双桶液相色谱 - 串联质谱(LC-MS / MS)系统,每天量化96个椎间膜*

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    来自近蛋白质组学和信号转导,Max-Planck生物化学​​研究所,克罗普斯帕茨18,D-82152 Martinsrid,德国
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  • Richard A. Scheltema
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  • H. Christian Eberl.
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  • Nils A. Kulak.
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  • Eva C. Keilhauer
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  • Korbinian Mayr.
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  • Matthias Mann.
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      蛋白质组学领域已经在LC-MS / MS系统中的技术进步演变,现在可以在合理的时间内分析非常深的蛋白质。然而,大多数应用不处理全细胞或组织蛋白质蛋白质,而是有关手头的研究背景相关的限制亚甲蛋白蛋白,或者由广泛的分馏而产生。与此同时,对许多条件或扰动的调查对测量能力进行了应变。在这里,我们开发了一种能够处理大量低或中等复杂性样本的高吞吐量工作流程,并专门针对一天内96孔板的分析(每个样品15分钟)。我们将平行样品加工与改进的液相色谱平台相结合,驱动两个分析柱的串联,其耦合到四轴横梁质谱仪(Q辐射HF)。修改的LC平台消除了测量之间的空闲时间,并且Q辐射HF的高排序速度降低了所需的测量时间。我们将管道应用于酵母染色质重塑景观,并在约1天内显示染色质复合物的96个下拉的量化。这仅具有500μg输入材料,以96孔格式化酵母培养。我们的系统检索了已知的复杂构件和允许具有许多诱饵蛋白的高吞吐量。偶数替代的复杂组合物在这些非常短的梯度中可检测到。因此,与已建立的工作流程相比,样品吞吐量,灵敏度和LC / MS-MS-MS占空比是改善的多重。管道可以扩展到不同类型的相互作用研究和其他培养基复杂性蛋白质组。
      霰弹枪蛋白质组学涉及蛋白质的鉴定和定量(
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      霰弹枪蛋白质组学自动多维蛋白质识别技术。
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      基于质谱的蛋白质组学。
      ,
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      • Heck A.J.
      下一代蛋白质组学:迈向蛋白质组动力学的一体化视图。
      )。在分析之前,将蛋白质消化成肽,得到高度复杂的混合物。为了处理这种复杂性,肽通过液相色谱分离,然后用质谱(MS)进行在线分析,今天在短时间内促进几乎完全细胞系蛋白质蛋白质的表征(
      • Altelaar a.f.
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      下一代蛋白质组学:迈向蛋白质组动力学的一体化视图。
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      人癌细胞系的深层蛋白质组和转录组映射。
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      人细胞系的定量蛋白质组。
      )。除了整个蛋白质组的表征之外,还存在对分析低或中等复杂性样品的需求。鉴于系统生物学观点的趋势,通常必须测量样品组。发生一种这样的较低复杂性蛋白质混合物在测定感兴趣的蛋白质的物理相互作用伙伴中,这需要通过诱饵蛋白鉴定和定量蛋白质“下拉”或免疫沉淀。蛋白质相互作用对于几乎所有生物过程至关重要,并通过调节酶来协调细胞的行为,形成大分子组件和官能化的多转肽复合物,其能够比其部件的总和更复杂的行为。人类基因组具有近20,000个蛋白质编码基因,据估计,80%的蛋白质从事复杂的相互作用,并且130,000至650,000个蛋白质相互作用可以在人细胞中进行(
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      估计人类偶联的大小。
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      二元互动映射的实证框架。
      )。这些数字表明了蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI)的系统和高通量映射以了解这些复合物。
      引入常规方法检测PPI,例如酵母双杂交筛(Y2H)(
      • 领域S.
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      一种检测蛋白质 - 蛋白质相互作用的新型遗传体系。
      )或亲和纯化结合质谱(AP-MS)1 (
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      • Aeberberold R.
      用质谱分析蛋白质复合物。
      ),彻底改变了蛋白质临界域。特别是AP-MS作为目录交互的重要工具,其目的是与许多不同生物中的基本生化机制更好地了解(
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      蛋白质复合物的系统鉴定 酿酒酵母酿酒酵母 通过质谱。
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      蛋白质复合物的系统分析酵母蛋白质的功能组织。
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      含有保守和必需蛋白复合物的交互网络 大肠杆菌.
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      • Superti-Furga G.
      蛋白质组调查显示酵母细胞机械的模块化。
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      酵母中蛋白质复合物的全球景观 酿酒酵母酿酒酵母.
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      质谱法的大规模映射人蛋白 - 蛋白质相互作用。
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      人内源性核心络合物分析。
      )。它可以在近乎生理条件下进行,并且能够识别功能性蛋白质复合物(
      • Gavin A.c.
      • Maeda K.
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      图表蛋白质 - 蛋白质相互作用的最新进展:基于质谱的方法。
      )。此外,具有定量质谱法的亲和纯化的组合大大提高了非特异性背景粘合剂的真正互动者的辨别,在AP-MS场中的长期挑战(
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      使用定量质谱法测定特定蛋白质 - 蛋白质相互作用的高置信度。
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      用定量质谱分析蛋白质 - 蛋白质相互作用。
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      • 嘿m.y.
      通过亲和富集MS而不是亲和纯化MS进行准确的蛋白质复合物。
      )。如今,使用量化的AP-MS来解决许多不同的生物学问题,例如在扰动时检测PPI的动态变化(
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      • Kratchmarova I.
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      蛋白质相互作用网络分析的集成质谱与计算框架。
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      酪氨酸磷酸化细菌蛋白的宿主细胞酰蛋白酶。
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      表观遗传组蛋白标记及其读者的定量相互作用蛋白质组学与基因组分析。
      )。最近的发展甚至可以提供所研究的诱饵和捕食蛋白的丰富和化学计量信息,与来自非常深细胞蛋白质蛋白质的定量数据相结合。此外,AP-MS中的样品制备现在可以以能够产生每天数百个样品的高通量格式进行。通过在样本生成中的这种产量,AP-MS管道的LC-MS / MS部分已成为大型研究的主要瓶颈,将吞吐量限制为少量可用样品的吞吐量。原则上,通过同位素标签策略复用分析可以避免这种限制(
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      用同位素质量使用报道离子同位素增加TMT的多路复用能力。
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      • 那就是我
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      • DOCE C.
      • Savitski m.m.
      • Bantscheff M.
      高分辨率启用TMT 8-PLEXING。
      )或通过急剧减少每个样本的测量时间(
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      • orton d.j.
      • 摩尔r.j.
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      • 霍普金斯D.F.
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      • 史密斯r.d.
      • Belov M.E.
      一个LC-IMS-MS平台,提供高通量蛋白质组学研究的动态范围增加。
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      • Falkenby L.G.
      • satmartin G.
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      • Jensen O.N.
      整合固相提取毛细管液相色谱(SPELC)与ESI-MS / MS接口,以快速表征和定量蛋白质和蛋白质。
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      • Soensgaard P.
      • Bache N.
      • 穆罕默德S.
      • Heck A.J.
      使用集成的固相萃取 - 液相色谱-SMS / MS系统快速分析蛋白质组和椎间眼。
      )。前者策略要求精湛的处理步骤控制,并未被广泛实施。后一种策略取决于具有足够高的测序速度的质谱仪,以在很短的时间内处理下拉。自19年前的介绍以来(
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
      • Fröhlichf.
      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      ),侧面质谱仪具有更快的测序能力,Q辐射HF现在达到最多17 Hz的肽测序速度(
      • 施泰米r.a.
      • Hauschild J.P.
      • Lange O.
      • 霍恩堡D.
      • Denisov E.
      • 达莫e.
      • Kuehn A.
      • Makarov A.
      Q辐射HF,具有预过滤器,高性能四极杆和超高场轨道分析仪的台式质谱仪。
      )。现在应该使其可行的是大大降低每测量花费的时间量。
      虽然非常短的LC-MS / MS运行原则上可以用于高通量分析,但它们通常会导致LC-MS占空比下降。这是因为每个样本都需要初始洗涤,加载和平衡步骤,与梯度时间无关,这对大多数LC设置具有大量百分比 - 通常至少为15-20分钟。为了实现更高效的LC-MS占空比,同时保持高灵敏度,可以介绍第二分析柱。这使得能够并行化与样品负载和LC操作步骤相关的几个步骤,包括阀门切换。这种双层分析栏或“双桶:已经针对各种应用程序和平台描述了设置(
      • 面包师E.S.
      • liveay e.a.
      • orton d.j.
      • 摩尔r.j.
      • Danielson 3,W.f.
      • 之前的D.C.
      • 易卜拉欣Y.M.
      • Lamarche B.L.
      • Mayampurath上午
      • 什叶派A.A.
      • 霍普金斯D.F.
      • 唐克。
      • 史密斯r.d.
      • Belov M.E.
      一个LC-IMS-MS平台,提供高通量蛋白质组学研究的动态范围增加。
      ,
      • 沉Y.
      • 托利ć
      • 赵立
      • pasa-tolićl。
      • Li L.
      • Berger S.J.
      • Harkewicz R.
      • 安德森G.A.
      • Belov M.E.
      • 史密斯r.d.
      高效多毛细管液相色谱,高效率蛋白质组学用直线高性能ESI FTICR质谱法。
      ,
      • Belov M.E.
      • 安德森G.A.
      • Wingerd M.A.
      • UDSeth H.R.
      • 唐克。
      • 之前的D.C.
      • Swanson K.R.
      • Buschbach M.A.
      • strittmatter e.f.
      • 摩尔r.j.
      • 史密斯r.d.
      一种用于高通量蛋白质组学的自动高效毛细管液相色谱 - 傅立叶变换离子回旋谐振质谱仪。
      ,
      • 博尼尔E.
      • Tessier S.
      • 载体A.
      • Thibault P.
      用于靶向蛋白质组学分析的多维多维纳米MS系统。
      ,
      • liveay e.a.
      • 唐克。
      • 泰勒B.K.
      • Buschbach M.A.
      • 霍普金斯D.F.
      • Lamarche B.L.
      • 赵立
      • 沉Y.
      • orton d.j.
      • 摩尔r.j.
      • 凯莉r.t.
      • UDSeth H.R.
      • 史密斯r.d.
      全自动四柱毛细管LC-MS系统,用于最大化蛋白质组学分析中的产量。
      ,
      • orton d.j.
      • 墙M.J.
      • Doucette A.A.
      双LC-MS平台,用于高通量蛋白酶分析。
      )。
      从今天标准的报告的性能和吞吐量开始(
      • Guruharsha K.G.
      • 有害J.F.
      • 翟德
      • Mintseris J.
      • Vaidya P.
      • Vaidya N.
      • Beekman C.
      • 黄C.
      • Rhee D.Y.
      • CenaJ O.
      • McKillip E.
      • 莎娜。
      • Stapleton M.
      • WAN K.H.
      • yu c.
      • Parsa B.
      • 卡尔森J.W.
      • 陈X.
      • Kapadia B.
      • Vijayraghavan K.
      • Gygi S.P.
      • Celniker S.E.
      • OBAR R.A.
      • Artavanis-Tsakonas S.
      一种蛋白质复杂网络 果蝇黑胶基.
      ,
      • 吉尔霍尔e.c.
      • 嘿m.y.
      通过亲和富集MS而不是亲和纯化MS进行准确的蛋白质复合物。
      ,
      • Behrends C.
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      • 哈珀J.W.
      人类自噬系统的网络组织。
      ,
      • 柯林斯B.C.
      • Gillet L.C.
      • Rosenberger G.
      • 罗斯特H.L.
      • vichakevski A.
      • Gstaiger M.
      • Aeberberold R.
      通过SWATH质谱定量蛋白质相互作用动力学:在14-3-3系统中的应用。
      ,
      • Poulsen J.W.
      • Madsen C.T.
      • 年轻的C.
      • Poulsen F.M.
      • 尼尔森M.L.
      使用胍盐酸盐进行快速高效的蛋白质消化和单步亲和力纯化质谱法。
      ),我们询问是否有可能在样品吞吐量和灵敏度方面获得多重增加,以及整体湿实验室成本和工作时间的相当大降低。具体而言,我们的目标是在一天中量化96个中等复杂性样本。这种许多样品可以用96孔板加工,目前是高度平行化的样品制备工作流程的选择的格式,通常具有高度自动化。我们研究了样品制备,液相色谱和质谱中需要哪种进展。基于我们的研究结果,我们开发了一个平行化平台,用于高通量样品制备和LC-MS / MS分析,我们应用于来自酵母染色质重塑景观的下拉样品。已知复杂成员的检索程度担任发达管道的质量控制。

      实验步骤

       酵母裂解物的制备

      GFP.标记的酵母菌株 酿酒酵母酿酒酵母 GFP克隆集合(
      • 嗯w.k.
      • Falvo J.v.
      • Gerke L.C.
      • 卡罗尔A.S.
      • 豪森·克林。
      • Weissman J.s.
      • o'shea e.k.
      萌芽酵母蛋白质定位的全局分析。
      ),亲本菌株BY4741和对照菌株PHIS3-GFP(
      • 吉尔霍尔e.c.
      • 嘿m.y.
      通过亲和富集MS而不是亲和纯化MS进行准确的蛋白质复合物。
      )在标准条件下,在96-深井板(Sarstedt,NümbreCht,德国)的YPD液体培养基中培养。我们使用了32种不同的酵母菌菌株在生物三倍体中,导致96个实验样品。生长酵母细胞直至它们达到光密度 600 nm 大约1,然后收获培养体积平等2个ODES。将酵母细胞粒料溶解在300μl裂解缓冲液中(150米m NaCl, 50 mm Tris-HCl(pH8.0),1米m MgCl2,5%甘油,1%Igepal Ca-630(Sigma-Aldrich,Schnelldorf,德国),完全蛋白酶抑制剂(Roche,Mannheim,德国),1%苯并酶(Merck,Darmstadt,德国))转移到FastPrep Tubes(MP含有1mM二氧化硅球(裂解基质C,MP生物医学)的生物医学,eSchwege,德国),并以最大速度在FastPrep24仪器(MP生物医学)中裂解6×1分钟。通过以16,100×离心清除裂解物 g for 10 min at 4 °C.

      亲和力净化

      GFP.-MultiAlplap(Chromotek,MartinsRied,德国)的每个孔用200μl缓冲液1洗涤三次(150米m NaCl, 50 mm Tris-HCl,pH 8.0),然后用清除的酵母细胞裂解物(500μg总蛋白质提取物)温和,在4℃下温和地摇动60分钟。接下来,用200μl缓冲液2洗涤每个孔两次(150米m NaCl, 50 mm Tris-HCl(pH8.0),0.25%Igepal Ca-630)和与200μL缓冲液1的4次,在与25μL洗脱缓冲液温育之前(2 m urea, 20 mm Tris-HCl(pH8.0),1米m DTT,100ng序列级改性胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi,USA)在室温下持续90分钟。随后,将所得肽用25μl烷基化缓冲液烷基化(2 m urea, 20 mm Tris HCl(pH 8.0),5米m 碘乙酰胺),最后用50μl尿素缓冲液洗涤一次(2 m urea, 20 mm Tris HCl,pH8.0)分别为10分钟。在每个步骤之后收集来自洗脱,烷基化和洗涤步骤的上清液,并在清洁的96孔板中组合。将该板在室温下孵育过夜,以确保完全消化。第二天早上,通过每孔加入10μl10%TFA来停止消化物。酸化肽纯化在陡峭上(
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      蛋白质组学中的蛋白质组学中的基质辅助激光解吸/电离,纳米电子涂布剂和LC / MS样品预处理的停止和去提取提示。
      )含有两层聚(Styrenyivinylbenene) - 相 - 相磺酸盐(empore2241,3 m,德国诺伊斯,德国)材料脱落并净化肽。用具有60μL洗脱缓冲液(80%乙腈,1%氢氧化铵)的缘物洗脱样品,并在SpeedVac浓缩器中蒸发30分钟。将剩余的肽溶液体积用缓冲液A *(2%AcN,0.1%甲酸)调节至4μL。

      LC-MS / MS分析

      在网上色谱用经过改进的Thermo Easy-NLC 1000 UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Berve)进行,耦合到Q辐射的HF仪器,具有纳米电喷雾离子源(Thermo Fisher Scientific)。两种分析柱(15厘米长,75μm内径)用ReprosiL-Pur C包装在内部18 AQ1.9μm倒立相树脂(Maisch GmbH博士,Ammerbuch,德国)在缓冲液A(0.5%甲酸)中,并在背压方面与确保互换性互换性。在线分析期间,将分析柱置于调节温度为55°C的改进的柱加热器(SONOUND GmbH,Biberach,German)中。结果描述了对两个系统的修改。将肽加载到分析柱上,在650巴的背压处(通常导致500nl / min的流速),并用两个不同的线性梯度为8-30%缓冲液B(80%ACN和0.5 %甲酸)以450nl / min的流速,通过Intelliflow技术在10分钟和22分钟内(通常在大约500巴的背压)上控制。用SprayQC进行在线质量控制(
      • 施泰米r.a.
      SIMPTQC:实时LC-MS / MS质量监测系统,用于最大限度地使用搁板组件。
      ),使用附加插件延伸,以支持控制分析柱的喷射电压的高压开关(结果)。用Q辐射加(27分钟梯度)和Q辐射HF(14分钟梯度)仪器获得MS数据,因为后者被发现最快的两倍(
      • 施泰米r.a.
      • Hauschild J.P.
      • Lange O.
      • 霍恩堡D.
      • Denisov E.
      • 达莫e.
      • Kuehn A.
      • Makarov A.
      Q辐射HF,具有预过滤器,高性能四极杆和超高场轨道分析仪的台式质谱仪。
      )因此能够处理14分钟梯度的快速色谱。该仪器分别用数据依赖性前5个和前10个方法进行编程,动态地选择来自调查扫描(300-1,650)的最丰富的尚未测序的前体离子。使用Tune 2.5和Xcalibur 3.0.63控制仪器。在两个仪器的最大离子注射时间为45 ms,循环时间为约800毫秒,足以在观察到的洗脱峰值上产生16个数据点(14分钟)或25个数据点(27分钟)的中位数(结果) 。根据其先前确定的最佳值选择进一步的设置(
      • 施泰米r.a.
      • Hauschild J.P.
      • Lange O.
      • 霍恩堡D.
      • Denisov E.
      • 达莫e.
      • Kuehn A.
      • Makarov A.
      Q辐射HF,具有预过滤器,高性能四极杆和超高场轨道分析仪的台式质谱仪。
      )。使用具有预测自动增益控制的靶值的1E5离子的靶值进行测序,用预测自动增益控制确定前体的分离,窗口为1.4Th。调查扫描分别以70,000和60,000分,分别收购 m / z. 200和HCD光谱的分辨率分别设定为17,500和15,000 m / z. 200.归一化碰撞能量设定为27,指定在最大填充时间最大达到的目标离子值的最小百分比的“欠填充比”定义为10%(27分钟)和40%(14分钟)。升高的测序阈值确保了随着样品的复杂性降低,碎片扫描具有更高的质量。此外,S镜头射频电平设置为60,这使得最佳传输 m / z. 肽从我们的消化中占据的区域(
      • 施泰米r.a.
      • Hauschild J.P.
      • Lange O.
      • 霍恩堡D.
      • Denisov E.
      • 达莫e.
      • Kuehn A.
      • Makarov A.
      Q辐射HF,具有预过滤器,高性能四极杆和超高场轨道分析仪的台式质谱仪。
      )。从碎片选择中排除了未分配的,单次或五个和更高的充电状态的前体离子。

      数据分析

      通过MaxQuant蛋白质组学数据分析工作流程1.4.3.14(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )。蛋白质和肽光谱比赛的假发现率(FDR)切断的速度被设定为1%。肽需要具有七个氨基酸的最小长度和4,600da的最大质量。 MaxQuant用于基于在时间依赖于时间校准之后最大为4.5ppm的初始允许的初始质量偏差的搜索来进行碎片扫描进行识别识别。允许的片段质量偏差为20ppm。使用Uniprotkb鉴定碎片光谱 S. Cerevisiae. 数据库(基于2014-07释放; 6,643个条目)与综合的Andromeda搜索引擎相结合262个常见污染物(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )。将酶特异性设定为精氨酸和赖氨酸的C-末端,也允许在脯氨酸前切割,并且最多两个错过的裂解。作为可变修饰,将半胱氨酸的氨基甲酰化和N-末端蛋白乙酰化和甲硫氨酸氧化成。启用了“运行之间的匹配”,并启用了具有标准设置的最大时间差的30秒和无标签量化(LFQ)(
      • Cox J.
      • 嘿m.y.
      • Luber C.a.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      通过延迟标准化和最大肽比例提取的精确的蛋白质组无标记量化,称为MAXLFQ。
      )。存储在原始文件中的其他元数据(例如 使用MSFilereader(Thermo Scientific)用内部开发的工具提取离子注入时间,噪声水平等)。
      使用R脚本和统计环境进行分配互动者的目标进一步的数据分析(
      • Ihaka R.
      • 绅士R.
      R:数据分析和图形的语言。
      )使用ggplot(
      • 威克姆H.
      GGPLOT2:高雅图形进行数据分析。
      )用于数据可视化。简而言之,LFQ强度值为基数10对数,导致正态分布。缺失值是通过从强度值的下边缘的正常分布中随机选择而抵消(对于该正常分布,换档设置为1.8标准偏差与平均值和宽度为0.3标准偏差;请参阅描述放置的直方图 图。 S8和S9)。在随后的步骤中排除蛋白质,其诱饵少于两个有效值,其三份用于诱饵的三份(由于强度值的抵抗特征,主要呈现为显着耗尽的蛋白质)。将富集富集被计算为诱饵测量与亲本菌株的蛋白质组测量(符合其所用的平均值)之间的平均比率 t 测试)。对于富集富集,另外确定平均值的标准误差。基于置换的FDR控制 t 测试 p 针对诱饵三份和亲本菌株三份(使用250个排列)之间的每种蛋白质计算值。这 p 使用缩放因子S0进行调整值,该缩放因子S0具有在FDR控制之前的值1的值,这会放大均值差异的重要性(
      • Tusher V.G.
      • Tibshirani R.
      • 楚G.
      微阵列施加到电离辐射响应的显着性分析。
      )。此外,计算了每个蛋白质的LFQ强度曲线(由该蛋白质的所有测量强度值)与诱饵的LFQ强度分布组成的相关性(由所有测量的强度值组成)(
      • 吉尔霍尔e.c.
      • 嘿m.y.
      通过亲和富集MS而不是亲和纯化MS进行准确的蛋白质复合物。
      ),并得到相关的相关性 p 使用Benjamini和Hochberg程序将值调整为1%FDR。基于以下规则分配互动器类:(a)仅限<1% FDR t 测试意义,(a +)两者<1% FDR t 测试意义,和<1%fdr相关意义,(b +)两者<5% FDR t 测试意义和<仅1%FDR相关意义和(b)<5% FDR t 测试意义。来自的互动者 酿酒酵母 Genome Database (www.yeastgenome.org.)主要占A +,A和B +的课程。因此,我们单独进行后续分析。对于每个重要的异常值,我们还基于所介绍的S0缩放,引入了单一意义价值 t 测试,结合了丰富价值和 t 测试统计。这是从原点的日志空间中的距离计算。该值越高,该特定互动者的数据质量和实验成功越好。化学计量信息以两种方式确定。第一称谓的相互作用化学计量是基于计算的强度的绝对量化值之间的比率(从获取的来自所获取的质谱数据)到诱饵的基于互联器的拷贝数)(
      • Schwänhausserb。
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      )。第二个称为丰度化学计量是诱饵互动者的正常细胞拷贝数与诱饵之间的比率。

      结果

       减少LC-MS / MS分析时间

      首先,我们旨在建立最佳条件,以减少LC梯度长度。流量和梯度起始百分比都需要适应,以确保每种肽的信号不会降低并且最大化肽在梯度上的扩散。为此,我们测试了在Q辐射HF上的标准HeLa摘要对色谱峰宽度(从200至500nl / min)和梯度长度(从15至120分钟到120分钟的影响)的影响。
      • 施泰米r.a.
      • Hauschild J.P.
      • Lange O.
      • 霍恩堡D.
      • Denisov E.
      • 达莫e.
      • Kuehn A.
      • Makarov A.
      Q辐射HF,具有预过滤器,高性能四极杆和超高场轨道分析仪的台式质谱仪。
      )。到目前为止,对峰宽的最大效果缩短了梯度长度,因为这在宽度上的〜75%的减少,而流速仅减少了〜4%(Fig. 1A)。关于总体蛋白质组深度,我们能够使用最短梯度长度为15分钟的Q.辐射HF(Fig. 1B)。因此,当设想高样品吞吐量时,蛋白质样品的复杂性不应超过这样的数字。我们还确定蛋白质标识,用于较低的测序速度(Fig. 1B)。值得注意的是,甚至具有较低测序速度的平台,如orbitrap X1,均具有120分钟梯度的约1,000个蛋白质,表明该机器已经具有足够长的梯度给定的较低复杂性样品的所有蛋白质的可能性。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1用于非常短的梯度的色谱优化。 (A)峰宽作为梯度长度和流速的函数。效果大小是计算减少与峰宽的最大变化相比。 (B)蛋白质标识的外推,作为各种MS平台的梯度长度和扫描速度的函数(Q辐射Hf和加,orbitrap Elite和Velos,LTQ orbitrap XL)。 (C)流速对在所有测量中识别的一组750个独特同位素模式的信号对噪声的影响并在整个梯度上展开。 (D)通过较高流速引起的洗脱时间移位,归一化为梯度长度。
      由于缓冲液中的肽的较高稀释剂,我们通过提取所有运行中识别的一组750同位素模式的信号 - 噪声值来研究较高的流量率可能对信号对噪声产生不利影响。并展开完全保留时间范围。对于最长的梯度长度为120分钟,我们观察到更高的流速的信号对噪声的略微降低,而意外地更高的流速部分地改善了最短梯度的信号 - 噪声。对于中间梯度长度,流速不会显着影响信噪比。在30和15分钟的两个最短梯度之间,我们观察到信号对噪声的下降,我们将其归因于LC的缓冲区递送的不精确( Fig. 1C)。鉴于缓冲混合物从混合T连接到分析柱的尖端所花费的时间,因此对于肽的肽,较短的梯度在梯度占用(肽占用的梯度百分比)遭受影响使用较低的流量。通过迫使肽以更高的流速洗脱来提高这一点。对于最短的梯度长度,我们能够在梯度(在9分钟)中的60%从梯度(在6分钟为6分钟)中的肽洗脱开始,从而改善完全梯度和肽的涂布提供更好的色谱分辨率。对于30分钟的梯度,第一洗脱从10分钟(梯度时间的35%)移动至7分钟(25%)(Fig. 1D)。
      基于这些发现,我们确定了最佳梯度时间为27分钟,流速为450 nL / min,这使得LC泵的背压保持在约500巴的可接受水平。然而,这仍然导致96个样本的2天测量。预计与27分钟梯度相比,相同数量的样品测量的相同数量的测量的相同流量的12分钟梯度将具有降低的色谱性能。该时期也太短,不能并行将肽转移到分析柱上。因此,我们将梯度时间增加到14分钟并在夹层制备时间内激活加载泵,可将所有肽可靠地将所有肽装载到分析柱上。另外,我们将梯度的起始乙腈百分比从2%到8%(实验过程)增加,以在梯度的早期点开始肽洗脱。总的来说,这导致肽洗脱8分钟和18分钟的时间框架,分别为14和27分钟梯度的总测量时间60和75%。在这些条件下,中值峰宽度(碱基)分别为6 s(14分钟)和11s(27分钟)。

      易于NLC上的双桶色谱

      接下来,我们开始开发双桶色谱系统,以减少在将肽加载到LC柱期间质谱仪的空转时间。遗憾的是,我们使用的Thermo Easy-NLC 1000 UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific)没有描述这样的设置,并且广泛用于壁画家庭的质谱仪。要解决此问题,我们修改了Easy-NLC 1000 UHPLC系统的液体途径( 图。 2A-2D)。简而言之,我们将样品环直接放置在泵S和阀门之间,使系统能够利用泵S作为样品拾取和样品加载泵(在原始设置中,泵A用作样本 - 装载泵)。阀门S连接到阀W(在原始设置中,该阀门连接到用于从线路的缓冲器快速抽空的废物管线)连接到缓冲器A和B混合-T连接和两个分析柱。通过标准样品线。此设置允许将一个样本加载到一个分析列中,而另一个被洗脱。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2并行UHPLC操作,具有两个分析列。 (A)在阀门S的这种位置,样品泵可以填充样品环。 (B)通过切换阀S,可以将样品环的内容物装载到一个分析柱上。 (C)在该阀W的这种位置,可以用流动相洗脱分析柱1,同时加载分析柱2。 (D)通过切换阀W的位置,倒置该行为。 (E)在常规设置中,质谱仪在HPLC加载新样品时未排序。浅灰色箭头表示移动相位在其中处于活动状态的位置。 (F)通过双桶设置,这种空闲时间被规避,实现几乎连续运行。 (G)分析柱的定位参考质谱仪的入口。 (H)重新设计两个分析列的柱烤箱。
      为了利用这种新的液体通路并并行驱动两个分析列,我们还修改了控制UHPLC系统的“业务逻辑”。分析过程中的正常顺序步骤(Fig. 2E)被改变为彼此平行工作(Fig. 2F)。一旦对当前有源分析柱的制备完成,启动相和阀W已切换以洗脱加载的肽,则不受非活性的分析柱用于下一个样品。这是三个连续步骤进行的:首先,洗涤样品环,然后将新样品加载到样品回路中,最后将样品从样品环加载到分析柱上。利用上述泵和阀的布置,可以针对两个分析列中的每一个独立地执行这些操作。双桶系统的中辐射时间以最多160秒(图。 2E2F),由于需要重新填充基于注射器的泵并使它们恢复到压力,因此不能进一步减少该特定系统。 补充图。S1)。
      最后,我们修改了我们的标准分析柱加热器(
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
      • Fröhlichf.
      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      )容纳两个分析柱。两列现在以朝向大约2mm的距离尖端的距离在45度的固定角度朝向质谱仪入口的侧向指向侧向朝向质谱仪入口的固定角度(等于安装在围绕绕圈平台上的加热毛细管的宽度; Fig. 2G)。随着我们利用分析列的固定设置,我们无法并行提供喷射电压(Fig. 2H)。要使分析列之间的电压转换,我们还开发了一种能够向单个分析柱供电的高压开关,可通过通用串行总线连接控制(补充图S2)。我们为PlayQC环境开发的插件模块(
      • 施泰米r.a.
      SIMPTQC:实时LC-MS / MS质量监测系统,用于最大限度地使用搁板组件。
      )监视阀W的当前位置,并根据用户可定义的设置将喷射电压切换到洗脱分析柱。

      并行工作流程,用于在一天内分析96个下拉样本

      高吞吐量平台应该能够以并行化格式准备样本,随后在很短的时间段内测量它们的所有。在这里,我们开发了一个用于下拉样本的分析管道,其能够在下拉样品上实现这一目标(Fig. 3)。为了便于实现降低样本的高通量处理所需的简化工作流程,我们使用来自酵母GFP克隆收集的GFP标记的酵母菌株(
      • 嗯w.k.
      • Falvo J.v.
      • Gerke L.C.
      • 卡罗尔A.S.
      • 豪森·克林。
      • Weissman J.s.
      • o'shea e.k.
      萌芽酵母蛋白质定位的全局分析。
      )。通过以96孔格式结合酵母的培养和下拉的培养来获得进一步的改进。每个孔产生〜50百万百万酵母细胞,等于500μg的蛋白质裂解物,结果原来足以用于下拉实验。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3高通量LC-MS / MS蛋白质相互作用分析管道的工作流程。 酵母细胞和亲和纯化的培养均以96孔板格式进行,从而使样品制备并行化并最小化处理误差。通过双筒相色谱设置和Q辐射HF质谱仪的增加的序列,实现了1天内的96个下拉样品的LC-MS / MS分析。

      下拉样品上的质谱平台性能

      使用转录衔接子蛋白ADA2作为诱饵,我们将Q辐射HF的性能与LTQ-Orbitrap XL的性能进行了比较,该仪器大约9年前推出的仪器,其测序速度为2 Hz,通常用于下拉分析。值得注意的是,两个仪器都能够在2小时的常用测量时间内识别重构的ADA2复合体的所有已知成员(补充图S3A)。这表明,只要使用扩展的LC-MS / MS梯度即可,随着过去10年的较旧的orbitrap世代获取的蛋白质交互数据通常会通过重估而获得。然而,我们注意到蛋白质序列覆盖,因此,通过Q.辐射HF稍微改进,蛋白质序列覆盖率(通过除以所有MaxLFQ强度的中值来计算互动电器的MaxLFQ强度),使得设置稍微敏感在检测互动者时(补充图。S3B)。显然,这些梯度次数没有有效地利用Q辐射HF的卓越测序速度。通过将测量时间降低至15分钟,较旧平台的识别性能开始受到影响,而Q辐照的HF仍然允许捕获所有预期的互动者( 补充图S3A)。系统之间的主要差异在每种蛋白质的序列覆盖范围内,该Q. Q静置HF保持恒定恒定持续30分钟,在15分钟内略微降解,同时为orbitrap XL急剧降解(补充图。S3C)。降低的序列覆盖率对准确定量蛋白质的能力产生负面影响,因为无标记的定量随着与给定蛋白质相关的肽的数量而改善(
      • Cox J.
      • 嘿m.y.
      • Luber C.a.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      通过延迟标准化和最大肽比例提取的精确的蛋白质组无标记量化,称为MAXLFQ。
      )。这反映在测量的富集比中,该富集XL使得诱饵交流器几乎无法区分,而对于Q.与2小时相比,它仍然在30分钟内仍然仍然优越。补充图。S3B)。总体而言,正如所预期的那样,Q辐射HF优于杂种富集,序列覆盖率和同位素特征的所有测量时间的orbitrap XL(补充图。S3B-S3D)。虽然我们观察到在15分钟的Q辐射的HF方法中获得的序列信息减少,但这些非常短的运行仍然足够高的序列覆盖,以识别在调查中的复合物的成员。总之,这些结果表明,具有相对低的测序速度的质谱仪可以在蛋白质相互作用研究的长梯度下等效地表现,而高通量识别需要非常高的测序速度。

      数据采集​​系统的再现性

      为了研究不同测量之间的蛋白质量化的再现性,我们在我们的工作流程中获得了酵母染色质Remodelers RSC8,SPT7和SWI3的PPI数据。以三倍体测量的RSC8下拉的色谱图的目视检查已经为背部压力匹配分析柱的双桶系统显示了高度的技术再现性(Fig. 4A)。在现代PPI实验中,背景粘合剂的数量可以是数千个,而不是只有一些真正的互动者。我们利用这些非特异性粘合剂来估计再现性,通过计算每对测量之间的相关性,其中只有少数真正的互动者降低相关性(
      • 吉尔霍尔e.c.
      • 嘿m.y.
      通过亲和富集MS而不是亲和纯化MS进行准确的蛋白质复合物。
      )。大多数检测到的未特异性粘合剂在所有三种样品中确实是可重复定量的。 RSC8下拉的Pearson相关系数略微降低了一个例外( Fig. 4B),我们基于富集的大量抵押价值观,我们得出的富集并未完全成功。每个诱饵蛋白观察到的小异常人口确实代表了预期的互动伙伴(Fig. 4C补充图S4)。总的来说,这些结果表明,我们的双桶设置可以在两个独立测量之间使用非常低的MS空闲时间来操作,同时实现高再现性。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4双桶色谱,三个下拉梯度14分钟。 (A)在双筒LC-MS / MS设置上的生物三份RSC8下拉的基本峰色谱图。在所有情况下色谱法非常可再现。 (B)RSC8,SPT7和SWI3下拉的比较;所有全部用三份测量。 36个相关图的矩阵揭示了三份内酯内的MAXLFQ强度之间的高相关。 (C)缩小到spt7_02 相对 SWI3_01相关绘图。虽然具有非常相似的MAXLFQ强度检测大多数蛋白质,但在橙色(SPT7)和蓝色(SWI3)中标记的两个异常群代表了不同蛋白质复合物的不同复杂成员。

      PPI.数据质量来自非常短的渐变

      为了识别给定的诱饵蛋白的毛细血管,我们将所有互动者分为四个不同的类基本上(如上所述)(
      • 吉尔霍尔e.c.
      • 嘿m.y.
      通过亲和富集MS而不是亲和纯化MS进行准确的蛋白质复合物。
      )通过完全数据驱动(实验程序)来改进该概念。通过在A上运行的基于置换的虚假发现速率方法实现了来自非特异性粘合剂的特异性的区别 t 用两种不同的严格测试进行测试和富集(实验程序; 补充图S5A)。通过严格的截止的蛋白质代表高度富集的交互式助剂,而仅通过较少严格的截止的蛋白质的特征在于轻度富集的交互运动。所有其他蛋白质被认为是未指定的粘合剂。此外,与诱饵蛋白相比,我们使用Benjamini-Hochberg校正的强度剖面相关性潜在交流剂的相关性,以最大限度地减少轻度富集的交流器的假阳性鉴定(实验程序; 补充图S5E.S5F)(
      • 吉尔霍尔e.c.
      • 嘿m.y.
      通过亲和富集MS而不是亲和纯化MS进行准确的蛋白质复合物。
      )。通过这些标准,交互式器被分组为置信度A类A +,A,B +和B(补充图S4C.S4G)。来自整个酵母蛋白质组实验的绝对量化数据(
      • Kulak N.A.
      • Pichler G.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      在真核细胞中施加到复制数估计的最小,包封的蛋白质组学样品处理。
      )我们还允许我们估计在调查中的每种蛋白质复合物的相互作用和丰度化学测定体系(补充图S5D)。
      为了评估LC-MS / MS测量的质量控制和鉴于我们的大吞吐量,我们采用了三个不同的层。第一层由SprayQC提供的实时验证组成(
      • 施泰米r.a.
      SIMPTQC:实时LC-MS / MS质量监测系统,用于最大限度地使用搁板组件。
      )。除了电压开关的逻辑之外,该软件通过电子邮件通过电子邮件实现自动警告,以获取测量中涉及的大量组件,并为这些组件报告元数据(实验程序)。第二层包括通过每测量所鉴定的蛋白质的数量验证样品制备和LC-MS / MS测量成功。鉴于背景蛋白的优势,这种值应大致相等,所有下拉都是大致相等的。显示抵消值的直方图提供了避障蛋白的峰的形式的简单视觉指导(实验过程)。第三层是数据驱动的确定成功下拉实验的确定。为此,我们使用来自火山图的信息,特别是如上所述的意义值(实验程序)。对于所有的下拉,我们将此值与所有诱饵组合起来以确定BAITS的有效范围。在此范围之外落下的任何东西都被标记为潜在不可靠。

      S. Cerevisiae.染色质改造景观的快照

      使用双桶色谱操作的非常短的LC-MS / MS测量获得的数据表明,可以以高通量格式执行足够质量的AP-MS屏幕(Fig. 4)。为了研究我们在特定生物途径中涉及的一组蛋白质复合物上的工作流程,我们选择了30个不同的诱饵蛋白,这些诱饵蛋白质是酵母染色质重塑景观的一部分。此外,我们还使用了GFP表达的控制和单倍体亲本菌株(实验程序)。我们的诱饵选择跨越整个酵母蛋白质组的表达丰富三次( Fig. 5A)包括几个丰度的几个诱饵( <每个细胞100份)。我们发现,蛋白质输入量为500μg,其比传统使用的蛋白质输入量足就足以鉴定诱饵蛋白并检索已知的交互式,即使对于最低表达的诱饵蛋白(补充材料_14min和补充材料_27min)。另外,在可能的情况下,我们选择每种蛋白质复合物的多个诱饵,试图尽可能彻底地表征复杂的复杂性。该系列覆盖了21种不同的蛋白质复合物细分为四种酶类:组蛋白乙酰转移酶,染色质重塑,组蛋白甲基转移酶和组蛋白脱乙酰酶复合物。对于32个不同的酵母菌株,我们在生物三份酸盐中进行了下拉实验,导致96个样品。用14和27 min LC-MS / MS方法分别测量这些下拉样品中的每一个。在一起,以47.5小时(27分钟)或26.7小时(14 min)的开始到最终完整测量时间,包括所有开销的96个下拉样品的杂交体。如预期的那样,我们发现,与27分钟的方法相比,14中几乎每种蛋白质的诱饵蛋白和特异性交互酶的序列覆盖率降低了(Fig. 5B)。然而,在14分钟的运行中获取的序列信息仍然足以识别富集的诱饵及其相应的捕食。我们没有根据LFQ强度遇到关于生物信息浓缩价值的问题,因为旧平台上的短梯度是如此(见 补充图S6S7,补充材料_14min和补充材料_27min)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5诱饵和猎物特征比较14 相对 27分钟梯度方法。 (A)为下拉实验选择的30个诱饵蛋白跨越几种蛋白质表达丰度 S. Cerevisiae.,包括几种非常低的蛋白质(<每个细胞100份)。 (B)与27分钟的方法相比,所有所识别的蛋白质的独特序列覆盖率降低了14分钟的方法。诱饵蛋白质以红色标记。
      为了提供我们所识别的PPI的概述,我们创建了一个分配给定义的猎物分类之一的所有互动电场的拓扑网络。虽然整体互动阶级排名略微减少,但我们发现了最终复杂覆盖范围的小变化,即使在将14到27 min方法比较时,LC-MS / MS梯度几乎减半几乎减半(Fig. 6)。在21种蛋白质复合物中分析出来,在九种情况下,运行时间同样良好,而在十个案例中27分钟优于14分钟。相反,在两种情况下,14分钟的运行更好。即使对于几个非常低的丰富诱饵,27分钟的方法允许高于每小时的几个非常低的禁区,每个细胞少于100份。虽然14分钟的方法识别出较低的诱饵较少的诱饵,但其卓越的速度允许在几乎一半的时间内设定的相同样品的吞吐量。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6所有互动者的拓扑网络。 全球测量复合物的概述和14的成功率 相对 27分钟梯度。每种蛋白质被描绘为圆形,左半部分对应于14分钟和右半部分至27分钟的运行结果。颜色编码是指不同的互动剂类和选定的诱饵蛋白。每个复合体中央的数字代表总复杂组合物的百分位数,如14分钟(左)或27分钟(右)运行。彩色的矩形将复合物分成其独特的生物学功能。
      值得注意的是,我们甚至可以验证两种不同的RSC核小体重塑复合物的存在。 RSC复合物在两种不同的同种型中存在,其在DNA损伤响应中具有明显的作用,如RSC1或RSC2的存在所定义(
      • 凯恩斯B.R.
      • Schlichter A.
      • Erdjument-Bromage H.
      • Tempst P.
      • Kornberg R.D.
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      两种功能性不同的RSC核小体重塑复合物,含有钩,BAH和溴染色剂的必需品。
      ,
      • Chambers A.L.
      • 棕色
      • Durley S.C.
      • Beacham T.
      • 肯特N.A.
      • 下降J.A.
      RSC染色质重塑复合物的两种不同的同种型在DNA损伤反应中起不同的作用。
      )。在RSC4或RSC8上执行下拉下拉,我们将RSC1和RSC2识别为交互式,证明RSC4和RSC8是RSC复合同种型(补充材料_27min)的一部分。相反,拉下RSC2仅导致RSC2,但不是RSC1作为复杂的成员。这些结果表明,我们的工作流能够以快速的方式识别不同的复杂组合物。

      讨论和前景

      在本研究中,我们已经描述了在LC-MS / MS数据采集的约1天内分析最多96个蛋白质体,其复杂性较低,包括所有开销。我们的交互工作流程采用96孔格式的并行样本生成,以及具有非常高的测序速度的改进的LC设置和质谱仪。通过这种组合,我们证明了样品处理吞吐量和灵敏度以及LC-MS占空比的多重增加。
      包括前酵母培养和样品制备步骤,可以在48小时内实现96个下拉实验的加工。然而,可以并联处理几种96个样本,允许嵌套上游样品制备和下游LC-MS / MS分析。这原则上将允许持续的工作流程每天容量为96个不同的样本。这里提出的数据是在手动样品制备后获得的。然而,我们工作流程中的大多数样品制备步骤只需要液体处理,因此使用机器人样品制备系统容易自动化。
      LC-MS / MS数据采集在每个样品14分钟内将LC和MS系统推动到它们的当前限制。因此,与27分钟的运行相比,14分钟的运行产生降低的色谱质量。虽然这仍然足以产生几乎相同的复杂覆盖,但是14分钟的运行确实导致诱饵和猎物蛋白的序列覆盖率下降(Fig 5B)。这对分析产生了不利影响,更重要的是减少了丰富的价值,使得互动者更难(Fig 2b)。可以在改进的实验设计中获得潜在的优化。在这项研究中,我们专注于完整工作流程的再现性,并选择连续系列步骤中的所有步骤和测量。然而,随机化测量,同时确保一个特定下拉的所有重复始终在同一列上运行,还应进一步提高更高的数据质量和对交互测定的统计学意义。
      双桶系统的实施满足了有趣的可能性。在技​​术方面,它可以通过使用另一柱堵塞和反应,自动检测其中一个柱中的一个柱子,而不是停止进一步分析。为了检测到这种情况,软件在梯度期间跟踪压力的量和在装载期间实现的流量。当加载期间梯度或流速的压力超过关键参数时,系统会自动停止在该特定列上的操作。然后继续作为单桶系统继续操作。这种简单的机制有可能大大延长有效上升时间并使质谱仪的近24/7的操作能够实现。第二种技术可能性是自动测定样品加载的最佳时间。在特定分析柱上装载先前样品期间实现的流速可用于估计当前样品所需的加载时间。然后,软件自动确定装配样品前所需的延迟,例如用10分钟开销,以确保无论流速的波动如何完全加载样品。这对于基于双桶的LC设置尤其重要,因为在长梯度期间,可以想到,在另一个分析柱的梯度开始时,它可以是有害的,然后留在升高的温度条件下分析柱加热器。第三,可以通过使用两个完全独立的UHPLC系统进一步扩展所描述的设置。尽管在由于软件相关的问题导致我们目前的系统上实施的这种概念并不直接,但硬件组件的额外冗余将使错误的UHPLC进行故障排除,而另一个系统保持测量。通过这种方式,正版24/7的LC-MS / MS数据采集操作将是可行的。
      最近,我们报告了一种高性能亲和力富集质谱法(
      • 吉尔霍尔e.c.
      • 嘿m.y.
      通过亲和富集MS而不是亲和纯化MS进行准确的蛋白质复合物。
      )使用精确定量背景和未特异性粘合剂,用于检索真正的蛋白质复合物。我们建议将两种策略结合起来允许有关绑定伙伴的自信检索和高吞吐量。这应该是一个强大的策略,特别是当高序列覆盖率不是必需的时(
      • ong s.e.
      • 李X.
      • Schenone M.
      • 舍瑞斯S.L.
      • carr s.a.
      用生化富集和氧化硅酸鉴定小分子探针和药物的细胞靶点。
      )。此外,我们的结果还表明,AP-MS可以用每次下拉500μg的蛋白输入量低至500μg,并在未来可能更低,这比以前描述的要低得多(
      • 吉尔霍尔e.c.
      • 嘿m.y.
      通过亲和富集MS而不是亲和纯化MS进行准确的蛋白质复合物。
      ,
      • Poulsen J.W.
      • Madsen C.T.
      • 年轻的C.
      • Poulsen F.M.
      • 尼尔森M.L.
      使用胍盐酸盐进行快速高效的蛋白质消化和单步亲和力纯化质谱法。
      )。这种敏感性的增加强烈促进了并行化,从而耗费了吞吐量。目前,我们的管道在大约1天内允许最大吞吐量96个样本。例如,具有更高多路复用的其他量化策略,例如TMT标记,甚至会增加吞吐量。
      虽然我们已经证明了蛋白质 - 蛋白质相互作用的工作流程,但我们的管道是通用的并且可以扩展到任何类型的基于蛋白质的相互作用研究,其中有效地固定诱饵材料作为亲和基质。我们设想其他诱饵,如肽,DNA,RNA,脂质或小分子将极大地促进大规模筛选和阐明的药物靶标,在扰动时蛋白质复合物形成的变化,以及蛋白质和DNA或RNA之间的交织关系。
      最后,此处描述了用于LC-MS / MS部分工作流程的前进也可以扩展到整个蛋白质谱的分析。例如,整个细胞裂解物的生化分馏是质谱基蛋白质组学中的常规方法,因为它能够更深入的表征(
      • 杨F.
      • 沉Y.
      • 营2nd,D.G.
      • 史密斯r.d.
      具有2D蛋白质组学分析的馏分依赖性高pH反相色谱法。
      ,
      • Kelstrup C.D.
      • Jersie-Christensen R.R.
      • Batth T.S.
      • arrey t.n.
      • Kuehn A.
      • Kellmann M.
      • 奥尔森J.V.
      基于Benchtop Quadrupole超高场轨道质谱仪的速度测序快速和深蛋白质。
      )。可以通过使用我们优化的LC-MS / MS设置来减轻由较大数量的级分引起的LC-MS / MS测量时间的伴随增加。在这里,我们证明了我们15分钟的非常短的梯度仍然能够在标准的HeLa消化中识别约700个蛋白质(Fig. 1B)。如果不超过这种复杂性,即使对于细胞系,小型模型生物或临床样品的分馏整个蛋白质蛋白蛋白,也可以进行高通量分析。最后,鉴于蛋白质组学相关技术的指数进展,直到整个蛋白质素可以在几分钟内测量,它应该是时间问题。

      致谢

      我们感谢Max Planck Institute的同事,特别是Marco Hein寻求帮助和富有成效的讨论; Christian Schmid,Martin Wied,Daniel Vik和Gabriele Sowa技术援助; Jochen RECH用于提供GFP酵母菌株; Thermo Scientific的科学家,尤其是Ole Vorm和Ole Hoerning; Sonation GmbH的GeorgVölkle和Wolfgang Schrader。最后,但并非最不重要的是,我们感谢Skunkworks鼓励一个高效的协作工作模型。

      补充材料

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