化学蛋白质组学分析揭示了pyrido的替代作用方式[2,3-d]嘧啶激酶抑制剂*

      属于pyrido的小分子抑制剂[2,3-d嘧啶类化合物被开发为患有癌症进展的蛋白酪氨酸激酶的拮抗剂。来自该化合物类的衍生物对抗亚马替尼的大部分抗性有效BCR-ABL..从晚期慢性骨髓白血病患者中分离的突变体。在这里,我们建立了一种有效的蛋白质组学方法,采用固定的吡啶[2,3-d嘧啶配体作为亲和探针,并鉴定由这类化合物影响的30多个人蛋白激酶。值得注意的是,体外激酶测定揭示了丝氨酸/苏氨酸激酶样的相互作用的胱天蛋白样细胞凋亡 - 调节蛋白激酶(Rick)和P38α是最有效的抑制激酶靶标。因此,pyrido [2,3-d嘧啶未区分酪氨酸和丝氨酸/苏氨酸激酶。相反,我们发现这些抑制剂对于具有保守的小氨基酸残基,例如ATP结合口袋的关键部位,具有保守的小氨基酸残基的蛋白激酶非常选择。我们进一步证明了P38和Rick激酶活性在吡啶上的完整细胞中的抑制[2,3-d嘧啶抑制剂治疗。此外,这两个激酶的既定功能作为炎症反应的信号换能可以与有效相关体内通过吡啶抑制细胞因子的产生[2,3-d嘧啶化合物。因此,我们的数据证明了采用固定的激酶抑制剂的蛋白质组学方法的效用,用于鉴定与以前未被识别的治疗应用相关的新靶标。
      蛋白激酶是细胞信号传导的关键控制元素,其在各种疾病(如人类癌症)中被解除调节。因此,近年来,蛋白激酶酶的酶系列是主要的药物靶标(
      • 科恩P.
      蛋白激酶 - 二十一世纪的主要药物目标是什么?
      )。通过小分子抑制剂可以实现蛋白激酶的药理抑制,其通过干扰ATP结合阻断激酶的催化活性。各种蛋白激酶选择性药物目前处于临床发展的不同阶段,并且可能在不久的将来进入市场。苯胺嘧啶化合物伊替尼甲磺酸盐(Gleevec,STI571)是第一酪氨酸激酶抑制剂接受FDA认可,并且该药物成功用于治疗慢性髓性白血病(CML)
      使用的缩写是:CML,慢性骨髓白血病; 16-BAC,16-苯并二甲基 - n - 氯化乙二醇铵; ATF2,激活转录因子2; CSK,C末端SRC激酶; DMF,二甲基甲酰胺; EDC, N - 乙酯 - N' - (3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐; EGF,表皮生长因子; ERK,细胞外信号调节蛋白激酶; FAK,焦粘连激酶; FBS,胎牛血清; FGFR,成纤维细胞生长因子受体; Gak,Cyclin G相关激酶; HFF,人类包皮成纤维细胞; IFN-β,干扰素-β; JNK,C-Jun N-末端激酶; LPS,脂多糖; MAPK,丝裂剂激活蛋白激酶; MAPKAP-K2,MAPK活化蛋白激酶2; MBP,髓鞘基本蛋白质; MEK1,MAPK / ERK激酶1; MIP-1α,巨噬细胞炎症蛋白-1α; MS,质谱; PBMC,外周血单核细胞; pp58,pyrido [2,3-d]嘧啶衍生物58; Rick,rip样式的相互作用的caspase凋亡 - 调节蛋白激酶; RSK1,核糖体S6蛋白激酶1; SRPK1,SR蛋白质特异性激酶1; TNF-α,肿瘤坏死因子-α。
      1使用的缩写是:CML,慢性骨髓白血病; 16-BAC,16-苯并二甲基 - n - 氯化乙二醇铵; ATF2,激活转录因子2; CSK,C末端SRC激酶; DMF,二甲基甲酰胺; EDC, N - 乙酯 - N' - (3-二甲基氨基丙基)碳二酰亚胺盐酸盐; EGF,表皮生长因子; ERK,细胞外信号调节蛋白激酶; FAK,焦粘连激酶; FBS,胎牛血清; FGFR,成纤维细胞生长因子受体; Gak,Cyclin G相关激酶; HFF,人类包皮成纤维细胞; IFN-β,干扰素-β; JNK,C-Jun N-末端激酶; LPS,脂多糖; MAPK,丝裂剂激活蛋白激酶; MAPKAP-K2,MAPK活化蛋白激酶2; MBP,髓鞘基本蛋白质; MEK1,MAPK / ERK激酶1; MIP-1α,巨噬细胞炎症蛋白-1α; MS,质谱; PBMC,外周血单核细胞; pp58,pyrido [2,3-d]嘧啶衍生物58; Rick,rip样式的相互作用的caspase凋亡 - 调节蛋白激酶; RSK1,核糖体S6蛋白激酶1; SRPK1,SR蛋白质特异性激酶1; TNF-α,肿瘤坏死因子-α。
      (
      • Capdeville R.
      • Buchdunger E.
      • Zimmermann J.
      • 重要A.
      Glivec(STI571,iMatinib),合理开发的靶向抗癌药物..
      )。伊马替尼,一系列BCR-ABL酪氨酸激酶活性因素对CML发病机构的致力抑制剂,在疾病的早期阶段具有高效,而在高级CML患者中观察到抗性形成和随后的治疗失败。 BCR-ABL从复发患者中的生化分析揭示了ABL激酶结构域内的氨基酸取代作为对伊马替尼的分子抗性的主要原因(
      • Gorre M.E.
      • 穆罕默德米
      • Ellwood K.
      • HSU N.
      • PAQUETT R.
      • Rao P.N.
      • Sawyers C.L.
      由BCR-ABL基因突变或扩增引起的STI-571癌症治疗的临床抵抗力。
      ,
      • Shah N.P.
      • Nicoll J.M.
      • 纳加B.
      • Gorre M.E.
      • Pacquette R.L.
      • Kuriyan J.
      • Sawyers C.L.
      BCR-ABL.. 激酶结构域突变在慢性相和喷砂危机中赋予酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(STI571)的多克隆抗性慢性骨髓白血病。
      ,
      • von bubnoff n.
      • Schneller F.
      • Peschel C.
      • Duyster J.
      BCR-ABL.. 基因突变与费城 - 染色体阳性白血病至STI571的临床抗突变:一个前瞻性研究..
      )。除了伊马替尼,来自pyrido的抑制剂[2,3-d嘧啶类化合物已被鉴定为高效的ABL激酶阻滞剂(
      • Dorsey J.f.
      • Jove R.
      • KRAKER A.J.
      • 吴j.
      pyrido [2,3-d嘧啶衍生物PD180970抑制P210BCR-ABL酪氨酸激酶并诱导K562白血病细胞的凋亡..
      )。 pyrido [2,3-d嘧啶最初被开发为几种酪氨酸激酶的宽活性抑制剂,例如Src,血小板衍生的生长因子受体和成纤维细胞生长因子受体(FGFR)(
      • Panek R.L.
      • lu g.h.
      • klutschko s.r.
      • Batley B.L.
      • dahring t.k.
      • 哈比星期三。
      • Hallak H.
      • Doherty A.M.
      • Keizer J.A.
      体外 PD166285的药理表征,一种新的纳米粗助剂和宽活性蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
      ,
      • klutschko s.r.
      • 哈比星期三。
      • Boschelli D.H.
      • 吴Z.
      • KRAKER A.J.
      • 阿玛上午
      • 哈特尔B.G.
      • 沉C.
      • Klohs W.D.
      • Steinkampf R.W.
      • Driscoll D.L.
      • 尼尔森·赫姆。
      • elliott w.l.
      • 罗伯茨B.J.
      • stoner c.l.
      • 文森特P.W.
      • Dykes D.J.
      • Panek R.L.
      • lu g.h.
      • 主要的T.C.
      • dahring t.k.
      • Hallak H.
      • 布拉德福德L.
      • 表演alter H.D.H.
      • Doherty A.M.
      2-取代的氨基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8h) - 酮。针对选定酪氨酸激酶的结构 - 活性关系 体外体内 抗癌活动..
      )。在随后的研究中,还显示出这类化合物中的衍生物效果抑制BCR-ABL和C-Kit酪氨酸激酶活性(
      • Dorsey J.f.
      • Jove R.
      • KRAKER A.J.
      • 吴j.
      pyrido [2,3-d嘧啶衍生物PD180970抑制P210BCR-ABL酪氨酸激酶并诱导K562白血病细胞的凋亡..
      ,
      • WISNIEWSKI D.
      • Lambek C.L.
      • 刘C.
      • 纷争A.
      • veach d.r.
      • 纳加B.
      • 年轻的m.a.
      • Schindler T.
      • Bornmann W.G.
      • Bertino J.R.
      • Kuriyan J.
      • 克拉克森B.
      BCR-ABL.和C-kit受体酪氨酸激酶有效抑制剂的表征。
      )。最近,pyrido [2,3-d]测试Abl活性的嘧啶抑制剂,用于抗各种植被耐胰岛素 BCR-ABL.. 在复发患者中检测到同种型(
      • LaRoséeP.
      • Corbin A.S.
      • Stoffregen E.P.
      • Deininger M.W.
      • Druker B.J.
      BCR-ABL.激酶抑制剂PD180970对临床相关的BCR-ABL同种型的活性,导致含有伊马替尼甲板(Gleevec,STI571)的抗性..
      )。 Thr-315至异氨酸取代,其直接干扰在ATP结合口袋处的抑制剂结合,使BCR-ABL抵抗伊马替尼和吡啶[2,3-d]嘧啶pd180970(Fig. 1)。但是,值得注意地,所有其他临床相关的BCR-ABL变体由LaRosée测试 等等。 通过PD180970保留了对抑制的敏感性。这些包括在伊马替尼 - 不敏感患者中经常检测到的Y253F,E255K和M351T突变体,其干扰ATP结合环的扭曲构象或对伊马替尼结合至关重要的激活循环的闭合构象(
      • Gorre M.E.
      • 穆罕默德米
      • Ellwood K.
      • HSU N.
      • PAQUETT R.
      • Rao P.N.
      • Sawyers C.L.
      由BCR-ABL基因突变或扩增引起的STI-571癌症治疗的临床抵抗力。
      ,
      • Shah N.P.
      • Nicoll J.M.
      • 纳加B.
      • Gorre M.E.
      • Pacquette R.L.
      • Kuriyan J.
      • Sawyers C.L.
      BCR-ABL.. 激酶结构域突变在慢性相和喷砂危机中赋予酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(STI571)的多克隆抗性慢性骨髓白血病。
      ,
      • von bubnoff n.
      • Schneller F.
      • Peschel C.
      • Duyster J.
      BCR-ABL.. 基因突变与费城 - 染色体阳性白血病至STI571的临床抗突变:一个前瞻性研究..
      ,
      • 布兰福德S.
      • Rudzki Z.
      • 沃尔斯·沃尔斯
      • Grigg A.
      • 亚瑟C.
      • 泰勒K.
      • Herrmann R.
      • 林ch K.P.
      • Hughes T.P.
      高频率聚集在慢性骨髓白血病患者的BCR / ABL的腺苷三磷酸三磷酸盐结合区域内,或慢性骨髓性白血病或PH阳性急性淋巴细胞白血病,他们开发伊马替尼(STI571)电阻。
      ,
      • Hofmann W.-k.
      • 琼斯L.C.
      • LEMP N.A.
      • De Vos S.
      • Gschaidmeier H.
      • Hoelzer D.
      • 奥特曼O.G.
      • Koeffler H.P.
      pH(+)急性淋巴细胞白血病对酪氨酸激酶抑制剂STI571具有独特的BCR-ABL基因突变。
      )。因此,pyrido [2,3-d嘧啶的药物可以在许多耐药性CML的情况下显示出疗效,因为组成型BCR-ABL活性仍然是进一步疾病进展的恶劣。以前的 体内 吡啶测试[2,3-d嘧啶激酶抑制剂已经证明抑制肿瘤生长,但是由于这些化合物的溶解度有限,不能在小鼠异种移植物中观察到一致的剂量依赖性效果(
      • klutschko s.r.
      • 哈比星期三。
      • Boschelli D.H.
      • 吴Z.
      • KRAKER A.J.
      • 阿玛上午
      • 哈特尔B.G.
      • 沉C.
      • Klohs W.D.
      • Steinkampf R.W.
      • Driscoll D.L.
      • 尼尔森·赫姆。
      • elliott w.l.
      • 罗伯茨B.J.
      • stoner c.l.
      • 文森特P.W.
      • Dykes D.J.
      • Panek R.L.
      • lu g.h.
      • 主要的T.C.
      • dahring t.k.
      • Hallak H.
      • 布拉德福德L.
      • 表演alter H.D.H.
      • Doherty A.M.
      2-取代的氨基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8h) - 酮。针对选定酪氨酸激酶的结构 - 活性关系 体外体内 抗癌活动..
      ,
      • Dimitroff C.J.
      • Klohs W.
      • 沙姆达A.
      • PERA P.
      • Driscol L.D.
      • veith J.
      • Steinkampf R.
      • Schroeder M.
      • Klutchko S.
      • 苏林兰州A.
      • 亨德森B.
      • dougherty t.j.
      • Bernacki R.J.
      选定受体酪氨酸激酶抑制剂的抗血管生成活性,PD166285和PD173074:对光动力治疗的影响。
      ,
      • KRAKER A.J.
      • 罗伯茨B.J.
      • 文森特P.W.
      • Patmore S.J.
      • 艾略特W.
      体内 选择性C-SRC酪氨酸激酶(TK)抑制剂的抗肿瘤活性..
      )。因此,明显需要药用化学的额外努力来赋予该类化合物的更好的药物状性质。此外,根据先前归因于吡啶的非特异性毒性作用[2,3-d]嘧啶激酶抑制剂,选择性仍然是必须评估这种多功能复合支架的衍生物的关键问题(
      • WISNIEWSKI D.
      • Lambek C.L.
      • 刘C.
      • 纷争A.
      • veach d.r.
      • 纳加B.
      • 年轻的m.a.
      • Schindler T.
      • Bornmann W.G.
      • Bertino J.R.
      • Kuriyan J.
      • 克拉克森B.
      BCR-ABL.和C-kit受体酪氨酸激酶有效抑制剂的表征。
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1pyrido的化学结构[2,3- d嘧啶基化合物和抑制剂亲和基质。 The pyrido[2,3-d嘧啶PP58在结构上有关PD166285和PD180970。 PP58的PEG化产生PP58PEG。碳二亚胺酰亚胺偶联导致PP58对ECH Sepharose 4B的共价固定化。
      通常对蛋白激酶的面板进行抑制剂选择性,其中测试各种重组酶的活性对抑制剂的敏感性(
      • 戴维斯S.P.
      • reddy h.
      • Caivano M.
      • 科恩P.
      一些常用蛋白激酶抑制剂的特异性和作用机制。
      ,
      • 贝恩J.
      • Mclauchlan H.
      • 艾略特M.
      • 科恩P.
      蛋白激酶抑制剂的特异性:更新..
      )。虽然这种已建立的策略提供了关于抑制剂的相对选择性的有用结果,但它具有几个缺点,因为可以测试超过500个人蛋白激酶的小亚群,并且通常不包括不同类型的酶如不同类型的酶的替代蛋白质靶标
      • 曼宁G.
      • 唠叨D.B.
      • 马丁内斯·
      • 猎人T.
      • sudarsanam s.
      人类基因组的蛋白质激酶补体..
      )。研究抑制剂功能的概念性不同的方法采用合适的小分子衍生物,其可以在色谱珠粒上共价固定,然后用于细胞靶蛋白的亲和纯化(
      • Knokeaert M.
      • 灰色。
      • Damiens E.
      • chang y.-t.
      • 格雷尔P.
      • 格兰特K.
      • 舍gusson D.
      • Mottram J.
      • Soete M.
      • Dubremetz K.-f.
      • Le Roch K.
      • Doerig C.
      • 舒尔茨P.G.
      • Meijer L.
      细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的细胞内靶标:使用固定化抑制剂的亲和色谱法鉴定。
      ,
      • Knokeaert M.
      • Wieking K.
      • 施密特S.
      • Leost M.
      • 格兰特
      • Mottram J.C.
      • kunick c.
      • Meijer L.
      细胞内的浸润靶标。在固定化抑制剂上的亲和纯化后鉴定。
      ,
      • 棕色D.
      • Superti-Furga G.
      重新发现药物发现中的甜蜜点..
      ,
      • 万王。
      • hur
      • CHO C.Y.
      • 刘Y.
      • 阿德里安F.J.
      • Lozach O.
      • 巴赫斯。
      • Mayer T.
      • Fabbro D.
      • Meijer L.
      • 灰色的N.S.
      Hymenialdisine类似物的合成与靶标鉴定..
      )。与敏感的MS分析组合,这种化学蛋白质组学策略具有揭示来自培养细胞,组织或甚至整个生物的提取物中的小分子抑制剂的细胞靶蛋白。化学蛋白质组织的成功实施重视依赖于亲和纯化程序的效率和性能。我们最近报告了一种亲和层析技术,该技术在优化的生化条件下运行,允许鉴定P38抑制剂SB 203580和双吲哚基酰亚胺型蛋白激酶C抑制剂的几种先前未知的细胞靶标(
      • GODL K.
      • 江边J.
      • Kurtenbach A.
      • Habenberger P.
      • Blencke S.
      • Gutbrod H.
      • Salassidis K.
      • Stein-gerlach M.
      • Missio A.
      • 克特伦米
      • Daub H.
      一种鉴定蛋白激酶抑制剂细胞靶标的有效蛋白质组学方法。
      ,
      • Brehmer D.
      • GODL K.
      • Zech B.
      • 江边J.
      • Daub H.
      受邻吲哚基酰亚胺型蛋白激酶C抑制剂影响的细胞靶标的蛋白质组..
      ,
      • GODL K.
      • Daub H.
      激酶抑制剂选择性和功能的蛋白质组学分析。
      )。
      在这里,我们改善了这种蛋白质组学方法进行吡啶[2,3-d嘧啶衍生物并鉴定了该抑制剂类的30多种新的细胞蛋白激酶靶标。值得注意的是,两者都是 体外 和鉴定的丝氨酸/苏氨酸激酶的细胞活性像吡啶粘连的相互作用的胱天蛋白样细胞凋亡 - 调节蛋白激酶(RICK)和P38α是纯化的粘连[2,3-d本研究中使用的嘧啶抑制剂。在炎症细胞因子生物合成中达成了既定作用,pyrido [2,3-d嘧啶抑制剂治疗干扰了各种先天免疫应答,例如脂多糖(LPS)诱导的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)从单核细胞中释放。因此,我们证明了蛋白激酶抑制剂的蛋白质组学策略的效用,用于鉴定与预先识别的治疗应用有关的新靶标。

      实验步骤

       试剂和质粒 -

      从Invitrogen(San Diego,CA)获得细胞培养基和脂质溶解。从Amersham Biosciences(瑞典乌普萨拉)购买放射化学性,ECH Sepharose 4B和Poly(I:C)。组蛋白是从Roche(巴塞尔,瑞士)获得的。 GST激活转录因子2(ATF2),GST-CRK,催化活性的GST-细胞外信号调节蛋白激酶2(ERK2)和刺虫获得(ERK2),并获得抗戊酮(普利安德,NY)。所有其他试剂均可从Sigma(St.Louis,Mo)获得。
      使用的抗体是小鼠单克隆抗V-src(癌基因,San Diego,Ca),小鼠单克隆抗ABL(Pharmingen,San Diego,Ca),兔多克隆抗Rick(亲和力生物,金色,CO),小鼠单克隆抗-Cyclin G相关激酶(Gak)(Mobitec,Gottingen,德国),小鼠单克隆抗是,小鼠单克隆抗SR蛋白质特异性激酶1(SRPK1)和小鼠单克隆抗Aurora A(来自BD转导的所有三种Laboratories,Lexington,Ky)。从细胞信号传导技术(Bealverly,MA)购买的抗体是兔多克隆抗P38,兔多克隆抗促乳型蛋白激酶激活蛋白激酶2(MAPKAP-K2),兔多克隆抗磷酸-MapKAP-K2(Thr- 344),兔多克隆抗磷酸 - 核糖体S6蛋白激酶1(RSK1)(THR-359 / SER-363)。从Santa Cruz生物技术(Santa Cruz,CA)获得的抗体是兔多克隆抗FGFR1,兔多克隆抗C-JUN N-末端激酶(JNK)1/2,兔多克隆抗ERK1 / 2,兔多克隆反局灶粘附激酶(FAK),兔多克隆抗C-末端SRC激酶(CSK),兔多克隆抗MAPK / ERK激酶1(MEK1),兔多克隆抗WEE1,兔多克隆抗RSK1和小鼠单克隆抗LYN 。
      来自商业来源的重组蛋白激酶是人P38α,人JNK2α2,人Aurora A,人类MEK1,人EphB4,人类SRC(来自Upstate),以及小鼠ABL(新英格兰Biolabs,Beverly,MA)。
      根据制造商的协议(Stratagene,La Jolla,CA)进行先前描述的质粒PGEX-4T1-GAK的诱变诱变诱变(
      • GODL K.
      • 江边J.
      • Kurtenbach A.
      • Habenberger P.
      • Blencke S.
      • Gutbrod H.
      • Salassidis K.
      • Stein-gerlach M.
      • Missio A.
      • 克特伦米
      • Daub H.
      一种鉴定蛋白激酶抑制剂细胞靶标的有效蛋白质组学方法。
      )。重组野生型和突变GAK表示为GST融合蛋白 大肠杆菌 as described (
      • GODL K.
      • 江边J.
      • Kurtenbach A.
      • Habenberger P.
      • Blencke S.
      • Gutbrod H.
      • Salassidis K.
      • Stein-gerlach M.
      • Missio A.
      • 克特伦米
      • Daub H.
      一种鉴定蛋白激酶抑制剂细胞靶标的有效蛋白质组学方法。
      )。使用腺病毒定向表达的重组瑞克酶产生如上所述(
      • 克特伦米
      • Stegmueller K.
      • Eickhoff J.
      • Herzberger K.
      • 犹豫不决
      • Choidas A.
      • Daub H.
      • GODL K.
      利用腺病毒复制的特征来支持哺乳动物激酶生产..
      )。哺乳动物细胞中的rick和fgfr1质粒已在其他地方描述(
      • GODL K.
      • 江边J.
      • Kurtenbach A.
      • Habenberger P.
      • Blencke S.
      • Gutbrod H.
      • Salassidis K.
      • Stein-gerlach M.
      • Missio A.
      • 克特伦米
      • Daub H.
      一种鉴定蛋白激酶抑制剂细胞靶标的有效蛋白质组学方法。
      ,
      • Blencke S.
      • Zech B.
      • Engkvist O.
      • GREFF Z.
      • orfi l.
      • 霍维斯Z.
      • Keri G.
      • Ullrich A.
      • Daub H.
      一种守护结构决定蛋白激酶敏感性对选择性抑制剂的表征。
      )。

       复合合成和共价偶联 -

      pyrido [2,3-d本研究中称为PP58和PP58PEG的嘧啶激酶抑制剂并从Evotec-Oai购买。如前所述合成PP58(
      • klutschko s.r.
      • 哈比星期三。
      • Boschelli D.H.
      • 吴Z.
      • KRAKER A.J.
      • 阿玛上午
      • 哈特尔B.G.
      • 沉C.
      • Klohs W.D.
      • Steinkampf R.W.
      • Driscoll D.L.
      • 尼尔森·赫姆。
      • elliott w.l.
      • 罗伯茨B.J.
      • stoner c.l.
      • 文森特P.W.
      • Dykes D.J.
      • Panek R.L.
      • lu g.h.
      • 主要的T.C.
      • dahring t.k.
      • Hallak H.
      • 布拉德福德L.
      • 表演alter H.D.H.
      • Doherty A.M.
      2-取代的氨基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8h) - 酮。针对选定酪氨酸激酶的结构 - 活性关系 体外体内 抗癌活动..
      )。通过溶解0.44mmol pp58,0.44mmol 1-溴-2- [2-(2-乙氧基 - 乙氧基) - 乙氧基] - 甲酸乙酯,在10ml 1,4-二恶烷中加入0.44mmol二异丙胺并回流反应来制备PP58PEG。混合物36小时。将溶液冷却至室温,在真空下除去溶剂。通过柱色谱法纯化残余物[硅胶;二氯甲烷/甲醇(95:5)]得到PP58PEG作为黄色固体。
      对于PP58固定,将2.5ml排干琼脂糖4b用50ml 0.5洗涤三次3次 m NaCl,两次用50毫升H.2o最后一次用50ml 50%二甲基甲酰胺(DMF)/ 50%EtOH。然后将2.5毫升排出的珠子重悬于5毫升0.75米中m PP58的溶液溶解在50%DMF / 50%EtOH中,然后加入750μL1 m N - 乙酯 - N' - (3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)在50%DMF / 50%EtOH中。在室温下在室温下孵育过夜,在黑暗中持续搅拌,在加入5ml 33%DMF / 33%EtOH / 34%1之前用15mL 50%DMF / 50%EtOH洗涤珠子三次。 m 乙醇胺pH 8.0和650μL1 m EDC。在室温下孵育2-H后,在黑暗中持续搅拌,用15mL 50%DMF / 50%EtOH洗涤珠子三次,两次,含15毫升0.5 m NaCl和一次用15ml 20%EtOH。将所得珠粒在4℃下储存在黑暗中,作为20%乙醇中的悬浮液。

       细胞培养,裂解物制剂和体外关联实验 -

      在补充有10%胎牛血清(FBS)的Dulbecco改性鹰培养中,维持COS-7,Hela,U373和人类包皮成纤维细胞(HBF)细胞。 COS-7细胞转染,[32p]正正磷酸盐标记,并且如前所述进行细胞rick激酶活性的分析(
      • GODL K.
      • 江边J.
      • Kurtenbach A.
      • Habenberger P.
      • Blencke S.
      • Gutbrod H.
      • Salassidis K.
      • Stein-gerlach M.
      • Missio A.
      • 克特伦米
      • Daub H.
      一种鉴定蛋白激酶抑制剂细胞靶标的有效蛋白质组学方法。
      ,
      • Daub H.
      • Blencke S.
      • Habenberger P.
      • Kurtenbach A.
      • Dennenmoser J.
      • 江边J.
      • Ullrich A.
      • 克特伦米
      SRPK1和SRPK2的鉴定为主要细胞蛋白激酶磷酸化乙型肝炎病毒核心蛋白。
      )。
      为了在不同PP58浓度存在下检查细胞P38和ERK活性,Hela细胞与含有10米的缓冲液裂解m Tris-HCl pH 7.5,150米m NaCl, 1 mm EDTA,1%Triton X-100,1%脱氧胆酸钠,0.1%SDS加添加剂(10米m sodium fluoride, 1 mm Orthovanatate,10μg/ ml抑肽蛋白,10μg/ ml leapeptin,1米m PMSF, 1 mm DTT)。在SDS-PAGE之后,通过检测细胞P38谱图-K2或细胞ERK基板RSK1的磷酸特异性抗血清的免疫印迹提供了用于细胞P38和ERK活性的读出。
      为了 体外 与抑制剂亲和力珠子,Hela细胞或转染的COS-7细胞在含有50米的缓冲液中裂解m HEPES pH 7.5, 150 mm NaCl,0.5%Triton X-100,100m EDTA, 1 mm EGTA加添加剂。离心后,将裂解物调整为1 m NACL之前 体外 200μl高盐裂解物在4℃下用20μl排出的PP58基质或对照基质进行3小时。指示,1米 m 将免费的PP58加入裂解物中。三次洗涤步骤后含有1的裂解缓冲液 m NaCl,用40μl1.5×SDS样品缓冲液洗脱珠子。在SDS-PAGE之后,将蛋白质转移到硝酸纤维素膜中并用指定的抗体免疫。

       亲和层析和制备凝胶电泳 -

      冷冻Hela细胞(2.5×109; CILBIOTECH,MONS,比利时)在分析之前裂开了30毫升相同的TRITON X-100含缓冲液加上样品制备的添加剂 体外 协会实验。然后根据先前描述的方法,使用PP58柱使用PP58柱进行亲和层析,用于纯化固定的SB 203580相关抑制剂的细胞靶标的方案(
      • GODL K.
      • 江边J.
      • Kurtenbach A.
      • Habenberger P.
      • Blencke S.
      • Gutbrod H.
      • Salassidis K.
      • Stein-gerlach M.
      • Missio A.
      • 克特伦米
      • Daub H.
      一种鉴定蛋白激酶抑制剂细胞靶标的有效蛋白质组学方法。
      )。用含有1米的缓冲液洗脱结合蛋白质后m PP58 and 10 mm ATP,使用含有0.5%SDS的裂解缓冲液进行第二洗脱步骤。如上所述,浓缩并沉淀出来的洗脱级分。通过16-苯并二甲基溶解的第一种洗脱级分的三分之二n - 氯化铵(16-BAC)/ SDS-PAGE,其余材料用于LC-MS / MS分析(
      • GODL K.
      • 江边J.
      • Kurtenbach A.
      • Habenberger P.
      • Blencke S.
      • Gutbrod H.
      • Salassidis K.
      • Stein-gerlach M.
      • Missio A.
      • 克特伦米
      • Daub H.
      一种鉴定蛋白激酶抑制剂细胞靶标的有效蛋白质组学方法。
      ,
      • Daub H.
      • Blencke S.
      • Habenberger P.
      • Kurtenbach A.
      • Dennenmoser J.
      • 江边J.
      • Ullrich A.
      • 克特伦米
      SRPK1和SRPK2的鉴定为主要细胞蛋白激酶磷酸化乙型肝炎病毒核心蛋白。
      )。

       质谱-

      凝胶切除的蛋白质点和蛋白质条带是胰蛋白酶消化,然后通过MARDI MASS MAPTIPPED在BRUKER Ultraflex TOF / TOF质谱仪(Bruker,Billerica,MA)上分析(
      • GODL K.
      • 江边J.
      • Kurtenbach A.
      • Habenberger P.
      • Blencke S.
      • Gutbrod H.
      • Salassidis K.
      • Stein-gerlach M.
      • Missio A.
      • 克特伦米
      • Daub H.
      一种鉴定蛋白激酶抑制剂细胞靶标的有效蛋白质组学方法。
      ,
      • Beardsley R.L.
      • 赖利J.P.
      MALDI大众映射的灭阴程序优化。
      )。对于纳米HPLC MS / MS,通过SDS-PAGE从PP58柱洗脱的蛋白质在仅约12mm的分离距离上通过SDS-PAGE溶解。用Coomassie蓝色染色后,将凝胶切成切片并使用Pharmacia(Qupsala,瑞典)低分子量蛋白标准和BSA作为参考蛋白估计每部分的蛋白质含量,每阵子和AIDA的浓度为1μg软件(Raytest,Straubenhardt,德国)进行量化。对MALDI样品进行蛋白质消化和肽分离。
      使用Bioinert Ultimate Nano-HPLC系统(Dionex,Sunnyvale,CA)进行肽样品的分离。然后注射10μl每样的样品(含有高达1μg肽),纯化肽并浓缩18-pepmap预柱(内径为0.3mm,孔径×5mm,孔径,3μm粒径),流速为30μl/ min,在0.1%TFA中。随后,在分析75μm内径×150mm C上分离肽18-pepmap柱(Dionex; 100埃孔尺寸,3μm粒度),柱流量为200nl / min。梯度(溶液A:0.1%甲酸,5%ACN;溶液B:0.1%甲酸,80%ACN)以5%开始,在90分钟后以60%B结束。
      使用Q-TOF II质谱仪(Waters Corp.,Micromass,Manchester,United Kingdom)获得MS和MS / MS数据。通过MassLynx软件自动选择双重和三次带电肽离子,每种肽将最多18秒碎片。 MS数据被自动处理,并由MassLynx软件生成数据库搜索的蛋白质标识的峰值列表。数据库搜索使用NCBI蛋白质数据库与内部吉祥物服务器进行。

       体外激酶测定 -

      基质磷酸化反应相对于所有激酶活性测定中的时间是线性的,因此表示初始速度。如表明的PP58浓度和50μ的存在,如下所述进行P38α,Rick,Gak和JNK2的激酶测定。m cold ATP (
      • GODL K.
      • 江边J.
      • Kurtenbach A.
      • Habenberger P.
      • Blencke S.
      • Gutbrod H.
      • Salassidis K.
      • Stein-gerlach M.
      • Missio A.
      • 克特伦米
      • Daub H.
      一种鉴定蛋白激酶抑制剂细胞靶标的有效蛋白质组学方法。
      )。为了 ki. 测定,P38α也在100,150和200μ处测定m ATP和JNK2也在5,10和25μ测试m ATP。在含有20μm的反应缓冲液中,在30℃下测定PP58抑制ABL,SRC和EphB4活性30分钟m Tris-HCl pH 7.5,10米m MgCl2,0.8米m MnCl2, 1 mm DTT, 0.1 mm EGTA, 100 μm 酸钠,50μm ATP,2μCI[γ- 32P] ATP和0.2mg / ml GST-CRK,0.4mg / ml髓鞘碱性蛋白(MBP),或0.2mg / mL甘油醛-3-磷酸脱氢酶分别为激酶底物。
      Mek1和极光在37℃下在37℃下在37℃下进行30μl。根据制造商的协议使用50μ的方案测定激酶m ATP和1μCI[γ- 32p]在不同PP58浓度存在下ATP。包含的激酶底物蛋白为MEK1和0.025mg / ml kemptide的0.25mg / ml为0.25mg / ml无活性GST-ERK2,用于极光A.通过加入SDS样品缓冲液停止使用蛋白质基质来测量激酶活性的反应。在凝胶电泳之后,通过放射造影,通过磷酸缩影来观察磷酸化的底物蛋白。对于极光的定量激酶介导的肽底物磷酸化,肽与Whatman p51纸结合,洗涤,和 32然后在闪烁计数器中测量P掺入。 IC的确定50 [0-100%]使用收场软件(伊泰群,Horley,萨里,英国)进行值。

       细胞因子测定 -

      冷冻人外周血单核细胞(PBMC)购自Cambrex Bio Science(East Rutherford,NJ)。将解冻和洗涤的细胞重悬于含有1%FBS的RPMI 1640培养基中,然后将其播种成24个井(1×106 每孔细胞)。在1小时后,吸出培养基,用培养基洗涤细胞培养板以除去非更漂亮的细胞,并加入新鲜培养基。在加入我之前再次交换培养基2所以或不同量的PP58和随后的LPS(Sigma; Serotype 055:B5)刺激人类PBMC。 16小时后,使用来自R的ELISA试剂盒收获并分析上清液&D系统量化TNF-α,巨噬细胞炎症蛋白-1α(MIP-1α)和IL-8释放到介质中的水平。在抑制剂和随后的LPS或Poly(I:C)处理之前,将汇合HFF细胞与含有1%FBS的新鲜DMEM一起温育30分钟。在16小时后配体刺激后,测量上清液中的IL-8水平。所有细胞因子测定均按制造商的指示进行。
      在DMEM / 1%FBS中也进行U373细胞刺激,使用Trizol方法(Invitrogen)处理在聚(I:c)处理后2小时分离总RNA,然后在RNeasy柱上消化DNase I消化(Qiagen,Hilden,德国)。基于ABI棱镜7000序列检测系统的TAQ聚合酶的5'外切核酸酶活性,通过定量RT-PCR测定干扰素-β(IFN-β)mRNA水平(应用生物系统,福斯特城,CA)。根据制造商的方案,RNA用上标II(Invitrogen)和寡核酸寡端引物逆转录。在寡核苷酸的3'末端,在5'末端和TAMRA TM上用FAM™标记基因特异性Taqman探针。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(用来自应用生物系统的预发达的Taqman测定试剂测定)作为管家基因。 IFN-β的底漆序列为:5'-gacatccctGaggagattaAGCA-3'(前进),反向:5'-GGAGCATCTCATAGATGGTCAATG-3'(反向),5'-FAM-CGTCCTCCTTCTCTGGAACTGCGCAG-TAMRA-3'(TAQMAN探针)。

      结果

       产生功能性吡啶[2,3-D]嘧啶抑制剂亲和力基质 -

      来自pyrido的衍生物[2,3-d嘧啶类化合物最初鉴定为几种蛋白酪氨酸激酶的有效抑制剂,例如FGFR1和SRC(
      • klutschko s.r.
      • 哈比星期三。
      • Boschelli D.H.
      • 吴Z.
      • KRAKER A.J.
      • 阿玛上午
      • 哈特尔B.G.
      • 沉C.
      • Klohs W.D.
      • Steinkampf R.W.
      • Driscoll D.L.
      • 尼尔森·赫姆。
      • elliott w.l.
      • 罗伯茨B.J.
      • stoner c.l.
      • 文森特P.W.
      • Dykes D.J.
      • Panek R.L.
      • lu g.h.
      • 主要的T.C.
      • dahring t.k.
      • Hallak H.
      • 布拉德福德L.
      • 表演alter H.D.H.
      • Doherty A.M.
      2-取代的氨基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8h) - 酮。针对选定酪氨酸激酶的结构 - 活性关系 体外体内 抗癌活动..
      )。 PD166285,这一初始系列中最有效和可溶性类似物之一(Fig. 1),其特征在于各种细胞测定,后来发现在纳米摩尔浓度下阻断WEE1激酶活性(
      • Panek R.L.
      • lu g.h.
      • klutschko s.r.
      • Batley B.L.
      • dahring t.k.
      • 哈比星期三。
      • Hallak H.
      • Doherty A.M.
      • Keizer J.A.
      体外 PD166285的药理表征,一种新的纳米粗助剂和宽活性蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
      ,
      • 王Y.
      • 李R.
      • 吹绒r.n.
      • 克拉德A.
      • 劳伦斯T.
      • Leopold W.R.
      • 太阳y.
      PD0166285的P53突变细胞的放射敏化,一种新型G(2)检查点ATHOTOR ..
      )。寻找细胞BCR-ABL活性的替代抑制剂导致吡啶的鉴定[2,3-d] Pd180970如Pd180970,其在低纳米摩尔范围内具有酪氨酸激酶活性的嘧啶衍生物(Fig. 1)(
      • Dorsey J.f.
      • Jove R.
      • KRAKER A.J.
      • 吴j.
      pyrido [2,3-d嘧啶衍生物PD180970抑制P210BCR-ABL酪氨酸激酶并诱导K562白血病细胞的凋亡..
      ,
      • WISNIEWSKI D.
      • Lambek C.L.
      • 刘C.
      • 纷争A.
      • veach d.r.
      • 纳加B.
      • 年轻的m.a.
      • Schindler T.
      • Bornmann W.G.
      • Bertino J.R.
      • Kuriyan J.
      • 克拉克森B.
      BCR-ABL.和C-kit受体酪氨酸激酶有效抑制剂的表征。
      )。 Abl激酶结构域中的晶体结构与类似的吡啶[2,3-d嘧啶化合物在蛋白质表面上表现出抑制剂2-苯锆取代基的暴露(
      • 纳加B.
      • Bornmann W.G.
      • Pellicena P.
      • Schindler T.
      • veach d.r.
      • 米勒W.T.
      • 克拉克森B.
      • Kuriyan J.
      C-ABL激酶结构域的晶体结构与小分子抑制剂PD173955和伊马替尼(STI-571)。
      )。基于这些结构数据,我们推理先前描述的类似物将初级氨基函数暴露于溶剂中,因此应在该取代基的共价固定后保留其蛋白质激酶结合性质。该抑制剂显示在 Fig. 1 并且已被描述为一系列吡啶的衍生物58 [2,3-d]嘧啶(
      • klutschko s.r.
      • 哈比星期三。
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      • 吴Z.
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      • Steinkampf R.W.
      • Driscoll D.L.
      • 尼尔森·赫姆。
      • elliott w.l.
      • 罗伯茨B.J.
      • stoner c.l.
      • 文森特P.W.
      • Dykes D.J.
      • Panek R.L.
      • lu g.h.
      • 主要的T.C.
      • dahring t.k.
      • Hallak H.
      • 布拉德福德L.
      • 表演alter H.D.H.
      • Doherty A.M.
      2-取代的氨基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8h) - 酮。针对选定酪氨酸激酶的结构 - 活性关系 体外体内 抗癌活动..
      )。因此,我们将该化合物称为本研究中的PP58。然后在初级氨基位置将PP58缩缩。得到的化合物Pp58peg“拓扑上”模拟物固定化PP58,其通过与碳二亚胺(Carbodiidide)存在于ECH Sepharose的游离羧基(Fig. 1)。然后测试PP58和PP58PEG都在 体外 使用MBP作为底物蛋白的SRC激酶活性的测定(
      • 王Q.
      • 史密斯J.B.
      • 哈里森M.L.
      • geahlen r.l.
      鉴定酪氨酸67牛脑髓霉素碱性蛋白作为胸腺P56LCK的特定磷酸化位点。
      )。重要的是,PP58的PEG化对抑制SRC激酶活性的抑制剂效力没有显着影响(图2A)。因此,在其伯胺的PP58的延伸不会干扰激酶结合,结果将该部分鉴定为抑制剂的共价固定的理想部位。值得注意的是,PP58用亚诺奥马尔IC抑制SRC50 在我们的测定中的价值,这在IC下方的数量级50 value of 13 nm reported earlier (
      • klutschko s.r.
      • 哈比星期三。
      • Boschelli D.H.
      • 吴Z.
      • KRAKER A.J.
      • 阿玛上午
      • 哈特尔B.G.
      • 沉C.
      • Klohs W.D.
      • Steinkampf R.W.
      • Driscoll D.L.
      • 尼尔森·赫姆。
      • elliott w.l.
      • 罗伯茨B.J.
      • stoner c.l.
      • 文森特P.W.
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      • Hallak H.
      • 布拉德福德L.
      • 表演alter H.D.H.
      • Doherty A.M.
      2-取代的氨基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8h) - 酮。针对选定酪氨酸激酶的结构 - 活性关系 体外体内 抗癌活动..
      )。这种差异很可能是由于我们的测定中存在的低得多的SRC酶浓度。在我们的实验中,我们观察到PP58在较高的SRC蛋白浓度下表现为滴定试剂。为了测量低酶浓度的SRC活性,还需要分析蛋白质基质的磷酸化,这可以在凝胶电泳分离后量化。与激酶底物磷酸化的过滤器结合测定相比,该实验设计具有更有利的可测量激酶活性与背景信号的比例。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2聚乙二醇化和固定化PP58的表征。A, 体外 通过重组SRC酪氨酸激酶在表明浓度的PP58和PP58PEG的存在下进行MBP的磷酸化。 SDS-PAGE后, 32通过放射自显影,P掺入MBP中。 B,来自Hela细胞的总裂解物用于 体外 与控制珠粒(CTRL)或PP58亲和基质相关联。将免费的PP58加入到其中表示的裂解物中。通过SDS-PAGE分解总裂解物,上清液馏分和从对照或PP58珠粒洗脱的结合蛋白质,并通过用SRC特异性抗体进行免疫印迹分析。相对于总细胞裂解物和上清液,将10倍的结合蛋白质级分装载在凝胶上。 C,制备来自对照或FGFR1转染的COS-7细胞的总细胞提取物。对表达FGFR1表达细胞的裂解物进行 体外 如上所述的关联和SDS-Page。然后用FGFR1特异性抗血清进行免疫印迹。在对照转染的COS-7细胞中不可检测到FGFR1表达。
      测试内源性表达的SRC激酶是否明确与吡啶相互作用[2,3-d嘧啶亲和力基质,我们将总细胞裂解物与Hela细胞进行 体外 在不存在或存在的游离PP58化合物的情况下与对照珠粒或PP58珠子相关联。如通过用特异性抗血清的免疫印迹分析,PP58基质特异性耗尽来自总裂解物的SRC,而当包含游离抑制剂时,防止了与PP58珠子的结合(图。2B)。验证pyrido的功能[2,3-d]具有第二已知抑制剂靶标的嘧啶基质,我们制备来自FGFR1的COS-7细胞的总细胞裂解物 体外 结合研究。如图所示 图2C.,异位表达的FGFR1受体酪氨酸激酶特异性保留在PP58珠粒上。总之,这些实验将PP58基质作为一种新的亲和试剂,用于纯化细胞吡啶[2,3-d嘧啶抑制剂靶标。

       亲和层析纯化细胞吡啶[2,3-D]嘧啶抑制剂靶标的靶标 -

      表征pyrido的细胞靶[2,3-d]嘧啶抑制剂PP58在蛋白质组织范围内,我们从2.5×10加载总细胞提取物9 PP58 Advinity Column上的Hela单元使用从我们先前描述的程序(
      • GODL K.
      • 江边J.
      • Kurtenbach A.
      • Habenberger P.
      • Blencke S.
      • Gutbrod H.
      • Salassidis K.
      • Stein-gerlach M.
      • Missio A.
      • 克特伦米
      • Daub H.
      一种鉴定蛋白激酶抑制剂细胞靶标的有效蛋白质组学方法。
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      • Brehmer D.
      • GODL K.
      • Zech B.
      • 江边J.
      • Daub H.
      受邻吲哚基酰亚胺型蛋白激酶C抑制剂影响的细胞靶标的蛋白质组..
      )。在大量洗涤之后,用含有游离的PP58和ATP的运行缓冲液特异性释放结合的蛋白质。然后通过制备型16-BAC / SDS-PAGE沉淀洗脱的蛋白质并通过制备型纯化材料进行三分之一。随后的Coomassie染色允许检测超过50个蛋白质点(图3A),用MALDI-TOF / TOF质谱仪从凝胶中切除并通过质量指纹识别分析。通过PSD碎片进一步表征所选肽。尖锐地,含有蛋白激酶的大部分切除斑点,并且可以从制备型16-BAC / SDS凝胶中鉴定蛋白激酶和近25个不同成员的这种酶类别图3A)。表明蛋白质点的列表显示在 表I.。在鉴定的细胞靶标中是几种细胞质酪氨酸激酶,如FAK,TEC,JAK1,FER,SRC相关激酶是的,并且由最突出的斑点CSK之一代表,其通过磷酸化来调节SRC家族酶的磷酸盐保守的C-末端酪氨酸残基(
      • Superti-Furga G.
      • Fumagalli S.
      • KöglM.
      • Courtneidge S.A.
      • Draetta G.
      CSK.抑制C-SRC活性需要SRC的SH2和SH3结构域。
      )。尽管SRC本身本身特别绑定到PP58矩阵,如上所示,但没有从凝胶中识别。最有可能的是,SRC与其更加丰富的相对是,因此由相当突出的蛋白质点覆盖。有趣的是,Abl酪氨酸激酶,已知的吡啶[2,3-d嘧啶抑制剂靶标可以在凝胶的高分子量区域中鉴定。除了细胞质酪氨酸激酶外,MS数据还揭示了受体酪氨酸激酶Ephb2,EphB4和Ron作为吡啶[2,3-d嘧啶相互作用的蛋白质。一起服用,这些鉴定吡啶的各种新的酪氨酸激酶靶标[2,3-d嘧啶支持该复合类中衍生物的概念是广泛活性酪氨酸激酶抑制剂。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3细胞吡啶的亲和纯化[2,3-d嘧啶抑制剂靶标。 制备HeLa细胞提取物并加载到PP58柱上。首先用含有游离PP58和ATP的缓冲液洗脱致密的蛋白质。 A,用16-BAC / SDS-PAGE分解的三分之二的洗脱级分,用Coomassie蓝染色,然后通过MS分析可视化蛋白质斑点。已识别的蛋白质列于 。洗脱蛋白的其余部分用于LC-MS / MS分析。结果显示在 . B在第一次洗脱步骤之后,将剩余的结合蛋白质从PP58亲和柱中用SDS的缓冲液释放并通过SDS-PAGE分离。对Coomassie染色的蛋白质带进行了MS分析。
      T有能力的 I16-BAC / SDS-PAGE后蛋白质分析MS分析的结果
      现货没有。蛋白质名称gi no。
      a NCBI GenBank™登录号。
      Mr [Da]小组/家庭
      b 根据曼宁的鉴定蛋白激酶对群体和家庭进行分类 等等。 (
      • 曼宁G.
      • 唠叨D.B.
      • 马丁内斯·
      • 猎人T.
      • sudarsanam s.
      人类基因组的蛋白质激酶补体..
      )。
      1甲基噻吩醇磷酸化酶450527331,250
      2未确定
      3HSP2766284122,327
      4乳酸脱氢酶1378684736,507
      4蛋白质磷酸酶4.450602735,080
      5吡哆醛激酶1354331731,808
      6甘油醛-3-磷酸脱氢酶3164536,054
      7p38 α450306941,493CMGC / MAPK.
      7ERK22098653141,390CMGC / MAPK.
      8ERK22098653141,390CMGC / MAPK.
      9ERK22098653141,390CMGC / MAPK.
      10JNK12098651944,022CMGC / MAPK.
      11ERK118669642,106CMGC / MAPK.
      12JNK2146312944,024CMGC / MAPK.
      12MEK1557947843,439ste / ste7.
      13极光A.2792385545,809其他/ AUR.
      14极光A.2792385545,809其他/ AUR.
      15极光A.2792385545,809其他/ AUR.
      16极光A.2792385545,809其他/ AUR.
      17极光A.2792385545,809其他/ AUR.
      18CSK.475807850,704TK / CSK.
      19真核翻译伸长因子1α450347150,140
      20JNK2146312944,029CMGC / MAPK.
      21MYT1291467153,992其他/吴
      22是的488566160,801TK / SRC.
      23是的488566160,801TK / SRC.
      24是的488566160,801TK / SRC.
      25丙酮酸激酶3.3328641857,937
      26r450653761,195tkl / ripk.
      27未确定
      28TEC.450742973,629TK / TEC.
      29热休克70-KDA蛋白8572987770,898
      30热休克70-KDA蛋白9B2423468873,680
      31莫森1462582461,872
      32热休克70-KDA蛋白51650723772,333
      33radixin.450646768,564
      34ezrin2161449969,413
      35MARK2984548783,205Camk / Camkl.
      36热休克90-KDA蛋白1β2014959483,264
      37热休克90-KDA蛋白1β2014959483,264
      38HRI.783945871,315其他/佩克
      39488523194,624TK / FER.
      40KHS13031614795,040ste / ste20
      42热休克蛋白GP961501055090,194
      42KHS22598744798,954ste / ste20
      43PKN34025485199,421AGC / PKN.
      44PKN34025485199,421AGC / PKN.
      45FAK.24476013119,233TK / FAK.
      46JAK14504803131,957TK / JAKA.
      47EphB416209618108,270TK / EPH.
      48EphB217975765117,493TK / EPH.
      49ABL.514268124,955TK / ABL.
      50GAK.4885251143,165其他/ nak.
      51GAK.4885251143,165其他/ nak.
      52罗恩4505265152,227TK /遇见
      53氨基甲酰基磷酸合成酶121361331164,939
      54GCN27243057169,235其他/佩克
      55未确定
      56未确定
      a NCBI GenBank™登录号。
      b 根据曼宁的鉴定蛋白激酶对群体和家庭进行分类 等等。 (
      • 曼宁G.
      • 唠叨D.B.
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      • 猎人T.
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      人类基因组的蛋白质激酶补体..
      )。
      令人惊讶的是,凝胶上可能最突出的蛋白质点不是酪氨酸激酶,而是表示SER / THR蛋白激酶P38α(图3A)。除了P38α之外,我们还鉴定了有丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号传导的其他几种Ser / Thr激酶。此外,MS将RICK(也称为RIP2或Cardiak),GAK和PKN3作为细胞靶标。在早期的研究中也鉴定了这些Ser / Thr激酶,其中我们使用相同的蛋白质组学策略来表征P38抑制剂SB 203580的细胞靶标。从这些结果中,似乎吡啶[2,3-d嘧啶和吡啶基咪唑抑制剂具有重叠的细胞蛋白激酶靶标。大多数其他分析的蛋白质斑点代表了丰富的细胞蛋白质物种,不属于蛋白激酶的超家族。虽然这些鉴定的蛋白中的几种也结合核苷酸,例如ATP或NADH,因此可以是电位PP58靶标,但它们在洗脱级分中的存在很可能是由于它们的高细胞丰度,所述高细胞丰度可根据这些蛋白为PP58的相当弱的亲和力补偿矩阵 (图3A, 表I.)。为了测试这一非蛋白激酶靶标的假设,我们分析了乳酸脱氢酶的活性 体外 并且没有检测到100μ的任何显着抑制作用m PP58在此酶(数据未显示)。
      此外,我们使用Q-TOF质谱仪进行纳米仑反相HPLC-MS / MS分析。为此目的,通过PP58亲和色谱法纯化的细胞靶蛋白分数的较小等分试样在SDS凝胶中的短距离上溶解。用胰蛋白酶孵育凝胶切片后,对洗脱的肽进行LC-MS / MS分析。这种方法揭示了吡啶的10个额外的细胞蛋白激酶靶标[2,3-d]嘧啶pp58,如酪氨酸激酶Fyn,Lyn,Blk,DDR2和Epha2。从这些实验中显示出来自这些实验的蛋白激酶鉴定 表二。有趣的是,PP58亲和层析导致鉴定属于各种不同组和家族的蛋白激酶,表明吡啶[2,3-d嘧啶抑制剂对人Kinome的一组系统相关成员没有选择性(表I和II)。此外,LC-MS / MS未检测到16-BAC / SDS凝胶中发现的几种激酶,反之亦然。因此,即使在我们的研究中分析了蛋白质组的高度富集的亚基,即使是在我们的研究中,这两种不同的蛋白质组学方法也提供了互补的结果。该观察结果符合各种研究,其中二维凝胶-MS和LC-MS / MS鉴定策略已被应用于更复杂的蛋白质混合物,例如总细胞提取物(
      • 施密特F.
      • Donahoe S.
      • 哈格斯K.
      • Mattow J.
      • 很愉快的U.E.
      • kaufmann s.h.
      • Aeberberold R.
      • Jungblut p.r.
      二维电泳和同位素编码亲和标签技术互补分枝杆菌蛋白质组的互补分析。
      ,
      • 王J.
      • 薛Y.
      • 冯X.
      • 李X.
      • 王H.
      • 李W.
      • 赵c.
      • 郑X.
      • 可能。
      • 周P.
      • 尹杰。
      • Bhatnagar A.
      • 王R.
      • 刘S.
      蛋白质组学轮廓分析 ThermoanaErobacter tengcongensis. 在最佳文化条件下..
      )。
      T有能力的 II由LC-MS / MS鉴定的蛋白激酶靶标
      蛋白质名称gi no。
      a NCBI GenBank™登录号。
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      人类基因组的蛋白质激酶补体..
      )。
      ABL.514268124,955TK / ABL.
      arg6382062128,343TK / ABL.
      布尔克91420457,757TK / SRC.
      CSK.475807850,704TK / CSK.
      DDR2545381496,752TK / DDR.
      EphA2125333108,254TK / EPH.
      EphB212644190117,507TK / EPH.
      EphB416209618108,270TK / EPH.
      ERK123206643,136CMGC / MAPK.
      ERK22387940,420CMGC / MAPK.
      488523194,624TK / FER.
      Fyn.450382360,762TK / SRC.
      GAK.4885251143,165其他/ nak.
      JNK12098651944,022CMGC / MAPK.
      JNK2108226648,149CMGC / MAPK.
      18727156,033TK / SRC.
      MEK1557947843,439ste / ste7.
      MEK21348905444,424ste / ste7.
      MYT1291467153,992其他/吴
      NEK23180729737,956其他/ NEK.
      p38α249960041,293CMGC / MAPK.
      p38β2012877441,357CMGC / MAPK.
      r450653761,195tkl / ripk.
      是的488566160,801TK / SRC.
      ZAK.754253791,264TKL / MLK.
      a NCBI GenBank™登录号。
      b 根据曼宁的鉴定蛋白激酶对群体和家庭进行分类 等等。 (
      • 曼宁G.
      • 唠叨D.B.
      • 马丁内斯·
      • 猎人T.
      • sudarsanam s.
      人类基因组的蛋白质激酶补体..
      )。
      最后,我们使用含SDS的缓冲液进行第二洗脱步骤,从PP58亲和柱中释放任何剩余的蛋白质。随后的SDS-PAGE揭示了几种COMASSIE - 可品牌蛋白条带和蛋白激酶是,瑞克,WEE1和P38α可以通过MS识别(图3B.)。除了WEE1之外,还在制备型16-BAC / SDS凝胶中的蛋白质点中检测所有这些激酶,但是通过将免费的PP58和ATP作为洗脱试剂的组合使用,从柱中没有定量释放。这可能表明这些靶标对固定化抑制剂的特定高亲和力。

       吡啶[2,3-D]嘧啶抑制剂靶标的体外表征 -

      为了验证MS与二级测定结果,使用来自HeLa细胞的总细胞提取物 体外 具有或不含游离的pyrix或pp58基质的关联研究[2,3-d嘧啶化合物加入孵育中。然后通过凝胶电泳分解来自上清液级分和由亲和珠的蛋白质中的非环蛋白,并通过凝胶电泳来解决,并用针对MS鉴定的蛋白激酶的特异性抗体进行免疫印迹(Fig. 4)。所有分析的激酶可以证实为PP58基质的特异性粘合剂。作为阴性对照,我们探测Ser / Thr激酶SRPK1,其在HeLa细胞中表达,并没有与PP58亲和材料相互作用(Fig. 4)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4免疫斑分析确认MS结果。 对来自Hela细胞的总细胞裂解物进行 体外 与控制矩阵或PP58矩阵相关联。将免费PP58添加到指示的潜伏中。总裂解物,来自上清液的非环蛋白和从珠子洗脱的结合蛋白质通过SDS-PAGE分离并用针对ABL的特异性抗体免疫,YAK,CSK,GAK,RICK,P38,JNK1 / 2,ERK1 / 2,MEK1 ,wee1,aurora a,lyn和srpk1。
      尽管通过抑制剂珠粒从裂解物中的不同PP58激酶靶标或多或少地定量耗尽,但是这种类型的测定不会产生关于它们各自的敏感性的定量数据至PP58。要解决这个重要问题,我们执行了 体外 三种酪氨酸激酶SRC,ABL和EphB4的激酶测定和六种Ser / Thr激酶P38α,Rick,Gak,MeK1,JNK2和Aurora A在不同PP58浓度和50μm 冷ATP。除了Ephb4受体酪氨酸激酶外,我们可以确定IC50 PP58对所有重组酶的PP58受激酶活性的值。在Ephb4的情况下,IC50 对于pp58抑制低于10 nm,但由于所用酶制剂的比较低,因此不能完全确定。令人惊讶的是,我们发现,不仅具有Src和Abl等酪氨酸激酶,通过PP58与亚诺诺莫olar IC有效果抑制50 值,但也鉴定了Ser / Thr激酶P38α,Rick和Gak对吡啶的抑制非常敏感[2,3-d嘧啶衍生物(图5A)。瑞克显示了最低的IC50 value of only 0.18 nm 关于PP58抑制。在STARK对比中,需要1,000至10,000倍的PP58浓度对于SER / THR激酶MEK1,JNK2和Aurora A的半最大抑制需要( 图5A)。这种在较大苏氨酸残基在易受抑制的激酶中发现较大的苏氨酸残基的位置,这显着降低了对pp58的敏感性与较大的甲硫氨酸或亮氨酸侧链相关图5A)。随着早期的研究表明ABL(
      • LaRoséeP.
      • Corbin A.S.
      • Stoffregen E.P.
      • Deininger M.W.
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      BCR-ABL.激酶抑制剂PD180970对临床相关的BCR-ABL同种型的活性,导致含有伊马替尼甲板(Gleevec,STI571)的抗性..
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      • 纳加B.
      • Bornmann W.G.
      • Pellicena P.
      • Schindler T.
      • veach d.r.
      • 米勒W.T.
      • 克拉克森B.
      • Kuriyan J.
      C-ABL激酶结构域的晶体结构与小分子抑制剂PD173955和伊马替尼(STI-571)。
      )最近由我们展示吡啶的酪氨酸激酶靶标[2,3-d]嘧啶抑制剂如SRC(
      • Blencke S.
      • Zech B.
      • Engkvist O.
      • GREFF Z.
      • orfi l.
      • 霍维斯Z.
      • Keri G.
      • Ullrich A.
      • Daub H.
      一种守护结构决定蛋白激酶敏感性对选择性抑制剂的表征。
      )用较大的氨基酸替换该关键苏氨酸显然干扰抑制剂的二氯苯基部分在核苷酸结合口袋处的疏水腔中的延伸,从而强烈干扰ATP竞争性吡啶的结合[2,3-d嘧啶抑制剂对这些激酶靶标。为了测试该结构决定簇是否也与高敏感的SER / THR激酶相关,我们将GAK的等同苏氨酸突变为蛋氨酸,并在PP58存在下用野生型和突变酶进行激酶测定。如图所示 图5B.,Gak的Thr-123至Gak的蛋氨酸突变体对PP58的浓度耐受完全抑制野生型酶活性的浓度。我们进一步量化了PP58对P38α和JNK2的亲和力,因此确定了相应的 ki. 每个激酶PP58的值。这些PP58靶标是密切相关的激酶,但氨基酸残基在PP58敏感性至关重要的氨基酸残基(P38α中的Thr-106与JNK2中的MET-108相比)的临数临时。这 ki. PP58的PP58的值为3.8±1.9 nm 和 0.32 ± 0.04 μm分别表明P38α对抑制剂的较高亲和力大约为JNK2。我们的结果表明,在相关部位存在苏氨酸等小残留的存在是吡啶高亲和力靶标的结构决定因子[2,3-d嘧啶抑制剂。然而,值得注意的是,PP58亲和基质还用作各种蛋白激酶的有效净化试剂,其缺乏这种结构特征,并且对吡啶具有更低的亲和力[2,3-d嘧啶抑制剂PP58。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5体外 由吡啶靶向的细胞蛋白激酶的测定[2,3-d嘧啶抑制剂PP58。A,在不同PP58浓度存在下测量几种蛋白激酶靶标的活性 体外 如“实验程序”下所述。坚定的ic50 与PP58抑制激酶活性的值与ATP结合位点周围临界苏氨酸残基的对准的氨基酸序列相比,其在对PP58具有高亲和力的大多数激酶靶标中被保守。 B,针对组蛋白磷酸化测定具有野生型激酶结构域或相应的GST-GAK-T123M突变体的重组GST-GAK融合蛋白 体外 在指示的PP58浓度下。在SDS-PAGE之后,通过放射自显影检测底物蛋白磷酸化。

       通过吡啶的P38和Rick激酶活性的细胞抑制[2,3-D]嘧啶pp58-

      pyrido [2,3-d嘧啶化合物被开发为酪氨酸激酶抑制剂,用于癌症治疗。我们的发现:pyrido [2,3-d嘧啶衍生物有效地靶向SER / THR激酶P38和RIC,这是建立炎症反应的信号传感器,促使我们研究PP58对完整细胞中激酶活性的影响(
      • 李约。
      • Laydon J.T.
      • McDonell P.C.
      • Gallagher T.F.
      • Kumar S.
      • 绿色D.
      • 麦利D.
      • Blumenthal M.J.
      • 嘿嘿
      • Landvatter S.W.
      • strickler J.E.
      • Mclaughlin m.m.
      • 西门子I.R.
      • 费舍尔小
      • Livi G.P.
      • 白色J.R.
      • 亚当斯J.L.
      • 年轻的p.r.
      涉及炎症细胞因子生物合成调节的蛋白激酶。
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      • 下巴a.i.
      • dempsey p.w.
      • 布鲁恩K.
      • 米勒J.F.
      • 郑G.
      受体相互作用蛋白2在先天和适应性免疫应答中的参与..
      ,
      • Kobayashi K.
      • Inohara N.
      • Hernandez L.D.
      • 加兰J.E.
      • nunez g。
      • Janeway C.A.
      • Medzhitov R.
      • Flavell R.A.
      Rick / RIP2 / Cardiak介导先天和自适应免疫系统的受体的信号传导。
      )。为了监测细胞P38活性,通过免疫印迹与磷磷特异性抗血清的免疫印迹分析其直接细胞谱图Mapkap-K2的磷酸化(
      • eyers p.a.
      • van den ijssel p.
      • Quinlan R.A.
      • Goedert M.
      • 科恩P.
      使用应激活化蛋白激酶2a / p38的耐药突变体,以验证SB 203580的体内特异性。
      )。通过植物霉素处理激活P38,在THR-344处引发MAPKAP-K2磷酸化,并且通过蜂窝IC以剂量依赖性方式抑制该刺激50 值略低于10 n以下m (图6A)。用MAPKAP-K2蛋白质特异性抗体的免疫印迹分析显示由于在多个位点的蛋白质磷酸化而导致MAPKAP-K2的植物霉素诱导的带偏移。分子量的这种明显变化也通过PP58再次恢复,尽管浓度略高于THR-344的磷酸化。相比之下,高达100 nm PP58对RSK1的表皮生长因子(EGF) - 刺激磷酸化没有影响,这是通过ERK MAPK级联介导的下游信号传导事件。该对照实验说明PP58可以在低纳摩尔浓度下表现出一定程度的选择性 体内.
      图缩略图GR6.
      Fig. 6用吡啶的细胞P38和Rick激酶活性抑制[2,3-d嘧啶pp58。A,PP58对细胞P38激酶活性的影响。用指定的PP58浓度处理血清饥饿的HELA细胞15分钟,然后用10μg/ ml的菌霉素刺激30分钟,或在细胞裂解之前用50ng / ml eGF刺激5分钟。通过凝胶电泳分解总细胞提取物,然后用抗血清免疫批压,特别是在MapKap-k2中识别磷酸化的Thr-344(左上方面板),RSK1在THR-359和SER-363上双重磷酸化(右上列面板),mapkap-k2(左下方面板)或rsk1(右下方)。 BPP58对Rick激酶的细胞抑制。用PPM7-RICK-KRDCST表达质粒(1.35μg/孔)瞬时转染COS-7细胞加上编码全长激酶(0.15μg/孔)的对照载体或PPM7- rick质粒。后 [32P]正正磷酸盐标记和亲和纯化使用链霉素珠粒,通过在蛋白质检测之前通过蛋白质检测与链霉素-HRP进行放射性显影来观察细胞Rick-KRDC磷酸化。
      为了研究PP58对完整细胞中RICK活性的影响,我们进行了一种测定,其中激酶 - 无活性RICK片段用作用于共表达的野生型酶的细胞磷酸化基质。如图所示 图6B.,剂量依赖 体内 观察到PP58对RICK活性的抑制,低至30 nm 抑制剂已经将细胞瑞克底物磷酸化降低超过50%。

       通过吡啶[2,3-D]嘧啶化合物pp58-细胞因子产生细胞因子的细胞抑制

      我们鉴定P38和Rick作为pyrido细胞靶点[2,3-d嘧啶抑制剂提出了该问题,除了除了它们的细胞生长抑制性能外,诸如PP58的化合物是否可能抑制炎症反应。为了测试这一点,我们首先分析了PP58对初级人PBMC中LPS诱导的TNF-α释放的影响(
      • rutault k。
      • Hazzalin C.A.
      • Mahadevan L.C.
      ERK和P38 MAPK抑制剂的组合烧蚀肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA诱导。用于TNF-α转录物的选择性稳定化的证据..
      )。如所示 图7A,LPS刺激的TNF-α产生通过PP58具有蜂窝IC的PP58抑制50 value of around 3 nm。这种效果可能与PP58介导的抑制在中所示的细胞MAPKAP-K2磷酸化的功能相关联 图6A,因为遗传证据已经建立了P38激酶的这种细胞靶作为LPS刺激的TNF-α生物合成的基本传感器(
      • Kotlyarov A.
      • 霓虹A。
      • Schubert C.
      • Eckert R.
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      • Gaestel M.
      MapKap激酶2对于LPS诱导的TNF-α生物合成至关重要。
      )。除了TNF-α,我们还测量了趋化因子MIP-1α和IL-8的水平。用IC有效地抑制MIP-1α的LPS调节的生物合成50 of about 15 nm 在人类PBMC中,而IL-8产量较不易受吡啶的影响[2,3-d]嘧啶和100 nm PP58将该细胞因子的释放减少约50%。与PBMC相比,抑制效果为100 nm LPS诱导的IL-8生产中的PP58在人类包皮成纤维细胞中有点明显(图7B.)。如进一步所示 图7B.,PP58在细胞暴露于合成的双链RNA类似物聚(I:C)时,PP58也干扰了IL-8生物合成,其作用于造成的Toll样受体3并以类似于病毒感染的方式触发细胞信号(
      • Akira S.
      哺乳动物的收费受体..
      )。 PP58对细胞因子分泌的细胞效应不是一般化合物毒性的结果,因为高达100℃m 抑制剂在我们的测定中没有显着影响细胞活力(数据未显示)。抗病毒反应的标志之一是诱导干扰素,例如IFN-β。使用U373星形细胞瘤细胞,研究了PP58对聚(I:C) - 触发IFN-β基因诱导的PP58对定量RT-PCR的影响(
      • 仆人M.J.
      • Grandvaux N.
      • 这是B.R.
      • Duguay D.
      • 林R.
      • Hiscott J.
      鉴定所需的最小磷酸群位点 体内 响应病毒和双链RNA的干扰素调节因子3的激活。
      )。有趣的是,pyrido [2,3-d嘧啶浓度低至10 nm 强烈损害IFN-βmRNA的合成。一起服用,我们的结果建立了pyrido [2,3-d]嘧啶pp58作为具有效力抗炎特性的先天免疫应答的小分子拮抗剂。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7吡啶的LPS-和聚(I:C)刺激细胞因子诱导的细胞抑制[2,3-d嘧啶衍生物PP58。A,在用不同PP58浓度的15分钟预处理之后,用1μg/ mL LPS刺激人PBMC。 16小时后,收获培养上清液,并通过ELISA量化释放的细胞因子TNF-α,MIP-1α和IL-8的水平。在没有抑制剂的情况下,细胞因子水平设定为100%,并且它们在增加PP58剂量存在下培养基中的浓度相对于该值表达。用PP58计算DOSE依赖性抑制TNF-α和MIP-1α的曲线,采用收场。与对照处理的单核细胞相比,LPS刺激TNF-α,MIP-1α和IL-8的释放,分别分别约75-,25-和5倍。从LPS处理细胞的上清液中的细胞因子水平为12ng / ml(TNF-α),70ng / ml(MIP-1α)和247ng / ml(IL-8)。 B,HFF细胞与我预处理2所以或指示的PP58浓度为15分钟,然后用50μg/ ml聚(I:C)或1μg/ mL LPS刺激。 16小时后,通过ELISA测量细胞培养上清液中的IL-8水平。 C,在用指示的PP58浓度预孵育15分钟后,在裂解和RNA分离之前刺激U373星形细胞瘤细胞2小时,在50μg/ ml聚(I:C)。逆转转录后,进行定量PCR以测量对照中的IFN-β基因诱导,并孵育和聚(I:C) - 治疗细胞。 IFN-β-处理细胞的转录物水平设定为100%,并且抑制剂治疗的水平相对于该值显示。

      讨论

      虽然属于pyrido的抑制剂[2,3-d已知嘧啶类化合物作用于几种蛋白激酶,所有这些先前描述的靶标属于酪氨酸激酶家族,因此似乎吡啶[2,3-d嘧啶抑制剂对这种特定的人类碱基组是选择性(
      • Dorsey J.f.
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      • KRAKER A.J.
      • 吴j.
      pyrido [2,3-d嘧啶衍生物PD180970抑制P210BCR-ABL酪氨酸激酶并诱导K562白血病细胞的凋亡..
      ,
      • Panek R.L.
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      • klutschko s.r.
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      • Doherty A.M.
      • Keizer J.A.
      体外 PD166285的药理表征,一种新的纳米粗助剂和宽活性蛋白酪氨酸激酶抑制剂。
      ,
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      2-取代的氨基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8h) - 酮。针对选定酪氨酸激酶的结构 - 活性关系 体外体内 抗癌活动..
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      • 克拉克森B.
      BCR-ABL.和C-kit受体酪氨酸激酶有效抑制剂的表征。
      )。此处提出的结果鉴定了几种SER / THR激酶,如高敏感的吡啶[2,3-d[此外,这些蛋白激酶属于人Kinome的不同组。因此,对吡啶的敏感性[2,3-d嘧啶抑制与系统发育关系不相关(
      • 曼宁G.
      • 唠叨D.B.
      • 马丁内斯·
      • 猎人T.
      • sudarsanam s.
      人类基因组的蛋白质激酶补体..
      )。相反,在ATP结合口袋,通常是苏氨酸的小残留物在所有高敏感的激酶中保守。该结构决定簇允许将抑制剂的二氯苯基取代基投影到与ATP结合位点相邻的疏水袋中。在ATP结合位点本身,抑制剂的其他部分如其吡啶[2,3-d嘧啶核心结构与ATP的腺嘌呤部分相结合(
      • Blencke S.
      • Zech B.
      • Engkvist O.
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      • Keri G.
      • Ullrich A.
      • Daub H.
      一种守护结构决定蛋白激酶敏感性对选择性抑制剂的表征。
      )。重要的是,疏水袋不与激酶结合的ATP分子的任何部分相互作用,解释为什么临界苏氨酸替换为较大的残留物,例如甲硫氨酸的空间与抑制剂结合,但不会消除蛋白激酶活性。该结构基质的相关性先前记录了酪氨酸激酶,也适用于Ser / Thr激酶,如突变分析所示(
      • LaRoséeP.
      • Corbin A.S.
      • Stoffregen E.P.
      • Deininger M.W.
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      BCR-ABL.激酶抑制剂PD180970对临床相关的BCR-ABL同种型的活性,导致含有伊马替尼甲板(Gleevec,STI571)的抗性..
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      一种守护结构决定蛋白激酶敏感性对选择性抑制剂的表征。
      )。然而,我们的亲和方法也导致了几种靶标的有效纯化,大多数是SER / THR激酶,其在临界位置具有大的疏水残基,例如蛋氨酸。与这种庞大的侧链赋予的立藻膜一致,通过吡啶抑制这些激酶[2,3-d]嘧啶pp58与micromolar IC50 值而不是低纳米摩尔甚至亚诺莫罗拉尔IC50 针对激酶确定的值,例如P38,Rick和Gak。这些次要测定结合 ki. P38α和JNK2的测定证实了pyrido [2,3-d嘧啶抑制剂珠粒允许蛋白激酶富集抑制剂的相对亲和力。仅在微摩尔抑制剂浓度存在下影响的靶激酶的有效纯化 体外 进一步表明,PP58对基质的共价连接不会导致相对于激酶结合的空间阻断,并且该结论与来自聚乙二醇化抑制剂衍生物获得的SRC激酶测定的数据一致。对我们的知识,pyrido [2,3-d嘧啶抑制剂基质允许纯化和鉴定比以往的任何蛋白质组学研究中的更多人体蛋白激酶。因此,PP58树脂提供了一种有用的试剂,以比较Kinome的显着子集的激酶表达水平。这种新的生物化学工具的潜在应用涉及不同人肿瘤细胞中潜在药物靶标的表达分析。这种实验方法可能导致重要发现,因为相关的致癌蛋白激酶经常存在于人类癌症的升高(
      • 舞蹈J.
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      用蛋白激酶抑制剂对癌症治疗的问题和进展。
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      超越赫赛汀和Gleevec ..
      )。
      本研究的重大结果是鉴定P38和Rick作为pyrido [2,3-d]嘧啶抑制剂靶向衍生物PP58观察到的效力抗炎作用的背景下,原因如下:吡啶[2,3- d据报道,嘧啶PD166285在Klutschko大鼠中具有良好的口服生物利用性 等等。 (
      • klutschko s.r.
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      2-取代的氨基吡啶[2,3-d]嘧啶-7(8h) - 酮。针对选定酪氨酸激酶的结构 - 活性关系 体外体内 抗癌活动..
      )。尖锐的是,通过中间体转化为最终代谢物PD166285,然后在稳定的等离子体浓度下以超过100n的浓度检测m 超过24小时。这种稳定的代谢物是本研究中使用的PP58衍生物。鉴于在初级单核细胞中观察到LPS诱导的LPS诱导的TNF-α生物合成的有效抑制,低于PP58浓度 体外,显而易见的猜测是,在吡啶的口服施用时应在动物中看到类似的抗炎作用[2,3-d]嘧啶,如PD166285。这仍有待测试。从某种意义上说,这种动物研究的积极结果将验证我们的化学蛋白质组学方法作为一种有价值的工具,以将先前未被识别的治疗区域联系起来的现有药物。
      使用吡啶的主要问题[2,3-d嘧啶如pd166285或pp58衍生物是它们表观缺乏特异性。然而,来自早期药用化学研究的数据,证明了吡啶的选择性[2,3-d可以改善嘧啶的化合物。例如,示出了3,5-二甲氧基苯基代替6-位中存在的2,6-二氯苯基官能团,显着增加了吡啶的选择性[2,3- d] FGFR的嘧啶(
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      )。然后将这些衍生物与其他靶标如SRC无效。因此,似乎有可能优化这种有效的化合物类别用于其他靶标,例如p38激酶,这最终可能导致新药的开发用于治疗人类疾病。

      致谢

      我们感谢Robert Brehm和Kirsten Minkhart提供了卓越的技术援助。我们还要感谢DirkWehmhöner和Manfred Nimtz,可以访问Q-TOF II仪器。

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