人免疫球蛋白G3(IgG3)的铰链区O-糖基化酶[S]

  • Rosina Plomp.
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    北林登大学医学中心,雷恩,荷兰雷明大学医学中心中心
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  • 吉莉安德克斯
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    阿姆斯特丹大学实验性免疫树病学,阿姆斯特丹,荷兰
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  • yoann rombouts.
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    北林登大学医学中心,雷恩,荷兰雷明大学医学中心中心

    莱顿,莱顿,荷兰莱顿大学医学中心风湿病系
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  • Remco visser.
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    阿姆斯特丹大学实验性免疫树病学,阿姆斯特丹,荷兰
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  • 卡罗丽恩上午Koeleman.
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    北林登大学医学中心,雷恩,荷兰雷明大学医学中心中心
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  • Guinevere S.M. Kammeijer.
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    北林登大学医学中心,雷恩,荷兰雷明大学医学中心中心
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  • BAS C. Jansen.
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    北林登大学医学中心,雷恩,荷兰雷明大学医学中心中心
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  • Theo Rispens.
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    荷兰阿姆斯特丹大学学术医疗中心,阿姆斯特丹大学学术医疗中心免疫病理学系
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  • 保罗J. Hensbergen.
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  • Gestur Vidarsson.
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    阿姆斯特丹大学实验性免疫树病学,阿姆斯特丹,荷兰
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  • 曼弗雷德武力
    一致
    应该解决对应的通信
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    北林登大学医学中心,雷恩,荷兰雷明大学医学中心中心

    生物分析化学,Vu University Amsterdam,阿姆斯特丹,荷兰
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了欧洲联盟(第七框架计划Highglycan Project,Grant Number 278535)的支持。
    1所用的缩写是:AbcOMMONIUM双碳癌癌组分1 QCeCapillary电泳诱导的重链ChidColision诱导的解离梗死抗原结合FCFragmentCrystallizableFCγRFC-Gamma-Gamma eCtercregdob1chimerceryMN12H2抗体,来自人单克隆IgG2抗体Dob1hekhuman胚胎肾上腺肾上腺肾上腺素肾上腺素肾上腺素N-CetylhexosamineiggimmunoglobulinγtrapniationTrapneuac.N - 乙酰甘氨酸酸-TITPTRANEIENTISTOHINTSISTNOTHOPHOHEOLENTNPtrinItrophenol。
    [S]本文含有补充材料表S1-S7和FGS。 S1-S5。
      免疫球蛋白G(IgG)是人血清中存在的最丰富的蛋白质之一和免疫系统的基本组分。 IgG3代表人血清中IgG总量的〜8%,由于其细长的铰链区和增强的效应器功能,从另一个IgG亚类中脱颖而出。该研究报告了在蛋白水解消解后用纳米-ESI-IT-MS(/ MS)分析观察到IgG3铰链区域的部分O-糖基化。发现IgG3铰链内的重复区域是在三重重复基序中的苏氨酸中的o-糖基化部分。在各种IgG3样品中检测到非,单可以和脱脂的核心1型O-聚糖,两种IgG3样品,两种聚烯烃和单克隆。具有电子转移解离碎片和CE-MS / MS的Nanolc-ESI-IT-MS / MS用于确定IgG3 O-糖基化的位点。通过重组产生的突变体IgG3进一步证实O-糖基化位点,其中潜在的O-糖基化位点被淘汰。
      对于来自六个供体的IgG3样品,我们发现了类似的O-聚糖结构和位点占用,而对于相同的样品,FC CH2结构域的保守N-糖基化显示出相当大的接合变异。发现三种O-糖基化位点中的每一个的占据率在六个血清衍生的IgG3样品中为〜10%,两种单克隆IgG3配方~13%。
      免疫球蛋白G(IgG)是人血清中存在的最丰富的蛋白质之一,并且占总血清免疫球蛋白含量的约四分之三(
      • 弯腰J.W.
      • Zegers B.J.
      • 桑德勒P.C.
      • Ballieux R.E.
      健康儿童和成人血清免疫球蛋白水平。
      )。作为体液免疫的主要介质和适应性和先天免疫系统之间的重要联系,IgG是免疫系统的基本组分。 IgG由两种重链和浅色链组成,由二硫键连接。蛋白质可以细分为抗原结合(Fab)和受体结合(Fc)区域。 IgG有四个亚类,所有这些亚类共享整体结构同源性,但它们的氨基酸序列略有不同;人血清亚类的数量如下:IgG1> 2 > 3 > 4 (
      • 莫尔州
      • terry w.d.
      • Waldmann T.A.
      人类IgG亚类的代谢特性。
      )。
      IgG.3表示人血清中IgG总量的〜8%(
      • 莫尔州
      • terry w.d.
      • Waldmann T.A.
      人类IgG亚类的代谢特性。
      ),出于多种原因,从其他IGG子类中脱颖而出。首先,IgG3包含一个细长的铰链区域,其直到三重重复序列(根据同组型,从一到三个范围内的实际数字(
      • Vidarsson G.
      • DEKKERS G.
      • RISPENS T.
      IGG子类和同型:从结构到效应功能。
      )))负责FAB和FC部分之间的灵活性增加,以及两个FAB臂之间的更宽且更柔性的角度(
      • roux k.h.
      • Strelets L.
      • michaelsen t.e.
      人IgG子类的灵活性。
      ,
      • Dangl J.L.
      • WENSELT.G.
      • 莫里森S.L.
      • stryer l.
      • Herzenberg L.A.
      • oi v.t.
      基因工程嵌合人,兔和小鼠抗体的分段灵活性和补体固定。
      )。与其他亚类相比,这种灵活性可能导致IgG3与其他亚类相比增加的IgG3与某些类型的抗原的二价(
      • roux k.h.
      • Strelets L.
      • michaelsen t.e.
      人IgG子类的灵活性。
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      • Scharf O.
      • 镀金H.
      • 王L.R.
      • eller n ..
      • Frazier D.
      • 抛光B.
      • 斯科特D.E.
      来自多克隆人免疫缺陷病毒(HIV)免疫球蛋白的免疫球蛋白G3比中和HIV型1的其他亚类更有效。
      ,
      • Cavacini L.A.
      • emes c.l.
      • 动力J.
      • desharnais f.d.
      • 杜瓦尔M.
      • Montefiori D.
      • Posner M.R.
      重链恒定区对人单克隆抗体抗原结合和HIV-1中和的影响。
      )。其次,IgG3对C1Q具有更高的亲和力,该C1Q发起了经典补体途径(
      • Dangl J.L.
      • WENSELT.G.
      • 莫里森S.L.
      • stryer l.
      • Herzenberg L.A.
      • oi v.t.
      基因工程嵌合人,兔和小鼠抗体的分段灵活性和补体固定。
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      • 红路S.
      • Michaelsen T.
      • Sandlie I.
      • 克拉克M.R.
      对人体白细胞抗原CD52的人IgG1和人IgG3抗体的补体激活。
      )。 IgG3和C1Q之间的相互作用不是由于细长的铰链区域,如通过研究表明具有IgG1或IgG4样铰链序列的重组IgG3表现出对C1Q的更大结合亲和力而不是野生型IgG3(
      • 红路S.
      • Michaelsen T.
      • Sandlie I.
      • 克拉克M.R.
      对人体白细胞抗原CD52的人IgG1和人IgG3抗体的补体激活。
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      • nordhaug l.
      • BREKKE O.H.
      • 郑重B.
      • 桑廷R.
      • Aase A.
      • michaelsen t.e.
      • Sandlie I.
      嵌合小鼠人IgG3抗体,具有IgG4样铰链区的抗体比具有正常铰链的IgG3更有效地诱导补蛋白介导的溶解。
      ,
      • Natsume A.
      • 在M.
      • Takamura H.
      • Nakagawa T.
      • Shimizu Y.
      • Kitajima K.
      • Wakitani M.
      • OHTA S.
      • 砂浆M.
      • Shitara K.
      • Niwa R.
      IgG.1 / IgG3混合同种型的工程化抗体,具有增强的细胞毒性活性。
      )。第三,IgG3对FCγ受体(FCγRS)具有更高的总体亲和力,通过它可以影响先天免疫系统的效应细胞(
      • Hogarth下午
      • Pietersz G.A.
      FC.受体靶向治疗炎症,癌症及以后。
      )。 IgG3的CH2结构域和铰链区域被显示为仪器结合高亲和力FcγRI受体(
      • 坎菲尔菲尔德S.M.
      • 莫里森S.L.
      人 - IgG对其高亲和力Fc受体的结合亲和力由CH2结构域中的多个氨基酸测定并由铰链区调节。
      )。最后,与其他IGG子类相比,IgG3通常具有较短的半衰期(1 相对 3 weeks) (
      • 莫尔州
      • terry w.d.
      • Waldmann T.A.
      人类IgG亚类的代谢特性。
      )。将该差异追溯到H435R突变,其在生理pH下赋予正电荷,导致对新生儿Fc受体(FCRN)的结合降低,这参与靶向溶酶体降解的IgG(
      • Stapleton n.m.
      • 安德森J.T.
      • 令人遗憾的是
      • bjarnarson s.p.
      • verheul r.c..
      • Gerritsen J.
      • 赵玉。
      • Kleijer M.
      • Sandlie I.
      • de haas m.
      • Jonsdottir I.
      • van der schoot c.e.
      • Vidarsson G.
      FCRN介导的运输竞争导致人IgG3的半衰期,并提供治疗潜力。
      )。低效率的FCRN介导的运输也会导致粘膜组织中IgG3水平降低,并在胎盘上受到IgG3的损伤(
      • Einarsdottir H.
      • 姬y。
      • visser r.
      • 莫C.
      • Scherjon S.
      • van der schoot c.e.
      • Vidarsson G.
      含H435的免疫球蛋白G3同质型在人胎盘上有效地运输:对新生儿的异丙化体介导的疾病的影响。
      )。由于已经描述了大量IGG3同样型,这些属性对所有类型的IgG3都不保持了真实,其中一些缺少H435R替换并具有与IgG1类似的半衰期和胎盘传输速率(
      • Stapleton n.m.
      • 安德森J.T.
      • 令人遗憾的是
      • bjarnarson s.p.
      • verheul r.c..
      • Gerritsen J.
      • 赵玉。
      • Kleijer M.
      • Sandlie I.
      • de haas m.
      • Jonsdottir I.
      • van der schoot c.e.
      • Vidarsson G.
      FCRN介导的运输竞争导致人IgG3的半衰期,并提供治疗潜力。
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      • Einarsdottir H.
      • 姬y。
      • visser r.
      • 莫C.
      • Scherjon S.
      • van der schoot c.e.
      • Vidarsson G.
      含H435的免疫球蛋白G3同质型在人胎盘上有效地运输:对新生儿的异丙化体介导的疾病的影响。
      ,
      • Dard P.
      • Lefranc M.P.
      • Osipova L.
      • Sanchez-Mazas A.
      DNA序列的IGHG3等位基因与人群主要G3M单倍型相关的等位基因。
      ,
      • 杰弗里斯r.
      • Lefranc M.P.
      人免疫球蛋白同质型:可能对免疫原性的影响。
      )。 IgG3比其他IgG亚类更多态,如大量已知的同质型(
      • 杰弗里斯r.
      • Lefranc M.P.
      人免疫球蛋白同质型:可能对免疫原性的影响。
      )。大多数多态性位于CH2或CH3结构域中,但铰链区域的长度也可以显示出高度的变化。取决于序列的次数,铰链区可以在不同IgG3同质型之间的27至83个氨基酸残基之间变化(
      • Vidarsson G.
      • DEKKERS G.
      • RISPENS T.
      IGG子类和同型:从结构到效应功能。
      ,
      • 杰弗里斯r.
      • Lefranc M.P.
      人免疫球蛋白同质型:可能对免疫原性的影响。
      ,
      • Dard P.
      • 哈克斯。
      • Frippiat J.P.
      • 偏乐
      • Langaney A.
      • Lefranc M.P.
      • Sanchez-Mazas A.
      IGHG3基因显示了一种结构多态性,其特征在于不同的铰链长度:新的2外铰链基因的序列。
      )。
      一个 N - 链接复杂型甘草在所有IGG子类和同型的CH2结构域中积极保守并发现。本网站存在的甘草类型已被证明影响IgG的效应功能(
      • 安东尼下午
      • nimmerjahn f.
      差异IgG糖基化在体内FcγRs抗体相互作用中的作用。
      )。缺乏核心岩藻糖的N-聚糖导致IgG通过与FCγRIIIA和FCγRIIIB的更强的结合具有增强的促炎能力(
      • 安东尼下午
      • nimmerjahn f.
      差异IgG糖基化在体内FcγRs抗体相互作用中的作用。
      ,
      • 盾牌R.L.
      • 莱J.
      • Keck R.
      • O'Connell L.Y.
      • 洪克。
      • 孟Y.G.
      • Weikert S.H.
      • Presta L.G.
      人IgG1 N-连接的寡糖上缺乏岩藻糖,改善了对人FcγRIII和抗体依赖性细胞毒性的结合。
      ,
      • Kapur R.
      • Kustiawan I.
      • vestheim A.
      • Koeleman C.A.
      • visser r.
      • Einarsdottir H.K.
      • Porcelijn L.
      • 杰克逊D.
      • 金尔B.
      • 雷德德·芬
      • 空白D.
      • 滋养剂B.
      • Killie M.K.
      • michaelsen t.e.
      • de haas m.
      • RISPENS T.
      • van der schoot c.e.
      • Wuhrer M.
      • Vidarsson G.
      妊娠期血小板含有血小板的IgG1-FC岩氧化酶突出突出。
      )。相反,携带唾液酸化的N-聚糖的IgG表现出抗炎特性,可能由于增加了C型凝集素的结合亲和力和/或减少与FCγR的结合(
      • 安东尼下午
      • nimmerjahn f.
      差异IgG糖基化在体内FcγRs抗体相互作用中的作用。
      ,
      • Kaneko Y.
      • nimmerjahn f.
      • Ravetch J.v.
      FC.唾液酸溶胶产生免疫球蛋白G的抗炎活性。
      ,
      • karsten c.m.
      • Pandey M.K.
      • PIGGE J.
      • Kilchenstein R.
      • 泰勒P.R.
      • 罗斯米
      • 麦当劳J.U.
      • ORR S.J.
      • Berger M.
      • Petzold D.
      • Blanchard V.
      • Winkler A.
      • HESS C.
      • 里德下午
      • Majoul i.v.
      • 海峡R.T.
      • 哈里斯N.L.
      • KöhlG.
      • Wex E.
      • Ludwig R.
      • Zillikens D.
      • nimmerjahn f.
      • Finkelman F.D.
      • 棕色G.D.
      • ehlers m.
      • KöhlJ.
      FC.半乳糖基化介导的IgG1的抗炎活性及Fcγγ〜γ[riib和dectin-1]介导的抗炎活性。
      )。
      据报道了各种免疫球蛋白的O-连接的糖基化。 o-聚糖存在于人IgA1和IgD和小鼠IgG2B的铰链区上(
      • 金H.
      • yamaguchi y。
      • Masuda K.
      • Matsunaga C.
      • Yamamoto K.
      • irimura t.
      • Takahashi N.
      • kato k。
      • Arata Y.
      小鼠免疫球蛋白G2B铰链区的O-糖基化。
      ,
      • Mattu T.S.
      • 请求r.j.
      • 威利斯A.c.
      • 克里安米
      • Wormald M.R.
      • lellouch a.c.
      • rudd下午
      • Woof J.M.
      • DWEK R.A.
      人血清IgA1,Fab和Fc区的糖基化和结构及N-糖基化对Fcα受体相互作用的作用。
      ,
      • Takahashi N.
      • Tetaert D.
      • 欺骗B.
      • 林L.C.
      • Putnam F.W.
      人免疫球蛋白Dδ重链的完整氨基酸序列。
      )。 IgA1含有铰链区域中的O-糖基化(丝氨酸和苏氨酸)的九个潜在位点,其中占据3-5,而IGD据报道携带四个和七种o-聚糖(
      • Mattu T.S.
      • 请求r.j.
      • 威利斯A.c.
      • 克里安米
      • Wormald M.R.
      • lellouch a.c.
      • rudd下午
      • Woof J.M.
      • DWEK R.A.
      人血清IgA1,Fab和Fc区的糖基化和结构及N-糖基化对Fcα受体相互作用的作用。
      ,
      • Takahashi N.
      • Tetaert D.
      • 欺骗B.
      • 林L.C.
      • Putnam F.W.
      人免疫球蛋白Dδ重链的完整氨基酸序列。
      ,
      • Takayasu T.
      • Suzuki S.
      • Kametani F.
      • Takahashi N.
      • Shinoda T.
      • okuyama t.
      • Munekata E.
      在人免疫球蛋白D的铰链区域中含半乳胺胺糖肽的氨基酸序列。
      )。观察到鼠IgG2B铰链中的O-糖基化以防止蛋白水解消化(
      • 金H.
      • yamaguchi y。
      • Masuda K.
      • Matsunaga C.
      • Yamamoto K.
      • irimura t.
      • Takahashi N.
      • kato k。
      • Arata Y.
      小鼠免疫球蛋白G2B铰链区的O-糖基化。
      )。同样,发现IgA1更容易受到降解的影响 链球菌 神经氨酸酶治疗后的蛋白酶(
      • reinholdt j.
      • Tomana M.
      • Mortensen S.B.
      • 克里安米
      免疫球蛋白A1通过口服链球菌降解的分子方面。
      )。
      在这项研究中,我们报告了人IgG3铰链的部分O-糖基化。我们从各种来源获得多元和单克隆IgG3,并用胰蛋白酶或蛋白酶K进行蛋白水解消化。纳米反相(RP)-ESI离子捕集器(IT)-MS / MS用于检查所得(Glyco)肽,揭示IgG3铰链区内多个位点上的核心1型O-聚糖。

      实验步骤

       免疫球蛋白来源

       来自供体血清的多克隆IgG3

      从六个血清样品纯化IgG3(平均供体年龄:44.5±9岁;三个男性和三名女性;详情列于 补充表S1)。血清样本从健康捐助者收集,符合制度道德委员会的知情同意。将静脉血液收集在9ml吸尘器血清凝块活化剂管(GRENER BIONE,Kremsminster,奥地利)中,并在室温下孵育30分钟,然后在1800克中以离心15分钟。然后收集血清级分并在-20℃下储存。通过在HITRAP蛋白G HP柱(GE Healthcare,Buckinghamshire,UK)上运行血清并用0.1洗脱而分离IgG m 甘氨酸-HCl,pH 2.7。然后将含有IgG含有的含有重组蛋白A(GE HealthCare)的HITAP Mabselect肯定柱,并使用AMICOL超15离心过滤装置10 KDA(Merck Millipore,Darmstadt,德国)使用幻灯片-A-Lizer透析盒,10K MWCO(Dionex / Thermo Scientific,Sunnyvale,CA),对PBS透析。

       来自汇集等离子体的多克隆IgG3

      从汇集等离子体纯化的IgG3从雅典研究和技术(雅典,GA)商购获得。在询问时,我们了解到,这种IgG3已被硫酸葡聚糖治疗,然后离心以沉淀脂质。然后将倒样的血浆进行硫酸铵沉淀,然后进行硼酸沉淀。用离子交换色谱分离IgG,通过亲和色谱(RPRETEIN A),凝胶过滤色谱和Jacalin柱进行IgG3的进一步纯化以除去次IgA污染物。该纯化方法没有将IgG3暴露于最高pH条件或55℃的温度。

       单克隆IgG3.

      两种单克隆重组抗GDOB1 IgG3同质型,G3M(G)和G3M,在HEK-293F自由式细胞系列(Life Technologies,Paisley,UK)中产生。然后用HITAP Mabselect肯定柱纯化IgG3M,用重组蛋白A(GE Healthcare)施用,而IgG3M(g)用蛋白G hITAP HP柱(GE Healthcare)纯化。

       单克隆IgG3突变体

      将三种IgG3 G3M(G)铰链突变体重组产生,与野生型IgG3 G3M(g)一起生产。如前所述,分别将小鼠IgG1抗-2,4,6-三硝基苯酚(TNP)Hapten抗体(TNP)Hapten抗体(TNP)Hapten抗体的可变区分别克隆到人IgG3和Kappa骨架上(
      • Kapur R.
      • Kustiawan I.
      • vestheim A.
      • Koeleman C.A.
      • visser r.
      • Einarsdottir H.K.
      • Porcelijn L.
      • 杰克逊D.
      • 金尔B.
      • 雷德德·芬
      • 空白D.
      • 滋养剂B.
      • Killie M.K.
      • michaelsen t.e.
      • de haas m.
      • RISPENS T.
      • van der schoot c.e.
      • Wuhrer M.
      • Vidarsson G.
      妊娠期血小板含有血小板的IgG1-FC岩氧化酶突出突出。
      ,
      • Kruijsen D.
      • Einarsdottir H.K.
      • Schijf M.A.
      • coenjaerts f.e.
      • van der schoot e.c.
      • Vidarsson G.
      • van bleek下午
      鼻内给予抗体结合的呼吸道合胞病毒颗粒有效地将病毒特异性的免疫反应中的小鼠进行了促进。
      )。编码用于IgG3突变体的合成DNA,用丙氨酸(A)代替三个苏氨酸(T)和/或丝氨酸,由Geneart(Invitrogen)产生5'-NHEI和3'BSU36I片段。在抗TNP IgG3重链中连接NHEI-BSU36I片段在野生型重链中替换相应的片段。在HEK-293F自由式细胞系表达系统(Invitrogen)中产生抗体,其与编码P21,P27和PSVLT基因的vectors(
      • vink t.
      • Oudshoorn-Dickmann M.
      • Roza M.
      • Reitsma J.J.
      • de Jong R.N.
      一种用于生产抗体的简单,鲁棒,高效的瞬态表达系统。
      )增加蛋白质的生产。使用Äktaprime加上系统(GE Healthcare)在蛋白G HITAP HP柱(GE Healthcare)上纯化抗体,过夜透析PBS。

       单克隆IgG3 / 4 Fc构建体

      在HEK-293F自由泳细胞系(Invitrogen)中产生四种重组IgG3和IgG4 Fc构建体,并用蛋白G柱(蛋白G Sepharose 4快速流动; GE Healthcare)纯化,如Rispens所描述的那样 等等。 (
      • RISPENS T.
      • 戴维斯上午
      • Ooijevaar-de Heer P.
      • Aspalah S.
      • 百德o.
      • 萨顿B.J.
      • Vidarsson G.
      • Aalberse R.C.
      动力学工厂臂交换研究人免疫球蛋白G(IgG)亚类中重链相互作用的动态。
      )。所有构建体含有IgG4铰链区域,以及两个IgG3同质型的CH2和CH3区域(G3M(B)-FC-H4和G3M(C3C5)-FC-H4)或两种IgG4变体的CH2和CH3区( IgG4-FC-V397M和IgG4-FC-V397M,K392N)。

       多克隆和单克隆IgG4

      收集几个IgG4样品。使用抗IgG4与琼脂糖(克隆MH164.4,Sanquin,Amsterdam,Netherlands)相反的抗IgG4,从类风湿性关节炎患者的血浆中亲和纯化多克隆IgG4样品。将第二IgG4样品富含来自莱顿大学医学中心的患者的血清,具有极高的IgG4血清滴度(14.4mg / ml)。血清被热灭活并进行33%硫酸铵沉淀,然后透析降低盐含量。然后使用Äktaprime加色谱系统(GE Healthcare)富含IgG4富含HITAP DEAE Sepharose和Superdex 200栏(GE Healthcare);使用ELISA鉴定含IgG4的级分并合并。用蛋白G柱纯化在HEK细胞中产生的单克隆抗TNP IgG4样品,并以与IgG3突变体所述相同的方式透析PBS。此外,我们以治疗性抗体NaTalizumab(Tysabri; Biogen Idec,Badehoevedorp,荷兰)的形式获得了重组人源化IgG4样品,其在鼠骨髓瘤细胞中产生。
      可以在重组样品的蛋白质序列中找到 补充表S2.

       SDS-PAGE分析和蛋白水解消解

      用2-β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,Mo)在95℃下减少5μg的IgG样品10分钟。然后将IgG在NUPAGE 4-12%BIS-TRIS SDS-PAGE凝胶(Invitrogen)上进行,并用Coomassie G-250染色(简称Safestain,Invitrogen)。频段被切除,切成碎片,用25米洗净m 碳酸氢铵(ABC

      使用的缩写是:

      ABC
      碳酸氢铵
      C1q
      补码组件1 q
      ce
      毛细管电泳
      CH.
      保守重链
      c
      碰撞诱导的解离
      工厂
      片段抗原结合
      FC.
      片段结冰
      FCγR.
      FC.-gamma受体
      GDob1
      来自人单克隆IgG2抗体DOB1的嵌合MN12H2抗体v基因抗体
      he
      人类胚胎肾脏
      十六进制
      己糖
      赫奈克
      N - 乙酰己糖胺
      IgG.
      免疫球蛋白γ.
      离子陷阱
      NeuAc.
      N - 乙酰甘氨酸酸
      T-ITP.
      短暂的等呋喃疗法
      TNP.
      Trinitrophenol。
      ,西格玛 - 奥尔德里奇),并用乙腈(Biosolve,Valkenswaard,荷兰)脱水。然后通过加入50μl10m再次用还原剂处理IgG处理m DL.-dithiothreitol(dtt; sigma-aldrich)25米m ABC溶液在55℃下进行30分钟。随后通过添加乙腈脱水凝胶块。通过与50μl55米孵育来实现半胱氨酸残基的烷基化m 碘乙酰胺(Sigma-Aldrich)25米m ABC在黑暗中的溶液20分钟。然后用25米洗涤凝胶片m ABC和乙腈脱水。第二次重复洗涤和脱水,随后将样品完全干燥在离心真空浓缩仪(Eppendorf,汉堡,德国)中。
      对于蛋白水解消化进行,30μl25米m ABC含有胰蛋白酶(测序级修饰的胰蛋白酶,Promega,Madison,Wi),蛋白酶K(来自 三千克专辑; Sigma-Aldrich)或Chymotrypsin(从牛胰腺测序等级,Roche施用的科学,德国曼海姆,德国)加入干燥的凝胶块中。 IgG:胰蛋白酶1:20的酶(W / W)比例为1:3用于蛋白酶K和1:20用于Chymotrypsin。将样品保持在冰上1小时,以使酶进入凝胶片。如果凝胶块未完全浸没,则进一步10-20μl25米m 添加了ABC。将样品在37℃下孵育过夜。第二天早上收集了凝胶片周围的溶液。在添加另外20μl的25米之后m ABC,将凝胶片在37℃下孵育1小时。然后再次收集溶液并加入第一部分,并储存在-20℃。
      或者,在溶液中消化几种IgG3样品而不将烷基化消化:3μg的IgG3与0.3μg胰蛋白酶一起孵育,总体积为25μl25μmm ABC在37°C过夜。
      内皮蛋白酶ASPN(新英格兰Biolabs,Ipswich,MA)用于进一步消化胰蛋白酶产生的(Glyco)肽。通过加入1.5μLAspn和15μl2xAspn缓冲液(100μm)进行消化(100μlm Tris-HCl, 5 mm 硫酸锌,新英格兰Biolabs)至15μl胰蛋白酶消化的IgG3,并在37℃下孵育过夜。

       超糖糖苷酶消化

      在胰蛋白酶IgG糖肽上进行外糖苷酶消化。首先将胰蛋白酶消化的IgG3加热至95℃,5分钟以灭活胰蛋白酶。然后将样品在离心真空浓缩器(EPPendorf)中干燥,并通过加入16μlmilli-q纯化的水重悬,2μl50μm m 乙酸钠(pH5.5),1μl唾液酸酶(Glyko唾液酸酶A,Prozyme,Hayward,Ca)和1μl半乳糖苷酶(Glykoβ-半乳糖苷酶,prozyme)。将样品在37℃下孵育过夜。

       Nanolc-ESI-IT-MS(/ MS)分析

      用纳米载速率(Dionex / Thermo Scientific)的纳米载速率(RP) - 电气喷雾(ESI)-IOLERSPRAY(ESI)-IOLION(ESI)陷阱(ESI)捕集(IS)-MS-ins-ins-mors(/ ms)分析IgG3(GLYCO)肽(Dionex / Thermo Scientific)。 ESI-IT-MS(Bruker Daltonics,Bremen,德国)。普雷柱(适度的Pepmap C18毛细管柱,300μm×5mm,粒径5μm,Dionex / Thermo Scientific)用于洗涤和浓缩样品,并在适当的PEPMAP RSLC C18纳米柱上实现分离(75μmx 150 MM,粒径2μm,狄俄克斯/热科学),流速为500 nL / min。使用以下线性梯度,其中溶剂A在水中的0.1%甲酸组成,溶剂B为95%乙腈,5%水:T = 0分钟,1%溶剂B; t = 5分钟,1%b; t = 20分钟,25%b; t = 25分钟,70%b; t = 30分钟,70%b; t = 31分钟,1%b; T = 55分钟,1%B.使用裸熔融二氧化硅毛细管(内径为20μm),用ESI-NaNosprayer(4500V)以正离子模式电离。将溶剂在180℃下蒸发,氮流量为5升/分钟。将Captivespray Nanobooster(Bruker Daltonics)安装在质谱仪上,并用ACN饱和氮流量以增强灵敏度。设定了MS1离子检测窗口 m / z. 350-1400,以及MS2窗口 m / z. 140-2200。通过碰撞诱导的解离(CID),每个MS1光谱中的三个最高的尖峰自动分段。为了鉴定蛋白酶K-和胰蛋白酶产生的O-糖肽的肽序列,对手动选择的前体进行MS3分析:表示不含糖的肽的MS2峰值靶向碎片。在单独的LC-MS运行中,在选定的前体离子对电子转移解离碎片进行。

       T-ITP-CE-ESI-QTOF-MS(/ MS)分析

      在衍生自合并等离子体的胞粒唾液酸酯和半乳糖苷酶处理的IgG3样品上进行瞬时同胞术(ITP)-Capillary电泳(CE)-ESI-QTOF-MS / MS分析。在CESI 8000系统(AB SCIEX,Framingham,MA)上实现了分离,通过多孔护套连接到超高分辨率(UHR)-QTOF Maxis冲击MS系统(Bruker Daltonics)以正离子模式进行耦合。样品迁移超过90cm裸熔毛毛细管(I.D.30μm,O.D.150μm,AB Sciex)。使用10%乙酸溶液作为背景电解质和50米m 乙酸铵溶液作为前导电解质。施加20kV的电压,在1分钟内注射70ng。 MS1和MS2的离子检测窗口被设定为AT m / z. 50–2200.

       数据处理

      使用DataAnalysis 4.2软件(Bruker Daltonics)分析LC-MS(/ MS)数据。在该程序中,使用功能化合物 - 自动化(N)用于产生300种复合光谱(在其中产生的化合物产生的SUM光谱 m / z. 在色谱峰值宽度为0.5分钟的窗口0.5°的窗口),并且这些数据被解泛建并导出为吉祥物通用文件。使用吉祥物搜索算法(吉祥物守护进程2.2.2;矩阵科学,英国)进行蛋白质识别通过主要序列数据库搜索。使用以下吉祥物设置:分类: HOMO SAPIENS.;数据库:Swissprot;酶:胰蛋白酶(用于胰蛋白酶消化)/ NO酶(用于蛋白酶K消化)/胰凝乳蛋白酶(用于Chymotrypsin消化);固定修饰:氨基甲酰基(C);可变修改:氧化(m); Max错过了裂缝:1; MS1肽耐受性:0.3 da; MS / MS耐受性:0.3 da; #13c:0。
      手动筛选碎片光谱,用于普通的氧化氧鎓碎片离子,其是糖肽碎片的特征: m / z. 366.14, [1 HexNAc (N - - 乙酰己糖胺)+ 1六角(己糖)+ H]+; m / z. 292.10, [1 NeuAc (N - 乙酰呋喃酸)+ H]+; m / z. 274.09, [1 NeuAc - H2o + h]+; m / z. 657.23,[1 hexnac + 1 hex + 1 neuac + h]+。从O-糖肽的MS / MS光谱,可以推导出甘草的组成和肽部分的质量。使用expasy findpept软件工具使用这种肽质量来产生匹配的IgG肽序列(http://www.expasy.org/tools/findpept.html)。然后使用肽部分的MS3光谱通过将光谱中的峰与预期的B和Y离子进行比较来确认肽序列,根据蛋白质探测器MS-产品工具(http://prospector.ucsf.edu/prospector/cgi-bin/msform.cgi?form=msproduct)。
      通过将LC-MS光谱在0.5分钟的固定时间窗口周围围绕每个(Glyco)肽的0.5分钟的固定时间窗口,然后求出背景矫正强度,通过对胰蛋白IgG3肽SCDTPPCPR的相对定量进行。每个O-糖肽的前3个同位素峰。如果化合物存在于多个电荷状态中,则总结不同电荷状态的背景校正峰值强度,然后使数据归一化,使总量为100%。将一个单独的校正因子施加到每个糖肽以校正的事实上,较高质量化合物具有在前3个同位素峰中存在的信号强度的较低百分比。首先,使用Idcalc版本0.3(华盛顿大学)计算每个同位素峰中存在信号强度的百分比。校正因子由肽的前三个同位素峰存在的信号强度的百分比除以O-糖肽的前三个同位素峰存在的信号强度的百分比。
      为了获得更准确的测定胰蛋白酶IgG3肽SCDTPPCPR的寡糖占用百分比,使用唾液酸酯和半乳糖苷酶处理的胰蛋白酶消化样品的LC-MS分析进行相对定量。肽和肽+六酸之间的比例以与上述相同的方式测定。
      使用SELMAN报告的调整方法进行IGG3的N-糖基化的相对定量 等等。 (
      • Selman M.H.
      • Derks R.J.
      • 邦德A.
      • Palmblad M.
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      • Dolhain R.J.
      • 雷德德·芬
      • Wuhrer M.
      FC特异性IgG糖基化通过使用护套流动ESI喷雾器接口的鲁棒纳米反相HPLC-MS分析。
      )。使用新型内部工具进行靶向对齐,其根据校准物的列表对准Nanolc-ESI-IT-MS光谱 m / z. 和保留时间值。各种IgG3 N-糖肽用作校准剂。该算法检查了 m / z. 在每个校准物周围的给定时间窗口中的区域,并隔离本地最大值。然后将观察到这些最大值和所需保留时间的保留时间作为第二程度多项式拟合的输入阵列,返回用于改变整个光谱的观察到的保留时间的功能,从而得到良好的对准光谱。内部工具3D Max Extractor用于提取特定信号的信号强度 m / z. 视窗。该程序检查了所有数据点 m / z. - 给定分析物周围的时间空间,并报告每个分析物观察到的最大强度。从光谱和总结确定属于具有2+,3+或4+的电荷状态的IgG2 / 3糖肽的前三个同位素峰的矫正强度。通过除以所有糖肽值的总和强度来归一化糖肽值。如果它们在至少32%的样品中表现出超过3的信噪比,则包括糖脓性肽。含有N-糖基化位点的胰蛋白酶肽在IgG3和IgG2中具有相同的质量,因此通过该方法,我们不能区分IgG3和IgG2糖肽。

       结果

       IgG.3的O-糖基化

      获得各种类型的IgG3样品:从六个供体血清纯化的多克隆IgG3样品(44.5±9岁,三名男性+三名女性(细节 补充表S1));从合并的等离子体纯化多克隆IgG3;和在人胚胎肾(HEK)细胞中产生的两种重组单克隆抗GDOB1 IgG3同质型(G3M(G)和G3M)。通过SDS-PAGE分析这些样品在还原条件下,随后Coomassie染色显示在〜60kDa上的上带,对应于IgG3的重链和〜30kDa的下频带,对应于Kappa和Lambda轻链(补充图。S1)。 IgG3M样品表现出略低的质量,这是预期的,因为该IgG3偶型缺乏其中一个铰链重复基序。单个供体样品明显不如其他IgG3样品纯度纯度,这可能是由于样品制备的差异。切除条带,使用DTT进行蛋白质,然后用​​半胱氨酸残基烷基化,随后用胰蛋白酶或蛋白酶K烷基消化。然后通过纳米-RP-ESI-IT-MS(/ MS)分析样品。产生的数据进行自动序列数据库搜索蛋白质识别(补充表S3)。确认〜60kDa的所有带含有IgG3重链,而25-30kDa的下带含有κ轻链(在单克隆样品中)或Kappa和λ轻链(在多克隆样品中)。在单个供体样品中可见的〜52kDa下的较低带(补充图。S1通过检查亚类特异性肽(数据未显示)确定,发现主要含有IgG1,2和3的IgG1,2和3。
      通过搜索Oxonium碎片离子的LC-MS / MS碎片光谱来检测O-糖肽,其是糖肽碎片的特征: m / z. 366.14 [六克+六角+ h]+; m / z. 292.10 [NeuAc + H]+; m / z. 274.09 [NeuAc - H2o + h]+;和 m / z. 657.23 [河内+六角+ Neuac + H]+。在所有IgG3样品的胰蛋白酶和蛋白酶K消化中鉴定了三种类型的O-聚糖:[1六克纳克+ 1六角],[1六克纳克+ 1六六角+ 1 NeuAc],[1六克纳克+ 1 Hex + 2 Neuac] 。描绘了胰蛋白酶糖肽的碎片光谱 Fig. 1.
      图缩略图GR1.
      Fig. 1Nanolc-ESI-IT-CID光谱显示各种胰蛋白酶产生的重组IgG3M(G)O-糖肽的碎片化。 非,单 - 和脱脂核心1型O-聚糖(A-C.用肽SCDTPPCPR和含有纯酸化的O-Glycan被看见 N-Cetyllactosamine(N - 乙酰甘氨酸胺+半乳糖)(D)。这些结构部分地基于文献,因为难以区分不同类型的ePEXOSE和 N - 具有质谱法的乙酰己酯。 Tripy充电的峰顶 m / z. 895.48在面板D中具有比前体质量更高的质量,因此可能来自污染物。显示每个碎片频谱的MS1前体峰值。 Pep = peptide;黄色方形= N - 乙酰甘乳酰胺,黄色圆圈=半乳糖;蓝色方形= N - 乙酰葡糖胺;紫色钻石= N - 乙酰甘氨酸。
      虽然质谱不显示单糖的确切同一性,但通过唾液酸酶和半乳糖苷酶消化这些糖肽的导致寡糖的整理(补充图S2),从而确认存在α2连接的存在 N - 乙酰呋喃酸和β1连接的半乳​​糖。基于文学,我们预计肝脏附着在肽上是一个 N - 乙酰甘乳酰胺(
      • tarp m.a.
      • 克劳森H.
      粘蛋白型O-糖基化及其在药物和疫苗发育中的潜在用途。
      )。因此,所遇到的聚糖结构可能是非,单体和脱脂的核心1型O-聚糖。仅在单克隆重组IgG3样品中观察到次要分数但不同的第四种类型的O-Glycan:[2 hexnac + 2 hex + 2 Neuac](Fig. 1D)。峰值在1313.541+ 在MS / MS光谱中,对应于完整的O-聚糖B-离子(Glycan碎片的命名法由Domon和Costello描述(
      • Domon B.
      • Costello C.E.
      糖缀合物Fab-MS MS光谱中的碳水化合物片段化的系统术语。
      )),表明可以是核心1或芯2型的六血糖O-聚糖。全面概述了 m / z. 可以在MS1和对应于O-糖肽的MS2光谱中的值 补充表S4.

       IgG.3 O-糖基化位点的定位

      通过MS 3肽的MS3碎片鉴定胰蛋白酶和蛋白酶K-产生的O-糖肽的氨基酸序列。在胰蛋白酶消化中,还可以看到相同的肽而没有附着的聚糖,证明o-糖基化位点仅部分占据。肽序列可以追溯到IgG3铰链区内的三重重复序列(Fig. 2)。该区域含有六种潜在的O-糖基化位点:三个苏氨酸残基和三种丝氨酸残基。传统的IgG3欧盟符号(
      • 伊德曼上午
      • Cunningham B.A.
      • 胆量。
      • Gottlieb P.D.
      • rutishauser u.
      • Waxdal M.J.
      整个γG免疫球蛋白分子的共价结构。
      )基于所有IgG亚类之间的同源性,不覆盖三重重复序列,因此引入替代符号方法以在IgG3铰链区域内称为氨基酸残基。 IgG3铰链覆盖四个外显子,其最后三个用于相同氨基酸序列的编码(分配IgG3M形成异常,因为它只有两次重复)。铰链区域内的氨基酸的位置将被指定为“HX-Y”,其具有“X”的外显子数(1/2/4)和外显子内的氨基酸数(
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      )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2IgG.3的示意性概述,由两条重链(如暗灰色,一个变量和三个保守域)和两个轻链(浅灰色,一个变量和一个保守域)组成。 黑条代表中间链硫化物键。在结构域CH 2中存在N-糖基化位点。每个IgG3重链含有三个铰链重复序列,其中两个或三个部分占用的O-糖基化位点。示出了主要胰蛋白酶和蛋白酶K-产生的O-糖肽的肽序列。
      蛋白酶K-生成的糖肽 H4–6DTPPPCPRCPEL.234 demonstrates that TH4–7 被占领,而占用 H2/3–6dtpppcprocpepk.H3/4–3 展示了tH2–7 or TH3–7 或两者也被占用。然而,蛋白酶K消化并不允许我们确认或反应,因为含有丝氨酸残留物的所有O-糖肽也含有苏氨酸残基的所有O-糖肽也占用。
      因此,我们试图使用内蛋白酶aspn,以进一步消化从“SCDTPPPCPR”到“SC”和“DTPPPCPR”的衍生自单克隆IgG3的胰蛋白酶产生的胰蛋白酶生成的O-糖肽。然而,虽然大部分核化胰蛋白酶铰链重复肽通过ASPN切割,但具有相同肽序列的O-糖肽残留未消化。在用唾液酸酶和半乳糖苷酶处理胰蛋白酶和半乳糖苷酶后,将O-Glycopepty肽耐受ASPN消化耐受抗胰岛素消化。将大部分O-聚糖缩小到单个 N - 乙酰己糖胺(数据未显示)。
      为了获得关于IgG3铰链区域内O-聚糖的位置的进一步证据,我们对IgG3M的唾液酸酯和半乳糖苷酶处理的胰蛋白酶摘要进行电子转移解离,对纳米-ESI-IT-MS / MS分析进行了分析(S. )。在得到的质谱中可以观察到具有甘油部分的肽骨干碎片,并且可以在得到的质谱中观察到,这似乎与占苏氨酸残基的占用(Fig. 3A)。具有CID碎片的Nanolc-ESI-IT-MS / MS还揭示了似乎显示肽骨干碎片与聚糖保留的信号,但信号强度太低为明确(数据未示出)。通过使用更敏感的技术T-ITP-CE-ESI-QTOF-MS / MS具有CID碎片,分析衍生自合并等离子体的唾液酸酶和半乳糖苷酶处理的胰蛋白酶消化IgG3(图。 3.B3C),我们能够观察与肽骨干碎片有关的次要峰(Y7和Y8)而无需聚糖损失,表明占苏氨酸残留物的占用。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3(A)Nanolc-ESI-IT-MS / MS,具有电子转移解离破碎的重组IgG3M的唾液酸酯和半乳糖苷酶处理的胰蛋白酶糖肽的胰蛋白酶。肽骨干碎片(C-和Z-离子)和损失 N - 乙酰己糖胺(己酸)或半胱氨酸侧链(C)被观察到。 (公元前)CE-ESI-射线型CID分析是对衍生自合并等离子体的IgG3的唾液酸酶和半乳糖苷酶处理的胰蛋白酶分析,并显示碎片光谱(B)无人居住的胰蛋白酶铰链肽SCDTPPPCPR和(C)具有单一的同一肽的O-糖基化版本 N - 附着的 - 乙酰甘油酰胺。 B-和Y离子是注释。 MS1前体峰值显示在右侧。双重充电的峰值 m / z. 面板C中的694.327可能是一种共存化合物,其出现在光谱中,因为它存在于前体内 m / z. 窗口,达到峰值 m / z. 694.321在损失水后是相同的化合物。半胱氨酸残基已加下来表示碳氮化甲基化。
      为了进一步确定O-Glycan仅在苏氨酸残余物上存在,产生几种重组抗TNP IgG3M(g)蛋白,其中三种丝氨酸,三个苏氨酸或铰链中的所有六个潜在的O-糖基化位点重复区域被丙氨酸取代,以及野生型IgG3M(g)作为对照(蛋白质序列列入 补充表S2)。正如预期的那样,用胰蛋白酶或蛋白酶K消化野生型IgG3的LC-MS / MS分析,揭示了铰链区的O-糖基化,而在IgG3上观察到O-糖基化,其中所有六个潜在的O-糖基化网站已被丙氨酸取代。仅缺乏铰链区丝氨酸的IgG3含有在野生型IgG3中看到的相同的O-聚糖。在铰链重复中缺乏苏氨酸的IgG3中没有发现O-糖肽,同时表明IgG3铰链区内的O-聚糖仅在苏氨酸残留物上并且不含丝氨酸(补充图S3)。

       IgG.3 O-和N-糖基化的相对定量

      使用胰蛋白酶消化的IgG3的LC-MS数据进行O-糖基化的相对定量。附着于肽SCDTPPPCPR的不同聚糖的丰度被标准化为所有糖肽的总量(Fig. 4A)。当O-糖肽值在O-糖肽和未占用的肽的总和上归一化时,我们发现以下O-糖肽丰度:来自合并等离子体的IgG3的3.3%(标准偏差±0.6); 21.9%(±2.9)用于重组IgG3M(g),具有三个铰链重复; 18.5%(±1.8)用于两个铰链重复的IgG3m; 11.6%(±1.9)平均单助给者衍生的IgG3(补充表S5)。我们观察到IgG3-Hinge衍生的O-甘油肽的信号的比例轻微波动 相对 未占用的肽,这导致较大的技术变异,而不是我们仅在糖肽上正常化时。众所周知,与相应的核化肽相比,大型聚糖部分可能导致糖肽的相当降低的电离(
      • Stavenhagen K.
      • Hinneburg H.
      • Thaysen-Andersen M.
      • Hartmann L.
      • varónsilva d.
      • 福克斯J.
      • 卡斯达尔S.
      • RAPP E.
      • Seeberger P.H.
      • Kolarich D.
      糖蛋白微均质性和宏观异质性的定量映射:使用合成肽和糖肽的质谱信号强度评价。
      ),使得难以比较肽和糖肽信号强度。因此,为了获得可靠的相对定量数据,用外糖苷酶处理胰蛋白酶IgG3 O-糖肽,其应将所有O-聚糖压缩到单个 N - 乙酰甘乳酰胺,除了可能含有的次次六糖糖甘油膜 N - 乙酰葡糖胺。我们观察到低强度信号 m / z. 877.85似乎是这种六糖族聚糖的超糖酶消化产物,其中包含2个六六糖和1六个六六六六六六六六六六六六六烷基酶,表明聚糖可能是核心1型。超糖酶处理的胰蛋白酶处理的胰蛋白酶IgG3(O-Glyco)肽的LC-MS分析表明,衍生自六种供体中的每一个的IgG3内的o-糖基化位点的〜10%载有O-聚糖(Fig. 4B),并且间差异似乎相对较小。单克隆IgG3表现出略高的O-糖基化程度,占据〜12-14%的位点。源自汇集血浆的IgG3显示出较低水平的O-糖基化(5%),以及明显较低的溶性O-聚糖[1六克纳克+ 1六六六六+ 2 NeuAc],同时显示出单旋装型的水平增加-glycans与其他IgG3样品相比(Fig. 4A)。计算数量后 N - 乙酰甘氨酸每o-聚糖(Fig. 4C),源自汇集等离子体的IgG3的偏差变得更加明显。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4(A基于各种IgG3样品的纳米-ESI-IT-MS分析来自各种IgG3样品的纳米蛋白酶蛋白酶分析的IgG3 O-糖基化的相对定量(来自合并等离子体的IgG3,两种单克隆IgG3同种型和IgG3纯化于六种供体(D1-6))。信号强度在所有铰链衍生的O-糖肽的总和上标准化。相对丰度和技术变异是基于四种不同的胰蛋白酶消化的LC-MS分析,每种都测量两次。预期糖肽NHS的值预计显着低于实际值,因为在所有样品中具有双电荷的铰链肽重叠的三次带电的化合物,仅留下了双电荷的峰值以进行相对量化。 (B)估计O-糖基化的总百分比衍生自试验酶的胰蛋白酶(Glyco)肽的相对定量,将所有O-聚糖缩小到单一的六烷基醛。平均值和标准偏差基于同一样本的两个LC-MS分析。 (C) 的数量 N - 来自所列的相同的​​O-糖肽数据计算/每种O-聚糖的乙酰氨酰氨基丙氨酸A)。提供了全面的值列表 .
      在所有IgG3样品中,观察到铰链肽SCDTPPPCPR的改性版本,质量增加+ 42.04Da,其可以由乙酰化组成。在尼替糖基化和糖基化肽上观察到该修饰,并且不管附着的O-聚糖的类型或IgG3样品源的类型,发现改性肽的百分比稳定。 LC-ESI-IT-MS / MS光谱表明,改性似乎存在于N-末端丝氨酸或半胱氨酸残基上。当在没有还原烷基化的情况下在溶液中消化IgG3时(未示出的数据),在所得二硫桥连接的铰链二聚体上未观察到修饰,表明改性是样品处理的伪像。此外,具有与丙烯酰胺加合物的铰链肽对应的肿块的峰(m / z. 600.75(2+))或氧化二硫桥(m / z. 还可以看到535.70(2+)),但由于它们的信号强度分别仅为主要肽峰的信号强度约为5%或小于2%,因此我们不希望这些修改显着影响我们的结果关于糖肽量化。
      因为O-糖基化的类型和量在衍生自不同单一供体的IgG3中出现类似的,因此我们还在N297的位置研究了Fc N-糖基化的间接差异。使用单一供体IgG3的胰蛋白酶消化来完成Fc N-糖基化的相对定量(补充图S4补充表S6)。在这些供体的IgG2 / 3 n-糖基化之间观察到微细差异,最明显的半乳糖基化程度。
      溶液内胰蛋白酶消化IgG3无需还原烷基化产生通过两个链间二硫桥夹在一起的铰链重复肽的二聚体。在所有IgG3样品中观察到单糖基化二聚体。在单克隆IgG3样品中,在非常低的丰度(〜1.0%(g))和0.4%(g3m)的o-glycopeptips +肽的总共(g3m))中观察到附着两个脱脂糖苷的二聚体)(补充表S7);在多克隆IgG3样品中,我们没有观察到二糖基化二聚体,这可能是由于这些样品比单克隆样品更少,因此在LC-MS中具有更高的背景。

       使用IgG4铰链的Fc构建体的O-糖基化

      在HEK细胞中产生的四种重组IgG Fc构建体,所有携带IgG4铰链(
      • RISPENS T.
      • 戴维斯上午
      • Ooijevaar-de Heer P.
      • Aspalah S.
      • 百德o.
      • 萨顿B.J.
      • Vidarsson G.
      • Aalberse R.C.
      动力学工厂臂交换研究人免疫球蛋白G(IgG)亚类中重链相互作用的动态。
      ),也发现携带O-聚糖(补充图S5)。 Fc-域将G3M(B)或G3M(C3C5)配对IgG3或IgG4中的任一个组成,具有V397m或V397m,K392N;可以审查蛋白质序列 补充表S2。在LC-MS(/ MS)分析中观察到的胰蛋白酶和蛋白酶K消化物中的O-糖肽含有一个潜在的糖基化位点:铰链区中的丝氨酸残留物在完整的IgG4中的位置228位;遇到的O-糖肽的肽序列列于 补充表S4.
      由于这些发现,我们还研究了整个IgG4上是否存在O-糖基化。我们从具有高IgG4水平的患者的血清和从类风湿性关节炎患者的血清获得IgG4,以及在HEK细胞和人源化鼠IgG4治疗抗体中产生的IgG4样品。 LC-MS(/ MS)胰蛋白酶和蛋白酶K消化的分析显示肽覆盖S228,但未观察到O-聚糖。

       讨论

      IgG.3由于其细长的铰链区域和增强的效应器功能,从另一个IgG亚类脱颖而出。在本文中,我们证明了每个IgG3重链的铰链区域中的三重重复序列内的第一次α残留物的第一时间o-糖基化。在来自各种来源的IgG3中鉴定了非,单可以和脱脂的核心1型O-聚糖。六糖脱脂的O-聚糖也以非常低的丰度存在,但仅在单克隆IgG3样品中存在。

       IgG.3 O-糖基化的相对丰富和分布

      从胰蛋白酶产生的胰蛋白酶产生(Glyco)肽的纳米-ESI-IT-MS分析中确定了各种O-聚糖的相对丰度的估计。应当注意,因为单倍络合的O-糖肽的信号在三个带电状态下与铰链重复肽的双电荷峰重叠,所以在所有样品中具有推定的乙酰化改性,只有单胞嘧啶的O-糖肽的双重电荷信号是量化,从而导致对该O-甘油膜的低估。此外,已知具有不同甘油结构的糖肽可以具有不同的响应因子(
      • Stavenhagen K.
      • Hinneburg H.
      • Thaysen-Andersen M.
      • Hartmann L.
      • varónsilva d.
      • 福克斯J.
      • 卡斯达尔S.
      • RAPP E.
      • Seeberger P.H.
      • Kolarich D.
      糖蛋白微均质性和宏观异质性的定量映射:使用合成肽和糖肽的质谱信号强度评价。
      )因此,我们测量的相对丰度可能无法准确反映实际比率。为了获得含有O-聚糖的铰链重复基序的百分比的更可靠估计,胰蛋白酶IgG肽与外糖苷酶一起温育,将所有O-聚糖缩小到单个 N - 乙酰己糖胺。先前使用Nanolc-ESI-IT-MS对单糖基化肽的定量测量的研究发现,糖肽用单一 N - 乙酰甘氨酰胺产生类似于尼糖基化肽的信号强度(
      • Stavenhagen K.
      • Hinneburg H.
      • Thaysen-Andersen M.
      • Hartmann L.
      • varónsilva d.
      • 福克斯J.
      • 卡斯达尔S.
      • RAPP E.
      • Seeberger P.H.
      • Kolarich D.
      糖蛋白微均质性和宏观异质性的定量映射:使用合成肽和糖肽的质谱信号强度评价。
      )。鉴于结构之间的相似之处 N - 乙酰甘氨酸和 N - 乙酰甘乳酰胺,我们期望我们对脱胶和脱糖化的O-糖肽的相对定量的方法,以提供对O-糖基化程度的可靠估计。
      大约10%的铰链重复苏氨酸携带来自供体血清的多克隆IgG3中的O-Glycan。尽管捐助者的年龄和性别存在差异,但六种样品中的O-糖基化的程度和类型似乎类似。这与这些样品的N-糖基化谱形成相反,这确实表现出与文献一致的联系差异(
      • BakovićM.P.
      • Selman M.H.
      • Hoffmann M.
      • 鲁丹一世。
      • 坎贝尔H.
      • 雷德德·芬
      • Lauc G.
      • Wuhrer M.
      高通量IgG Fc N-糖基化通过糖肽质谱法的分析。
      )。在两种单克隆IgG3同质型中,我们检查了IgG3M(G)和IgG3M,〜12-14%的O-糖基化位点被占用;该增加可能是由于产生这些抗体的表达系统(HEK细胞)(
      • 克萨塞A.
      • delafosse l.
      • Gaudry J.P.
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      • 一个tonsson B.
      he和CHO细胞中表达重组蛋白的糖基化的差异。
      )。
      在商业化的血浆和其他IgG3样品中,在商业上获得的IgG3样品之间观察到O-糖基化的明显差异:前者呈现出较低水平的终端 N - 环酰氨酰氨基丙氨酸,总体上的O-糖基化水平较低。可以在该IgG3样品的制造商提供的制备方法的细节中找到两个解释:使用硼酸进行沉淀,并使用Jacalin塔去除次次IgA污染物。已知酸性处理导致末端N-乙酰尿氨酸酸的损失(
      • 陈福特。
      • dobashi t.s.
      • Evangelista R.A.
      毛细管电泳糖蛋白糖成分的定量分析。
      )。然而,与单助剂衍生的IgG3相比,汇集血浆衍生的IgG3的N-聚糖没有显示出唾液酸化的降低,这使得硼酸处理不太可能对O-聚糖唾液化的较低水平负责。 Jacalin是一种植物凝集凝集素,其具有亲和力的核心1型O-聚糖;它结合o-糖基化蛋白,例如IgA1,以及涉及携带O-糖基化的几种动物IgG(
      • Pedroso m.m.
      • pesquero n.c.
      • Thomaz S.M.
      • Roque-Barreira M.C.
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      Jacalin与人免疫球蛋白A1和牛免疫球蛋白G1:通过压电生物筛分测定的亲和常数。
      ,
      • Hortin G.L.
      • Trimpe B.L.
      凝集素亲和力层析蛋白质轴承o型寡糖:拟甘油蛋白酶的应用。
      )。然而,据报道,Jacalin对非唾液酸化的O-聚糖具有更高的亲和力(
      • Hortin G.L.
      • Trimpe B.L.
      凝集素亲和力层析蛋白质轴承o型寡糖:拟甘油蛋白酶的应用。
      ),对于在jacalin柱上进行的单克隆IgG3观察到的,发现耗尽用于非缀合的并部分耗尽单次单糖,但不用于未唾液酸化的O-聚糖(未发表的数据)。这并未解释为什么汇集的血浆衍生的IgG3与单个供体血清衍生的IgG3相比,汇集的血浆衍生的IgG3将表现出较低水平的脱脂O-聚糖和更高水平的单胞嘧啶O-聚糖。在任何情况下,难以说出可能耗尽的任何内容,而不能够观察原始的非jacalin治疗的合并等离子体样品的O-糖基化曲线。因为它表明Jacalin与O-糖基化的IgG3铰链相互作用,并且由于偏离从拟拟合处理的血浆衍生样品获得的偏离O-糖基化曲线 相对 从没有Jacalin Feetelion获得的单一人捐助者的IgG3,对于该IgG3样品获得的结果将不被视为总体人群的代表性。
      O-糖基化可能在所有IgG3中随机分布,因为发现单克隆细胞培养物以部分o-糖基化而不是完全或非O-糖基化的IgG3。此外,通过中间三硫化物桥连接的铰链肽 - 二聚体重复很少携带两个O-聚糖,这表明O-糖基化在IgG3分子的子集上没有聚集在一起。如果O-糖基化随机分布,预计将预期将至少一个O-Glycan携带IgG3的大约一半(1 - (1-0.10)= 1-((1-0.10)^ 6)= 47%)。我们观察到,小于1%的铰链肽二聚体重复在单克隆IgG3样品中携带两种脱脂的O-聚糖,而假设随机O-糖基化位点的预期值将是〜3.8%(G3M(g))和2.8%( G3m)。这些发现表明,如果聚糖已经存在于相对的重链上的相邻部位,则抑制O-连接的聚糖的添加,从而将O-糖基化分散在较高百分比的IgG3s上。

       确定IgG铰链区O-糖基化的标准

      基于IgG3铰链重复区域的氨基酸序列,它形成O-糖基化的靶标并不令人惊讶。已知o-糖基化在具有高丰度的脯氨酸残基的序列中发生,优先于相对于糖基化位点(
      • 威尔逊I.B.
      • Gavel Y.
      • von heijne g.
      O-连接糖基化位点周围的氨基酸分布。
      )。在IgG3铰链重复中,16个氨基酸残基中的六种由脯氨酸组成,其中+3相对于糖基化位点。此外,由于其延伸的地层,IgG3铰链区域具有高度的表面可访问性(
      • 约翰逊下午
      • michaelsen t.e.
      • 范围下午
      铰链区的构象和人IgG3的各种碎片。
      ),其也与O-糖基化有关(
      • Julenius K.
      • MølgaardA.
      • Gupta R.
      • 布鲁纳克斯。
      哺乳动物粘液型O-糖基化位点的预测,保护分析及结构特征。
      )。与M(g)相比,在重组IgG3M中观察到的略微较低的O-糖基化程度可能是略低的糖基化的负责:IgG3M的铰链区域的较短长度,其含有两个铰链重复而不是三个,可以降低糖基转移酶的可访问性。在铰链,T的N-末端末端的苏氨酸残基上观察到O-糖基化。H1–4,T.H1–9 和 TH1–10,这可能是由于本地氨基酸序列或该区域的二级结构。
      发现O-糖基化存在于具有IgG4或IgG3 CH 2和CH3结构域的Fc构建体的IgG4铰链上。考虑到IgG4铰链区域中的脯氨酸残基(在-4,-3,-1,2和4相对于O-糖基化位点S228)中的高丰度(处于O-糖基化位点S228),这并不令人惊讶,这是o的众所周知的标记 - 糖基化(
      • 威尔逊I.B.
      • Gavel Y.
      • von heijne g.
      O-连接糖基化位点周围的氨基酸分布。
      )。然而,完整的IgG4,无论是从血清纯化还是在与Fc构建体相同的HEK细胞表达系统中表达,未发现铰链区O-糖基化。因此,由于在完整IgG4的情况下,Fab片段的存在可能会影响铰链区域的可达性,防止在GOLGI装置中的o-glycan附着。类似地,最近在HEK和CHO细胞中产生的IgG1 Fc-碎片上报道了O-糖基化,但在同样情况下不产生的完整IgG1(
      • ahmed a.a.
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      • Lomino J.v.
      • Ravetch J.v.
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      抗炎免疫球蛋白G Fc蛋白的结构表征。
      )。这加强了可访问性对于o-glycans的附着必不可少的概念(
      • Julenius K.
      • MølgaardA.
      • Gupta R.
      • 布鲁纳克斯。
      哺乳动物粘液型O-糖基化位点的预测,保护分析及结构特征。
      )。对于人IgG3,这是通过其IgG3铰链的广泛长度提供的,其在完整的IgG分子中用于其他IgG亚类被Fab片段屏蔽。

       IgG.3 O-糖基化的功能

      在IgG3铰链区发现的O-聚糖的功能尚未被研究,但之前发现产生了几种选择。首先,铰链糖基化可能禁止蛋白水解降解。 IgG铰链是许多细菌或内源性蛋白酶的靶标(
      • Brezski R.J.
      • 约旦罗..
      与侵袭性疾病相关的蛋白酶切割IgG:对宿主免疫的逃避策略?
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      • 约旦罗..
      肿瘤相关和微生物蛋白酶通过对铰链近端的单个裂解来抑制宿主IgG效应子功能。
      ),IgG3铰链的延伸结构可能是IgG3比其他IgG亚类更容易受蛋白水解降解的原因(
      • Baici A.
      • KNÖPFELM.
      • FEHR K.
      • Skvaril F.
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      四种人免疫球蛋白G亚类与人溶酶体弹性蛋白酶蛋白分解的不同敏感性的动力学。
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      Pepsin消化不同亚类的人G-myeloma蛋白。 I.胃蛋白酶切割的特征特征作为时间的函数。
      )。我们发现胰蛋白酶IgG3 O-糖肽对内拷贝酶ASPN消化抗性,而相应的核心化肽不是,因此提供了铰链区O-聚糖可以保护铰链区域免受蛋白水解裂解掩蔽。相比之下,我们没有观察到任何不完全胰蛋白酶消化的任何证据,以切生的O-糖肽的形式。还发现O-糖基化在其他免疫球蛋白中介导蛋白酶抗性,例如小鼠IgG2B和IgA(
      • 金H.
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      • 克里安米
      免疫球蛋白A1通过口服链球菌降解的分子方面。
      )。铰链区寡糖的另一个功能可以包括帮助铰链区域保持延伸构象,这可能有助于Fab片段的柔韧性和取向,从而影响二价结合与靶抗原。
      此外,可以推测IgG3的O-糖基化的偏差可能具有病理效应,如针对IgA肾病(
      • Tomana M.
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      IgA肾病中的循环免疫复合物由IGA1组成,具有半乳糖缺乏铰链区和抗原抗体。
      )。已知IgA1的异常糖基化在IgA肾病中发挥因果作用:截短的O-聚糖被免疫球蛋白识别,导致抗体复合物的形成沉积在肾小球附近的血管壁上(
      • Tomana M.
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      致谢

      我们要感谢David Falck对糖尿病MS分析的糖尿病和Ngaisah Klar-Mohamad进行促进,以供应IgG4样品。

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