质组学的蛋白质降解的全局亚细胞表征*

  • 克服
    隶属关系
    基因调控中心,邓迪大学,邓德尼大学,邓迪,英国DD1 5eh的生命科学学院
    搜索本作者的文章
  • Yasmeen Ahmad.
    隶属关系
    基因调控中心,邓迪大学,邓德尼大学,邓迪,英国DD1 5eh的生命科学学院
    搜索本作者的文章
  • Kathryn J. Kirkwood.
    隶属关系
    基因调控中心,邓迪大学,邓德尼大学,邓迪,英国DD1 5eh的生命科学学院
    搜索本作者的文章
  • 托尼LY.
    隶属关系
    基因调控中心,邓迪大学,邓德尼大学,邓迪,英国DD1 5eh的生命科学学院
    搜索本作者的文章
  • Angus I. Lamond.
    一致
    应解决对应的谁:基因调控中心,生命科学学院,邓迪大学,邓德,邓迪,英国。 Tel.:Port.44-01382385473;传真:+ 44-01382385695;电子邮件: [电子邮件 protected]
    隶属关系
    基因调控中心,邓迪大学,邓德尼大学,邓迪,英国DD1 5eh的生命科学学院
    搜索本作者的文章
  • 作者脚注
    *这项工作得到了惠顾信托的补助金(Grant#:083524 / z / 07 / z,073980 / z / 03 / z,08136 / z / 03 / z和0909444 / z / 09 / z)和欧盟FP7潜在客户网络(授予#:Health-F4-2008-201648)。 A.I.L.是一个惠康信托校长研究员。
    本文含有补充材料。
      蛋白质降解提供了用于控制细胞周期进展和许多其他细胞途径的重要调节机制。为了综合分析U2OS骨肉瘤细胞中蛋白质降解的空间控制,我们将药物治疗和基于氧化素的定量质谱与亚细胞和蛋白质分馏组合。所得数据集分析了74,000多种肽,对应于核,细胞溶质,膜和细胞骨架室的〜5000蛋白。这些数据鉴定了快速降解的蛋白酶体靶标,例如PRR11并突出显示通过阻断蛋白酶体引起的转化机制导致平移抑制的反馈机制。我们展示这是通过激活展开蛋白质反应的介导的。我们观察到蛋白质降解的孤隔离差异,包括通过分析全细胞裂解物的分析而不表征的蛋白质。整个数据集的生物信息分析在蛋白质组动力学的百科全书中介绍了一种基于Web的资源,具有用于稳定性和亚细胞分布的蛋白质。
      靶向蛋白质降解是一种重要的调节机制,允许响应环境和时间刺激的细胞途径协调(
      • Ciechorover A.
      细胞内蛋白质降解:从溶酶体和泛素蛋白酶体系和毒素蛋白酶体系和药物靶向中,从模糊的术语降解。
      )。对不同的生化途径的控制,包括细胞周期进展和对DNA损伤的响应,至少部分地通过蛋白质降解的动态改变(
      • 芦苇s.i.
      棘轮和时钟:细胞周期,泛素质化和蛋白质转换。
      )。哺乳动物细胞中的先前大规模蛋白质组学研究表明,蛋白质降解的速率可以从分钟的时间尺寸变化,以基本上为亚稳态蛋白的无限稳定性(
      • Doherty M.K.
      • 哈蒙德D.E.
      • Clague M.J.
      • Gaskell S.J.
      • Beynon R.J.
      人蛋白质组的营业额:动态氧化剂测定蛋白质细胞内稳定性。
      ,
      • 伊甸园E.
      • Geva-Zatory N.
      • Issaeva I.
      • 科恩A.
      • DEKEL E.
      • 丹昂T.
      • 科恩L.
      • Mayo A.
      • Alon U.
      活性人体细胞中的蛋白质组半衰期动态。
      ,
      • Yen H.C.
      • 徐Q.
      • Chou d.m.
      • 赵Z.
      • elldege s.j.
      哺乳动物细胞中的全局蛋白质稳定性分析。
      ,
      • SchwanhäusserB.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      ,
      • Boisvert F.O.M.
      • Ahmad Y.
      • Gierlinski M.
      • Charriere F.
      • Lamont D.
      • 斯科特米
      • 巴顿G.
      • Lamond A.I.
      人体细胞蛋白质组果苗果实分析的定量空间蛋白质组学分析。
      ,
      • Savas J.N.
      • 富山B.H.
      • XU T.
      • yates 3rd,J.R.
      • Hetzer M.W.
      大鼠大脑中极度长的核孔蛋白。
      )。
      大多数细胞内蛋白质具有相似的降解速率,半衰期近似细胞倍增率。在5%的蛋白质下显示出低于三倍的蛋白质比蛋白质组平均值快三倍(
      • Doherty M.K.
      • 哈蒙德D.E.
      • Clague M.J.
      • Gaskell S.J.
      • Beynon R.J.
      人蛋白质组的营业额:动态氧化剂测定蛋白质细胞内稳定性。
      ,
      • 伊甸园E.
      • Geva-Zatory N.
      • Issaeva I.
      • 科恩A.
      • DEKEL E.
      • 丹昂T.
      • 科恩L.
      • Mayo A.
      • Alon U.
      活性人体细胞中的蛋白质组半衰期动态。
      ,
      • Yen H.C.
      • 徐Q.
      • Chou d.m.
      • 赵Z.
      • elldege s.j.
      哺乳动物细胞中的全局蛋白质稳定性分析。
      ,
      • Boisvert F.O.M.
      • Ahmad Y.
      • Gierlinski M.
      • Charriere F.
      • Lamont D.
      • 斯科特米
      • 巴顿G.
      • Lamond A.I.
      人体细胞蛋白质组果苗果实分析的定量空间蛋白质组学分析。
      )。然而,单个蛋白质的降解率可以改变,例如取决于细胞周期阶段或信令事件,并且也可以根据亚细胞定位而变化。这些受管制蛋白质稳定性的破坏是对癌症形式的疾病机制下放, 例如 p53 (
      • 莱明A.J.
      • MOMAND J.
      • Finlay C.A.
      p53肿瘤抑制基因。
      ,
      • vojtěsekb.
      • 泳道D.P.
      人乳腺癌细胞系中P53蛋白表达的调节。
      )和原癌基因c-myc(
      • Thomas L.R.
      • Tansey W.P.
      癌蛋白转录因子myc的蛋白水解控制。
      )。
      由于其低丰度,检测迅速降解的蛋白质可能是困难的。然而,基于质谱基的蛋白质组学的进步使得对细胞蛋白质蛋白酶的深入定量分析(
      • Cox J.
      用于数据驱动系统生物学的定量,高分辨率蛋白质组学。
      ,
      • Bensimon A.
      • Heck A.J.
      • Aeberberold R.
      基于质谱的蛋白质组学和网络生物学。
      ,
      • Cravatt B.f.
      • 西蒙上午
      • yates 3rd,J.R.
      基于质谱的蛋白质组学的生物学撞击。
      )。细胞培养氨基酸的稳定同位素标记(Silac)
      使用的缩写是:
      APC.
      促进复合物
      BCA.
      双子素素酸
      CBQCA.
      3-(4-羧基苯甲酰基)喹啉-2-羧醛醛
      CHX.
      环己酰亚胺
      DMEM.
      Dulbecco的改良鹰媒体
      脱氧核糖核酸
      脱氧核糖核酸
      核糖结型产品有缺陷
      基因本体论
      他是
      HEPES,EDTA,蔗糖
      HRP.
      辣根过氧化物酶
      LDS.
      硫酸锂锂
      MRNA.
      信使RNA
      RDP.
      快速耗尽的蛋白质
      RT.
      室内温度
      SCF.
      skp,cullin,f-box
      尺寸排除色谱法
      萨拉克
      稳定同位素用细胞培养中的氨基酸标记
      TBST.
      TBS Tween 20.
      TCEP.
      克里斯卡苄乙基膦
      三乙胺碳酸氢盐
      UPR.
      展开的蛋白质反应。
      1使用的缩写是: APC.
      促进复合物
      BCA.
      双子素素酸
      CBQCA.
      3-(4-羧基苯甲酰基)喹啉-2-羧醛醛
      CHX.
      环己酰亚胺
      DMEM.
      Dulbecco的改良鹰媒体
      脱氧核糖核酸
      脱氧核糖核酸
      核糖结型产品有缺陷
      基因本体论
      他是
      HEPES,EDTA,蔗糖
      HRP.
      辣根过氧化物酶
      LDS.
      硫酸锂锂
      MRNA.
      信使RNA
      RDP.
      快速耗尽的蛋白质
      RT.
      室内温度
      SCF.
      skp,cullin,f-box
      尺寸排除色谱法
      萨拉克
      稳定同位素用细胞培养中的氨基酸标记
      TBST.
      TBS Tween 20.
      TCEP.
      克里斯卡苄乙基膦
      三乙胺碳酸氢盐
      UPR.
      展开的蛋白质反应。
      (
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      )已被广泛用于测量不同条件下的丰度,相互作用,修改,周转和亚细胞定位等蛋白质性质(
      • Lamond A.I.
      • Uhlen M.
      • 角horn
      • Makarov A.
      • 罗宾逊C.V.
      • Serrano L.
      • Hartl F.U.
      • Baumeister W.
      • Werenskiold A.K.
      • 安德森J.S.
      • vorm o.
      • 划线M.
      • Aeberberold R.
      通过空间和时间(前景)通过蛋白质组学推进细胞生物学。
      )。亚细胞分级和蛋白质尺寸分离也是强大的技术,可增强细胞蛋白质组的深入分析。这些分馏技术不仅增加了总蛋白质组覆盖率,它们还提供了对蛋白质行为在亚细胞间隔之间的不同之处的生物学识。例如,亚细胞分馏突出了核心和细胞质之间核糖体蛋白质劣化速率的差异,(
      • Boisvert F.O.M.
      • Ahmad Y.
      • Gierlinski M.
      • Charriere F.
      • Lamont D.
      • 斯科特米
      • 巴顿G.
      • Lamond A.I.
      人体细胞蛋白质组果苗果实分析的定量空间蛋白质组学分析。
      ,
      • 林Y.W.
      • Lamond A.I.
      • 安德森J.S.
      核仁蛋白动力学分析显示核糖体蛋白的核降解。
      )。其他研究还证明了深入的亚细胞分级和产生的方法,以表征蛋白质素如何在细胞器中局部地定位(
      • Gatto L.
      • VizcaínoJ.A.
      • Hermjako H.
      • Huber W.
      • Lilley K.S.
      细胞器蛋白质组学实验设计和分析。
      ,
      • Dunkley T.P.
      • Watson R.
      • 格里芬J.L.
      • Dupree P.
      • Lilley K.S.
      通过同位素标记(LOPIT)通过细胞器蛋白的定位。
      ,
      • 安德森J.S.
      • Wilkinson C.J.
      • 市长T.
      • Mortensen P.
      • nigg e.a.
      蛋白质相关性分析蛋白质组学表征人中子组。
      )。
      在该研究中,我们使用基于氧化硅酸基的定量质谱法与广泛的亚细胞和蛋白质水平分馏联合,以鉴定人U2OS细胞中的快速降解的蛋白质。我们提供蛋白质组水平表征涉及当蛋白酶抑制时抑制蛋白质翻译的主要反馈机制。我们还提供了蛋白质组动力学的百科全书,是一个用户友好的在线资源,提供对整个数据集的访问。

      实验步骤

       材料

      U2OS细胞购自美国型文化收集(ATCC,Rockville,MD)。 Dulbecco的改良Eagle媒介(DMEM),胎牛血清,抗生素,纽扣凝胶,LDS样品缓冲液,MES SDS-PAGE运行缓冲液,硝酸纤维素冰堆,SYPROLUSE IBLOT堆叠,SYPRO RUBY,Alexa Fluor 680-共轭二抗,以及CBQCA测定试剂盒获得Invitrogen(Carlsbad,CA)。 IRDYE 800缀合的二抗是从洛兰免疫化学(Gilbertsville,PA)获得的。 HRP缀合的二抗是来自细胞信号传导技术(Danvers,MA)。双子胆碱酸(BCA)测定试剂,Coomassie加(Bradford)试剂,亚细胞蛋白分级试剂盒,洗涤剂去除板,16%甲醇无多聚甲醛,适应薄膜C18柱和捕获筒(TCEP)(TCEP)(键 - 断路器中性pH值解决方案来自Thermo Scientific(Waltham MA)。胰蛋白酶黄金来自Promega。 SEP-PAK TC18 96-Wellμ-洗脱板来自水(Milford,MA)。完全蛋白酶抑制剂混合物片剂和磷酸磷酸酶抑制剂片来自罗氏(巴塞尔,瑞士)。所有其他材料均可从Sigma(圣路易斯,MO)获得。

       细胞培养

      简而言之,U2OS细胞在补充有10%胎牛血清(FCS)的DMEM中生长,2米 M L. -Glutamine,100u / L青霉素和100μg/ L链霉素在37℃下的10%CO2,并在〜80%的汇合中传代。对于U2OS细胞的硅酸盐标记,使用精氨酸和赖氨酸游离DMEM并补充有稳定的同位素,除了如前所述的透析Fcs(
      • 布隆S.
      • PRADET-BALADE B.
      • Verheggen C.
      • 莫尔德
      • Boi0.
      • Georgieva M.
      • Azzag K.
      • 罗伯特M.C.
      • Ahmad Y.
      • NEEL H.
      • Lamond A.I.
      • Bertrand E.
      HSP90及其R2TP / prefoldin的Cochaperone涉及RNA聚合酶II的细胞质组件。
      )。在通过胰蛋白酶化分裂后,在药物处理前2-3天内达到〜80%的汇合,在药物处理和分馏的裂解前超过〜80%汇合。

       硅酸盐标记的U2OS细胞的亚细胞分级

      对于硅酸筛,用DMSO,40μg/ ml环己酰亚胺或10μ处理U2OS细胞m Mg132对于6小时,然后在1:1:1的细胞的比例中组合,并通过与亚细胞蛋白分级试剂盒(Pierce)的洗涤剂溶解性分馏。然后将这些级分沉淀氯仿 - 甲醇(
      • Wessel D.
      • flüggeu.i.
      洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质在稀释溶液中进行定量回收的方法。
      )通过在消化和液相色谱 - 串联MS(LC-MS / MS)分析之前,通过分子量进一步分离分子量。

       变性尺寸排阻色谱(SDS-SEC),胰蛋白酶消化和肽清理

      使用Dionex Ultimate 3000 HPLC系统,分数重悬于4%SDS,100米m NaCl, 25 mm TCEP, 50 mm N-乙基马来酰亚胺,10米m Na PO4 将pH6.0加热至65℃,然后通过0.45μm过滤器过滤。将样品注入(每次注射50μl-250μg蛋白)上,在Mabpacsec柱(Dionex)上,与0.2%SDS,100米平衡m NaCl, 10 mm Na PO4 pH 6.0。流速为0.2毫升分钟−1 使用低蛋白质结合96-深孔板(EPPendorf)收集8×200μL级分。三乙胺碳酸氢盐(Teab,1 m 将pH8.0)加入各级分中以将pH调节至8.0,并在0.1中稀释胰蛋白酶 m 以1:50的比例加入茶巾,在37℃下孵育18小时。如前所述,使用96孔板中的洗涤剂去除树脂从每个级分中除去SDS(
      • Bereman M.S.
      • Egertson J.D.
      • maccoss m.j.
      基于霰弹枪蛋白质组学分析的SDS的过程比较。
      )。对于脱盐脱盐三氟乙酸(TFA)加入到1%(v / v)中,使用Sep-Pak TC18 96-孔μ洗脱板纯化终浓度和肽。肽在200μl50%(v / v)乙腈0.1%TFA中洗脱,并在5%(v / v)甲酸中重新悬浮之前加速至干。使用CBQCA测定在0.1中稀释的肽样品稀释后使用CBQCA测定测定肽浓度 m 硼酸盐缓冲pH9.3。

       LC-MS / MS和MS数据分析

      使用DiONEX终极3000纳米烯普肽系统,将4μg肽中的5%(v / v)甲酸注入ACClaim Pepmap C18纳米捕集柱(Dionex)上。用2%(v / v)乙腈后0.1%(v / v)甲酸肽在50mm×75μm上溶解在140分钟的有机梯度上的50mm×75μm的肽C18反相分析柱上,流速为200 nL闵−1。使用内径为5μm(目的)的熔融二氧化硅发射器,通过纳米电喷雾电离在1.2kV下通过纳米电喷雾电离电离。串联质谱分析在Qex是质谱仪(Thermo Scientific)上进行。使用MaxQuant软件包版本1.2.2.5处理,搜索和量化数据,如前所述(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      ,
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和 romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      ),使用默认设置并使用包含109,824个条目的人为Uniprot数据库(06/07/11)。用于最大分析的设置是:允许两次失败的裂缝;固定改性是半胱氨酸上的N-乙基马来酰亚胺;酶是胰蛋白酶(k / r不是p之前);分析中包括的可变修饰是甲硫氨酸氧化,谷氨酰胺的脱酰胺,N-末端热谷氨酸形成,蛋白质N-末端乙酰化。用于前体离子的质量耐受性,使用20ppm的耐受性用于片段离子。使用默认的MaxQuant设置,允许肽和蛋白质鉴定允许最大误率为1%。该截止用于接受单个光谱以及最大输出中的整个蛋白质。此前已经显示出该阈值是一种严格的方法,用于识别真正的积极匹配(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )。对于在同一蛋白质组内的Swissprot和颤抖中的相同蛋白质,报道了Swissprot的比赛。如果它们共用相同的肽覆盖,则在相同的蛋白质组中记录同种型。所指出的所有重复均为生物重复,蛋白质定量来自至少两种生物重复。所有蛋白质的氧化硅比使用β-微管蛋白,组蛋白H 2 A和GAPDH比标准化。没有删除异常数据点。

       硅酸数据的统计分析

      p 使用学生计算价值 t 测试比较每种蛋白质的三种生物复制氧化硅比,以对对照,已知的稳定蛋白质的三种生物复制氧化酶, IE。 β-管蛋白,组蛋白H2a和GAPDH。对于CHX / DMSO(M / L)和MG132 / DMSO(H / L)氧化率比例是单尾和双尾 t 试验分别使用。使用Shapiro-Wilk测试测试了正常性的值。

       SDS-PAGE和免疫印迹

      为了产生总细胞裂解物,使用2%SDS在10米中,细胞裂解细胞的总体积的5倍m HEPES, 250 mm sucrose, and 1 mm EDTA(HES BUFFER),50米m N-乙基马来酰亚胺,完全蛋白酶抑制剂EDTA-Fly(Roche)和Phosstop(Roche)。在65℃下孵育裂解物,并且通过使裂解剂通过QIASHREDDER(QIAGEN)除去由于DNA的粘度。为每个样品的SDS-PAGE加载等量的蛋白质,每局10μg。使用MES运行缓冲器的4-12%(W ​​/ V)BIS-TRIS NUPAGE GELS执行SDS-PAGE根据制造商的指示,但添加了25米m TCEP,在LDS样本缓冲液中。根据制造商的指示(Invitrogen)进行Sypro Ruby染色。对于蛋白质印迹,分离的蛋白质被电泳转移到IBlot硝酸纤维素膜中,在TBS(TBST)中以0.1%Tween-20中的3%非脱脂牛奶中封闭,并在TBST中与5%牛血清白蛋白(BSA)中的一抗孵育过夜在4°C。孵育后,在TBST中洗涤膜三次,并用HRP标记的或Alexa Fluor 680 / IRDYE 800在TBST中的3%非脱脂脱脂牛奶中被标记的二抗孵育。使用Immobillon化学发光底物(Millipore)来可视化蛋白质,并用用于HRP标记的二抗的冷却的CCD相机(FUJI)成像,或用于Alexa Fluor 680 / IRDYE 800标记的二抗的胆管奥德赛CLX成像器。

       免疫荧光显微镜

      如上所述,在玻璃盖玻璃上培养细胞。所有后续步骤为25°C。然后用PBS中用3%多聚甲醛固定细胞。用PBS洗涤固定细胞,用50米淬灭游离醛基组m PBS中的甘氨酸。然后使用1%Triton X-100透露细胞10分钟,然后在PBS中洗涤。通过在TBST中封闭5%BSA来加工盖玻片以免疫标记。在TBST中的5%BSA中孵育在盖玻片上孵育一发子抗体。盖玻片在PBS中洗涤。用Alexa Fluor 488或Alex Fluor 594缀合的二抗检测初级抗体,其在盖玻片上孵育30分钟,在TBST中在5%BSA中孵育30μg/ mL Hoechst 33342.通过在Leica SP2 AOB上的共聚焦显微镜分析光学部分显微镜。生成的图像是来自细胞单层中间的单个共焦切片。

       u2os细胞的siRNA转染

      使用Rnaimax(Invitrogen)在Optimem培养基(Invitrogen)中用0.45 nmols转染U2OS细胞。 24小时后,通过SDS-PAGE或流式细胞术通过胰蛋白酶化收获细胞。

       荧光激活细胞分选(FACS)

      将含有10%Fcs的DMEM中的异步U2OS细胞悬浮液在室温下用25μg/ mL Hoechst 33342孵育5分钟。使用ACS Vantage Diva仪器(BD Biosciences),通过DNA含量将细胞通过DNA含量分类成G1,S和G2相细胞群。将分选细胞在PBS中洗涤,并在HES缓冲液中以2%SDS裂解。

      结果

       用于识别迅速降解的蛋白质的工作流程

      为了鉴定快速降解的蛋白质,将骨肉瘤细胞用环己酰亚胺(CHX)处理6小时,这迅速阻断翻译伸长率和因此蛋白质合成。这种方法已用于许多蛋白质降解研究(
      • 周P.
      确定蛋白质半衰期。
      )并与先前使用脉冲 - 氧化剂的研究互补以鉴定迅速降解的蛋白质(
      • Doherty M.K.
      • 哈蒙德D.E.
      • Clague M.J.
      • Gaskell S.J.
      • Beynon R.J.
      人蛋白质组的营业额:动态氧化剂测定蛋白质细胞内稳定性。
      ,
      • SchwanhäusserB.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      ,
      • Boisvert F.O.M.
      • Ahmad Y.
      • Gierlinski M.
      • Charriere F.
      • Lamont D.
      • 斯科特米
      • 巴顿G.
      • Lamond A.I.
      人体细胞蛋白质组果苗果实分析的定量空间蛋白质组学分析。
      )。为了确定快速降解的蛋白质是泛素 - 蛋白酶体系的底物,用蛋白酶体抑制剂Mg132处理6小时的单独的U2OS细胞群。作为对照,用DMSO处理U2OS细胞6小时。 DMSO对照,环己酰亚胺和Mg132处理的细胞分别在“光”,“培养基”或“重”氧化镁培养基中生长( Fig. 1A;请参阅方法)。 6小时孵育后,将三种细胞群以相等的量混合并如下所述用于MS分析(Fig. 1A )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1使用综合蛋白质组学工作流程的全局蛋白质降解分析。 A,基于氧化硅酸的定量光谱法的工作流程以鉴定快速降解的蛋白质。 B,使用已知定位的标记蛋白评估硅酸丝筛的亚细胞分馏。标记包括GAPDH,β-微管蛋白和六核酶-2(胞质粒子级分),柠檬酸合酶,语法-4,语法-7,RAB-4B和灯-1(膜级分),组蛋白H2A和MORF4L1(核分数) ,Vimentin和角蛋白-10(细胞骨架级分)。总蛋白质的百分比显示在 y 轴。颜色表示每个分数中的百分比。 C,蛋白质SDS-SEC分级分析 相对 基于一个预测的蛋白质分子量 在Silico. 人类基因组的翻译。硅酸屏中蛋白质检测的平均分子显示在 y 轴。这 x axis shows the log2 缩放预测蛋白质分子量。
      通过亚细胞室和分子量分离从混合细胞群中分离的所得同位素编码的蛋白质(Fig. 1A)。产生四个亚细胞级分, IE。 核,细胞溶溶胶,细胞骨架和膜。通过蛋白质分子量单独分离每个亚细胞级分,如前所述(SDS-SEC),通过变性SDS尺寸排阻色谱法(SDS-SEC)(
      • 在努力硕士
      • 纾困
      • Pourkarimi E.
      • 干草r.t.
      • 布坎南G.
      • Coulthurst S.
      • Xirodimas D.P.
      • Gartner A.
      • Lamond A.I.
      用线虫中的氨基酸标记稳定同位素标记。
      ,
      • 在努力硕士
      • Kirkwood K.J.
      • Xirodimas D.P.
      • Lundberg E.
      • Uhlen M.
      • Lamond A.I.
      NEDD8途径下游的MRFAP1变化和相互作用的表征。
      )。用胰蛋白酶消化蛋白质并通过LC-MS / MS分析。进行该实验的三种生物学重复。
      鉴定肽和使用MaxQuant定量的硅酸脂肪(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      ,
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和 romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )。共有超过74,000种肽,对应于〜5,000个蛋白质,在三个生物复制中的至少两个中鉴定和定量(补充表S1补充表S2)。本研究分析的〜5000个蛋白质是人蛋白质组的高度代表性,基于总数据集中的氨基酸频率和基因本体(生物过程)术语频率(补充图。S1A,S1B)。已知在分离室中富集所选标记蛋白的亚细胞分布的分析(Fig. 1B), 确认的>每分的80%富集。对于每个亚细胞分数,来自群众的蛋白质>500 kDa down to <10 KDA使用SDS-SEC有效地分离(Fig. 1C )。

       快速耗尽蛋白的表征

      上述工作流程将检测快速耗尽的蛋白质(RDP),其在环己酰亚胺处理后的丰度降低,无论是降解还是分泌物。识别具有高统计显着性的RDP, p 使用a计算值 t 与对照,已知的稳定蛋白质的CHX / DMSO(M / L)氧化物比相比,每种蛋白质的复制CHX / DMSO(M / L)氧化硅比的试验。 IE。 β-管蛋白,组蛋白H2a和GAPDH。意义截止值 p < 0.05 (-Log10(P)>1.3)被使用,结合了一个要求>CHX / DMSO(M / L)氧化镁比率下降50%(日志2 标准化比率CHX / DMSO<-1),表明小于6小时的至少50%耗尽。
      这些标准从〜5000蛋白的总数据集中产生110 rdps(Fig. 2一个绿色的盒子,和 补充表S3)。包括先前所示的蛋白质是迅速降解的,例如P21(
      • starostina n.g.
      • kipreos e.t.
      多种降解途径调节通用CIP / KIP CDK抑制剂。
      ),morf4l1和mrfap1蛋白质(
      • 在努力硕士
      • Kirkwood K.J.
      • Xirodimas D.P.
      • Lundberg E.
      • Uhlen M.
      • Lamond A.I.
      NEDD8途径下游的MRFAP1变化和相互作用的表征。
      )和jun-b(
      • 高米
      • Labuda T.
      • 夏Y.
      • 加拉赫E.
      • 方D.
      • 刘Y.C.
      • 卡琳米
      通过e3连接酶瘙痒的JNK依赖性磷酸化来控制Jun营业额。
      )( Fig. 2A,绿色文本)。一些RDP在单独的亚细胞隔间中显示出不同的降解速率(补充图S2),证明单个蛋白质稳定性可以根据本地化而变化。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2鉴定迅速耗尽的蛋白质。 A,~5000蛋白的分析表明,来自每种蛋白质的三种重复的平均比例表示,由黑点表示(n = 3)。这 y 轴显示A. p value (-log10 转化的)来自a t 与阴性对照蛋白的生物重复相比,对每种蛋白质的三种生物学重复进行测试,这不显示快速耗尽。相对折叠变化显示在 x axis using the log2 比率环己酰亚胺/ DMSO(中/光)。蛋白质与A. p <0.05和折叠变化<-1由绿色盒子覆盖,我们将其定义为快速耗尽的蛋白质(RDPS)。在本研究中强调的先前未表征蛋白质的实例标记为红色,并且被认为是阳性对照的蛋白质以绿色标记。 B,显示每个亚细胞分数中发现的蛋白质的分析,其平均比于黑点代表的每种蛋白质的三种重复(n = 3)。这 y 轴显示A. p value (-log10 转化的)来自a t 与阴性对照蛋白的生物重复相比,对每种蛋白质的三种生物学重复进行测试,这不显示快速耗尽。相对折叠变化显示在 x axis using the log2 比率环己酰亚胺/ DMSO(中/光)。蛋白质与A. p <0.05和氧化硅比<-1由绿色盒覆盖,我们将其定义为馏分特异性的快速降解的蛋白质(RDPS)。

       快速耗尽的蛋白质在亚细胞室之间变化

      相同的意义截止值(p < 0.05 and >CHX / DMSO M / L SILAC比率下降50%),用于分析每个亚细胞分数的数据(Fig. 2B)。这鉴定了额外的蛋白质子集,其丰富在特定隔间中快速减少,但在总数据集中未被识别为RDP(Fig. 2a,b)。 C7ORF59,FAM32A,PLOD3和GLT25D1,提供了在总数据集中未检测到未检测到的蛋白质的明确实例,但从单个亚细胞分数的数据分析显示它们表现为特定的舱室RDPS(Fig. 2A, 2B 蓝点,看 补充表S1 有关详细信息)。这些实施例说明这种现象不仅限于单独的任何一部分,进一步表明它适用于在多个位置中检测到的蛋白质,而不仅仅是富含单个隔室的蛋白质。对于大多数隔室特异性RDPS,在其他级分中没有看到CHX / DMSO(M / L)比率的互核性增加,表明降低的丰富导致降解和分泌,而不是从室内的细胞内运输(补充表S1 )。

        RDP. S的比较分析

      分析了鉴定的RDP,用于涉及目标降解机制的序列基序(补充表S3)与近期大规模的数据相比(>检测到5000个蛋白质),脉冲-Silac在HeLa细胞中的蛋白质周转分析(
      • Boisvert F.O.M.
      • Ahmad Y.
      • Gierlinski M.
      • Charriere F.
      • Lamont D.
      • 斯科特米
      • 巴顿G.
      • Lamond A.I.
      人体细胞蛋白质组果苗果实分析的定量空间蛋白质组学分析。
      )或小鼠NIH-3T3细胞(
      • SchwanhäusserB.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      )。我们还研究了RDP的名单,以标记以前已知和预测的分泌蛋白质(补充表S3 )(
      • Emanuelsson O.
      • 尼尔森H.
      • 布鲁纳克斯。
      • von heijne g.
      基于其N-末端氨基酸序列预测蛋白质的亚细胞定位。
      ),由于蛋白质分泌,而不是降解,环己酰亚胺治疗后的相对丰度迅速降低。使用基于主题的预测或先前的定位数据对RDP的线粒体靶向也已经为每种蛋白质注释(补充表S3 )(
      • Emanuelsson O.
      • 尼尔森H.
      • 布鲁纳克斯。
      • von heijne g.
      基于其N-末端氨基酸序列预测蛋白质的亚细胞定位。
      )。
      其中许多新型RDP含有已知的降解靶向基序,例如促进复合物(APC / C)Ken盒(
      • Pfleger C.M.
      • Kirschner M.W.
      Ken盒子:与CDH1为目标的D盒子不同的APC识别信号。
      ,
      • 刘Z.X.
      • 元F.
      • ren J.
      • Cao J.
      • 周Y.H.
      • 杨Q.
      • 薛Y.
      GPS-ARM:通过预测D-Box和Ken盒来计算APC / C识别主题的计算分析。
      ),apc / c d - 盒子(
      • 刘Z.X.
      • 元F.
      • ren J.
      • Cao J.
      • 周Y.H.
      • 杨Q.
      • 薛Y.
      GPS-ARM:通过预测D-Box和Ken盒来计算APC / C识别主题的计算分析。
      ,
      • 格雷泽姆
      • 默里A.W.
      • Kirschner M.W.
      Cyclin被泛素途径降解。
      )和SKP1-CULLIN-FBOX(SCF)FBXW7绑定站点(
      • 韦尔克米
      • Clurman B.E.
      FBW7泛素连接酶:在细胞分裂的十字路口,生长和分化的十字路口中的肿瘤抑制剂。
      ,
      • 纳什P.
      • 唐X.
      • orlicky s.
      • 陈问:
      • Gertler F.B.
      • Mendenhall M.D.
      • Sicheri F.
      • Pawson T.
      • 泰尔斯米
      CDK抑制剂的多立体磷酸化设定了DNA复制发作的阈值。
      )( 补充表S3)。这些基序在许多蛋白质中发现,在细胞周期中通过特定阶段的快速降解在细胞周期中进行丰富的蛋白质(
      • 芦苇s.i.
      棘轮和时钟:细胞周期,泛素质化和蛋白质转换。
      )。在本研究中确定的所有110次RDP的比较,来自以前大规模的大规模哺乳动物蛋白质周转研究的数据显示>在早期的研究中没有报告我们的新RDP数据的34%(补充表S3)。在预先在前述研究中检测到的那些RDP蛋白质中,70%也发现在小鼠NIH-3T3数据中快速降解(共同检测到的61个蛋白质),并且在HELA数据中也迅速降解了59%( 37种蛋白质被普遍检测到)。并非所有RDP在这些以前的大规模研究中被检测到迅速转过来的事实可能反映分析细胞类型和生物体的差异。

       蛋白酶体抑制触发展开的蛋白质反应

      检查总蛋白质组数据集和110 rdps的子集以响应蛋白酶体抑制剂Mg132(Fig. 3A, 3B补充表S1)。有趣的是,在这两种情况下<1%的蛋白质显示出蛋白酶体抑制后大量变化, IE。 增加或减少,大于双重 p <0.05,mg132处理后。为了确认Mg132处理有效地阻断了蛋白酶体,我们分析了我们预先改变的K48连接的泛素和组蛋白H2A泛素缀合物的总数据集,这将在蛋白酶体抑制后改变(
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 李杰。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      )。这表明Mg132治疗显着增加了K48连接的泛素缀合物的丰度,并且显着降低了组蛋白H 2-ubiquitin缀合物的水平(补充图S3A),确认蛋白酶体抑制。在我们的总数据集中,许多蛋白质在MG132处理后显着增加的蛋白质与展开蛋白质反应(UPR)的诱导有关,包括ATF3,SerpinH1,HSF2和Hsp90ab1(Fig. 3A)。为了进一步研究Mg132介导的UPR的活化,在MG132处理6小时后,我们在MG132处理后免疫细胞裂解物,以测试EIF2α的磷酸化,已知在UPR期间诱导(
      • dverte.e.
      一般翻译因子的基因特异性调节。
      )。这证实了在用Mg132处理后ef2alpha对eIF2α的磷酸丝氨酸51增加的增加,这是翻译的抑制作用(补充图。S3B)。 Mg132处理后的许多蛋白质显着降低,是预测分泌的RDP蛋白质( 例如 胶原蛋白COL1A1)或有线粒体( 例如 ChCHD2),或整体膜定位( 例如 golm1)。因此,这些数据指示哪个RDP可能是蛋白质组目标, IE。 在MG132治疗后,RDP的父次的副本不会显着变化。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3蛋白酶体抑制的蛋白质组响应分析。 A,〜5000蛋白的分析表明了从黑点所代表的每种蛋白质的三种重复的平均比例n = 3)。这 y 轴显示A. p value (-log10 转化的)来自a t 与阴性对照蛋白的生物学重复相比,对每种蛋白质的三种生物重复进行测试,这不显示出快速变化。相对折叠变化显示在 x axis using the log2 比率Mg132 / DMSO(重/灯)。 B,分析迅速耗尽的蛋白质以响应蛋白酶体抑制剂Mg132。这 y 轴显示使用日志的RDP的相对折叠变化2 比率Mg132 / DMSO(重/灯)。这 x 轴显示使用日志的RDP的相对折叠变化2 比率环己酰亚胺/ DMSO(中/光)。本研究强调的先前未表达蛋白质的实例标记为红色,并且蛋白质被认为是阳性图中的绿色标记为绿色。 C,在蛋白质抑制的存在或不存在的时间过程中,在蛋白酶体抑制的情况下进行蛋白质抑制以检查蛋白质降解的情况下,免疫引起U2OS细胞的总细胞裂解物后的免疫印迹,(n = 3)。箭头(填充白色)表示PRR11频段,箭头(填充黑色)表示MLF2频段,星号标记非特异性频段。 D,定量PRR11频段(C)错误栏,指示标准偏差(n = 3)。也可以看看 用于完整污染图像。

       新型RDP分析

      根据数据中选择了四种新的RDP进行了进一步表征 补充表S3 并且抗体试剂的可用性 IE。 (富含脯氨酸的蛋白质11,PRR11;卷轴螺旋螺旋卷线圈 - 含有蛋白2,CHCHD2;无表称蛋白,C20ORF43;和骨髓白血病因子2,MLF2)(Fig. 2AFig. 3A, 3B 红点)。我们的MS数据表明,蛋白质合成抑制后,所有四种蛋白质在丰度下降,3(PRR11,C20ORF43和MLF2)在Mg132处理后没有显着变化,与它们是蛋白酶体靶标,而CHCHD2在丰度下降(Fig. 3A, 3B)。当蛋白酶抑制时,这些蛋白质中的任何蛋白质都不会显着增加。接下来,我们使用互补的Western Blotting方法分析了它们的降解(Fig. 3C )。
      用ChCHD2,PRR11,C20ORF43和MLF2蛋白的特异性抗体免疫,用与Mg132组合使用的环己酰亚胺的时间过程或与Mg132组合使用的环己酰亚胺的总细胞裂解物进行免疫裂解物。Fig. 3C)。这些数据显示所有四种蛋白质在单独的环己酰亚胺治疗后在氧化硅酸盐实验中观察到的相似程度。这完美地证实了所有四个因素都是RDP。这些实验还显示PRR11,C20ORF43和MLF2通过加入Mg132与环己酰亚胺加入劣化,表明它们是蛋白酶体靶标。然而,CHCHD2未受Mg132保护,并且仍然在具有类似的动力学中的丰富下降,仅为单独添加环己酰亚胺。因此,CHCHD2可能因蛋白质组合的机制而降解。

       PRR11是细胞周期调节

      通过PRR11 mRNA的siRNA敲降验证免疫印迹中PRR11蛋白的检测(补充图。S3C)。印迹数据的定量表明,通过同时Mg132治疗U2OS细胞的同时稳定(Fig. 3D)。 PRR11蛋白质先前是无特征化的,但含有与细胞周期调节蛋白质降解相关的多个高度保守的序列基序(Fig. 4ASup The Proplemal表S3)。因此,我们测试了PRR11的丰度在细胞周期期间是否有所不同。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4PRR11细胞周期调节分析。 A,示出了包括特征和图案的整个人PRR11蛋白序列的概述( 最佳 ),具有已知的泛素化位点和磷酸化位点。显示了PRR11蛋白的C末端区域的对准( 底部 ),具有各种基序和相关的已知翻译后的翻译后修饰。每个序列基序的保存由彩色覆盖层表示。蛋白质序列中的红色垂直条代表缺失的序列或移除间隙以显示同源性。在对准中突出了人PRR11蛋白。 B,基于所示的栅极,染色的异步U2OS细胞的异步U2OS细胞的异步U2OS细胞分选并分类为细胞周期的G1,S或G2 / m阶段,具有相应的总群体的百分比。显示了来自起始异步电池的总细胞裂解物的免疫印迹和分选G1,S和G2 / M细胞(n = 2)。箭头头(填充白色)表示PRR11频段,星号标记非特异性频段。
      首先,使用特异性PRR11抗体在Cococal免疫荧光显微镜中表征U2OS细胞中的PRR11表达和定位(补充图S4)。这表明,与Vimentin相比,PRR11染色主要是细胞质,并且在细胞之间的强度变化,与Vimentin相比,在所有细胞中显示出类似的染色水平。为了测试PRR11染色强度的细胞变异反映了其丰度的细胞周期调制,我们使用基于DNA含量的活u2OS细胞的荧光激活细胞分选(FACS)分析,得到异步,G1,S和G2 / M相细胞群。用PRR11抗体裂解细胞群和免疫印迹(Fig. 4B)。这表明PRR11水平从G1增加到G2 / M相增加。这些数据表明,PRR1蛋白的水平在细胞周期期间变化。

       迅速降解蛋白质的计算分析

      为了方便地访问本研究中产生的数量蛋白质组学数据的大量,我们开发了蛋白质组动力学的百科全书(http://www.peptracker.com/encyclopediaInformation/,)。这是一个在线资源,将所有蛋白质数据从本研究中核开,以及来自我们最近最近的蛋白质组学研究的数据,在公开的数据库中(Fig. 5A)。使用此数据库,我们已经分析了作为生物过程的RDPS确定的总蛋白质的子集,具有重要的阈值 p <与一个相比0.01 在Silico. 人类蛋白质组的翻译(Fig. 5B)。这表明,GO术语包括细胞周期的调节,有丝分裂,对DNA损伤刺激,大分子复合组装,染色质修饰和表皮发育的术语均显着富集在U2OS RDP子集中。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5快速降解蛋白的计算分析。 A从蛋白酶动态(EPD)的百科全书源自源自蛋白质组动力学(EPD)的数据。包括本研究中提供的整个数据集的EPD数据库可自由访问 http://www.peptracker.com/encyclopediaInformation/. B,使用David数据库分析RDP中的丰富生物过程(
      • 达W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      )。 这 y 轴表示易于分数(-log10 转换为RDP数据集中丰富的每个GO术语 相对 人类蛋白质组,与 p <0.01截止点缀红线表示。这 x 轴显示与每个GO术语(生物过程)相关的RDP的数量。与每个步义相关的气泡尺寸随着人类蛋白质组中该术语的频率增加而增加。颜色表示相关的GO条款。 C,使用字符串数据库分析RDP中的网络。每个蛋白质由节点和没有连接的蛋白质表示。节点之间的线条表示连接等实验相互作用(粉红色),共同表达(黑色),交互数据库(蓝色),文献(绿色)和同源性(紫色)。 K. 方法 群集已被用于突出显示具有这些节点的公共着色的RDP数据集中的子网。
      要搜索RDP之间的连接,我们使用字符串数据库(
      • Szklarczyk D.
      • Franceschini A.
      • Kuhn M.
      • Simonovic M.
      • 罗斯A.
      • Minguez P.
      • Doerks T.
      • 斯塔克米
      • Muller J.
      • Bork P.
      • Jensen L.J.
      • von mering c.
      2011年的字符串数据库:蛋白质的功能交互网络,全球整合和得分。
      ),分析包括共表达,蛋白质 - 蛋白质相互作用的多种参数,以及蛋白质(Fig. 5C)。鉴定了许多群集,其中几个有趣的网络脱颖而出。这包括我们以前作为染色蛋白调节的迅速降解的相互作用蛋白的网络识别的MRFAP1-MORF4L1-MORF4L2集群(
      • 在努力硕士
      • Kirkwood K.J.
      • Xirodimas D.P.
      • Lundberg E.
      • Uhlen M.
      • Lamond A.I.
      NEDD8途径下游的MRFAP1变化和相互作用的表征。
      )和PLK1-TPX2-UBE2C细胞周期相关群体,其含有与促进复合物的后期相关的组件(Fig. 5C )。
      对每个亚细胞分数内的RDP进行类似的聚类分析(补充图S5)。这在细胞质分数中显示了几种RDP簇,包括细胞周期相关的CDC20-UBE2C-UBE2S网络和ABL1-WASL信令网络。如预期的那样,膜馏分含有大多数分泌的蛋白质,以及细胞周期相关的P21-CDK4网络。核部分突出显示MRFAP1-MORF4L1网络(
      • 在努力硕士
      • Kirkwood K.J.
      • Xirodimas D.P.
      • Lundberg E.
      • Uhlen M.
      • Lamond A.I.
      NEDD8途径下游的MRFAP1变化和相互作用的表征。
      ),介质复合体和细胞周期相关信令网络,包含Aurora B和PLK1激酶。在所有亚细胞级分中,细胞骨骼隔室具有最少的RDP,并且含有包含细胞角蛋白酶1,2和10的一个主要簇。这些数据显示鉴定的总体许多RDP是连接的,也可以作为多蛋白复合物的一部分,或者作为监管途径的组成部分。

      讨论

      我们使用了一种综合蛋白质组学策略,结合亚细胞分馏,以鉴定U2OS骨肉瘤细胞的特定隔室中的快速降解的蛋白质。我们表征在蛋白质组水平下抑制平版翻译或蛋白酶体介导的降解的影响。基于分析来自5000多种人蛋白的74,000个肽,我们鉴定先前无表明,快速降解的蛋白质和蛋白质,其降解根据亚细胞定位而变化。使用我们的工作流程,整个数据集被用于亚细胞定位,表观分子量,丰度和特异性降解的亚细胞定位。还在蛋白质组水平分析对蛋白酶体抑制的反应,并显示出对蛋白质合成的大规模反馈抑制。这些数据提供了一种有价值的资源,详细说明了蛋白质组降解的空间控制及其在模型人U2OS细胞系中的调节。我们创建了百科全书的蛋白质组动态,为社区提供了方便的在线访问,我们生成的其他大型蛋白质组学数据集。
      这里使用的蛋白质组学策略的几个特征增强了所得数据集的生物价值。例如,因为许多迅速降解的蛋白质在低丰度中发生,尺寸分离和蛋白质子集的分析有助于降低LC-MS / MS期间检测竞争。亚细胞分级不仅辅助检测效率,包括例如膜蛋白,还提供了对蛋白质定位和舱室特异性降解的洞察力(
      • Ahmad Y.
      • Boisvert F.M.
      • Lundberg E.
      • Uhlen M.
      • Lamond A.I.
      蛋白质池,同种型和影响变型和亚细胞定位的修饰系统分析。
      )。该研究提供了在多个亚细胞位置存在的特定蛋白质的清晰示例,但是仅在这些位置的子集中表现为RDP。这在此处在单个RDP和蛋白质相互作用网络的水平下进行说明。通过分析全细胞裂解物的使用亚细胞分级依赖于使用亚细胞分级的这种空间控制的检测依赖于使用亚细胞分级。基于这些数据,我们推断蛋白质稳定性的空间控制可能比以前实现的更常见。因此,将来将有趣的是将这种现象与其他细胞类型和模型生物进行比较。
      我们认为,这里用于随后监测蛋白质降解的环己酰亚胺治疗的策略是与使用脉冲-SILAC技术的研究互补。环己酰亚胺处理具有避免代谢标记可能存在的问题,例如在短时间点和具有不同池的混合和未标记的氨基酸的混合产生的数据分析和解释的并发症中延迟掺入外源添加的氨基酸。另一方面,具有药物治疗的阻断翻译可能导致对可能影响细胞生理学和扭曲蛋白质组动力学的蛋白质组的间接影响。因此,我们认为这两种方法都是测量蛋白质稳定性和比较所得数据集的有效方法特别有用,正如我们对先前大规模的大规模脉冲素淤泥研究的基于基于环己酰亚胺的分析的比较所证明的(参见 补充表S3 )。
      对U2OS细胞的这项研究特别引人注目的是,抑制6小时的蛋白酶体不会导致几乎任何鉴定的蛋白质的丰度增加。这些发现与最近的两份报告一致,其在HCT116或HeLa细胞中显示出类似的效果, IE。 大多数蛋白质在蛋白酶体抑制后没有大量变化(
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 李杰。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      ,
      • Tatham M.H.
      • matic i.
      • 干草r.t.
      对比蛋白质组学分析鉴定了蛋白质质量控​​制中的SUMO的作用。
      )。在我们的研究中,即使具有RDP的子集,如果它们是蛋白酶体介导的降解的靶标,通常会增加其丰富,但用Mg132处理后几乎没有观察到的变化。然而,我们的分析证实,Mg132治疗有效地阻断了蛋白酶体,并导致了K48连接的泛素的水平增加,并降低了组胞蛋白缀合物的水平降低。虽然这些数据集可能缺少蛋白酶体抑制后增加的一些低丰度蛋白,但是( 例如 尽管如此,数据表明大多数蛋白质在蛋白酶被阻断时不会累积。
      这似乎是矛盾的,因为我们研究中发现的许多RDP似乎都是蛋白酶体的目标。我们建议通过我们目前的蛋白质组学数据提供该悖论的分辨率,所述蛋白质组学数据显示蛋白酶体抑制诱导UPR,从而导致对翻译的全局抑制。此外,我们在Mg132处理后观察到eIF2Alpha上的磷酸丝氨酸51增加。这些观察结果总结在所示的模型中 Fig. 6。这与江和韦克的观察结果一致(
      • 江H.Y.
      • Wek R.C.
      真核引发因子-2(EIF2α)的α-亚基的磷酸化降低了蛋白质合成,并响应于蛋白酶体抑制而增强细胞凋亡。
      ),据表明,抑制蛋白酶体导致SER51的真核引发因子EIF2ALPA的磷酸化和翻译的减少。这种磷酸化事件响应多种形式的细胞应激而发生,并通过减少荟萃TRNA的递送来导致对翻译的广泛抑制i 遇见 to the ribosome.
      图缩略图GR6.
      Fig. 6平移抑制或蛋白酶体抑制后蛋白质全组反应的模型。 核糖体产生天然蛋白质和非蛋白质。本机蛋白质可以通过可能根据亚细胞定位(由灰色箭头表示)而不同的机制来降解。环己酰亚胺治疗使我们将这种耗竭视为随着时间的推移随着蛋白质的降低而降低。在正常情况下,非毒性蛋白质迅速萎缩并被蛋白酶团降解。 Mg132处理的蛋白酶体抑制阻断天然蛋白质和非蛋白质的降解。这诱导了非肾性蛋白质的积聚,导致展开的蛋白质反应。对Mg132的这种反应的一个结果是通过EIF-2αser51磷酸化抑制蛋白质合成。因此,因为Mg132同时阻断蛋白酶体和蛋白质合成,所以观察蛋白酶体抑制后的大量增加的蛋白质增加,并且仅通过非呼吸瘤机制耗尽的RDP子集降低了丰富。
      该模型中展开蛋白质的来源是什么?以前的研究表明,在翻译期间,核糖体在翻译期间没有显示100%的保真度,并且建议高达30%的翻译蛋白质可能是非原生“核糖体产物”(滴水)(
      • Schubert U.
      • 安顿L.C.
      • 吉布斯J.
      • Norbury C.C.
      • yewdell J.W.
      • Bennink J.R.
      通过蛋白酶体快速降解大部分新合成的蛋白质。
      )。这种比例的滴水可能会有所不同, 例如 在不同的生长条件和细胞类型下。在正常条件下,滴落将迅速遍布普通吲哚脲化并被蛋白酶体降解。在存在蛋白酶体抑制剂时,当这些非天然蛋白不能被通常用于其破坏的泛素 - 蛋白酶体系(
      • Kriegenburg F.
      • Ellgaard L.
      • Hartmann-Petersen R.
      用于靶向错误粘附的蛋白质的分子伴侣蛋白依赖性降解。
      ),它们会随着时间的推移积累并触发UPR。这与我们的现象一致,表明,在抑制蛋白酶体后,各种指示UPR的蛋白质是上调的。如模型所示( Fig. 6),抑制蛋白酶体导致蛋白质组的效果,因为翻译的反馈抑制复杂的反馈抑制而导致超越抗体脱落。我们注意到,如模型所示,影响蛋白质稳定性和细胞生理学(例如自噬)的其他途径也可以通过蛋白酶体抑制和UPR触发。然而,在本研究中没有直接解决其他途径的贡献,并将是未来分析的有趣话题。
      生物信息学分析表明,我们识别的RDP富集了特定的GO条款(Fig. 5B),表明蛋白质稳定性的控制对于与这些GO术语相关的调节途径可能尤为重要。这些术语包括“细胞循环的有丝分裂”和“调节”,其中已知靶向蛋白质降解是至关重要的。此外,我们的分析表明,在细胞周期的G1相中使用的APC / C和FBXW7-SCF结合基序与许多RDP相关联。这进一步证实了蛋白质稳定性和细胞周期之间的联系,并与我们氧化屏幕中的大多数异步U2OS细胞的事实相关,所以我们的氧化屏中的大多数是G1相。有趣的是,尽管对细胞周期调节蛋白质的密集分析,专注于快速降解的蛋白质,但鉴定了新的实施例,例如PRR11。我们的分析表明,PRR11丰度在细胞周期上受到调节。该调节可能由保守的APC / C和FBXW7-SCF靶向基序在蛋白质的C末端(Fig. 4A)。因此,在晚期有丝分裂和G1相细胞中,PRR11蛋白可以通过APC / C和FBXW7-SCF复合物进行靶向降解。
      除细胞周期和有丝分裂外,还鉴定了一组RDP还强调了与靶向蛋白质降解的作用的过程相关的GO术语较小。这包括对GO术语,“染色质组织”和“染色质修饰”的高度显着的富集,其中两者都有多种蛋白质实例。其他相关过程突出显示包括“对压力”和“对DNA损伤刺激的响应”的“蜂窝响应”。富集术语“表皮发育”的富集也是有趣的,可以反映U2OS细胞系的间充质起源。我们建议将来将进一步探讨靶向蛋白质降解机制在这些过程中的潜在作用。
      除了鉴定可能的蛋白酶体底物中,我们的全局分析还表明了可能因蛋白质组合的机制而降解的RDP,或者分泌。例如,CHCHD2是先前所示的线粒体蛋白质以调节氧化磷酸化(
      • Baughman J.m.
      • Nilsson R.
      • Gohil v.m.
      • arlow d.h.
      • Gauhar Z.
      • Mootha V.K.
      氧化磷酸化调节剂的计算屏幕意味着线粒体RNA稳态中的SLIRP。
      )。我们的数据表明CHCHD2未通过蛋白酶体抑制免于降解,因此必须通过其他方法降解,例如通过CLP,LON或AAA复合物的线粒体降解途径(
      • 面包师光明
      • Haynes C.M.
      生物发生和老化期间的线粒体蛋白质质量控​​制。
      )。对于靶向用于自噬发生的许多膜蛋白和蛋白质,还将需要蛋白酶体的蛋白质的降解,其使用溶酶体蛋白酶(
      • Ciechorover A.
      蛋白水解:从溶酶体到泛素和蛋白酶体。
      )。我们的RDP数据集包括分泌蛋白质的可能实例, 例如 胶原蛋白和蛋白质依赖于溶酶体降解, 例如 golm1。这支持该数据集提供了人类U2OS细胞中RDP的代表性概述。
      总之,本研究提供了一种资源,该资源识别U2OS细胞中的全局和隔室特异性迅速降解的蛋白质,其中许多是先前无表达睡眠的。我们还记录了由蛋白酶体抑制诱导的翻译的负反馈产生的蛋白质组效果,并提出了负责机制的模型。 RDP的生物信息学分析突出了蛋白质降解控制的生物过程可能发挥重要作用。未来研究的一个有趣的途径是如何检查蛋白质降解在正常和转化的细胞之间的不同之处,因为在这些细胞状态之间可能差异调节染色体调节,染色质调节和DNA损伤修复的许多蛋白质。

      补充材料

      参考

        • Ciechorover A.
        细胞内蛋白质降解:从溶酶体和泛素蛋白酶体系和毒素蛋白酶体系和药物靶向中,从模糊的术语降解。
        细胞死亡有所不同。 2005; 12: 1178-1190
        • 芦苇s.i.
        棘轮和时钟:细胞周期,泛素质化和蛋白质转换。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2003; 4: 855-864
        • Doherty M.K.
        • 哈蒙德D.E.
        • Clague M.J.
        • Gaskell S.J.
        • Beynon R.J.
        人蛋白质组的营业额:动态氧化剂测定蛋白质细胞内稳定性。
        J.蛋白质组。 2009; 8: 104-112
        • 伊甸园E.
        • Geva-Zatory N.
        • Issaeva I.
        • 科恩A.
        • DEKEL E.
        • 丹昂T.
        • 科恩L.
        • Mayo A.
        • Alon U.
        活性人体细胞中的蛋白质组半衰期动态。
        科学。 2011; 331: 764-768
        • Yen H.C.
        • 徐Q.
        • Chou d.m.
        • 赵Z.
        • elldege s.j.
        哺乳动物细胞中的全局蛋白质稳定性分析。
        科学。 2008; 322: 918-923
        • SchwanhäusserB.
        • 巴士D.
        • 李恩
        • Dittmar G.
        • Schuchhardt J.
        • 狼J.
        • 陈W.
        • Selbach M.
        哺乳动物基因表达控制的全局量化。
        自然。 2011; 473: 337-342
        • Boisvert F.O.M.
        • Ahmad Y.
        • Gierlinski M.
        • Charriere F.
        • Lamont D.
        • 斯科特米
        • 巴顿G.
        • Lamond A.I.
        人体细胞蛋白质组果苗果实分析的定量空间蛋白质组学分析。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2012; 11M111.011429
        • Savas J.N.
        • 富山B.H.
        • XU T.
        • yates 3rd,J.R.
        • Hetzer M.W.
        大鼠大脑中极度长的核孔蛋白。
        科学。 2012; 335: 942
        • 莱明A.J.
        • MOMAND J.
        • Finlay C.A.
        p53肿瘤抑制基因。
        自然。 1991; 351: 453-456
        • vojtěsekb.
        • 泳道D.P.
        人乳腺癌细胞系中P53蛋白表达的调节。
        J. Cell SCI。 1993; 105: 607-612
        • Thomas L.R.
        • Tansey W.P.
        癌蛋白转录因子myc的蛋白水解控制。
        adv。癌症res。 2011; 110: 77-106
        • Cox J.
        用于数据驱动系统生物学的定量,高分辨率蛋白质组学。
        安努。 Rev. Biochem。 2011; 80: 273-299
        • Bensimon A.
        • Heck A.J.
        • Aeberberold R.
        基于质谱的蛋白质组学和网络生物学。
        安努。 Rev. Biochem。 2012; 81: 379-405
        • Cravatt B.f.
        • 西蒙上午
        • yates 3rd,J.R.
        基于质谱的蛋白质组学的生物学撞击。
        自然。 2007; 450: 991-1000
        • ong s.e.
        • Blagoev B.
        • Kratchmarova I.
        • 克里斯滕森D.B.
        • 斯丁H.
        • Pandey A.
        细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2002; 1: 376-386
        • Lamond A.I.
        • Uhlen M.
        • 角horn
        • Makarov A.
        • 罗宾逊C.V.
        • Serrano L.
        • Hartl F.U.
        • Baumeister W.
        • Werenskiold A.K.
        • 安德森J.S.
        • vorm o.
        • 划线M.
        • Aeberberold R.
        通过空间和时间(前景)通过蛋白质组学推进细胞生物学。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2012; 11O112.017731
        • 林Y.W.
        • Lamond A.I.
        • 安德森J.S.
        核仁蛋白动力学分析显示核糖体蛋白的核降解。
        Curr。 BIOL。 2007; 17: 749-760
        • Gatto L.
        • VizcaínoJ.A.
        • Hermjako H.
        • Huber W.
        • Lilley K.S.
        细胞器蛋白质组学实验设计和分析。
        蛋白质组学。 2010; 10: 3957-3969
        • Dunkley T.P.
        • Watson R.
        • 格里芬J.L.
        • Dupree P.
        • Lilley K.S.
        通过同位素标记(LOPIT)通过细胞器蛋白的定位。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2004; 3: 1128-1134
        • 安德森J.S.
        • Wilkinson C.J.
        • 市长T.
        • Mortensen P.
        • nigg e.a.
        蛋白质相关性分析蛋白质组学表征人中子组。
        自然。 2003; 426: 570-574
        • 布隆S.
        • PRADET-BALADE B.
        • Verheggen C.
        • 莫尔德
        • Boi0.
        • Georgieva M.
        • Azzag K.
        • 罗伯特M.C.
        • Ahmad Y.
        • NEEL H.
        • Lamond A.I.
        • Bertrand E.
        HSP90及其R2TP / prefoldin的Cochaperone涉及RNA聚合酶II的细胞质组件。
        摩尔。细胞。 2010; 39: 912-924
        • Wessel D.
        • flüggeu.i.
        洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质在稀释溶液中进行定量回收的方法。
        肛门。生物学习。 1984; 138: 141-143
        • Bereman M.S.
        • Egertson J.D.
        • maccoss m.j.
        基于霰弹枪蛋白质组学分析的SDS的过程比较。
        蛋白质组学。 2011; 11: 2931-2935
        • Cox J.
        MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
        NAT。 Biotechnol。 2008; 26: 1367-1372
        • Cox J.
        • Neuhauser N.
        • Michalski A.
        • 施泰米r.a.
        • 奥尔森J.V.
        和 romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 1794-1805
        • 周P.
        确定蛋白质半衰期。
        方法mol。 BIOL。 2004; 284: 67-77
        • 在努力硕士
        • 纾困
        • Pourkarimi E.
        • 干草r.t.
        • 布坎南G.
        • Coulthurst S.
        • Xirodimas D.P.
        • Gartner A.
        • Lamond A.I.
        用线虫中的氨基酸标记稳定同位素标记。
        NAT。方法。 2011; 8: 849-851
        • 在努力硕士
        • Kirkwood K.J.
        • Xirodimas D.P.
        • Lundberg E.
        • Uhlen M.
        • Lamond A.I.
        NEDD8途径下游的MRFAP1变化和相互作用的表征。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2012; 11M111.014407.
        • starostina n.g.
        • kipreos e.t.
        多种降解途径调节通用CIP / KIP CDK抑制剂。
        趋势细胞BIOL。 2012; 22: 33-41
        • 高米
        • Labuda T.
        • 夏Y.
        • 加拉赫E.
        • 方D.
        • 刘Y.C.
        • 卡琳米
        通过e3连接酶瘙痒的JNK依赖性磷酸化来控制Jun营业额。
        科学。 2004; 306: 271-275
        • Emanuelsson O.
        • 尼尔森H.
        • 布鲁纳克斯。
        • von heijne g.
        基于其N-末端氨基酸序列预测蛋白质的亚细胞定位。
        J.Mol。 BIOL。 2000; 300: 1005-1016
        • Pfleger C.M.
        • Kirschner M.W.
        Ken盒子:与CDH1为目标的D盒子不同的APC识别信号。
        基因。开发。 2000; 14: 655-665
        • 刘Z.X.
        • 元F.
        • ren J.
        • Cao J.
        • 周Y.H.
        • 杨Q.
        • 薛Y.
        GPS-ARM:通过预测D-Box和Ken盒来计算APC / C识别主题的计算分析。
        Plos一个。 2012; 7: e34370
        • 格雷泽姆
        • 默里A.W.
        • Kirschner M.W.
        Cyclin被泛素途径降解。
        自然。 1991; 349: 132-138
        • 韦尔克米
        • Clurman B.E.
        FBW7泛素连接酶:在细胞分裂的十字路口,生长和分化的十字路口中的肿瘤抑制剂。
        NAT。癌症。 2008; 8: 83-93
        • 纳什P.
        • 唐X.
        • orlicky s.
        • 陈问:
        • Gertler F.B.
        • Mendenhall M.D.
        • Sicheri F.
        • Pawson T.
        • 泰尔斯米
        CDK抑制剂的多立体磷酸化设定了DNA复制发作的阈值。
        自然。 2001; 414: 514-521
        • 金W.
        • 贝内特e.j.
        • Huttlin E.L.
        • 郭阿。
        • 李杰。
        • 可能A.
        • Sowa M.E.
        • RAD R.
        • 赶紧J.
        • 梳理M.J.
        • 哈珀J.W.
        • Gygi S.P.
        泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
        摩尔。细胞。 2011; 44: 325-340
        • dverte.e.
        一般翻译因子的基因特异性调节。
        细胞。 2002; 108: 545-556
        • Szklarczyk D.
        • Franceschini A.
        • Kuhn M.
        • Simonovic M.
        • 罗斯A.
        • Minguez P.
        • Doerks T.
        • 斯塔克米
        • Muller J.
        • Bork P.
        • Jensen L.J.
        • von mering c.
        2011年的字符串数据库:蛋白质的功能交互网络,全球整合和得分。
        核酸RES。 2011; 39: D561-D568
        • Ahmad Y.
        • Boisvert F.M.
        • Lundberg E.
        • Uhlen M.
        • Lamond A.I.
        蛋白质池,同种型和影响变型和亚细胞定位的修饰系统分析。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2012; 11M111.013680
        • Tatham M.H.
        • matic i.
        • 干草r.t.
        对比蛋白质组学分析鉴定了蛋白质质量控​​制中的SUMO的作用。
        SCI。信号。 2011; 4: rs4
        • 江H.Y.
        • Wek R.C.
        真核引发因子-2(EIF2α)的α-亚基的磷酸化降低了蛋白质合成,并响应于蛋白酶体抑制而增强细胞凋亡。
        J. Biol。化学。 2005; 280: 14189-14202
        • Schubert U.
        • 安顿L.C.
        • 吉布斯J.
        • Norbury C.C.
        • yewdell J.W.
        • Bennink J.R.
        通过蛋白酶体快速降解大部分新合成的蛋白质。
        自然。 2000; 404: 770-774
        • Kriegenburg F.
        • Ellgaard L.
        • Hartmann-Petersen R.
        用于靶向错误粘附的蛋白质的分子伴侣蛋白依赖性降解。
        FEBS J. 2012; 279: 532-542
        • Baughman J.m.
        • Nilsson R.
        • Gohil v.m.
        • arlow d.h.
        • Gauhar Z.
        • Mootha V.K.
        氧化磷酸化调节剂的计算屏幕意味着线粒体RNA稳态中的SLIRP。
        Plos Genet。 2009; 5
        • 面包师光明
        • Haynes C.M.
        生物发生和老化期间的线粒体蛋白质质量控​​制。
        趋势生物化学。 SCI。 2011; 36: 254-261
        • Ciechorover A.
        蛋白水解:从溶酶体到泛素和蛋白酶体。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2005; 6: 79-87
        • 达W.
        • 谢尔曼B.T.
        • LEMPICKI R.A.
        用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
        NAT。 protoc。 2009; 4: 44-57