逐叠生物合成途径的靶向蛋白质组学完成了一种综合基因组学 - 蛋白质组学 - 代谢组织的细胞新陈代谢图像*

  • EduardSabidó
    隶属关系
    从生物学系,分子系统生物学研究所,瑞士8093苏黎世

    系统生理学和代谢疾病的能力中心,瑞士8093苏黎世
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  • 奥斯瓦尔德Quehenberger
    隶属关系
    医学部门和加州大学药理学,圣地亚哥,拉霍亚,加利福尼亚州,92093-0601
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  • 秦沉
    隶属关系
    从生物学系,分子系统生物学研究所,瑞士8093苏黎世
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  • 清云昌
    隶属关系
    统计与计算机科学部门,普渡大学,西拉斐特,印第安纳州47107
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  • ishita shah
    隶属关系
    化学和生物化学部门以及加利福尼亚大学,圣地亚哥,拉霍亚,加利福尼亚州的医学院和药理学系,92093-0601
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  • Aaron M. Armando.
    隶属关系
    化学和生物化学部门以及加利福尼亚大学,圣地亚哥,拉霍亚,加利福尼亚州的医学院和药理学系,92093-0601
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  • Alexander Andreyev.
    隶属关系
    化学和生物化学部门以及加利福尼亚大学,圣地亚哥,拉霍亚,加利福尼亚州的医学院和药理学系,92093-0601
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  • 奥尔加韦克斯
    隶属关系
    统计与计算机科学部门,普渡大学,西拉斐特,印第安纳州47107
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  • 爱德华A.丹尼斯
    一致
    应讨论对应的通信:化学和生物化学和生物化学和药理学系,加州大学医学院,圣地亚哥,La Jolla,CA 92093-0601。
    隶属关系
    化学和生物化学部门以及加利福尼亚大学,圣地亚哥,拉霍亚,加利福尼亚州的医学院和药理学系,92093-0601
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  • Ruedi Aebbersold.
    一致
    应解决对应的通信:分子系统生物学研究所,Eth-Zürich,沃尔夫冈 - 保利斯特拉斯16,8093苏黎世,瑞士。
    隶属关系
    从生物学系,分子系统生物学研究所,瑞士8093苏黎世

    系统生理学和代谢疾病的能力中心,瑞士8093苏黎世

    瑞士苏黎世大学苏黎世大学理学院
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了国家卫生研究院大规模协作Lipid地图的支持,欧洲研究理事会(RA)的资金和欧洲联盟通过欧洲研究委员会先进的授予233226(对ra) ,以及System生物学(SystemsX)的瑞士瑞士倡议的Liverx计划(至ES)。
    本文含有补充材料。
      异甘油构成各种各样的生物活性脂质介质,这些凝胶蛋白是由花生素酸产生的,并在细胞信号传导和众多疾病的炎症方面发挥关键作用。我们以前在Raw264.7巨噬细胞中定量了逐渐定量的eIcsanoid代谢物生产响应于Toll样受体4信号传导并分析编码参与逐渐结合的酶代谢物生物合成途径的酶的转录物水平。我们现在通过多重反应监测质谱法在Raw264.7巨噬细胞中的相似实验条件下报告了蛋白质水平变化的定量。一种精确的靶向蛋白质定量方法。该数据完成了逐渐整理的基因组,蛋白质组学和代谢组分分析的果晕生物化学途径。
      异氰烷构成由花生素酸产生的多种生物活性脂质介质,其在细胞信号传导和众多疾病的炎症方面起到关键作用(
      • Khanapure S.P.
      • Garvey D.S.
      • Janero D.R.
      • 露出l.g.
      炎症中的七氧化物:生物合成,药理学和治疗前沿。
      ,
      • Medzhitov R.
      炎症的起源和生理作用。
      ,
      • Medzhitov R.
      炎症2010:旧火焰的新冒险。
      )。在基础条件下,生物体系具有非常低的游离脂肪酸,包括花生酸,因为脂肪酸主要被发现在甘油三酯,甾醇酯和磷脂中酯化。特异性受体的激活导致许多下游事件,包括通过磷脂酶A的作用引发来自膜磷脂的游离花生酸的释放2 及其随后转化为含氧代谢物通常称为籽糖苷(
      • Buczynski M.W.
      • Dumlao D.S.
      • 丹尼斯E.A.
      专题审查系列:蛋白质组学。芍洲生物学的集成OMICS分析。
      )。我们以前在Raw264.7巨噬细胞中定量了七盐蛋白代谢产物生产(
      • Harkewicz R.
      • Fahy E.
      • Andreyev A.
      • 丹尼斯E.A.
      在内毒素刺激的巨噬细胞样细胞中观察到的arachidonate衍生的二倍体前吡喃植物产生。
      ,
      • Buczynski M.W.
      • Stephens D.L.
      • 鲍德里·绅士R.C.
      • GRKOVICH A.
      • 认为R.A.
      • 丹尼斯E.A.
      TLR.-4和持续的钙激动剂协同产生独立于Raw264中蛋白质合成的果香素。 7个细胞。
      )响应于Toll样受体4(TLR-4)
      使用的缩写是:
      TLR.
      Toll样受体
      克拉
      kdo.2-Lipid A.
      MRM.
      多重反应监测。
      1使用的缩写是:TLR.
      Toll样受体
      克拉
      kdo.2-Lipid A.
      MRM.
      多重反应监测。
      agonist Kdo2-1pid a(kla),单一明确定义的脂多糖亚种和巨噬细胞炎症计划的有效诱导剂(
      • Raetz C.R.
      • Garrett T.A.
      • Reynolds C.M.
      • shaw w.a.
      • 摩尔J.D.
      • 史密斯Jr.,D.C.
      • Ribeiro A.A.
      • 墨菲r.c.。
      • Ulevitch r.j.
      • 可怕的C.
      • reichart d。
      • 玻璃C.K.
      • 贝纳C.
      • Subramaniam S.
      • Harkewicz R.
      • 鲍德里·绅士R.C.
      • Buczynski M.W.
      • 库珀J.A.
      • 认为R.A.
      • 丹尼斯E.A.
      KDO2-脂质A 大肠杆菌,通过TLR-4激活巨噬细胞的定义内毒素。
      )。我们还以刺激后的时间的函数进行代谢型材的流动分析(
      • Gupta S.
      • Maurya M.R.
      • Stephens D.L.
      • 丹尼斯E.A.
      • Subramaniam S.
      基于脂质谱磁体通量分析的逐芍药状代谢与信号传导的综合模型。
      )和转录组分析作为巨噬细胞脂质体的更广泛研究及其转录组相关性的一部分(
      • 丹尼斯E.A.
      • 认为R.A.
      • Harkewicz R.
      • Quehenberger O.
      • 棕色H.A.
      • Milne S.B.
      • Myers D.S.
      • 玻璃C.K.
      • 硬曼G.
      • reichart d。
      • Merrill Jr.,A.H.
      • Sullards M.C.
      • 王E.
      • 墨菲r.c.。
      • Raetz C.R.
      • Garrett T.A.
      • 关Z.
      • Ryan A.c.
      • 罗素D.W.
      • 麦当劳J.G.
      • 汤普森下午
      • shaw w.a.
      • 苏克斯
      • 赵玉。
      • Gupta S.
      • Maurya M.R.
      • Fahy E.
      • Subramaniam S.
      小鼠巨噬细胞脂质体。
      )。我们现在在类似的实验条件下报告在类似的实验条件下,使用多重反应监测,定量准确的靶向质谱法,这些蛋白质中涉及蛋白质化合物的丰富变化的量化。结果完成了使用小鼠Raw264.7细胞作为模型系统的七七种生物化学途径的第一个完全综合的基因组,蛋白质组学和代谢组分。

      实验步骤

       样品制备

      RAW 264.7巨噬细胞(美国型文化收集,目录号码TIB-71)以1×10的密度接种7 cells into 75-cm2 组织培养烧瓶并生长18小时以达到〜2×10的密度7 DMEM中的细胞/烧瓶(没有酚红),补充有4米毫克 - 谷氨酸,4.5克−1d-Glucose,10%热灭活的Fcs和1%青霉素/链霉素(Invitrogen)。用KLA刺激细胞(100ng ml−1 在刺激后,最终浓度)并在0.5,1,2,4,8,12和24小时收获。在添加Dulbecco的PBS后,在0和24小时收集控制细胞。在双刺激时间课程的情况下,用KLA处理细胞(100ng ml−1),并在4小时后,用ATP刺激巨噬细胞(最终浓度,2米m)。用ATP处理后在0,2,4,8和20小时收获细胞;在添加Dulbecco的PBS后,在0和24小时收集非刺激的对照细胞。所有实验一式三份完成。
      使用放射免疫沉淀测定改性缓冲液(1%Nonidet P-40,0.1%脱氧胆酸钠,150米,均匀化细胞粒料m NaCl, 1 mm EDTA, 50 mm TRIS,pH 7.5,蛋白酶抑制剂EDTA,10米m NaF, 10 mm 焦磷酸钠,5米m 2-甘油磷酸盐)和玻璃玻璃紧密均化器(Wheaton科学产品)。离心匀浆(20,000× g 在4℃下15分钟),收集上清液并在4℃下保持。用尿素-TRIS缓冲液重悬了颗粒(50米m Tris, pH 8.1, 75 mm NACL,8 m UREA,无EDTA蛋白酶抑制剂,10米m NaF, 10 mm 焦磷酸钠,5米m 2-甘油磷酸盐)。超声处理后,将样品再次离心(20,000× g 在4℃下15分钟)。收集所得上清液并与先前的上清液混合。丢弃所得颗粒。使用牛血清白蛋白作为标准的BCA蛋白质测定(Thermo Fisher Scientific)量化总蛋白质含量。立即制备匀浆等分试样并储存在-80℃。使用SDS-PAGE和银染色样品质量和浓度是双重检查的(补充图。S1)。
      将100μg总蛋白质的总蛋白质与100μg重标记的参考蛋白质组混合(见下文),将组合的样品用6体积的冰冷丙酮沉淀过夜(16小时,-20℃)用于质谱分析。丢弃上清液,将粒料干燥并重新悬浮在新制备的消化缓冲液中(8 m 尿素,0.1 m NH4HCO3)。用12米降低样品m 二硫醇(30分钟,37°C)并用40米烷基化m 碘乙酰胺(45分钟,25℃)在黑暗中。用0.1稀释样品 m NH4HCO3 最终浓度为1.5 m 用序列级胰蛋白酶(1μg; promega Ag),在37℃下消化过夜。消化后,用三氟乙酸酸化至pH2.8并用MacroSpin C脱盐,将肽混合物酸化至pH2.818 二氧化硅列(巢集团Inc.)。将样品在真空下干燥并将其溶液化至1μgμL−1 在质谱分析之前,在0.1%甲酸和2%乙腈中。

       重度同位素标记的参考蛋白质组的制备

      从美国型培养收集(目录号CRL-1830)获得HEPA1-6小鼠细胞系,标记为细胞培养基中氨基酸的稳定同位素标记,并用作所有样品中的重标记的参考蛋白质组。细胞在37℃和5%CO中生长2l-Lysine-和 l-Arginine-unpleted高葡萄糖DMEM(Caisson Laboratories Inc.)补充有10%透析的FCS(Bioconcept),1%青霉素/链霉素(Invitrogen)和 l-13C615N4-Arginine和 l-13C615N2-LYSINE(SIGMA-ALDROCH)。将细胞在150厘米中培养2 板块(Nunclon)并在80%的汇合中传代。通过质谱法定期检查重氨基酸的掺入细胞等分试样,并保持培养物直至掺入>实现了95%。然后用冰冷的PBS洗涤细胞,从板上刮擦,并如上所述均化。

       多重反应监测检测

      经过先前报告的一般高通量策略,开发了多次反应监测(MRM)测定(
      • Picotti P.
      • rinner o.
      • Stallmach R.
      • Dautel F.
      • Farrah T.
      • Domon B.
      • 文字H.
      • Aeberberold R.
      用于蛋白质和蛋白质素的选定反应监测测定的高通量产生。
      )。最初,在含有胰蛋白酶的长度的长度为6至20个氨基酸的4至六种独特的肽,并且为每个选定的蛋白选择了不含切割的肽。在MS实验中先前观察到的独特肽(
      • 玛特L.
      • Hermjakob H.
      • 琼斯P.
      • Adamski M.
      • 泰勒C.
      • D.
      • Gevaert K.
      • vandekerckhove J.
      • APWEILER R.
      骄傲:蛋白质组学识别数据库。
      ,
      • Desiere F.
      • 德意曲e.w.
      • 国王N.L.
      • nesvizhskii a.i.
      • Mallick P.
      • ENG J.
      • 陈S.
      • eddes J.
      • Loevenich S.N.
      • Aeberberold R.
      PeptidAtlas项目。
      )在肽选择过程​​中优先考虑。对于先前没有报告肽(以前未识别的蛋白质)的那些蛋白质,肽选择是基于Peptideie的MS适用性评分(
      • Mallick P.
      • Schirle M.
      • 陈氏
      • 浮动M.R.
      • 李H.
      • 马丁D.
      • ranish J.
      • 骑B.
      • 施密特R.
      • Werner T.
      • Kuster B.
      • Aeberberold R.
      蛋白质蛋白肽对定量蛋白质组学的计算预测。
      )。允许含有氨基酸的所有肽易于经历非特异性反应(MET,TRP,ASN和GLN),并且仅在没有其他选择时选择(
      • Lange V.
      • Picotti P.
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      定量蛋白质组学的选定反应监测:教程。
      )。通过点合成(JPT肽技术)化学合成所选肽,并以用于MRM测定发育的未纯化形式。在MRM触发的MS中收集片段离子光谱2 Qtrap 4000仪器中的每种肽的模式(ab / sciex)。光谱用于确认标识,以提取MRM分析的最佳片段离子,并获得肽保留时间。小姐2 通过吉祥物搜索引擎(v.21;矩阵谱)分析数据,其针对包含所有所选蛋白质和通过反转胰蛋白酶肽的氨基酸序列而产生的所有所选蛋白质和相应的诱饵条目的定制鼠标Uniprot数据库。搜索参数设置为2.0Da,用于前体质量耐受性,0.8Da,片段质量耐受性,完全胰蛋白肽,没有白切肽,基于诱饵作业的错误发现率为1%(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
      )。将半胱氨酸氨基甲酰化被设定为固定改性,并使用甲硫氨酸氧化作为可变改性。使用内部写入的Perl脚本从验证的片段离子谱产生光谱库,并且对于每个光谱,选择四个最强烈的Y离子被选择为要监测的最佳MRM转换。质谱参数,例如碰撞能量和降水潜力,以及关于肽库的产生,MRM测定的发展和谱库创建的进一步细节可以在以前的报告中找到(
      • Picotti P.
      • rinner o.
      • Stallmach R.
      • Dautel F.
      • Farrah T.
      • Domon B.
      • 文字H.
      • Aeberberold R.
      用于蛋白质和蛋白质素的选定反应监测测定的高通量产生。
      ,
      • Picotti P.
      • Bodenmiller B.
      • 穆勒L.N.
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      全动态范围蛋白质组分析 S. Cerevisiae. 通过靶向蛋白质组学。
      )。

       测量和数据分析

      MRM.测量是对杂交三重四极孔/离子阱质谱仪(4000 Q-Trap; AB / SCIEX)进行的,配备有纳米LC电喷雾电离源。将熔合二氧化硅微毛细管柱(75μm)拉动并用魔术C包装18 AQ 5-μm反相材料(Michrom Bioresources)。将样品(2μg)加载到2.5cm前柱(100μm;新目标)上包装18 反相材料,并在30分钟内以300 nL min的流速在30分钟内从5至30%的缓冲液B分析−1 使用Tempo Nanolc系统(应用生物系统)。缓冲A包含98%h2O,2%ACN和0.1%的甲酸;缓冲b包含2%h2O,98%ACN和0.1%的甲酸。在生物样品的MRM测量之间进行空白运行,以避免样品携带。在调度的MRM模式下,使用5分钟的保留时间窗口进行测量,每个方法的~400转换和2.5秒的循环时间。这些参数确保了超过10毫秒/过渡的停留时间。在这些测量中使用每个时间点的三个重复。
      基于(I)与靶向肽相关的过渡迹线的涂层,用多谜语v.1.1β(施用生物系统)评价对应于靶肽的转变基团。 (ii)对于给定肽的至少四种共抑制过渡迹线的存在超过信噪比为3; (iii)光线MRM相对强度与重对对应物之间的相关性; (iv)MRM相对强度与MS中获得的强度之间的相关性2 MRM检测期间的光谱; (v)复制之间的一致性。
      最初,所有峰强度都是由基于对数的2转换的,并且除去了阶段条件的超过三分之二的完全缺失强度的转变。对所有测量进行恒定归一化以均衡运行之间的参考转换的中值峰值强度(
      • Zien A.
      • Aigner T.
      • Zimmer R.
      • Lengauer T.
      集体化:基因表达数据标准化的一种新方法。
      )。保留剩余的归一化MRM峰值强度以进行定量分析。总之,一组29个靶蛋白每种肽一至四个肽表示,并且每种肽由两到四对轻重的转换表示。使用线性混合效应模型进行蛋白质水平定量和对差分丰度的测试(
      • chang c.y.
      • Picotti P.
      • Huettenhain R.
      • Heinzelmann-Schwarz V.
      • Jovanovic M.
      • Aeberberold R.
      • Vitek O.
      选定的反应监测(SRM)测量中的蛋白质意义分析。
      ),如MSSTATS软件包中所述(http://www.stat.purdue.edu/∼ovitek/Software.html)。的列表 p 对于每个比较单独计算值,并调整以控制截止值0.01(
      • Benjamini Y.
      • Hochberg Y.
      控制虚假发现率:多次测试的实用和强大的方法。
      )。

       统计分析

      SPEARMAN的等级相关性,即用于测量两个变量之间的统计依赖性的非参数方法,用于测试转录组和蛋白质组学集之间的统计相关性。转基因组和蛋白质组学折叠变化(Ti,Pi)对每个转录物的和时程的相应蛋白质进行实验,转换为等级(Ti,Pi),并且Spearman的等级相关系数(ρ)根据Pearson相关性计算排名折叠变化变量TI和PI之间的系数。通常,数字值范围从+1到-1,ρ>0表示正相关,ρ<0表示相反方向和ρ= 0的相关性,表示无相关性。

      结果

      MRM.测定最初设计用于映射逐渐参与七叠质生物合成途径的成套蛋白质(
      • Buczynski M.W.
      • Dumlao D.S.
      • 丹尼斯E.A.
      专题审查系列:蛋白质组学。芍洲生物学的集成OMICS分析。
      )(Fig. 1补充表1)。对应于两到四个独特的肽/蛋白的MRM测定与先前报道的一般高通量策略后的合成肽开发(
      • Picotti P.
      • rinner o.
      • Stallmach R.
      • Dautel F.
      • Farrah T.
      • Domon B.
      • 文字H.
      • Aeberberold R.
      用于蛋白质和蛋白质素的选定反应监测测定的高通量产生。
      )。基于先前MS实验中的观察数(以下)选择独特的肽(
      • 玛特L.
      • Hermjakob H.
      • 琼斯P.
      • Adamski M.
      • 泰勒C.
      • D.
      • Gevaert K.
      • vandekerckhove J.
      • APWEILER R.
      骄傲:蛋白质组学识别数据库。
      ,
      • Desiere F.
      • 德意曲e.w.
      • 国王N.L.
      • nesvizhskii a.i.
      • Mallick P.
      • ENG J.
      • 陈S.
      • eddes J.
      • Loevenich S.N.
      • Aeberberold R.
      PeptidAtlas项目。
      )或者,当没有可用的证据时,在Peptideie(
      • Mallick P.
      • Schirle M.
      • 陈氏
      • 浮动M.R.
      • 李H.
      • 马丁D.
      • ranish J.
      • 骑B.
      • 施密特R.
      • Werner T.
      • Kuster B.
      • Aeberberold R.
      蛋白质蛋白肽对定量蛋白质组学的计算预测。
      )。来自这些肽,我们产生了含有MRM测定的光谱文库,适用于79个逐芍相关蛋白质(补充表1)此处呈现为逐渐且方便的工具,用于在不同条件和治疗下靶向和快速量化多种蛋白质的易于衡量多种蛋白质。为了进一步说明所发育的MRM测定的效用,我们使用它们来研究KLA和ATP在逐渐结论的转发组和浮游组织中与这些结果集成,从而完成第一个完全综合的基因组,果皮生物化学途径的蛋白质组学和代谢组分析。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1蛋白质的示意图涉及与果香生物合成相关的不同途径。 突出显示 颜色 是MRM测定已经开发的蛋白质,其中,在Raw264.7鼠巨噬细胞全细胞提取物中检测到和量化暗色蛋白质,通过MRM靶向蛋白质组学。没有MRM测定的那些蛋白质可以进入 深灰色.
      细胞最初用KLA攻击(
      • Raetz C.R.
      • Garrett T.A.
      • Reynolds C.M.
      • shaw w.a.
      • 摩尔J.D.
      • 史密斯Jr.,D.C.
      • Ribeiro A.A.
      • 墨菲r.c.。
      • Ulevitch r.j.
      • 可怕的C.
      • reichart d。
      • 玻璃C.K.
      • 贝纳C.
      • Subramaniam S.
      • Harkewicz R.
      • 鲍德里·绅士R.C.
      • Buczynski M.W.
      • 库珀J.A.
      • 认为R.A.
      • 丹尼斯E.A.
      KDO2-脂质A 大肠杆菌,通过TLR-4激活巨噬细胞的定义内毒素。
      )在治疗后诱导炎症反应并在0,0.5,2,4,8,12和24小时收获。用0和24小时缺乏KLA处理的细胞作为对照。通过MRM分析细胞提取物,没有进一步分级,并且基于峰值高度定量检测的肽,并与未处理的对照样品的峰值相比(补充表2)。总共29种蛋白质含有唾液酸的生物合成途径的所有分支(Fig. 1)(
      • Buczynski M.W.
      • Dumlao D.S.
      • 丹尼斯E.A.
      专题审查系列:蛋白质组学。芍洲生物学的集成OMICS分析。
      )通过MRM靶向蛋白质组学的未分割Raw264.7鼠巨噬细胞提取物可以检测和定量。补充表3.)。
      通过比较三个生物复制的标准化峰强度进行检查,检查MRM测量重现性(补充图S2和S3)。观察到蛋白质丰度谱的几种变化,并且在19个监测蛋白中最多18个蛋白质丰富的显着变化响应于KLA治疗,包括环氧化酶-2和白三烯A-4水解酶,其中两者都在其中发挥关键作用合成前列腺素和白核菌素(Fig. 2补充图S4和表2)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2A,用KLA巨噬细胞刺激后,蛋白质丰度在0.5,1,2,4,8,12和24小时变化。仅提出了至少一个时间点的具有显着折叠变化的蛋白质。将所有时间点与未经处理的对照样品(没有KLA)进行比较。颜色表示增加(黄色的)或减少(蓝色的)蛋白质丰富,而强度反映了相应的日志2(折叠变化)。 B,KLA治疗巨噬细胞后所选蛋白的对数折叠改变曲线。这 误差酒吧 代表平均值的标准错误。 ***, p value < 0.001; **, 0.001 < p value < 0.01; *, 0.01 < p value <0.05。所有实验一式三份完成。蛋白质代码是指没有后缀_Mouse的Uniprot数据库标识符。
      然后将蛋白质丰度谱与我们之前在相同的实验条件下获得的转录组数据进行比较(
      • 丹尼斯E.A.
      • 认为R.A.
      • Harkewicz R.
      • Quehenberger O.
      • 棕色H.A.
      • Milne S.B.
      • Myers D.S.
      • 玻璃C.K.
      • 硬曼G.
      • reichart d。
      • Merrill Jr.,A.H.
      • Sullards M.C.
      • 王E.
      • 墨菲r.c.。
      • Raetz C.R.
      • Garrett T.A.
      • 关Z.
      • Ryan A.c.
      • 罗素D.W.
      • 麦当劳J.G.
      • 汤普森下午
      • shaw w.a.
      • 苏克斯
      • 赵玉。
      • Gupta S.
      • Maurya M.R.
      • Fahy E.
      • Subramaniam S.
      小鼠巨噬细胞脂质体。
      )。对于每对蛋白质和转录物对,计算非参数矛盾的秩相关系数(ρ)以估计其统计依赖性(补充表4.)。尽管许多蛋白质显示蛋白质和转录物之间的正相关性或相反方向的负相关(Fig. 3补充图S5),其他人没有任何相关性(例如 过氧化物乙醇酰基辅酶氧化酶2)。因此,明确表示不间断的蛋白质谱可以从转录水平预测,这突出了测量蛋白质丰度并产生蛋白质组学数据集的重要性,以补充可用的转录组和脂质组数据集以更好地理解正在研究的系统。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3A,蛋白质的谱图(坚实的黑线)和转录物(虚线灰线)用相应的Spearman的秩相关系数(ρ)折叠KLA细胞刺激的变化。 B,对所有检测到的蛋白质 - 转录对计算的Spearman排名相关系数的分布。
      为了进一步检查七氧化生物合成系统的动态,我们进行了额外的MRM测量以量化与巨噬细胞的组合KLA和ATP刺激的逐叠糖相关的蛋白质组反应,其设计为嘌呤能受体的引发实验(
      • Buczynski M.W.
      • Stephens D.L.
      • 鲍德里·绅士R.C.
      • GRKOVICH A.
      • 认为R.A.
      • 丹尼斯E.A.
      TLR.-4和持续的钙激动剂协同产生独立于Raw264中蛋白质合成的果香素。 7个细胞。
      )。为了确定ATP是否可以增强超出KLA效果的炎症反应,我们将使用KLA引发巨噬细胞,然后在4小时后用ATP进行第二次刺激。在ATP刺激之后在0,2,4,8和20小时收获细胞,并且不受刺激的细胞用作对照。将结果与巨噬细胞的KLA治疗中获得的相应折叠变化进行比较(Fig. 4)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4A,用KLA + ATP巨噬细胞刺激后蛋白质丰度在0,2,4,8和20小时的变化。在加入ATP之前,将细胞用KLA预处理4小时。时间过程是指ATP治疗。仅表示具有至少一个时间点的具有显着倍数变化的蛋白质。将所有时间点与未处理的对照样品(没有KLA或ATP)进行比较。颜色表示增加(黄色的)或减少(蓝色的)蛋白质丰富,而强度反映了相应的日志2(折叠变化)。 B,仅kLA和KLA + ATP实验之间的时间尺度比较。 C,与未处理的对照细胞(没有KLA或ATP)相比,巨噬细胞KLA + ATP处理后的对数折叠改变型蛋白质的折叠改变曲线。这 误差酒吧 代表平均值的标准错误。 ***, p value < 0.001; **, 0.001 < p value < 0.01; *, 0.01 < p value <0.05。所有实验一式三份完成。蛋白质代码是指没有后缀_Mouse的Uniprot数据库标识符。
      与非刺激对照相比,KLA / ATP双刺激在与非刺激控制相比时产生的19个蛋白质的显着变化(Fig. 4A)。虽然这些变化中的许多变化与在KLA处理的巨噬细胞中观察到的这些变化类似,但在比较KLA的结果和KLA / ATP治疗的结果时,注意到了一些显着差异。首先,KLA / ATP刺激对前列腺素生物合成的活化显示出更强的影响,产生更高水平的环氧氧酶-2(或前列腺素G / H合酶2,PGH2)而不是KLA刺激。其次,组合的刺激方案产生了甚至在稍后的时间点持续的pGH2水平的增加(Fig. 4C)。第三,在该途径中的其他酶,包括单独与KLA治疗没有显着变化的前列腺素D合酶(PTGD2),现在表现出蛋白质丰度的显着增加。逐芍生物合成体系的其他酶,如微粒体谷胱甘肽 S - 与仅KLA治疗相比,转移酶3(MGST3),白三烯A-4水解酶和12-脂氧合酶,显示出没有显着变化或蛋白质丰度的略微降低。

      讨论

      在本作本作中,我们介绍了一组MRM测定的79种七种果索糖相关蛋白的MRM测定,作为逐渐顺利的逐渐达到多种蛋白质在不同条件和治疗中进行迅速量化的多种蛋白质的工具。我们通过研究Raw 264.7巨噬细胞的果索糖相关蛋白质组的KLA和ATP在果索糖相关蛋白质组中的效果来说明这些测定的效用,并通过先前获得的转录组和代谢物血型数据将这些结果整合。
      克拉对鼠巨噬细胞的治疗揭示了蛋白质丰度的几种显着变化(Fig. 2补充图S4和表2)。在蛋白质中显示出大量变化的时间随时间随时间的显着变化,环加氧基酶-2(PGH2)在治疗8小时后,蛋白质丰富的早期蛋白质丰度超过32倍。此后,在刺激后,蛋白质水平均匀恒定。环氧氧酶-2是巨噬细胞炎症反应的重要组成部分,因为它催化了前列腺素生物合成的速率限制步骤。在刺激的巨噬细胞中观察到的环氧氧酶-2的强烈增加不仅与我们之前获得的转录组数据(Fig. 3)(
      • 丹尼斯E.A.
      • 认为R.A.
      • Harkewicz R.
      • Quehenberger O.
      • 棕色H.A.
      • Milne S.B.
      • Myers D.S.
      • 玻璃C.K.
      • 硬曼G.
      • reichart d。
      • Merrill Jr.,A.H.
      • Sullards M.C.
      • 王E.
      • 墨菲r.c.。
      • Raetz C.R.
      • Garrett T.A.
      • 关Z.
      • Ryan A.c.
      • 罗素D.W.
      • 麦当劳J.G.
      • 汤普森下午
      • shaw w.a.
      • 苏克斯
      • 赵玉。
      • Gupta S.
      • Maurya M.R.
      • Fahy E.
      • Subramaniam S.
      小鼠巨噬细胞脂质体。
      )但是,在我们以前的研究中报告的前列腺素,包括前列腺素D2,E2,F2α和J2的前列腺素的形成增加,它也一致。 补充表6.)。这些结果证实了蛋白质环氧化酶-2在对KLA的巨噬细胞炎症反应中的重要性(
      • Hempel S.L.
      • Monick m.m.
      • 匈纳伯人G.W.
      脂多糖在人肺泡巨噬细胞和血单核细胞中诱导前列腺素H合成酶-2蛋白和mRNA。
      ,
      • 李S.H.
      • Soyoola E.
      • Chanmugam P.
      • 哈特S.
      • 太阳W.
      • 钟H.
      • 刘S.
      • 西蒙斯D.
      • Hwang D.
      用脂多糖刺激巨噬细胞促丝瘤诱导环氧氧合酶的选择性表达。
      )。途径中涉及的其他蛋白质显示出蛋白质丰度的显着变化 - 例如前列腺素9-酮还原酶(CBR1),前列腺素F合成酶(CA093)和前列腺素E合酶2-或略微减少,表现出与转录组织数据良好相关的良好相关性(Fig. 5)。即使各种终端合成酶的表达水平在活性细胞中保持不变,KLA以及ATP鲁棒地刺激的前列腺素形成。这些观察结果表明,除了转录之外,还用于响应促炎刺激的最佳细胞二盐合成的其他调节机制。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5转录组织,蛋白质组学和代谢组学的示意性概述在用KLA巨噬细胞刺激后的前列腺素生物合成途径的前列腺素生物合成途径的变化。 Transcriptomics (T),蛋白质组学(P)和代谢组学()数据表示为每个转录物,蛋白质和代谢物的单独热图,其中颜色代表增加(黄色的)或减少(蓝色的)丰富,强度反映了相应的日志2(折叠变化)。将所有时间点与未经处理的对照样品(没有KLA)进行比较。对于微粒体前列腺素E合酶1 ptges仅获得转录组数据。
      除了基因表达和蛋白质丰度的变化之外,酶活性也可以通过涉及翻译后修饰和/或蛋白质易位的机制来调节。通过磷脂酶A的成员释放自由的花生酸或相关的多不饱和酸2 Superfamily,最突出的是IV组CPLA2,是各种七叠质生物合成途径的关键启动步骤(
      • 丹尼斯E.A.
      • Cao J.
      • Hsu Y.H.
      • Magrioti V.
      • Kokotos G.
      磷脂酶A2酶:物理结构,生物学功能,疾病意蕴,化学抑制和治疗干预。
      )。 IV组CPLA的活动2 通过细胞内钙来调节,钙与特定蛋白质结构域的结合诱导酶对膜的易位,其中磷脂用作基材。通过诱导不涉及蛋白质合成的机制诱导细胞内钙通量的激动剂在几分钟内非常快速地激活酶。 KLA刺激TLR-4途径不会诱导细胞内钙的可测量变化;然而,与钙激动剂相比,它导致自由arachidonate稳健增加,尽管速度较慢。在没有钙信号的情况下,IV族CPLA的义务易位和激活2 可能通过涉及神经酰胺-1磷酸盐或磷脂酰肌醇4,5-双磷酸酯(
      • 丹尼斯E.A.
      • Cao J.
      • Hsu Y.H.
      • Magrioti V.
      • Kokotos G.
      磷脂酶A2酶:物理结构,生物学功能,疾病意蕴,化学抑制和治疗干预。
      )。通过环氧化酶酶的活性进一步控制前列腺素的生产。环加氧基酶-1组成型表达,而环加氧基酶-2由KLA或通过KLA和ATP的组合强烈诱导(Fig. 1, Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4)。得到的环氧化酶活化,PGH2的代谢物用作前列腺素生产末端合成酶的底物(Fig. 5)。与主要通过表达控制的环加氧基酶-2的活性相比,在转录后水平对白酮生物合成中的5-脂氧合酶的活性进行调节(
      • RådmarkO.
      • Werz O.
      • Steinhilber D.
      • Samuelsson B.
      5-脂氧基酶:表达和酶活性的调节。
      )。免费花生素酸的可用性是白三烯生物合成的主要决定因素。事实上,刺激有效诱导白酮形成, 例如,导致细胞内钙的炎症剂,导致IV组CPLA的稳健激活2 和 5-lipoxygenase (
      • Werz O.
      5-脂氧合酶:细胞生物学和分子药理学。
      )。此外,IV组CPLA2 和5-脂氧合酶共享相似的结构,调节和磷酸化结构域,并且在细胞刺激后,两种酶都易于核膜,其中据认为,疟原酸与白嘧啶转化为白酮(
      • Peters-Golden M.
      • 布洛克T.G.
      5-脂氧合酶和皮瓣。
      )。膜结合的辅助蛋白5-脂氧合酶活化蛋白促进游离花生酸转移至5-脂氧合酶,并且对于有效的酶利用是必不可少的。
      虽然自身的TLR-4途径的激活不会引起白三烯合成,但该途径是众所周知的,用于响应于触发刺激而增强白酮的白三烯形成。与该概念一致,5-脂氧合酶途径的几个成员对Raw264.7细胞的KLA刺激显示出显着的变化。顺便提及,白三烯A-4水解酶催化促炎介质白酮B4的生物合成中的最终步骤,在蛋白质水平下显着降低,特别是在几个小时的KLA治疗后(Fig. 2补充图S4)。该发现与先前的观察结果一致,即使用TLR-4激动剂的Raw264.7细胞挑战导致前列腺素的产生,但不会诱导白三烯的形成,这主要取决于细胞内钙的碳钙(
      • Buczynski M.W.
      • Stephens D.L.
      • 鲍德里·绅士R.C.
      • GRKOVICH A.
      • 认为R.A.
      • 丹尼斯E.A.
      TLR.-4和持续的钙激动剂协同产生独立于Raw264中蛋白质合成的果香素。 7个细胞。
      )。然而,即使KLA本身并不刺激巨噬细胞中的5-脂氧基酶途径,若干研究表明它响应于钙激动剂的巨噬细胞增强白三烯释放(
      • Buczynski M.W.
      • Stephens D.L.
      • 鲍德里·绅士R.C.
      • GRKOVICH A.
      • 认为R.A.
      • 丹尼斯E.A.
      TLR.-4和持续的钙激动剂协同产生独立于Raw264中蛋白质合成的果香素。 7个细胞。
      ,
      • 铃木K.
      • Yamamoto T.
      • 佐藤A.
      • Murayama T.
      • amitani R.
      • Yamamoto K.
      • Kuze F.
      脂多糖灌注人肺泡巨噬细胞,用于增强超氧化物阴离子和白三烯B4的释放:与蛋白质合成的引发响应的自限析。
      ,
      • Aderem A.A.
      • Cohen D.S.
      • 赖特S.D.
      • cohn z.a.
      细菌脂多糖的巨噬细胞增强释放释放释放的花生酸代谢物。
      )。这种引发效应似乎是KLA挑战早期阶段的最大值,但在长时间暴露后耗散。与这些观察结果一致,我们发现白三烯A-4水解蛋白蛋白的初始但瞬态增加(Fig. 2补充图S4),其中部分可以解释对KLA引发效果的时间限制。此外,延长暴露于TLR-4激动剂诱导一氧化氮合成,这已被证明抑制5-脂氧基酶途径(
      • Werz O.
      5-脂氧合酶:细胞生物学和分子药理学。
      ,
      • Peters-Golden M.
      • 布洛克T.G.
      5-脂氧合酶和皮瓣。
      )。因此,白三烯生物合成途径的其他成员,例如5-脂氧基酶和微粒体谷胱甘肽 S - 转移酶3还显示出KLA治疗后期蛋白质水平的显着降低。在细胞色素白酮-B4ω-羟化酶3(​​CP4FE)中观察到阳性反应,该酶可能参与白三烯B4通过羟基化灭活(
      • 铃木K.
      • Yamamoto T.
      • 佐藤A.
      • Murayama T.
      • amitani R.
      • Yamamoto K.
      • Kuze F.
      脂多糖灌注人肺泡巨噬细胞,用于增强超氧化物阴离子和白三烯B4的释放:与蛋白质合成的引发响应的自限析。
      )。
      除了与前列腺素和白三烯生物合成相关的酶外,观察到涉及前列腺素分解代谢的许多酶的一般性降低。这是乙酰-CoA氧化酶2和3,前列腺素还原酶2,过氧化物3-氧代酰基-COA硫基酶A和丙酰基-COA C-酰基转移酶的情况,所有这些都显示出蛋白质水平随时间的一致减少(Fig. 2补充图S4)。只有蛋白质3-羟基乙酰辅酶脱氢酶(ECHP)在KLA刺激的后续时间点显示出显着增加。对于与12-脂氧合酶和15-脂氧合酶途径相关的蛋白质没有显着改变,这与先前报道的转录组数据一致,并表明KLA治疗对这些途径没有影响。
      进一步用巨噬细胞的组合KLA和ATP刺激研究了逐渐研究了逐渐研究的动态。已知ATP在佐剂样受体刺激之后被释放。释放的ATP与ATP门控钙通道P2X4触发引发炎症反应的钙流入(
      • Ulmann L.
      • Hirbec H.
      • Rassendren F.
      P2X4受体通过组织植物巨噬细胞介导PGE2释放并引发炎症疼痛。
      )。实际上,巨噬细胞的组合KLA和ATP刺激被设计为用作嘌呤能受体的引发实验(
      • Buczynski M.W.
      • Stephens D.L.
      • 鲍德里·绅士R.C.
      • GRKOVICH A.
      • 认为R.A.
      • 丹尼斯E.A.
      TLR.-4和持续的钙激动剂协同产生独立于Raw264中蛋白质合成的果香素。 7个细胞。
      )。
      额外的MRM测量来定量对KLA / ATP双治疗的逐渐相关的蛋白质组反应显示,与非刺激对照和仅适用于kLA治疗相比,几种蛋白质的丰度发生了显着变化(Fig. 4A补充表7.)。如上所述,KLA / ATP刺激对前列腺素生物合成的激活表现出比单独的KLA治疗更强。因此,KLA / ATP双处理产生了更高水平的环氧化酶-2(PGH2),与仅适用于KLA治疗相比,即使在以后的时间点也持续增加的蛋白质产生(Fig. 4C)。 KLA / ATP刺激也对5-脂氧合酶途径的酶产生了影响。酶像微粒体谷胱甘肽 S - 转移酶3和白三烯A-4水解酶,随着KLA治疗,其丰度显着降低,表明无明显变化或蛋白质丰富与双刺激的略微降低。
      总体而言,这项工作对理解主要巨噬细胞功能具有广泛的影响(
      • Norris P.C.
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      • Dumlao D.S.
      • 玻璃C.K.
      • 丹尼斯E.A.
      异氰化合物的特异性取决于TLR-4刺激的巨噬细胞表型。
      )。重要的是,它提供了全面的蛋白质组学数据(
      • 丹尼斯E.A.
      脂族学加入OMICS演变。
      )因此,完成了我们在几年前发起的小碧菁途径的全面概述(
      • Buczynski M.W.
      • Dumlao D.S.
      • 丹尼斯E.A.
      专题审查系列:蛋白质组学。芍洲生物学的集成OMICS分析。
      ),其包括用于同一组实验条件的代谢物,转录组和蛋白质组学数据。

      补充材料

      参考

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