溶酶体整体膜蛋白的蛋白质组学分析显示了细胞器的不同组成*

  • Richard D. Bagshaw.
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    研究所,生病儿童医院,多伦多M5G 1x8,加拿大

    实验室医学和病理学生,多伦多大学,多伦多,安大略省M5S 1A1,加拿大
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  • 唐·马尔兰
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    研究所,生病儿童医院,多伦多M5G 1x8,加拿大

    实验室医学和病理学生,多伦多大学,多伦多,安大略省M5S 1A1,加拿大
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  • 约翰W. Callahan.
    一致
    应解决对应的通信:病人的医院,研究内部。,榆树翼,RM。 9144,555大学Ave.,加拿大多伦多M5G 1X8。电话:416-813-5754;传真:416-813-8700.
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    研究所,生病儿童医院,多伦多M5G 1x8,加拿大

    生物化学部门,实验室医学部门和病理生物学,多伦多大学,多伦多,安大略省M5S 1A1,加拿大

    小儿科,多伦多大学,多伦多,安大略省M5S 1A1,加拿大
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  • 作者脚注
    *这项工作是通过加拿大卫生研究院的补助金的资助,并从加拿大基因组(对J.W. C.和D. J. M.)提供资金。
    本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
      溶酶体是内吞的亚细胞室,有助于细胞材料的降解和再循环。使用高纯化的大鼠肝脏三体(Triton WR1339填充溶酶体)和离子交换色谱/ LC串联MS的蛋白质/肽分离和鉴定程序,其特征在于该细胞器的主要整体膜蛋白补充剂。虽然我们鉴定的许多315蛋白质先前已经与溶酶体和底皮物相关,但是另外的是与内质网,高尔基,胞浆,血浆膜和脂质筏有关。将至少20个蛋白质被鉴定为未存在已知功能的外晶片的未知CDNA,并且鉴定了35个蛋白质,其中蛋白质和囊泡贩运中的功能。这种后期组包括多个RAB和鼻塞蛋白以及泛素。定义这些蛋白质在溶酶体膜中的作用将有助于阐明参与在各种疾病过程中受影响的细胞稳态和途径中涉及的新型溶酶体功能。
      溶酶体是单膜结合的亚细胞细胞器,被认为是内体途径中的主要恶劣隔室。他们在酸性pH值下占用的多样化水解酶。大多数驻留的水解酶被局部化到腔室中,并且很大程度上可溶的糖蛋白能够水解细胞的所有主要大分子。由于这些消化事件的产物而产生的更简单的分子从膜上的腹腔内腔室中易位,并释放到用于再利用的细胞质中。消化的物质通过溶酶体通过一系列过程中的,包括内吞,吞噬作用和自噬。在细胞代谢中发挥的枢轴作用溶酶体通过至少40个酶的发生表现出(
      • Meikle P.J.
      • 霍普伍德J.J.
      • 蛤蟆A.E.
      • 凯文w.f.
      溶酶体储存障碍的患病率
      )影响中性,磷酸和糖脂的分解代谢;复合碳水化合物;和蛋白质,其中顽固的大分子中间体储存在细胞器内,改变细胞的稳态并导致疾病状态。最近,已发现溶酶体是涉及调节分泌的高度动态细胞器(
      • Jaiswal J.K.
      • 安德鲁斯N.W.
      • 西蒙三。
      膜近端溶酶体是负责钙依赖性细胞依赖性卵尿量的主要囊泡。
      ),修复受损的血浆膜(
      • 雷迪A.
      • CALER E.V.
      • 安德鲁斯N.W.
      血浆膜修复由CA介导2+ - 溶酶体的卵尿量..
      )和形成骨折的荷叶边边框(
      • Stenbeck G.
      破骨骨杆菌中荷叶边边框的形成和功能..
      )。经典溶酶体被认为是溶酶体相关细胞器家族的一部分(有关审查,请参阅参考文献。
      • Dell'Angelica e.c.
      • Mullins C.
      • Caplan S.
      • Bonifacino J.s.
      与溶酶体相关的细胞器..
      )具有一系列特定于细胞功能, 例如 黑色素,血小板致密颗粒和硫酸颗粒。
      除了储存疾病之外,溶酶体均涉及各种其他人类病理,如阿尔茨海默病(
      • Pasternak S.H.
      • Bagshaw R.D.
      • Guiral M.
      • 张某。
      • Ackerley C.A.
      • Pak B.J.
      • Callahan J.W.
      • Mahuran D.J.
      Presenilin-1,尼卡斯特林,淀粉样蛋白前体蛋白和γ-分泌酶活性在溶酶体膜中共定。
      ,
      • Pasternak S.H.
      • Callahan J.W.
      • Mahuran D.J.
      内体/溶酶体体系在阿尔茨海默病的淀粉样蛋白-β的产生和病理生理学中的作用:从溶酶体角度重新审视空间悖论..
      ),自身免疫疾病,以及对传染病,癌症和药物的抵抗力。这些区域中的溶酶体中出现的角色仍然很大程度上是由于其整体膜蛋白的组成和拓扑的缺乏深入知识以及可以形成永久性和/或瞬时大分子复合物的其他细胞溶质蛋白质来促进膜 - 膜相互作用和融合事件。
      虽然涉及腔的溶酶体疾病的分子表征, IE。 可溶性,酶进一步,只有少数缺陷与溶酶体膜蛋白相关,如Danon病(灯-2)
      使用的缩写是:灯,溶酶体相关膜蛋白;跛行,溶酶体整体膜蛋白;圈套,可溶 N - 乙基咪酰亚胺敏感因子附着蛋白受体; MS / MS,串联MS; ER,内质网; NPC1,Niemann-Pick型C1; MGC,哺乳动物基因集合; V-ATP酶,真空型H.+ - 自分析ATP酶;鞋面,囊泡相关膜蛋白; EMP70,Endomembrane蛋白为70 kda; MEK,丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶激酶激酶; ERK,细胞外信号调节激酶; Creg,E1A刺激基因的细胞阻遏物; GL,灰色致命。
      1使用的缩写是:灯,溶酶体相关膜蛋白;跛行,溶酶体整体膜蛋白;圈套,可溶 N - 乙基咪酰亚胺敏感因子附着蛋白受体; MS / MS,串联MS; ER,内质网; NPC1,Niemann-Pick型C1; MGC,哺乳动物基因集合; V-ATP酶,真空型H.+ - 自分析ATP酶;鞋面,囊泡相关膜蛋白; EMP70,Endomembrane蛋白为70 kda; MEK,丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶激酶激酶; ERK,细胞外信号调节激酶; Creg,E1A刺激基因的细胞阻遏物; GL,灰色致命。
      (
      • Nishino I.
      • 傅J.
      • 坦吉K.
      • 山田T.
      • Shimojo S.
      • Koori T.
      • 莫拉米
      • Riggs J.E.
      • 哦,S.J.
      • Koga Y.
      • 起诉
      • Yamamoto A.
      • Murakami N.
      • Shanske S.
      • Byrne E.
      • 博尼拉E.
      • nonaka i.
      • Dimauro S.
      • Hirano M.
      原发性灯泡-2缺乏导致X-Linked varoolar心肌病和肌病(Danon病)..
      ),Niemann-Pick C(NPC1)(
      • Carstea E.D.
      • 莫里斯J.A.
      • 科尔曼K.G.
      • Loftus s.k.
      • 张D.
      • Cummings C.
      • 顾J.
      • Rosenfeld M.A.
      • Pavan W.J.
      • Krizman D.B.
      • 纳格尔J.
      • 聚合物M.H.
      • Sturley S.L.
      • ioannouy.a.
      • 希金斯M.E.
      • Comly M.
      • Cooney A.
      • 棕色A.
      • Kaneski C.R.
      • blanchette-mackie e.j.
      • dwyer n.k.
      • Neufeld E.B.
      • 张t.Y.
      • Liscum L.
      • 施特劳斯J.F.
      • ohno K.
      • Zeigler M.
      • Carmi R.
      • Sokol J.
      • Markie D.
      • 奥尼尔r.r.
      • van diggelen o.p.
      • ellder m.
      • Patterson M.C.
      • Brady R.O.
      • Vanier M.T.
      • Pentchev P.G.
      • Tagle D.A.
      niemann-pick c1疾病基因:胆固醇稳态介质的同源性..
      ),半胱氨酸(半胱氨酸)(
      • 镇M.
      • 让G.
      • cher
      • at Agent M.
      • 林业L.
      • 惠特更多S.A.
      • Callen D.F.
      • Gribouval O.
      • 培养器M.
      • 贝茨G.P.
      • Van't Hoff W.
      • 抗核酸C.
      编码整体膜蛋白的新型基因在肾病性囊内症中突变。
      )和Salla疾病(Salla病)(
      • verheijen f.w.
      • Verbeek E.
      • AULA N.
      • Beerens C.E.
      • Havelaar A.c.
      • Joosse M.
      • Peltonen L.
      • AULA P.
      • Galjaard H.
      • van der spek p.j.
      • 曼奇尼
      编码阴离子转运蛋白的新基因在唾液酸储存疾病中突变。
      ),已被确定。溶酶体膜对于维持细胞稳态是关键的,因为它提供了溶酶体和胞质溶胶的降解Milieu之间的通信联系。除了众所周知的溶酶体膜蛋白, IE。 灯和肢体,可以从生理摄取和助焊剂研究中预测,存在多种类别的转运蛋白。
      我们本研究的目标是定义溶酶体的整体膜级分的蛋白质组成。这是通过将亚细胞分级,差异提取和蛋白质分离技术与蛋白质组学型蛋白质鉴定相结合来实现的。综合调查溶酶体的先决条件之一是能够将细胞器净化到附近的均匀性和充分的收率。虽然许多程序已被用于溶酶体纯化,但我们选择了最可靠和最佳研究,即Triton WR1339填充的大鼠肝脏溶血酶(氚化素),如Leighton所描述的 等等。 (
      • Leighton F.
      • 普尔B.
      • Beaufay H.
      • Baudhuin P.
      • Coffey J.W.
      • 福勒S.
      • de duve c.
      来自肝脏肝脏的过氧化血剂,线粒体和溶酶体的大规模分离,注射了Triton WR-1339的大鼠。改进分离程序,自动分析,分数的生物化学和形态学性质。
      )。尽管氚化被认为是修饰的溶酶体,但它们含有一定量的非生理材料(Triton WR1339),氚组织保留溶酶体酶活性(
      • Pasternak S.H.
      • Bagshaw R.D.
      • Guiral M.
      • 张某。
      • Ackerley C.A.
      • Pak B.J.
      • Callahan J.W.
      • Mahuran D.J.
      Presenilin-1,尼卡斯特林,淀粉样蛋白前体蛋白和γ-分泌酶活性在溶酶体膜中共定。
      ,
      • Leighton F.
      • 普尔B.
      • Beaufay H.
      • Baudhuin P.
      • Coffey J.W.
      • 福勒S.
      • de duve c.
      来自肝脏肝脏的过氧化血剂,线粒体和溶酶体的大规模分离,注射了Triton WR-1339的大鼠。改进分离程序,自动分析,分数的生物化学和形态学性质。
      ,
      • Bagshaw R.D.
      • Pasternak S.H.
      • Mahuran D.J.
      • Callahan J.W.
      尼科斯林是居民溶酶体膜蛋白..
      ,
      • 烧伤J.
      • 施耐德D.L.
      大鼠肝溶酶体膜蛋白的表征。组成,酶活和营业额..
      )和表现与内体和吞噬蛋白融合测定中的溶酶体相同(
      • WATTIAUX R.
      • Jadot M.
      • Dubois F.
      • Watti -ux-de Coninck S.
      大鼠肝脏的吞噬作用:吞噬蛋白酶和溶酶体之间的关系..
      )。在该研究中,我们在溶酶体的整体膜蛋白级分中鉴定了215个单独的蛋白质,许多先前未与溶酶体相关的,其中几个仍然仅鉴定为无表征性CDNA。这些数据揭示了一种具有复杂蛋白质组合物的膜,并支持溶酶体是高度动态的细胞器。

      材料和方法

       溶酶体(三体组)隔离 -

      先前已经描述了Triton WR1339填充溶酶体的分离(
      • Pasternak S.H.
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      • 张某。
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      • Callahan J.W.
      • Mahuran D.J.
      Presenilin-1,尼卡斯特林,淀粉样蛋白前体蛋白和γ-分泌酶活性在溶酶体膜中共定。
      ,
      • Leighton F.
      • 普尔B.
      • Beaufay H.
      • Baudhuin P.
      • Coffey J.W.
      • 福勒S.
      • de duve c.
      来自肝脏肝脏的过氧化血剂,线粒体和溶酶体的大规模分离,注射了Triton WR-1339的大鼠。改进分离程序,自动分析,分数的生物化学和形态学性质。
      ,
      • Bagshaw R.D.
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      • Mahuran D.J.
      • Callahan J.W.
      尼科斯林是居民溶酶体膜蛋白..
      )。在牺牲CO中牺牲前5天,简要介绍了腹腔注射非裂解洗涤剂Tyloxapol(85毫克/ 100克动物重量)的腹腔注射2 腔室。肝被移除,均质化,并以1000×离心 g 10分钟产生后核上清液。通过以34,000×以34,000×离心上清液离心核上上清液产生粗细胞细胞颗粒 g 10分钟。将颗粒重悬于45%蔗糖中,层叠在14.3%蔗糖的不连续梯度下,34.5%蔗糖,并以77,000×离心 g 2小时。从14.3-34.5%的界面中除去Triton填充的溶酶体(三胞嘧啶),用0.25稀释 m 蔗糖,并以28,000×造粒 g 30分钟。苯基甲基磺酰氟(0.1米m)存在于所有解决方案中。

       电子显微镜-

      根据Leighton处理固定三体粒颗粒的切片,用于电子显微镜 等等。 (
      • Leighton F.
      • 普尔B.
      • Beaufay H.
      • Baudhuin P.
      • Coffey J.W.
      • 福勒S.
      • de duve c.
      来自肝脏肝脏的过氧化血剂,线粒体和溶酶体的大规模分离,注射了Triton WR-1339的大鼠。改进分离程序,自动分析,分数的生物化学和形态学性质。
      )。使用Gomori铅磷酸盐技术染色酸性磷酸酶(
      • 煮熟。
      )。

       溶酶体子分压 -

      如前所述,基于溶解度(
      • Pasternak S.H.
      • Bagshaw R.D.
      • Guiral M.
      • 张某。
      • Ackerley C.A.
      • Pak B.J.
      • Callahan J.W.
      • Mahuran D.J.
      Presenilin-1,尼卡斯特林,淀粉样蛋白前体蛋白和γ-分泌酶活性在溶酶体膜中共定。
      )。将简要洗涤的氚组重悬于50米中m Tris-HCl,pH 8.0,0.2 m NaCl并经受五个冷冻/解冻循环(用干冰/乙醇冷冻并在37℃下解冻)。通过离心15分钟以355,000×离心收集膜馏分 g 在4℃下,除去上清液(可溶/腔馏分)。用0.1处理原油颗粒 m Na2CO.3,pH 11.0(冰上30分钟)并以上离心,得到可溶性膜相关馏分。将剩余的膜沉淀指定为整体膜馏分。

       溶酶体整体膜蛋白在cm-sepharose上的分馏和质谱法鉴定 -

      将整体膜馏分溶于6 m 胍HCl和40米m Dithiothreitol。将溶液在45℃温育30分钟,以确保完全减少二硫键。加入碘乙酰胺,得到150米的最终浓度m 并在室温下在黑暗中孵育1小时。然后将蛋白质溶液两次透析过夜柱缓冲液(50米m 甲酸,pH 3.6,8 m 尿素,1%又是唯一的calbiochem)。制备透析囊含量和透析液的电导率测量以确保完全除去胍。将蛋白质溶液以10,000×离心 g 在在柱缓冲液中预平衡的CM-Sepharose阳离子交换柱上,在18℃下在18℃下进行15分钟。收集结合的级分,逐步梯度为20,40,80和250μmm NaCl溶于柱缓冲液中。丙酮沉淀的蛋白质级分,将颗粒溶解在Laemmli缓冲液中(
      • raemmli u.k.
      在噬菌体T4的头部组装过程中裂解结构蛋白..
      )。通过标准一维SDS-聚丙烯酰胺电泳在12%管凝胶(5mM)中分离蛋白质。凝胶(〜12cm)回收;固定在50%甲醇,10%乙酸中的2小时;放在凝胶切片机中;切成2-4毫米的切片。然后将切片与胰蛋白酶一起处理,如前所述(
      • Bagshaw R.D.
      • Callahan J.W.
      • Mahuran D.J.
      用Mini-C18柱脱溶蛋白样品的脱盐用于基质辅助激光解吸电离时间的飞行肽质量指纹。
      )。回收的肽进行C.18 基于NANO-LC-MS / MS的分离,使用水CAPLC具有Picofrit C.18 柱(新目的)符合Q-TOF质谱仪(Micromass)。

       蛋白质识别 -

      使用MassLynx版本3.5(Micromass)将原始MS / MS数据处理成峰值列表(.pkl)。该处理的标准是肽滤波器阈值2,并且使用MS / MS离子搜索(Mascot,Cablot)分析峰列表的最小峰宽度。 www.matrixscience.com.)使用国家生物技术中心非冗余蛋白(NCBI NR)数据库。一些光谱另外解释 德诺维 测序(Pepseq,Micromass)和序列标签(Peptidesearch,欧洲分子生物学实验室生物分析研究组)。通过吉祥物通过手动检查MS / MS数据来验证被吉祥物评分为重要数据库“命中”的所有蛋白质。用一种独特的肽鉴定的蛋白质具有MS / MS光谱,其含有适用于肽序列标签搜索的可解释的Y离子系列,并具有“身份”吉祥物肽分数(补充表1)。数据库搜索标准包括0.3 da的质量精度,一个可能的错过胰蛋白酶裂解。在某些情况下,发现甲硫氨酸氧化和胍基化肽修饰以及 N - 来自蛋白质的N-末端肽的乙酰化。通过使用BLASTP去除每种蛋白质来消除重复来生产未冗余的鉴定蛋白列表 相对 所有已识别的蛋白质的数据库。

       免疫印迹 -

      通过SDS-PAGE分离来自纯化的纯化纯化的纯化氚化合物的蛋白质(30μg)和始发大鼠肝匀浆,并转移到硝酸纤维素中。使用的原代抗体是抗大鼠灯-1(小鼠单克隆,Calbiochem),抗唾液酸三烷基酶1(ST6Gal1,由J.Paulson提供抗GPP130(Covance)和抗钙蛋白(H-70)和抗 - 来自Santa Cruz Biotechnology的-Ribophorin 1(C-15)。使用物种合适的辣根过氧化物酶 - 缀合的二抗与ECL和Hyperfilm(Amersham Biosciences)进行检测。

      结果

       Triton WR1339填充溶酶体(三胞嘧啶) -

      氚化素已被广泛表征为功能性二级(晚期)溶酶体(
      • Leighton F.
      • 普尔B.
      • Beaufay H.
      • Baudhuin P.
      • Coffey J.W.
      • 福勒S.
      • de duve c.
      来自肝脏肝脏的过氧化血剂,线粒体和溶酶体的大规模分离,注射了Triton WR-1339的大鼠。改进分离程序,自动分析,分数的生物化学和形态学性质。
      ,
      • 烧伤J.
      • 施耐德D.L.
      大鼠肝溶酶体膜蛋白的表征。组成,酶活和营业额..
      ,
      • WATTIAUX R.
      • Jadot M.
      • Dubois F.
      • Watti -ux-de Coninck S.
      大鼠肝脏的吞噬作用:吞噬蛋白酶和溶酶体之间的关系..
      ,
      • Khan M.N.
      • Posner B.I.
      • Verma A.K.
      • Khan R.J.
      • Bergeron J.J.
      细胞内激素受体:胰岛素和泌乳原的证据是在大鼠肝脏溶酶体部分的独特囊泡中沉淀物中的探讨。
      )。我们之前已经证明,在我们的三体组制剂(β-六氨基氨基氨基氨基氨基氨基酶的70倍富集)中富含溶酶体标记物(β-己氨胺酶活性,RAB7和灯-1),并且没有线粒体(柠檬酸合酶活性)和er的标记物没有标记(Calnexin蛋白)(refs。
      • Pasternak S.H.
      • Bagshaw R.D.
      • Guiral M.
      • 张某。
      • Ackerley C.A.
      • Pak B.J.
      • Callahan J.W.
      • Mahuran D.J.
      Presenilin-1,尼卡斯特林,淀粉样蛋白前体蛋白和γ-分泌酶活性在溶酶体膜中共定。
      • Bagshaw R.D.
      • Pasternak S.H.
      • Mahuran D.J.
      • Callahan J.W.
      尼科斯林是居民溶酶体膜蛋白..
      见下文)。孤立的三胞嘧啶的电子显微镜(图。1A)表示几乎所有的结构都是含有电子致密核的Triton WR1339填充溶酶体,并且很少或没有其他细胞器。这些溶酶体的膜具有酸性磷酸酶活性的强阳性染色(图。1B)进一步表征它们 善意 溶酶体。通过冷冻/解冻裂解和离心获得的三体组膜的电子显微镜显示出没有电子致密核和非晶膜的存在(图1C.)酸性磷酸酶阳性(图。1D)。很少或没有膜材料明显,酸性磷酸酶活性是阴性的。没有污染细胞器和后素制剂的再现性和可靠性以及保留功能和生理特性使Triton WR1339填充溶酶体是蛋白质组学模型的理想选择。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1纯化三体的电子显微镜检查。A,完整的三体组织; B,具有酸性磷酸酶特异性染色的完整氚组; C,衍生自冷冻/解冻骨折手术的三血型膜; D,具有酸性磷酸酶染色的三血糖膜(图像是×17,800)。

       溶酶体整体膜蛋白的分离和鉴定 -

      在蛋白质组学分析之前将样品排列成亚群的预分化通常导致识别出更大的蛋白质阵列。因此,在氚化的冻/解冻裂解后除去可溶性蛋白质,通过用碳酸钠处理除去外周结合的蛋白质(
      • 藤木y.
      • Hubbard A.L.
      • 福勒S.
      • Lazarow P.B.
      通过碳酸钠处理分离细胞内膜:在内质网的应用。
      )导致不溶性颗粒, IE。 整体膜馏分。由于在非离子洗涤剂(未示出的数据)中不完全溶解材料,可能是由于膜蛋白中的疏水性和耐洗涤剂域, 例如 NPC1 (
      • Taute A.
      • Watzig K.
      • 西蒙斯B.
      • Lohaus C.
      • 迈耶H.
      • Hasilik A.
      溶酶体膜中存在耐洗涤剂微膜..
      ),整体膜馏分溶解,减少, S - 在胍HCl中烷基化,然后透析 相对 8 m 尿素和pH 3.6的1%官员。使用NaCl步骤梯度,通过CM-Sepharose上的阳离子离子交换色谱开始,最初通过阳离子交换色谱法分馏整体膜蛋白。分馏的目标,由平板凝胶SDS-PAGE确认(Fig. 2),是为了富力丰富的蛋白质,并从高度丰富的酸性蛋白质达到它们的偏析, 例如 灯具(用于评论,参见参考文献。
      • Eskelinen E.L.
      • 田纳卡y.
      • Saftig P.
      在酸性边缘:溶酶体膜蛋白的出现功能..
      • 刘易斯五。
      • 绿色s.a.
      • 沼泽M.
      • VIHKO P.
      • Helenius A.
      • MELLMAN I.
      溶酶体膜的糖蛋白..
      )。因此,我们选择了系统的pH,使这些和其他具有非常低的PI值的蛋白质没有绑定(Fig. 2, 看 ”un“)到吸附剂(在这些条件下,约40%的总蛋白质没有结合)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2通过SDS-PAGE和银染色分析的CM-Sepharose色谱分离的大鼠肝脏三体的整体膜蛋白分数。un 与其他车道相比,车道约为5倍。将类似的制备型SDS-PAGE管凝胶切成2-4毫米切片,并且将每个切片用于凝胶中的消化和LC-MS / MS。
      通过将来自每柱级分的蛋白质分离,在管凝胶中分离成2-4mm的切片并用于凝胶中的消化,并通过在线LC-MS / MS分离并鉴定肽。从成千上万的MS / MS光谱获得,选择约13,300用于数据库搜索,导致溶酶体整体膜蛋白分数中的215蛋白(非冗余)鉴定(表I.)。这些基于其普遍接受的生物学功能组织成本地科。除非可以发现保守的结构域或正轨提供有关蛋白质的功能的信息,否则将来自非特征CDNA的NCBI NR数据碱中预测的假设蛋白分类为未知/无表现。例如,将“假设蛋白5031407H10”分类到囊状和蛋白质贩运类别中,因为它含有沙族(真空靶向)结构域(PFAM03164)。
      T有能力的 I从溶酶体整体膜蛋白级分中鉴定的蛋白质
      代谢
      醛脱氢酶3-A2139290282
      露络214267872
      arachidonic酸环氧基因139292044
      芳基磺基转移酶10916001
      ATP合成酶α亚基67299344
      ATP合成酶F0β亚基197054652
      ATP合成酶F1复合物O子单元203020613
      ATP合成酶γ链399305033
      甜菜碱 - 同型半胱氨酸甲基转移酶135406635
      氨基甲酰基磷酸合成酶183931862
      催化剂69786072
      CYP2A169787413
      CYP2C13254534061
      CYP2C22199240392
      CYP2C29.95065291
      CYP2D269787471
      CYP4A3284611552
      细胞色素 b5115600465
      DOPA /酪氨酸磺基转移酶119680921
      环氧化物水解酶169788134
      甘油醛-3-磷酸脱氢酶83934181
      l-gulono-γ-内酯氧化酶115600062
      过氧杂志1169239583
      视黄醇脱氢酶III型313774775
      类似于NADH脱氢酶(泛醌)1α子追容,9348584734
      免疫
      CD1抗原54204617
      FC受体153753226
      巨噬细胞表达基因1120182982
      MHC级Iα链9408251
      聚合物免疫球蛋白受体271517423
      类似于Igh-6蛋白质349352972
      类似于免疫球蛋白连接链348766933
      生物合成
      α-甘露糖苷酶II3487794015
      核心1β-1,3-半乳糖基转移酶126211245
      伸长因子Tu,类似于Riken cDNA 2300002G02348591871
      真核翻译伸长因子1α-2158050312
      热休克70KD蛋白5,GRP78,BIP257427636
      微粒体谷胱甘肽S-转移酶1197054532
      N - 乙酰甘氨酸氨基氨基转移酶I.135406856
      N-deacetylase /N-Sulfotransferase(普通鞘氨基氨基苯基)1;硫酸乙酰丙酯-N-脱乙酰酶/ N-磺基转移酶132422535
      ppgantase-t2.468771093
      蛋白二硫化物异构酶(ER60)918971
      核经碱I.69814861
      核糖体蛋白L13135920553
      核糖体蛋白L6167588641
      核糖体蛋白L7,细胞溶质[验证] -rat113837292
      核糖体蛋白S3,细胞溶溶胶[验证] -rat708501
      核糖体蛋白S3a,细胞溶质[验证] -rat83942211
      核糖体蛋白S42272295
      核糖体蛋白S666778091
      Sialyltransferase 1(ST6GAL1)11544613
      SiaLyl转移酶4a(st3gal1)66779572
      Sialyl转移酶8(GT3α-2,8-唾液酸酶)69815401
      类似于60 S核糖体蛋白L3(L4)384542461
      类似于60颗核糖体蛋白L7a(Shareit Locus蛋白3)(PLA-X多肽)348531323
      类似于60粒核糖体蛋白L8276855973
      类似于硫酸乙酰肝素2-磺基转移酶348609292
      类似于核糖体蛋白S8380493302
      类似于囊泡积分 - 膜蛋白VIP36前体276826916
      UDP糖基转移酶2家族,多肽B.139287181
      UDP-葡萄糖糖基糖苷酶2家族,会员5348767121
      膜受体/信号和细胞粘附
      亚利糖蛋白受体177052903
      asialoglycophotein受体283929262
      癌丙烯镁抗原相关细胞粘附分子139290602
      CD5969786351
      细胞表面抗原RB13-6-RAT13632742
      e-Selectin配体,Golgi设备蛋白1667790521
      鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α-11亚基135919511
      Harvey Rat Sarcoma oncogene,亚组r66778191
      脂蛋白受体相关蛋白348657596
      OX471115032
      P21 / H-RAS-1(C-H-RAS)1318731
      磷脂酰肌醇4-激酶II型167585544
      孕酮受体膜组分1111207202
      蛋白质 - 酪氨酸磷酸酶,受体类型,F.95070132
      嘌呤能受体P2X4139288064
      Rap2B133863381
      RRAS2,相关RAS病毒(R-RAS)癌基因同源物2133993081
      类似于CUX / CDP(1B1); Cux / CDP HomeoProtein348733661
      类似于GTP结合调节蛋白α-13链348752401
      类似于Mek Tending Partner 1348607832
      类似于垂体肿瘤转化基因1蛋白 - 相互作用蛋白348524164
      类似于Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1同种型RAC1B348704494
      类似于Riken cDNA 1300006M19348703941
      类似于转铁蛋白受体蛋白2(TFR2)348715363
      Toll样受体33343823810
      分子transport
      ATP绑定盒,子族B(MDR / TAP),成员6180347853
      ATP绑定盒,子族C(CFTR / MRP),成员2;管式多特异性有机阴离子运输器;多药耐药相关蛋白269786695
      氯离子泵相关55 kda蛋白214899871
      Niemann选择C1.66791044
      肽/组氨酸转运蛋白214267911
      类似于2810423E13RIK蛋白质348568832
      类似于钙结合线粒体载体蛋白质Aralar2(溶质载体家庭25,成员13)(柠檬酸)76575838
      类似于MLN64 N-末端结构域同源物(STARD3 N-末端,如蛋白质)276866791
      类似于proteoLipid蛋白2464854051
      类似于推定蛋白质,具有至少9个跨膜结构域,真核原子(43.9kDa)(2G415)348630281
      类似于溶质载体31,成员1194243101
      类似于TM9SF1蛋白质348741672
      类似于透射膜9超家族成员2348760892
      类似于跨膜9超家族蛋白质成员4348590183
      溶质载体家庭25(线粒体磷酸载体;腺嘌呤核苷酸易位器),构件3;磷酸盐载体,线粒体208061411
      溶质载体家庭25,成员4;线粒体腺嘌呤核苷酸易位器321893552
      溶质载体家庭29(核苷转运蛋白),成员3317451422
      Vatpase 100kda a3亚基71409423
      Vatpase亚单位B.171053702
      Vatpase亚基D(v0)39551009
      Vatpase亚基D(v1)407864633
      Vatpase亚单位E.17180911
      Vatpase亚单位G.277146151
      Vatpase亚单位H.143187222
      电压依赖的阴离子通道167559634
      膜结构和脂质筏
      CD36抗原样2(Limpii)1675891410
      潮湿-1蛋白376935102
      Flotillin-11312411820
      Flotillin-21312411915
      Golgi相关蛋白GCP360203020659
      LAMP1698114410
      LAMP2402547858
      perhibitin.66792999
      类似于带7蛋白(35.3kDa)(4n53)348631011
      类似于宏观素(CD68)348709663
      类似于Mal2a.326932851
      B细胞相关蛋白37;类似于雌激素受体活性的阻遏物348584368
      Stomatin(红细胞带7整体膜蛋白7.2b)77100188
      水解酶/共同因素
      5'核苷酸酶,ECTO110246432
      β-半乳糖苷酶1921852
      β-葡萄糖醛酸酶83935102
      Compeopsin F.348614193
      组织林L.676502
      Compeopsin Y.343285401
      二肽基肽酶IV697877312
      GM2神经节苷脂活化剂蛋白489760852
      肾氨肽酶m;亮氨酸芳基氨基肽酶1135919142
      溶酶体酸性磷酸酶83928429
      尼科斯林2781965113
      血浆谷氨酸羧肽酶139288801
      Praphosin.69814242
      β-半乳糖苷酶保护蛋白66794373
      X-脯氨酰氨基肽酶(氨基肽酶P)2,膜结合169240206
      分泌
      α-1抑制剂III128312252
      α-2-HS-糖蛋白(胎素)69784777
      载脂蛋白A-V1803477712
      载脂蛋白B.348630994
      载脂蛋白E.170333810
      补充组件9.169240061
      Dermcidin前体167519215
      上皮素/粒素前体83934934
      铁蛋白轻链21196958
      纤维蛋白原γ-一个链718292
      Fibronectin 1.95067034
      α-抑制剂H4重链95068195
      肽基丙醇异构酶C相关蛋白(妈妈)208061354
      妊娠区蛋白质219551424
      血清淀粉样蛋白P.83929032
      类似于E1A刺激基因的细胞阻遏物348808321
      Vitronectin95072413
      未知/无表格
      2810022L02RIK蛋白质159285811
      表达序列AV006840208468432
      假设蛋白XP_236205348633182
      Mg87蛋白质197055432
      Riken cDNA C730027E14221224971
      类似于AB2-095.348654645
      类似于细胞凋亡相关蛋白质4月3日; P18蛋白质348629963
      类似于cDNA 1810037C20348817601
      类似于CG14980-PB348704072
      类似于Chr14 ORF348697123
      类似于E25B蛋白质277019072
      类似于FAM3C样蛋白质384542801
      类似于灰色致命的骨质棘刺;灰色致命348534212
      类似于HTGN29蛋白质;角质形成细胞相关的跨膜蛋白2348707151
      类似于假设蛋白FLJ38482348777462
      类似于假设蛋白质mgc18837277196511
      类似于假设蛋白质mgc29390348692105
      类似于假设蛋白质mgc40107276729462
      类似于Riken cDNA 1100001H23348585513
      类似于Riken cDNA 1110055L24348547132
      类似于Riken cDNA 2010320H07基因348531211
      类似于Trim14α348684727
      未知(MGC蛋白质:72560)400185806
      未知(MGC蛋白质:72638)400185501
      杂皮和蛋白质贩运
      Arl10C128388714
      依赖于依赖的M6pr277131604
      Ergicp53,甘露糖结合凝集素1167587589
      热休克蛋白8;热休克同源蛋白70;热休克70KD蛋白8132422375
      Rab11b,会员Ras oncogene家族142491443
      Rab1A47589887
      Rab2139290061
      Rab5C276895053
      Rab6175122907
      Rab7130273926
      Riken cDNA 1500016L11.213121513
      Riken cDNA 3930401E15.380835732
      类似于ankyrin重复钩住锌手指图案长度348730952
      类似于包含1的EH域348618351
      类似于Golgi磷蛋白4; II型高尔基膜蛋白; 130 kda golgi局部磷蛋白; CIS golgi局部钙结合蛋白348570916
      类似于Golgi特异性Brefeldin A抵抗鸟嘌呤核苷酸交换因子1348635972
      类似于GP25L2蛋白质348736391
      类似于假设蛋白质
      5031407H10348517862
      类似于LRG-47276701332
      类似于NiSNAP1蛋白质348790192
      类似于Procollagen(III型)
      N-Endopeptivease.348519871
      类似于rab18.276873871
      类似于Rab5B.348622192
      类似于Ret-II348675832
      类似于riken cDNA 2010012F05348590752
      排序Nexin 3a.45071432
      Snapα..21435862
      syntaxin 7.111779204
      语法8; Syntaxin样蛋白3i35139289084
      TGN38203019766
      ubitquitin706375
      Vamp2B48941882
      VAMP8139291828
      囊泡通过互动输送
      用t-snares 1b同性恋348662433
      VPS24P蛋白质272293081
      在凝胶切片中鉴定蛋白质,其粗略地对应于它们计算的分子量,其具有诸如已知糖蛋白的一些例外, 例如 麦克风(预计是 Mr ~35,000,但发现了一个明显的 Mr ~80,000)和泛素(〜8kda单体,但在整个分子质量范围内发现)。为了确保我们的蛋白质分离和鉴定过程代表膜的真实组成,我们比较了所列理论蛋白质分子量的分布 表I. 对于从鼠标哺乳动物基因集合(MGC)全长cDNA数据碱基(包括13,007cDNA)的翻译预测的那些。显示的直方图(Fig. 3)清楚地表明我们的方法不受蛋白质大小偏向。应该指出的是,蛋白质的数量 Mr >在本研究中鉴定的200,000次比MGC收集的预测略大,表明膜蛋白质构成了较高比例的大蛋白质。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3来自MGC小鼠cDNA数据库的预测蛋白的分子量分布(2004年3月10日)(A)在大鼠肝溶酶体积分膜蛋白分数中鉴定的蛋白质的理论分子量(B)。

       溶酶体积分膜的蛋白质 -

      为了确定我们的蛋白质组学调查中最丰富的溶酶体膜蛋白,我们使用了由分配的独特肽数量的蛋白质丰富的蛋白质丰富度,这些蛋白质丰富量除以蛋白质的理论分子量。在这种丰富度量方面的前15%的蛋白质以粗体型表示 表I.。这些包括灯-1,灯泡-2和Limpii,如预期(如需审查,请参阅参考文献。
      • Eskelinen E.L.
      • 田纳卡y.
      • Saftig P.
      在酸性边缘:溶酶体膜蛋白的出现功能..
      )和V-ATP酶V0亚基D,RAB7和溶酶体酸性磷酸酶。有趣的是脂质筏成分Flotillin-1,Flotillin-2和Stomatin(
      • 萨利兹u.
      • Prohaska R.
      Stomatin,Flotillin-1和Flotillin-2是红细胞脂质筏的主要整体蛋白..
      ,
      • 福斯特L.J.
      • de hoog c.l.
      脂质筏的无偏的定量蛋白质组学揭示了信号传导因子的高特异性。
      )在溶酶体膜中也存在于相当大的丰富(
      • Taute A.
      • Watzig K.
      • 西蒙斯B.
      • Lohaus C.
      • 迈耶H.
      • Hasilik A.
      溶酶体膜中存在耐洗涤剂微膜..
      )。在相对高的丰度中发现的其他蛋白质是尼卡斯特林,铁蛋白轻链和载脂蛋白(A-V,E和B)。虽然Apob理论基因产品非常大(>500 KDA),我们可能发现较小的肠道特异性Apob48物种,因为对于Apob鉴定的肽是Apob48的推定的C末端剪接部位的N-末端(Apob100的近似氨基酸2151)(
      • 陈S.H.
      • Habib G.
      • 杨C.Y.
      • 顾Z.W.
      • Lee B.R.
      • 翁S.A.
      • Silberman S.R.
      • Cai S.J.
      • Deslypere J.P.
      • rosseneu m.
      • 派了上午
      • 李W.H.
      • Chan L.
      载脂蛋白B-48是Messenger RNA的产品,具有器官特定的内部停止密码子。
      )。
      我们鉴定了SiaLyl转移酶1的膜结合形式(ST6GAL1)。 II型跨膜蛋白最初局限于GOLGI,但也显示出在包括溶酶体膜的几种后GOLGI结构中(
      • 塔哈特·迪尔
      • 罗斯J.
      • Weinstein J.
      • 保尔森J.C.
      免疫电解显微镜检测到多肽表位纯化抗体检测大鼠肠唾液腺转移酶的大鼠肠道唾液酸糖酶的区域表达。
      )。当通过针对灯-1的免疫印迹分析三甲酰基转移酶1和GOLGI蛋白GPP130时,我们发现灯-1和唾液酸三糖酶1在三组织中基本上富集,而GPP130则不是( 图4,A和B.)。我们的唾液酸盐酶1的肽覆盖率包括两种胰蛋白酶肽(Gly29而且46)在β-淀粉样蛋白转换酶1(阿尔茨海默病β-分泌物活性)的两侧。在这个网站上切割,残留Gln38,随后是外蛋白酶和新的n末端产生可溶性唾液酸溶酶1(glu41)(
      • Kitazume S.
      • Tachida Y.
      • 好的a R.
      • Kotani N.
      • ogawa K.
      • Suzuki M.
      • 多头N.
      • Takio K.
      • 德州
      • Hashimoto Y.
      Alzheimerβ-分泌酶(BACE1)表征α2,6-唾液酸转移酶切割。
      )。我们还在溶酶体膜中发现了其他糖基转移酶,丰度略低(表I.)。在这些膜中富集唾液酸甲烷增长但不是GPP130以及其他糖基转移酶的存在表明,在溶酶体膜中可以存在先前未缺点的这种蛋白质的生物学作用。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4大鼠肝三体的免疫印迹。A,溶酶体膜蛋白灯-1; B,高尔基膜蛋白Sialyl转移酶1和GPP130; C,ER膜蛋白Calnexin和核酰素1.使用来自肝匀浆和三组织的等量蛋白质。
      我们以前证明存在尼卡斯特林和预析蛋白1(γ-分泌酶复合物的组分)以及溶酶体膜中的酸γ-分泌酶活性(
      • Pasternak S.H.
      • Bagshaw R.D.
      • Guiral M.
      • 张某。
      • Ackerley C.A.
      • Pak B.J.
      • Callahan J.W.
      • Mahuran D.J.
      Presenilin-1,尼卡斯特林,淀粉样蛋白前体蛋白和γ-分泌酶活性在溶酶体膜中共定。
      )。 Nicastrin被证实在本次调查中被证实是该调查中的主要溶酶体成分,其中13项独特的肽(表I. 和补充 表格1)。然而,我们没有鉴定来自这种复合物的其他推定部件的肽, 例如 maph1或pen2。同样地,尼卡斯特林,但没有γ-分泌酶复合物的其他组分,发现在黑色素的蛋白质组学研究中(溶酶体相关细胞器, 表二)(
      • Basrur V.
      • 杨F.
      • Kushimoto T.
      • Higashimoto Y.
      • Yasumoto K.
      • 瓦伦西亚J.
      • Muller J.
      • Vieira W.D.
      • Watabe H.
      • Shabanowitz J.
      • 听到v.j.
      • 狩猎d.f.
      • Appella E.
      早期黑色素的蛋白质组学分析:新型黑色素蛋白的鉴定
      )。
      T有能力的 II来自溶酶体,吞噬体和黑色素的常见蛋白质
      蛋白质名称Lysosome Gi号码吞噬噬菌体古氏菌数黑素糖胺GI号码
      代谢
      CYP4A328461155296449
      甘油醛-3-磷酸脱氢酶8393418P16858
      过氧杂志116923958P35700
      免疫
      巨噬细胞表达基因112018298I52603
      MHC级Iα链940825CAA06194
      生物合成
      真核翻译伸长系数1α215805031P10126
      热休克70-KDA蛋白5,GRP78,BIP25742763P20029p11021
      蛋白二硫化物异构酶(ER60)91897P27773P30101
      核经碱I.6981486P04843
      膜受体/信号和细胞粘附
      磷脂酰肌醇4-激酶II型1675855413559514
      类似于Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1同种型RAC1B34870449P15154
      分子transport
      ATP绑定盒,子族B(MDR / TAP),成员61803478511245444
      niemann-pick c16679104O15118
      V-ATPase亚单位B.17105370P50517P21281
      V-ATPASE亚基D.3955100P12953
      V-ATPASE亚基E13097342P50518P36543
      电压依赖的阴离子通道16755963Q60932P21796
      膜结构和脂质筏
      CD36抗原样2(Limpii)16758914P27615
      Flotillin-113124118O089173599573
      Flotillin-213124119Q14254
      LAMP-16981144P11438P11279
      LAMP-28393690P17046
      perhibitin.6679299P24142
      Stomatin(红细胞带7整体膜蛋白7.2b)7710018P54116P27105
      水解酶/辅电器
      β-葡萄糖醛酸酶893510P12265
      组织林L.67650P06797
      Compepsin Z.34978341CAB44494
      尼科斯林27819651Q92542
      Praphosin.94388051360694
      β-半乳糖苷酶保护蛋白6679437P16675
      分泌
      铁蛋白轻链,大鼠2119695P29391
      肽基丙醇异构酶C相关蛋白(妈妈)20806135397800
      杂皮和蛋白质贩运
      Arl10C12838871AI006608.
      热休克蛋白8;热休克同源蛋白70;热休克70-KDA蛋白813242237P08109
      Rab11b,会员Ras oncogene家族14249144P46638
      Rab213929006P53994
      Rab5C27689505P35278
      Rab713027392P51150P51149
      Snapα.2143586P54921
      泛素706371167510P02248
      报告并用于比较的蛋白质数量21511768
      发现溶酶体积分膜级分的十七蛋白具有翻译后改性的N-末端乙酰化(表I. 和补充 表格1)。这包括几种涉及贩运和三种蛋白质中的蛋白质,在“未知”本体中。 N-末端乙酰化是真核生物中蛋白质的常见翻译后修饰,并且通常表示蛋白质的n末端的细胞溶质拓扑。这些发现证实了Rab6的N-末端乙酰化,最初显示在Golgi囊泡的蛋白质组学研究中(
      • 贝尔A.W.
      • 沃德米
      • Blackstock W.P.
      • 弗里曼H.N.
      • Choudhary J.s.
      • 刘易斯A.P.
      • Chotai D.
      • Fazel A.
      • Gushue J.N.
      • PAIEMENT J.
      • 帕西斯。
      • Chevet E.
      • Lafreniere-Roula M.
      • Solari R.
      • Thomas d.y.
      • 罗利A.
      • Bergeron J.J.
      丰富的高尔基膜蛋白的蛋白质组学特征。
      ),我们现在向其他RAB(RAB1A和RAB11B)和SNARES(语法7和VAMP8)扩展此修改。虽然功能相关性 N - 这些特定蛋白质的乙酰化未知,最近据报道 N - ARF蛋白家族成员ARL3P的正确膜靶向需要 - 乙酰化(
      • Setty S.R.
      • Strochlic T.I.
      • 桐A.H.
      • Boone C.
      • Burd C.g.
      GOLGI靶向ARF样GTPASE ARL3P需要其Nα-乙酰化和整体膜蛋白SYS1P ..
      ,
      • Behnia R.
      • 恐慌B.
      • 唠叨J.R.
      • 蒙古罗
      靶向GOLGI的ARF样GTPASE ARL3P需要N-末端乙酰化和膜蛋白SYS1P ..
      )。
      在〜30至〜50kDa的分子量范围内的七个凝胶切片中鉴定了泛素(8kDa),因此存在于与其他蛋白质的缀合物中的整体膜馏分中。通过泛素的C末端与靶蛋白的赖氨酸侧链的C末端的缀合出来的Monoubiquinylation发生,而泛素分子在前后泛蛋白的赖氨酸残基的连续缀合出来发生较多氢吲哚基。泛素的赖氨酸48是在多泛素形成期间添加遍历蛋白肽的最常见的部位(有关审查,请参阅参考文献。
      • Weissman上午
      ubiquitylation的主题和变化..
      )。据据报道,络合素化作为基于胞质蛋白酶体的降解的标签,而膜膜在膜膜中的膜蛋白的Monoubiquityinylate或膜蛋白的多元脲素化,则足以使其在溶酶体中的运输和降解(
      • Haglund K.
      • Sigismund S.
      • 马尔托。
      • Szymkiewicz I.
      • 迪菲尔德P.P.
      • 迪克斯I.
      RTK的多次单次素次突出足以用于其内吞作用和降解。
      ,
      • Mosesson Y.
      • Shtiegman K.
      • 卡茨米
      • Zwang Y.
      • VEREB G.
      • Szollosi J.
      • yarden y.
      受体酪氨酸激酶的内吞作用由Monoubiquitylation驱动,而不是络合剂..
      )。然而,我们未鉴定本研究中含有赖氨酸48的肽。
      根据溶酶体在将小分子输送到其降解的Milieu中的主要作用,我们识别出(a)四种蛋白质,其含有70kDa(emp70)结构域的子宫内膜蛋白,其可具有小的分子膜运输功能(
      • 斯皮姆梅尔F.
      • 迪亚兹E.
      • Muhlbauer B.
      • pfeffer s.r.
      表征76kDa内体,多分料膜蛋白在整个进化中受到高度保守的。
      ),(b)溶质载体家族25(包括腺嘌呤核苷酸转运蛋白和磷酸盐转运蛋白)的蛋白质(c)推定的铜吸收转移器SLC31构件1和组氨酸转运仪SLC15构件14,和(d)ATP结合盒式家族的成员。同样,也发现了NPC1胆固醇转运蛋白和真空ATP质子泵的组分。除了V-ATP酶之外,鉴定的大多数转运蛋白被分配了五个或更少的肽,表明这些是溶酶体膜中的低丰度蛋白质。

       溶酶体,吞噬体和黑色素共同的膜蛋白 -

      我们编制了从已发表的吞噬蛋白酶的蛋白质组学研究鉴定的蛋白质的爆炸数据碱基(
      • 加入J.
      • Diez R.
      • Kieffer S.
      • Dermine J.F.
      • Gagnon E.
      • 恋爱尔·罗
      • Rondeau C.
      • Desjardins M.
      吞噬蛋白酶:洞察吞噬族函数..
      )和黑色素组(
      • Basrur V.
      • 杨F.
      • Kushimoto T.
      • Higashimoto Y.
      • Yasumoto K.
      • 瓦伦西亚J.
      • Muller J.
      • Vieira W.D.
      • Watabe H.
      • Shabanowitz J.
      • 听到v.j.
      • 狩猎d.f.
      • Appella E.
      早期黑色素的蛋白质组学分析:新型黑色素蛋白的鉴定
      )通过我们目前的调查中的每一个搜索215个蛋白质。我们的溶酶体整体膜级分中的四十蛋白也被发现在吞噬体和/或黑色素中(表二)。蛋白质如灯-1,V-ATP酶,电压依赖性阴离子通道1,RAB7,Flotillin-1,Stopatin和泛素的亚基B和E均为所有这些细胞器。在吞噬体和黑色素中也发现主要是ER蛋白GRP78(BIP)和蛋白二硫化物异构酶。另外三个RAB蛋白,RAB2,RAB5C和RAB11B也共同,也是甘蓝嗪-2,LiMPII和NPC1。在我们的调查中,我们鉴定了许多其他ER,Cytosol和Golgi蛋白(大部分归类为生物合成或新陈代谢 表I.)在溶酶体膜蛋白级分。虽然这些蛋白质在鉴定的肽数量方面具有稍低的丰度,但是据报道了一些这些蛋白质与吞噬物质和/或黑色素相关(表二因此,可能不是来自制剂的凹凸污染物,而是通过普通贩运途径出现溶酶体和这些相关的细胞器。以前已经证明,吞噬膜可能从ER膜出现,并且吞噬物体对吞噬细胞的成熟恰逢ER蛋白的量减少(
      • 加入J.
      • Diez R.
      • Kieffer S.
      • Dermine J.F.
      • Gagnon E.
      • 恋爱尔·罗
      • Rondeau C.
      • Desjardins M.
      吞噬蛋白酶:洞察吞噬族函数..
      ,
      • Gagnon E.
      • Rondeau C.
      • Chevet E.
      • 卡梅隆P.H.
      • Steele-Mortimer O.
      • PAIEMENT J.
      • Bergeron J.J.
      • Desjardins M.
      内质网介导的吞噬作用是进入巨噬细胞的机制..
      )。在一致的成熟水平,三血糖蛋白的免疫印迹表明,ER膜蛋白Calnexin是不可检测的,而核经碱1在低水平下存在(图4C.)。这表明ER膜及其相关的蛋白质可以参与早期溶酶体结构,并且在细胞器成熟期间以可变速率丢失。

      讨论

      细胞器的蛋白质组学的方法允许浓度,从而鉴定罕见的细胞蛋白,同时向其提供线索 体内 功能基于其本地化。该技术取决于有问题的细胞器的质量和产量。由于溶酶体在原生密度方面是异质的,因此它们难以通过常规方法纯化。通过减少大鼠肝脏中大量溶酶体的总密度来克服该问题的氚核溶酶体克服了该问题,允许在单一步骤中分离毫克数量的高度纯化的细胞器。此外,由于氚化素是仲溶酶体,它们代表了相对稳定的末期细胞器的群体。因此,它们的蛋白质组合物可以被认为是恒定的和本构作案, IE。 它们不太反映溶酶体的生命周期的过渡阶段。
      本文报告的215个蛋白质到我们的知识代表了迄今为止溶酶体膜差异鉴定的最大数量的蛋白质。先前的研究确定了27个蛋白质,其来自甘露糖6-磷酸脲亲和柱结合的可溶性溶酶体馏分(
      • journet a。
      • Chapel A.
      • Kieffer S.
      • roux f.
      • 加入J.
      人溶酶体的蛋白质组学分析:对单核细胞和乳腺癌细胞的应用..
      )。然而,溶酶体膜蛋白通常不会通过该途径向细胞器被转运,如此由它们的高唾液酸化状态反映 N - 链接的低聚糖。我们的离子交换色谱和一维SDS-PAGE的组合,然后是凝胶胰蛋白酶消化和质谱(LC-MS / MS)提供高度的蛋白质分离。它是稳健的,提供合理的再现性,可用于比较来自多重复合蛋白样品的蛋白质谱。
      一个有趣的发现是溶酶体膜中相对较高的脂质筏蛋白。脂质筏是富含胆固醇和鞘脂的小膜结构域,其具有对各种细胞信号传导事件进行分类,浓缩和组织蛋白质的能力。它们最近被证明浓缩参与囊泡融合的陷阱蛋白质(
      • Chamberlain L.H.
      • 古尔德G.W.
      介导胶乳4囊泡融合的囊泡和靶标蛋白质在不同的细胞内膜上的洗涤剂不溶性脂质筏中局部。
      )已被发现与晚期内体(
      • Fivaz M.
      • Vilbois F.
      • Thurnheer S.
      • Pasquali C.
      • Abrami L.
      • Bickel P.E.
      • Parton r.g.
      • van der goot f.g.
      内吞的GPI锚定蛋白的差异分类和命运。
      ),溶酶体(
      • Taute A.
      • Watzig K.
      • 西蒙斯B.
      • Lohaus C.
      • 迈耶H.
      • Hasilik A.
      溶酶体膜中存在耐洗涤剂微膜..
      )和吞噬膜(
      • Dermine J.F.
      • 加入J.
      • ST-LOUIS F.
      • rea s.
      • Parton r.g.
      • Desjardins M.
      氟哌妥林-1-富集的脂质筏域积聚在成熟的吞噬物质上。
      )。有趣地始致的吞食脂肪筏的数量与其成熟成吞噬粒子的脂肪筏的数量(
      • Dermine J.F.
      • 加入J.
      • ST-LOUIS F.
      • rea s.
      • Parton r.g.
      • Desjardins M.
      氟哌妥林-1-富集的脂质筏域积聚在成熟的吞噬物质上。
      );这与我们目前在成熟溶酶体上发现明显高丰富的脂质筏。它们在溶酶体膜中的存在表明即使是这种晚期细胞器的主要信号和分拣功能也是如此。与之一致我们已经鉴定了MEK结合合作伙伴1蛋白的大鼠原序,丝裂剂活化蛋白激酶级联的内体ERK途径的支架组分,并且已知在胞质溶胶上结合p14(未在本研究中鉴定)面对晚期的内皮肌/溶酶体(
      • Wunderlich W.
      • Fialka I.
      • Teis D.
      • Alpi A.
      • Pfeifer A.
      • Parton r.g.
      • Lottspeich F.
      • Huber L.A.
      一种新的14-kilodalton蛋白在晚期内体/溶酶体隔室中与丝裂剂活化的蛋白激酶支架MP1相互作用。
      ),ERK1 / 2的内骨激活所需的过程(
      • Teis D.
      • Wunderlich W.
      • Huber L.A.
      MP1-MAPK支架复合物的定位通过P14介导并对信号转导所需的介导。
      )。类似地,鉴定了E1A刺激基因(Creg)的细胞阻遏物证实先前对溶酶体甘露糖6-磷酸受体结合蛋白的研究(
      • journet a。
      • Chapel A.
      • Kieffer S.
      • Louwagie M.
      • Luche S.
      • 加入J.
      朝着单核细胞溶酶体蛋白的人类曲目..
      )。 Creg是一种分泌的糖蛋白,其促进多能干细胞的分化(
      • 小牛肉E.
      • Gromisman R.
      • 艾森斯坦M.
      • 吉尔G.
      分泌的糖蛋白Creg提高了Ntera-2人胚胎癌细胞的分化..
      )抑制甘露糖6-磷酸盐/胰岛素样生长因子II受体依赖性方式的细胞生长(
      • Di Bacco A.
      • 吉尔G.
      分泌的糖蛋白Creg抑制依赖于甘露糖-6-磷酸盐/胰岛素样生长因子II受体的细胞生长..
      )。我们还确定了LRG-47,一种巨噬细胞干扰素-γ-γ-诱导的GTP酶,所需的含有病原体的吞噬物质融合用溶酶体(
      • macmicking J.D.
      • 泰勒G.A.
      • 麦金尼J.D.
      IFN-γ-invucible LRG-47对结核病的免疫控制..
      )。还识别出是语法7,语法8,VTI1b和Vamp8。这些在晚期内体形成的复合物中发生,并且这种复合物是与其他内体的融合事件所必需的(
      • Antonin W.
      • Holroyd C.
      • Fasshauer D.
      • PABST S.
      • von mollard g.f.
      • Jahn R.
      晚期介导融合的圈套复合融合定义了陷阱结构和功能的保守性。
      )和溶酶体(
      • Mullock下午
      • 史密斯C.W.
      • Ihrke G.
      • 明亮的n.a.
      • Lindsay M.
      • 帕金森e.j.
      • 布鲁克斯D.A.
      • Parton r.g.
      • 詹姆斯D.E.
      • Luzio J.P.
      • Piper R.C.
      综合症7是末端内部隔室的局部覆盖物,与凹凸8缔合,并且是晚期内体溶酶体融合所必需的。
      )。集体这些发现表明在细胞内通信和信号传导事件中对溶酶体膜的重要作用。
      溶酶体膜的良好描述的功能一直是通过细胞再利用的降解产物的劣化产物。然而,已经确定了与这些溶酶体中这些活性有关的蛋白质。我们在本报告中发现的一个值得注意的蛋白质群体是预计拥有运输功能的显着蛋白质, 例如 EMP70领域,或溶质载体家族中的域名。现在可以评估这些蛋白质相对于溶酶体膜及其腔内容物的分子运输功能。
      虽然 德诺维 溶酶体的生物发生尚不清楚,鉴定溶酶体中共同的蛋白质及其相关细胞器可以帮助阐明它们的形成。作为起点,在吞噬蛋白酶和黑色糖胺的其他蛋白质组学调查中也鉴定了本研究中鉴定的溶酶体膜的许多公知的蛋白质(表二)。另一个人开始了解溶酶体生物发生和维护的过程,从我们的发现所谓的“灰致死”(GL)蛋白质产生。 GL已经以严重的形式涉及人体恶性常染色体隐性骨质术(
      • Chaloub N.
      • Benachenhou N.
      • Rajapurohitam V.
      • Pata M.
      • Ferron M.
      • Frattini A.
      • 别墅A.
      • 空气J.
      灰色致命突变在老鼠和人类中诱导严重的恶性常染色体隐性骨质术术术。
      )。在小鼠中,该基因的突变通过黑色细胞的颜料颗粒(黑色素)的“结块”引起涂层颜色的缺陷(
      • 格雷伯格H.
      灰色致命,在鼠标鼠中的一个新的突变..
      )缺陷的骨质体成熟引起的骨吸收中的缺陷(
      • Rajapurohitam V.
      • Chaloub N.
      • Benachenhou N.
      • neff l.
      • Baron R.
      • 空气J.
      小鼠骨质术灰度致死突变在破骨细胞成熟/功能中诱导缺陷。
      ), IE。 该蛋白质影响专业溶酶体的功能(用于评论,参见参考文献。
      • Stenbeck G.
      破骨骨杆菌中荷叶边边框的形成和功能..
      • Blott E.J.
      • Griffiths G.M.
      分泌溶酶体..
      )。对GL蛋白的溶酶体膜的定位和大量没有以前刻录的功能的蛋白质将有助于阐明其生物学作用。
      从该蛋白质组学调查中,显然溶酶体膜的蛋白质组成受到Golgi,ER和血浆膜组分的贡献的影响。突出显示这是在Golgi转移酶的整体膜分数中识别, 例如 Sialyltransferase 1(
      • 塔哈特·迪尔
      • 罗斯J.
      • Weinstein J.
      • 保尔森J.C.
      免疫电解显微镜检测到多肽表位纯化抗体检测大鼠肠唾液腺转移酶的大鼠肠道唾液酸糖酶的区域表达。
      )和其他糖基转移酶,其中一些已被证明具有较高的后GOLGI本地化(如有审查,请参阅参考文献。
      • Berger e.g.
      Golgi糖基转移酶的异位定位。
      )。同样,发现了一些丰富的ER蛋白, 例如 蛋白质 - 二硫化物异构酶,核磷蛋白1和细胞色素P450s,但有趣的是没有萼蛋白和血浆膜受体蛋白, 例如 发现了亚血糖糖蛋白受体和损伤的受体3。尽管将蛋白质和货物递送到溶酶体中的溶酶体和反式 - GOLGI网络是很好的,但自噬,螯合细胞质和细胞器进行降解的过程,也可以将蛋白质递送给溶酶体,其可能使用灯-2作为受体(
      • 田纳卡y.
      • Guhde G.
      • Suter A.
      • Eskelinen E.L.
      • 哈特曼D.
      • LULLMAN-RAUCH R.
      • 詹森下午
      • Blanz J.
      • von figura k。
      • Saftig P.
      灯-2缺陷小鼠中自噬液泡和心肌病的积累。
      )。许多丰富的ER和细胞溶质蛋白,如GRP78,蛋白二硫化物异构酶,细胞色素P450和甜菜碱 - 同型半胱氨酸 S - 已发现甲基转移酶与自噬液泡有关(
      • Ueno T.
      • Ishidoh K.
      • MINEKI R.
      • Tanida I.
      • Murayama K.
      • kadowaki m.
      • kominamie。
      自高糖膜相关甜菜碱同型甲基转移酶。螯合细胞溶质酶监测自噬的有限降解片段..
      ,
      • stromhaug p.e.
      • Berg T.O.
      • Fengsrud M.
      • Seglen P.O.
      大鼠肝细胞自噬蛋白的纯化和表征。
      ,
      • Ueno T.
      • Muno D.
      • kominamie。
      保存在从Leupeptin-施用的大鼠肝脏分离的自噬阳性膜中保存的内质网的膜标记。
      )。
      总之,溶酶体传统上被认为是内吞径的终点,并且具有针对其腔含量的主要非特异性降解能力。通过我们的溶酶体蛋白质组学策略似乎显然,膜是一种非常多样化的结构,可从各种亚细胞来源和途径接受膜和蛋白质贡献。通过脉络膜贩运和细胞内膜动力学,溶酶体膜的高度多样性是表示高度复杂的细胞器。溶酶体膜中的各种蛋白质可以组织成与目前为先前内体隔室设想的结构域结构(
      • Pfeffer S.
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      Rab9介导的囊泡囊泡转运到活细胞中的反式胶质粒子
      )。由于我们在溶酶体膜中鉴定了几种不同的兔子,因此仍然确定这些RAB蛋白中的每一个是否参与溶酶体膜中的另外的蛋白质组和不同结构域。

      致谢

      我们感谢斯蒂芬帕斯特纳克,迈克尔罗皮克和孙张力讨论和技术援助。

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