冲击II,深度霰弹枪蛋白质组学的非常高分辨率四极仪(QTOF)*

      杂交四极杆飞行时间(QTOF)质谱是蛋白质组学中使用的两个主要原理之一。虽然基于简单的基础知识,但在过去几十年中,在可实现的分辨率,质量准确性和动态范围内大大发展。 QTOF仪器的Bruker冲击平台利用了这些发展,在这里,我们开发和评估了霰弹枪蛋白质组学应用的影响。我们加热液相色谱系统的适应达到了非常窄的肽洗脱峰。冲击II配备有具有轴向和径向离子喷射的新的碰撞单元,高于高串联MS频率的倍增离子萃取。新的Repretron和探测器改善了解决功率,与之前的型号高达80%,IE。到40,000岁m/z1222.我们分析了从入口毛细管的离子电流,发现非常高的变速箱(>80%)直到碰撞细胞。模拟和测量表明60%的转移到飞行管中。我们适应QTOF数据的MaxQuant,改善绝对平均质量偏差,以优于1.45ppm。在90分钟的梯度中,可以在一次Hela消化中鉴定超过4800个蛋白质。工作流程实现了高的技术再现性(R2>0.99)复杂混合物中尖峰实验的精确折叠变化测定。使用无标记量化,我们迅速定量了单倍体的单倍体,并表现出来自不同组织的小鼠细胞系中的总蛋白质组差异。最后,在高pH反相分级后,我们确定了9515次蛋白质在三次测量的Hela肽混合物中,11,257蛋白单一测量的小脑 - 到目前为止,Qtof仪器报告的最高蛋白质组覆盖率。
      建立软电离技术的基本进步电离电离电离和基质辅助激光解吸/电离(
      • Karas M.
      • Hillenkamp F.
      具有超过10,000道尔顿的分子量的蛋白质的激光解吸电离。
      ,
      • Fenn J.B.
      • 萌C.K.
      • 黄S.F.
      • 怀特豪斯下午
      大量生物分子质谱的电喷雾电离。
      ),基于MS的蛋白质组学在过去二十年中推出了大量推出(
      • Aeberberold R.
      基于质谱的蛋白质组学。
      ,
      • Cravatt B.f.
      • 西蒙上午
      • yates 3rd,J.R.
      基于质谱的蛋白质组学的生物学撞击。
      ,
      • Altelaar a.f.
      • 慕尼宫
      • Heck A.J.
      下一代蛋白质组学:迈向蛋白质组动力学的一体化视图。
      ,
      • Richards A.L.
      • Merrill A.E.
      • Coon J.J.
      蛋白质组测序深入。
      )。自下而上,霰弹枪蛋白质组学通常在液相色谱 - 串联MS(LC-MS / MS)中进行1 纳米级液相色谱通过电喷雾电离与能够测量质谱并将所公认的前体峰的仪器耦合到能够测量色谱时间尺度的仪器的格式。霰弹枪蛋白质组学的根本挑战包括在相对较短的时期和肽丰度中洗脱的大量肽,其含量变化了许多数量级。朝着更高灵敏度,测序速度和分辨率的质谱仪的发展得到帮助,并有助于解决这些关键挑战(
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      蛋白质组学数据分析中的挑战与机遇。
      ,
      • Kelleher N.L.
      精密蛋白质组学:高分辨率和高质量准确性的情况。
      )。特别是由于它们的高分辨率和质量准确度高,引入了侧面分析仪的引入已经提出了该领域的领域状态(
      • Makarov A.
      静电轴向谐波轨道诱捕:高性能批量分析技术。
      ,
      • Zubarev R.A.
      • Makarov A.
      露天度质谱。
      )。流行的配置将四极杆质量滤波器耦合到压缩台式格式的orbitrap分析仪(
      • Michalski A.
      • 达莫e.
      • Hauschild J.P.
      • lange O.
      • Wieghaus A.
      • Makarov A.
      • Nagaraj N.
      • Cox J.
      • 角horn
      基于质谱的蛋白质组学使用Q辐射,高性能台式四轴锻体质谱仪。
      ,
      • 施泰米r.a.
      • Hauschild J.P.
      • lange O.
      • 霍恩堡D.
      • Denisov E.
      • 达莫e.
      • Kuehn A.
      • Makarov A.
      Q辐射HF,具有预过滤器,高性能四极杆和超高场轨道分析仪的台式质谱仪。
      ,
      • Kelstrup C.D.
      • Jersie-Christensen R.R.
      • Batth T.S.
      • arrey t.n.
      • Kuehn A.
      • Kellmann M.
      • 奥尔森J.V.
      基于Benchtop Quadrupole超高场轨道质谱仪的速度测序快速和深蛋白质。
      )。
      除了MS仪器的改进之外,整个蛋白质组学工作流程都是通过改进的LC系统和计算蛋白质组学的样品制备的关键进展(
      • 周H.
      • 宁Z.
      • 王F.
      • Seebun D.
      • FIGEYS D.
      蛋白质组学反应器及其在生物学中的应用。
      ,
      • kocher t.
      • Swart R.
      • Mechtler K.
      超高压RPLC连字符到LTQ-ORBITRAP VELOS显示峰值容量和鉴定的肽数之间的线性关系。
      ,
      • Cox J.
      用于数据驱动系统生物学的定量,高分辨率蛋白质组学。
      )。在一起,这种进步正在制作霰弹枪蛋白质组学,现在可以在合理的时间内进行深度分析(
      • Kelstrup C.D.
      • Jersie-Christensen R.R.
      • Batth T.S.
      • arrey t.n.
      • Kuehn A.
      • Kellmann M.
      • 奥尔森J.V.
      基于Benchtop Quadrupole超高场轨道质谱仪的速度测序快速和深蛋白质。
      ,
      • Nagaraj N.
      • Kulak N.A.
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Mayr K.
      • HOERNING O.
      • vorm o.
      通过单次超高HPLC在台式壁图上运行酵母蛋白质的系统宽扰动分析。
      ,
      • Hebert A.S.
      • Richards A.L.
      • Bailey D.J.
      • Ulbrich A.
      • Coughlin E.E.
      • Westphall M.S.
      • Coon J.J.
      一小时酵母蛋白质组。
      ,
      • Kulak N.A.
      • Pichler G.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      在真核细胞中施加到复制数估计的最小,包封的蛋白质组学样品处理。
      )。尽管如此,在复杂系统中对所有表达蛋白质的完全分析仍然极具挑战性,并且甚至可能无法实现在霰弹枪蛋白质组学中产生的所有肽的测量(
      • Michalski A.
      • Cox J.
      在单次霰弹枪蛋白质组学中,超过100,000种可检测的肽种类研磨,但大多数是数据依赖的LC-MS / MS无法访问的。
      ,
      • Savitski m.m.
      • Nielsen M.L.
      • Zubarev R.A.
      Modifificom,一种用于映射倒置后翻译后修饰的新型蛋白质组学工具,发现新颖的修饰类型和指纹复合蛋白质混合物。
      )。因此,迫切需要继续改进蛋白质组学技术。
      除了侧面的分析仪和其他离子陷阱技术之外,主要替代的MS技术是飞行时间,这是一种在不同领域几十年来使用的技术。蛋白质组学实验室中使用的配置将四极杆质量过滤器通过碰撞电池和正交加速单元与反射器和多通道板(MCP)检测器(
      • 莫里斯H.R.
      • Paxton T.
      • 戴尔A.
      • Langhorne J.
      • 伯格米
      • Bordoli R.S.
      • 霍伊斯J.
      • Bateman R.H.
      高敏感性禁区激活分解串联质谱法在新型四极/正交 - 加速飞行时间质谱仪上。
      )。 TOF扫描的产生远小于毫秒(MS),并添加了许多这些“脉冲”以获得具有所需信号的MS或MS / MS光谱到噪声比。我们自己的实验室已经使用了如Quadrupole的飞行时间(QTOF)仪器作为蛋白质组学的主要作战多年,但随后转换为高分辨率的诱捕仪器,因为它们的分辨率和质量准确度。然而,TOF技术具有基础景点,例如极高的扫描速度和空间充电的缺失,这限制了所有诱捕仪器中可用离子的数量。原则上,高光谱速率使得能够利用大部分离子的TOF仪器,从而承诺最佳灵敏度,动态范围,因此量化。这还意味着TOF可以自然地与离子迁移率装置接口,这通常是在MS时间尺度上分离离子。数据独立分析策略,如MSE,所有前体都同时碎片(
      • Silva J.C.
      • 丹尼R.
      • Dorschel C.
      • Gorenstein M.v.
      • 李G.Z.
      • 理查森克。
      • 墙D.
      • Geromanos S.J.
      大肠杆菌蛋白质组的同时定性和定量分析:甜美的故事。
      ,
      • Silva J.C.
      • Gorenstein M.v.
      • 李G.Z.
      • vissers J.P.
      • Geromanos S.J.
      LCMSE绝对定量蛋白质:平行MS采集的德形。
      )或条子,其中前体离子窗口通过整个质量范围快速循环(
      • Gillet L.C.
      • Navarro P.
      • 塔特S.
      • 罗斯特H.
      • selevsek n。
      • 重新勒
      • Bonner R.
      • Aeberberold R.
      由数据独立获取产生的MS / MS光谱的有针对性的数据提取:一致和准确的蛋白质组分析的新概念。
      ),还利用QTOF仪器提供的高扫描速度。似乎QTOFS设置为在蛋白质组学中复出近来的综合体,显示了复杂蛋白质组的令人印象深刻的覆盖。例如,使用MS的变体E 方法,在单次射击和小样品量的Hela细胞中报道5468蛋白的鉴定(
      • 遥远的美国。
      • Kuharev J.
      • Navarro P.
      • Levin Y.
      • SCHILD H.
      • Tenzer S.
      漂移时间特定的碰撞能量使得深度覆盖数据无关的采集蛋白质组学。
      )。在另一份报告中,采用离子迁移率以更好地将片段离子传输到探测器,导致人卵巢组织中高达7548蛋白的鉴定(
      • 掌舵D.
      • vissers J.P.
      • 休斯C.J.
      • Hahne H.
      • Ruprecht B.
      • Pachl F.
      • GRZYB A.
      • 理查森克。
      • WildGoose J.
      • 迈尔S.K.
      • 马克思H.
      • Wilhelm M.
      • 那就是我
      • Lemeer S.
      • Bantscheff M.
      • Langridge J.I.
      • Kuster B.
      离子迁移率串联质谱增强了自下而上蛋白质组学的性能。
      )。
      在本文中,我们描述了Bruker Daltonics的Benchtop Qtof仪器的影响II™,以及其在霰弹枪蛋白质组学中的应用。这款QTOF仪器是2008年首次推出的仪器系列的成员,它包括紧凑,影响和最大值。原始影响2011年推出,其次是冲击高清,其配备了更好的数字化器,扩大了探测器的动态范围。随着2014年商业上市的影响II,我们旨在实现足够的解决方案和测序速度,以满足苛刻的霰弹枪蛋白质组学实验。为了实现这一点,我们开发了一种改进的碰撞单元,正交加速器方案,反射和检测器。在这里,我们测量该仪器的离子传输特性以及典型的蛋白质组学实验中实际实现的分辨率和质量准确性。此外,我们研究了单次射击分析中可获得的蛋白质组覆盖,我们询问QTOF性能是否足以用于复杂细胞系和组织蛋白质蛋白质的非常深刻。

      实验步骤

       Hela裂解物的制备

      在Dulbecco的改性鹰培养基(DMEM)中培养HeLa细胞(ATCC,S3亚旋钮),含有10%胎牛血清,20米 m 谷氨酰胺和1%青霉素 - 链霉素(所有来自Paa Laboratories,Freiburg,德国)。通过以200×离心收集细胞 g 10分钟,用冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次,再次离心。小心地丢弃上清液,并将细胞沉淀在液氮中冷冻并储存在-80℃直至进一步使用。含有5×10的颗粒 7 将细胞重悬于1.5ml冰冷的毫级水中,然后加入等体积的三氟乙醇(Sigma-Aldrich,Taufkirchen,德国)。将细胞悬浮液保持在冰上10分钟,涡旋1分钟,并在20%的占空比和输出控制3(Branson Ultrasonics Sonifer,Danbury,CT; Model 250)中超声处理2分钟。加入200μL三(pH8.5,最终浓度:100米m),400μLTCEP(最终浓度:10米m)和400μl2-氯乙酰胺(CAA)(最终浓度:40米m)将裂解物在95℃温育10分钟。然后用50米稀释将样品稀释至15mlm 碳酸氢铵。通过添加Lysc(Wako Chemicals GmbH,Neuss,Neuss;比例1μgLysc:100μg样品蛋白)在37℃下消化混合物,然后添加胰蛋白酶(比率1μg胰蛋白酶:75μg样品蛋白,Promega GmbH,Mannheim,德国)在37°C过夜。在37℃的胰蛋白酶(比率1:125)的进一步消化5小时后,用水稀释估计浓度为1μg/μl的消化肽,并通过加入甲酸(FA)酸化(最终浓度:0.2%)并根据制造商的说明,在Sep-Pak TC18墨盒(Waters,Milford,MA)上纯化。使用Nanodrop分光光度计(Thermo Scientific,Wilmington,De)测定肽浓度。

      酵母裂解物的制备

      在酵母提取物蛋白胨(YPD)培养基(10g / L Bactoyeast,20g / L豆蔻豆蔻中,酿酒酵母(欧洲)在30℃下生长酿酒酵母(eur4743)(欧洲疗法)在30°C中生长TM值 蛋白胨(Bd),2%w / v葡萄糖)。细胞生长为日志阶段(OD600 0.6),通过1200×离心收获 g 在4℃下10分钟,用冷毫Q水洗涤,然后通过10,000×离心再次收集 g 在4°C下5分钟。细胞在1%脱氧​​胆酸钠中裂解,10米m TCEP, 40 mm CAA in 100 mm TRIS pH 8.5,在95°C下煮沸10分钟,并在30%的占空比和输出控制3(Branson Ultrasonics Sonifer; Model 250)中超声处理3分钟。通过色氨酸荧光发射测定法测定蛋白质浓度。将细胞裂解物用Milli-Q水稀释1:2,通过在37℃下添加LysC(Wako Chemicals GmbH,比率1μgLysc:50μg样品蛋白)来消化4小时,然后再加入Lysc(比率1:50 )在37°C下过夜。将相同体积的乙酸乙酯用1%TFA酸化在溶液中,涡旋样品涡旋2分钟,用SDB-RPS滞碱纯化消化的肽,如Kulak所述 等等。 (
      • Kulak N.A.
      • Pichler G.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      在真核细胞中施加到复制数估计的最小,包封的蛋白质组学样品处理。
      )。使用纳米玻璃分光光度计测定肽浓度。

      MEFS,HEPA和NSC细胞系裂解物的制备

      脊髓神经元 - 神经母细胞瘤(NSC-34)(CED-CLU140,Biozol,ECHING,德国),小鼠胚胎成纤维细胞(MEFS)(美国型文化收集,Manassas,VA)和小鼠肝癌(肝癌,HEPA 1-6 )(CRL-1830,美国型培养物收集)细胞系培养,如前所述制备的蛋白质(
      • 霍恩堡D.
      • depper c.
      • 黄油F.
      • Meissner F.
      • Sendtner M.
      初级和细胞系Motoneuron病模型的深层蛋白质组学评估界定了神经元特征的主要差异。
      )。简而言之,将细胞在裂解缓冲液中裂解(4%SDS,10米m 肝脏,pH8.0)在超声处理期间15分钟(5级,Bioruptor; Diagenode,Seraing(Ougrée) - 比利时)。然后用10μm降低二硫键的细胞裂解m DTT 30分钟,随后用55米烷基化m IAA 45分钟。为了除去洗涤剂,将冷丙酮(-20℃)加入到100μg蛋白质中,以终浓度为80%v / v,并且在-20℃下沉淀蛋白质至少2小时。离心悬浮液15分钟(4°C,16,000× g)在50μl6的重新悬浮之前,用80%丙酮(-20℃)洗涤沉淀物在50μl6 m urea/2 m thiourea, 10 mm hepes,pH 8.0。在加入1μg溶液后进行初始消化步骤(3 h),然后用四个体积为50米稀释m 碳酸氢铵和1μg胰蛋白酶在室温下过夜的最终消化。将得到的肽混合物在SDB-rps滞名上脱盐(
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      使用缘物的微纯化,富集,预分化和肽的肽储存的方案。
      )并进行单次LC-MS / MS分析。

      小脑裂解物的制备

      来自单个小鼠的小脑(菌株:C57BL6)在100米的4%SDS中均质化m TRIS pH 7.6使用FASTPrep 24均化器(MP生物医学,德国),在95℃下孵育10分钟,并在30%占空比和输出控制3(Branson Ultrasonics Sonifer; Model 250)中超声处理3分钟。为了除去洗涤剂,将丙酮(-20℃)加入到80%v / v的最终浓度中,并且在-20℃下沉淀蛋白质过夜。在1600×离心后小心丢弃上清液 g 在4℃下20分钟,用80%丙酮(-20℃)洗涤粒料。将蛋白质颗粒溶于8 m Urea in 10 mm 通过使用激发波长为295nm,通过350nm的色氨酸荧光发射测定Hepes和蛋白质浓度。蛋白质用10米降低m DTT 30分钟并用55米烷基化m 碘乙酰胺20分钟。加入硫脲以最终浓度为0.1 m,通过在室温下加入LysC(Wako Chemicals,比例1μgLysC:100μg样品蛋白)来消化样品,用4个体积为50米稀释3小时m 碳酸氢铵,并进一步用胰蛋白酶(比率1μg胰蛋白酶:100μg样品蛋白,promega)在室温下过夜。在使用LysC和胰蛋白酶(比率1:100)的进一步消化R室温后,通过添加TFA(终浓度:0.5%)并根据制造商的说明书在Sep-Pak TC18墨盒(水)上纯化消化的肽。使用纳米玻璃分光光度计测定肽浓度。

      样品制备量化

      通用蛋白质组学标准(UPS-1,Sigma-Aldrich)和蛋白质组学的动态范围标准(UPS-2,Sigma-Aldrich),含有48人蛋白质,无论是在等摩尔浓度(UPS-1)中还是配制成动态浓度范围,涵盖五个数量级(UPS-2),按照参考制备(
      • 王H.
      • 钱W.J.
      • 莫斯塔赫苗
      • 克劳斯T.R.
      • 安德森D.J.
      • 摩尔r.j.
      • 营2nd,D.G.
      • 汗A.H.
      • sforza d.m.
      • Pallavicini M.
      • 史密斯D.J.
      • 史密斯r.d.
      微型和纳米级蛋白质组织制备方法的开发与评价。
      )。将锐化的酵母样品(Promega)以0.1%三氟乙酸重新悬浮至终浓度为500ng /μl。将消化的UPS-2样品用两种不同量的250氟醇至2.5醇肽量掺入样品1和500mmol至5 Amol的样品2中的500mg酵母背景中,从而产生两个样品,具有理论比例1:1酵母蛋白质组和1:2用于UPS肽。在另一个样品中,将消化的UPS-1样品(25种Fmol用于所有组分)掺入500ng酵母中。

      高pH反相分馏

      在2.1×300mM型URC肽BEP柱上,在175μg的Hela或Cerebellum Peptides上进行的高pH反相肽预选化合物串联串联串联填充130埃孔,1.7μm粒径C.18 珠子(第186005792号,水)。基本反相缓冲液的梯度(缓冲剂A:0.1%甲酸,氢氧化铵pH 10;缓冲液B:0.1%甲酸,80%乙腈,氢氧化铵pH10)在突出HPLC系统上进行(Shimadzu,Duisburg ,德国)在60℃下以150μl/ min的流速。 LC RAN持续240分钟,5%缓冲液B的起始浓度在初始120分钟内增加到30%,浓度进一步增加至70%超过70分钟。此洗脱梯度之后是95%的洗涤和重新平衡。馏分收集在0.2ml洗脱后开始,每140秒收集馏分,得到72个级分,用于串联成24个级分(
      • dwivedi r.c.
      • Spicer V.
      • 更难的米
      • Antonovici M.
      • 站立K.G.
      • 威尔金斯J.A.
      • krokhin o.v.
      2D HPLC方案的实际实施,具有高通量自下而上蛋白质组学尺寸的精确肽保留预测。
      )。

      入口毛细管和穴居人Pray

      在我们的仪器中,与许多其他商业离子源设计相比,电喷雾(ES)工艺的高电压施加到真空毛细管入口,而喷雾器保持在地面,这允许更简单的源设计(补充无花果。S1A)。为了使ES电压和真空部分的电电位电耦合,我们使用由高电阻玻璃(〜1GoHM)制成的入口毛细管。定位毛细管入口处的ES电压意味着离子通过气体流量与电梯度相反(
      • 怀特豪斯下午
      • Dreyer R.N.
      • yamashita m.
      • Fenn J.B.
      用于液相色谱仪和质谱仪的电喷雾界面。
      )。在这种配置中,带电分子比周围气体略微慢。根据Bernoulli的定律,离子沿着毛细管的中心轴朝向最高气体速度的区域聚焦。设置往往会减少内毛细壁的污染(
      • Franzen J.
      通过毛细管通过毛细管输送气体中的离子的方法和装置。
      )。
      Bruker Captivespray纳米射线ES源通过可以使用仪器的干燥气体加热的短毛细管延伸,直接连接到真空入口毛细管上(补充图S1A)。喷雾尖端随着毛细管入口自动机械地对准,无需任何调整。穴位的原理是涡旋气体(通常是空气),其在三个不同阶段围绕发射极喷雾尖端扫描。第一个设计用于辅助喷雾地层,第二和第三,有助于将喷雾羽流聚焦到MS入口毛细管中。所有三种流量都仅通过MS系统的真空创建,这要求整个源是真空密封的。
      喷雾发射器由2厘米长,20μM熔融二氧化硅毛细管组成。它的尖端是蚀刻锥形的,因此内径保持恒定到尖端的极端使其非常稳健地防止堵塞。此外,它还允许使用从50nl / min至5μl/ min的流速使用相同的发射器,从而支持各种柱类型。通常用于蛋白质组学的熔融二氧化硅柱通常通过低死体积连接连接到发射器(补充图。S1A),该电触点还提供用于保持电喷雾处的电触点。

      最大限度地减少后彩柱的死量

      使用所描述的设计,CaptivesPray源提供非常稳定的电离;但是,当我们最初耦合到慕尼黑实验室中使用的LC设置时(
      • Nagaraj N.
      • Kulak N.A.
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Mayr K.
      • HOERNING O.
      • vorm o.
      通过单次超高HPLC在台式壁图上运行酵母蛋白质的系统宽扰动分析。
      ,
      • Ishihama Y.
      • Rappsilber J.
      • 安德森J.S.
      用于蛋白质组学的自组装颗粒浆料的微柱。
      ),我们观察到比我们通常做的更广泛的LC峰值洗脱分布(补充图。S1B)。此外,我们希望纳入柱式烤箱和拉动尖端柱。因此,我们构建了一个修改的源,它将捕获的后端保留,但通过我们部门使用的标准设置替换前端。包含尖端列的修改后的设置在补充图中。S1 C。列支架的修改设计允许精确对准和固定捕获源中的列。使用柱头的连接发球件施加电气接地。该设置产生了所需的窄LC峰值分布(补充图。S1 D)并且用于本文中描述的蛋白质组学分析。

      LC-MS / MS分析

      我们使用了一条Easy NLC-1000(Thermo Fishific)在线,耦合到冲击II(Bruker Daltonics),带有Captivespray离子源(Bruker Daltonics)。将肽混合物(1μg)加载到内部填充柱(50cm,75μm内径)上,填充C.18 材料(ReprosiL-Pur C18 AQ1.9μm反相树脂,Maisch GmbH博士,德国Ammerbuch-Rententen)。使用5-30%缓冲液B(80%AcN和0.1%Fa)的线性梯度以250ng / min超过90分钟的流速进行色谱分离。由于加载和洗涤步骤,LC-MS / MS运行的总时间较长约40至50分钟。
      通常,使用数据依赖的Auto-MS / MS方法获取LC-MS / MS数据,从循环中选择17个最丰富的前体离子进行碎片化,并调整到前体强度的MS​​ / MS求和时间(Compass 1.8获取和处理软件,Bruker Daltonics)。对于细胞系的深度蛋白质组测量与肽分馏组合,我们使用了“动态方法”,具有3秒的固定循环时间。 MS扫描的质量范围设置为延伸到 m/z 150至1750.动态排除持续时间为0.4分钟。使用α进行前体离子的分离 m/z 依赖的隔离窗口为1.5-5。碰撞能量在23-65 ev之间调整为23-65eV m/z value.
      为了定量分析酵母UPS标准的定量分析,我们使用了捕获柱设置(Pepmap PRO)(2cm×100μm; Thermo Scientific)和Dionex HPLC泵(Ultimate 3000,Thermo Scientific)。对于该实验,使用90分钟的多步法梯度(缓冲液A:0.1%Fa; Buffer B 100%ACN在0.1%FA中的Pepmap UHPLC柱(50cm×75μm,2μm; Thermo Scientific)上分离肽(50cm×75μm,2μm;热科学)。 )。未经修改的备用支散离子源(见上文)用于将LC系统与冲击II界面界面。对于定量,以1Hz的光谱速率获取全扫描MS光谱,然后获取1ms / MS光谱。获得每个样品的六次重复。对于酵母样品中UPS-1的数据采集,选择17个最强烈的前体离子进行碎片化,得到总循环时间为1.2秒。

      完整蛋白质分析

      Adalimumab在具有IDE(制造商,Genovis)的铰链区域处被切割,并降低以获得最近描述的Fc / 2,FD和轻链子单元(
      • Ayoub D.
      • jabs w.
      • Revemann A.
      • evers w。
      • 埃文斯C.
      • 主要L.
      • Baessmann C.
      • Wagner-Rousset E.
      • Suckau D.
      • 贝克A.
      通过完整,中间,下下,下降和自下而上的ESI和MALDI质谱技术,通过完整,中间,下下的组合和大规模的主要结构评估和广泛的甘油 - 分析。
      )。亚单位通过色谱分离(
      • Ayoub D.
      • jabs w.
      • Revemann A.
      • evers w。
      • 埃文斯C.
      • 主要L.
      • Baessmann C.
      • Wagner-Rousset E.
      • Suckau D.
      • 贝克A.
      通过完整,中间,下下,下降和自下而上的ESI和MALDI质谱技术,通过完整,中间,下下的组合和大规模的主要结构评估和广泛的甘油 - 分析。
      )在分析冲击II之前。使用SNAP算法进行分析数据以适应理论模式(
      • Senko M.W.
      • Beu S.C.
      • M单章锥体F.W.
      从分辨同位素分布中测定大型生物分子的单同位素质量和离子群。
      ,
      • Tsybin Y.O.
      • Fornelli L.
      • 钢琴C.
      • Luebeck M.
      • Parra J.
      • 托盘S.
      • Wurm F.M.
      • 哈特默·罗
      电子转移解离质谱法对完整单克隆抗体的结构分析。
      )。

      QTOF.数据的MaxQuant开发

      通常,来自标准MaxQuant计算工作流程的所有处理步骤,用于分析orbitrap数据,也应用于Qtof数据。非线性质量重新校准算法经历了主要适应性。其用于orbitrap的原始形式适用于两个变量对非线性依赖的重新校准函数 m/z 和保留时间。它已经扩展到包括质量重新校准取决于第三维度的峰值强度。这是必要的,因为通常在飞行数据时通常在飞行时间中找到的可观系统的非线性强度依赖性峰值质量偏移。强度依赖性在峰值强度的对数中作为多项式参数化。新的质量重新校准算法允许高质量的精度,而无需使用内部或外部校准物。
      我们添加了一个名为“Bruker Qtof”的新仪器类型,其中用于处理光谱处理的几个相关参数被设置为适合于分析由影响族产生的数据的默认值。这些参数包括用于组装3D峰值的质量匹配窗口,用于组装同位素图案和标记对的质量公差,初始肽质量公差窗口,用于安德罗姆的搜索和每3D峰值的最小所需扫描数。原始数据可以立即从专有的Bruker二进制格式读取,并且不需要转换到中间文件格式。峰质心用于由Bruker软件的精心算法确定。 MaxQuant的查看器模块已启用用于QTOF数据,其中其他功能允许可视化MS数据 m/z - 托管时间地图和注释和出口MS / MS光谱,以满足报告谱证据的日记要求。

      蛋白质组学数据分析

      使用MaxQuant软件(1.5.2.8或1.5.0.1版)分析所有数据(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      andromeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      ,
      • Cox J.
      • 嘿m.y.
      • Luber C.A.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      通过延迟标准化和最大肽比例提取的精确的蛋白质组无标记量化,称为MAXLFQ。
      )与Andromeda搜索引擎(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      andromeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )上面描述的适应和发展。对于蛋白质和肽,假发现率(FDR)设定为1%,并且我们指定了七个氨基酸的最小长度。基于在前体块的时间依赖性重新校验后,基于搜索的基于搜索基于搜索的识别肽的识别肽基于初始允许的预校正。允许的片段质量偏差为40ppm。 Andromeda搜索引擎用于MS / MS Spectra搜索对Uniprot人类数据库(2014年6月21日,包含88,976个条目和247个污染物),Uniprot Saccharomyces Cerevisiae数据库(2014年6月21日下载,包含6643个条目),Uniprot鼠标数据库(2014年6月21日下载,包含51,573个条目)和UPS Fasta文件由Sigma-Aldrich提供( http://www.sigmaaldrich.com/life-science/proteomics/mass-spectrometry/ups1-and-ups2-proteomic.html)用于定量研究。将酶特异性设定为C-末端以Arg和Lys,也允许在脯氨酸键处切割,最多两个错过的裂解。作为可变修饰选择固定改性和N-末端蛋白乙酰化和甲硫氨酸氧化的氨基甲酰甲酰化。
      MaxQuant的“运行之间的匹配”特征用于将标识转移到基于其质量和保留时间(最大偏差0.7分钟)将标识转移到其他LC-MS / MS运行,并且这也用于定量实验。用最近描述的无标记算法进行量化(
      • Cox J.
      • 嘿m.y.
      • Luber C.A.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      通过延迟标准化和最大肽比例提取的精确的蛋白质组无标记量化,称为MAXLFQ。
      )。我们需要最小肽比数和至少一个“剃刀肽”的定量计数。对于小脑,量化基于正常化的蛋白强度。数据的进一步分析是在MaxQuant Viewer中进行的,在Perseus Post数据采集包中是MaxQuant的一部分(全部免费提供的 www.maxquant.org.)在R统计计算环境中(
      R核心团队为统计计算的语言和环境。
      )。
      仅通过进一步分析严格排除潜​​在的污染物以及仅通过现场修饰鉴定的蛋白质。
      为了定量分析酵母的UPS标准,只有在所有12个重复中都有有效的值,才接受条目。然后将结果过滤,用于柔软的UPS-2蛋白的显着调节。
      酵母样品的分析基于无标记的强度(LFQ值)。过滤后(在至少一个组中的3个有效值)后,剩余的缺失值从正态分布(宽度:0.3;偏移:1.8)避阻。两个样本 t 用FDR进行测试< 0.01.
      对于全局细胞系比较,每次细胞系分析两次六次单次测量的三次单次(仅测量一次的NSC-34细胞线)。对于不同小区线的主成分分析(PCA),我们将在至少一组六个复制中限制数据集(LFQ强度)将数据集(LFQ强度)限制在至少一组中,至少有四个有效值。剩余的缺失值是从正态分布避阻的(见上文)。
      将细胞样品的蛋白质强度(总结肽强度)除以蛋白质丰度排名的分子量。注释(GO分子功能,生物过程,细胞组分; Kegg和Uniprot关键词)与具有Perseus的蛋白质组匹配。我们进行了1D注释浓缩(
      • Cox J.
      1D和2D注释富集:一种与互补高通量数据相结合定量蛋白质组学的统计方法。
      )关于归一化的蛋白质强度。为了评估蛋白质组覆盖范围,我们计算了我们样本中的类别的发生,并将其与Perseus的完全小鼠蛋白质组的类别计数进行比较。
      MS原始数据和用于蛋白质和肽识别和定量的数据作为补充表,通过具有数据集标识符PXD001592的骄傲伙伴存储库作为补充表。

      结果和讨论

       仪器概述

      Bruker Impact II是QTOF以BEBCHTOP格式,其设计具有几种改进(Fig. 1)。简而言之,离子在捕获饼干中产生,其在包装的纳米电子助推源中,其具有明确限定的气流,以通过毛细管入口将离子引导到真空中。双离子漏斗,基于史密斯和同事描述的原理(
      • Shaffer S.A.
      • 之前的D.C.
      • 安德森G.A.
      • UDSeth H.R.
      • 史密斯r.d.
      一种离子漏斗界面,用于改进离子聚焦和使用电喷雾电离质谱法的灵敏度。
      ),被定位在轴上,其防止中性沿离子路径进一步传递。压力从毛细管出口到后筋级(3毫巴到3×10的尺寸下降了几个数量级−4 MBAR),而离子电流几乎不明显(见下文)。另外,漏斗允许基于低电场强度的软转移独立于质量(通常为10V / cm,远低于喷嘴 - 撇油设计)。通过在两个漏斗之间引入电气加速度,仍然可以故意实现源自源片段化。漏斗和分析四极杆质量过滤器之间存在六脂离子引导,其具有基于高精度玻璃的整体设计。该四极可分离前体离子,用于碰撞细胞中的后续碎裂。完整的离子或片段可以从碰撞小区存储和提取,并进入正交偏转区域,作为非常窄的离子束(<500μm)。在这里,它们加速到无场的漂移区域。新设计的两级反射仪进一步补偿了与光束方向正交的速度分布。最后,离子在耦合到10位,非常高频(50 Gbit / s),零噪声数字转换器上的MCP检测器上冲击。数据收集由Bruker Compass数据系统协调,并且在这里描述的实验中,在MaxQuant环境中执行后期数据处理。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1冲击II质谱仪(不缩放)的示意图。

      优化碰撞细胞

      LC-MS / MS时间标度上的前体离子的高效碎片是捕杀蛋白质组学策略中肽鉴定肽的关键。我们优化了碰撞单元的几个方面(补充图。S2A):精确的几何对准允许沿着碰撞电池的轴线聚焦离子,直接转化为正交加速器的明确定义的起始条件,因此对于高质量分辨率是强制性的。这是通过碰撞小区设备的四极性配置来实现,提供窄伪势阱(
      • Gerlich D.
      不均匀的RF场是用于研究具有慢离子的过程的多功能工具。
      )。我们还在任何两个MS或MS / MS实验之间引入了径向喷射步骤,以减少死区时间。必须清空离子路径以避免在两个连续光谱之间的串扰而不引入大量离子损失。最重要的是,我们优化了片段光谱内的离子碎片和提取的时间,以通过实现电轴析场梯度来确保高频MS / MS。该梯度将离子引导朝向碰撞单元的出口,减少在淬火碰撞细胞之后在第一离子到达提取透镜的时间。从这里,它们可以朝向正交加速器迅速释放,形成与正交脉冲频率匹配的封装。 3ms后的离子密度(补充图中的上红色迹线。S2B–S2C)揭示了两个重要方面:使用轴向场梯度导致碰撞电池出口处的相当离子密度远短得多, IE。 在大约1毫秒而不是3毫秒之后。这表明离子转移更快三倍。此外,在淬火时,碰撞电池内的离子的总数降低至小于50%,这应该减少与淬火相关的离子损失相应。
      在不同的实验中确认了伪电位计算和模拟,比较了优化的碰撞细胞对不同MS / MS采集速率的胶纤维肽B碎片产率的性能(补充图3. S2D)。这揭示了淬火损失的降低实际上以16Hz的光谱速率改善了两倍的光谱速率。我们进一步观察到,即使在杆上的轻微污染情况下,轴向场梯度也提高了系统的稳定性。

      正交加速单元的高转移效率

      离子穿过飞行管,需要尽可能多的时间 m/z 在HV脉冲仪可以向检测器(通常在100到150μs之间)之前,物种需要到达检测器。为了避免过度损失离子,因此正交的TOF仪器通常以在TOF扫描期间将离子储存在碰撞单元中并及时释放正交加速器的时间的模式。如果所有离子确实转移,这将允许100%占空比,使得它们同时在正交促进剂中到达并且具有相同的动能。然而,在实践中,从碰撞单元朝向栅极镜头的提取时间是离子迁移率的函数。我们通过改变从打开栅极镜头的时间来分析这些组合效果,从而为不同的正交加速器(转移时间)的提取脉冲 m/z ratios (Fig. 2A)。离子轨迹和提取时间的模拟表明,在最佳转移时间条件下,约80%的单离子物种可以加速到TOF分析仪的漂移管中。在冲击II中,通过减少捕获区域和正交加速器之间的距离来进一步优化高转移效率 - 与在连续操作模式下操作的传统QTOF系统相比,它比较高了四倍。 图2.A 总结所选前体的相对传输效率(m/z 在100μs的转移时间下= 322th,922th和1522秒,这是一个标准设置,以覆盖在霰弹枪蛋白质组学中相关的质量范围。分析突出了低电平的离子 m/z 大多数人受到损害,我们以前通过添加特殊的提取条件来抵消蛋白质组学实验(
      • 斯丁H.
      • Kuster B.
      • Fernandez M.
      • Pandey A.
      正离子模式中前体离子扫描四极谱法测定酪氨酸磷酸化肽的检测。
      )。为了以一种更通用的方式解决这个问题,Bruker引入了“转移时间踩踏”操作模式,其中提取了第一高迁移率物种,然后是具有较低移动性的物种。在门的最初短短时间(通常为总扫描的50%)中,只有更高的移动性,低 m/z 离子通过栅极镜头,而下迁移率离子仍然累积在碰撞单元中。在第二转移时间步骤中,提取时间增加以允许低移动性,更高 m/z 离子通过栅极镜头。具有且不转移时间踩踏的光谱,揭示了对低质量离子的有益效果,在标准质量范围内没有明显的损失(Fig. 2B)。这对于标记依赖低质量报告离子的实验特别有益,如图所示。这些离子在低温下以大于60%的效率转移 m/z 萃取相和分析的片段光谱中的离子总量增加58%。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2A,绝对的离子强度 m/z 322,922和1522作为转移时间的功能。 每个分布的最大值 m/z 值是有效转移到飞行管中的最佳时间。 B,ITRAQ的片段谱标记为肽LFTGHPTPELLEK没有(蓝色)和(红色)转移时间踩踏增加较低的 m/z 包括报告离子的范围,而不会在较高质量范围内牺牲强度。
      我们的发展在一起导致了整体传输效率>60%进入正交加速度单位。这对最近的报告有利地进行了比较,其中对片段离子进行离子迁移率,并且它们的到达时间与正交提取同步,这导致对标准操作的检测灵敏性的提高至多10倍以下(
      • 掌舵D.
      • vissers J.P.
      • 休斯C.J.
      • Hahne H.
      • Ruprecht B.
      • Pachl F.
      • GRZYB A.
      • 理查森克。
      • WildGoose J.
      • 迈尔S.K.
      • 马克思H.
      • Wilhelm M.
      • 那就是我
      • Lemeer S.
      • Bantscheff M.
      • Langridge J.I.
      • Kuster B.
      离子迁移率串联质谱增强了自下而上蛋白质组学的性能。
      )。

      敏感性和离子转移

      成功通过仪器的离子数量,最终记录确定质谱仪的敏感性。我们对沿离子路径的转移效率感兴趣,从进入探测器的真空系统。为了通过实验确定这一点,我们注入了1pmol /μLBSA溶液或坯料溶液,并测量了这些条件之间的离子电流的差异。当将毛细管和漏斗区域的出口作为法拉第笼进行操作时,我们测量了63Pa的净离子电流,我们定义为起始值(100%)(Fig. 3)。第一漏斗的大离子接受孔径有效地捕获离子通量离开毛细管。它将离子转移到第二漏斗中,这也通过下一阶段以几乎无损方式通过离子,这证明了57 PA的净电流读数(>90%)六烷基后。同样地,超过90%的离子通过四极(在非肥胖选择操作中)和碰撞细胞转移。这些离子的超过60%通过正交加速器传输到飞行管中(见上文)。反射件包含两个网格,每个网格通过两次,导致几何定义的整体传输为74%。虽然所有这些离子都达到了MCP,但并非所有这些都进入通道,并非所有这些都不会导致二次电子(检测器量子产量)。但是,当产生二次离子时,它们被大大放大(>106 折叠),可以从电子噪声(零噪声检测)有效地区别。在一起,这导致我们的MCP检测器的估计检测概率为30%。尽管并非所有这些测量和估算非常精确,但它们表明将离子的总体检测概率传递到真空系统约10%。这种优异的数字是因为ES源产生的连续光束可以利用,并且所有离子引导元件已经成功优化了高传输。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3霰弹枪 - 蛋白质组学实验中最相关的质量范围的离子转移效率(m/z 100–1500). 插图在指示的测量点处显示净分析物离子电流,并在沿着冲击II仪器的飞行路径处处于各个阶段的正交加速器处的转移效率。

      分辨率和质量准确性

      对于影响,实施了几种改进:对称屏蔽,用于更好的离子聚焦;线网格增加传输;低温系数陶瓷间隔物,减少温度相关的质量漂移和改进的轴承轴承,以精确对准。这导致全蛋白质组学质量范围的分辨率增加约35%。由于通过更好地聚焦离子的重点,因此预期噪声的质量精度和信号相应地增加。对MCP检测器的改进包括增加的入口孔径,更高的电子加速场和优化的屏蔽。总的来说,这些措施导致2倍的离子冲击瞬变和30%的MCP检测效率高30%。
      总之,通过引入新的碰撞单元,反射器和检测器,预计TOF分析仪的分辨率将增加约70%至80%。为了在标准蛋白质组样本上实验测试,我们将数据分析了来自Hela消化的数据。典型肽的分辨率超过33,000,如实施例所示 Fig. 4A。分辨率的进一步增加可以通过“焦点模式”获得,这涉及实时处理和连续脉冲的对准并增加飞行时间确定的准确性,当多个物种同时到达检测器时(
      • rathtätho.
      飞行时间质谱仪的高分辨率检测。
      )。如图所示,这可能有助于解决蛋白质的同位素分布 Fig. 4B,该分辨率超过60,000的抗体亚基(>25 kda)。在TOF测量中,分辨率往往会增加 m/z (Fig. 4C),并为TuneMix组件达到40,000多个以上 m/z 1222.这构成了对先前的影响模型的70%至80%,影响高清。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4分辨率和质量准确性 A,肽同位素簇(m/z 558.8063, r = 33k)和 B,Adalimumab的FD单位(m/z 25442.5157, r = 63k, 0.26 ppm). 通过改进的探测器整体改进分辨率, C,依赖于总结肽强度,实现了质量准确度, D,在霰弹枪蛋白质组学实验中,使用Qtof优化版本的MaxQuant。
      解决能力的这种增加还应暗示蛋白质组学样本中的质量准确性,我们使用软件包MaxQuant测试,我们通过“实验程序”下描述的QTOF数据进行了调整到QTOF数据。 MaxQuant的特殊特征是各个质量准确度值的提取(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      ,
      • Cox J.
      • 哈伯纳N.C.
      离子阱串联质谱中包含多少肽序列信息?
      ),它允许在鉴定肽的鉴定中有效地利用高质量的精度。 MaxQuant最初是根据Hybrid orbitrap仪器的数据开发的。在这里,我们进一步发展了MaxQuant,以便分析QTOF数据,并且在这种情况下,从非线性质量重新校准算法提供的高质量准确性中的利润。由于环境温度漂移引起的热膨胀,QTOF数据中的特殊挑战是大规模规模的漂移。 MaxQuant采用双重搜索策略,实际上在每个蛋白质组学样本内部提供数百个参考质量。该特征有效地去除温度相关质量漂移的任何效果。该“软件锁定质量”功能使得不必使用专用的分子物种来校准光谱(
      • Cox J.
      • Michalski A.
      软件锁定质量通过二维最小化肽质量误差。
      )。随着这些发展在MaxQuant中,我们分析了超过90分钟的梯度运行的肽质量误差分布(Fig. 4D)。这表明平均绝对质量偏差为约1.45ppm,这对于QTOF仪器非常出色。

      单次分析的影响II性能

      为了探讨霰弹枪蛋白质组学的影响II的性能,首先分析了以单次营养形式(实验程序)衍生自哺乳动物细胞系的复杂肽混合物。我们通过在线HPLC分离1μg肽摘要,并在我们的实验室中使用的标准90分钟梯度进行三份分析。自下而上蛋白质组学中的典型数据相关采集方案包括MS扫描,后跟最强烈的前体的N MS / MS片段扫描(TOPN方法)。期望选择n使得总循环小于几秒钟。对于我们的测量,我们针对占空比为1.3秒,并设计了一个Top17方法,由200ms用于MS采集和适用于前体强度的MS​​ / MS集成时间。我们发现这一点是在MS中获取高S / N之间的良好平衡,并在MS / MS光谱中实现HELA消化的最佳离子强度。这种方法达到了7000多毫秒和79,700毫秒/ ms扫描。在每次运行MaxQuant,平均鉴定35,580个独特的肽序列,这导致三份分析中的48,172个独特的肽序列( 表I.)。这些肽每次运行平均为4854蛋白,并且Hela蛋白组共有5210个蛋白质,具有三个90分钟的梯度(Fig. 5A),表明可以使用相对较短的单次分析来实现深度覆盖。根据其质量精度和保留时间在运行之间传输识别(“MaxQuant中的运行”功能之间的“匹配”)导致每次运行约5100个蛋白质标识。比较三份分析之间的蛋白质身份(没有“运行”之间的“匹配”),我们观察到超过90%的蛋白质被鉴定在其中每个蛋白质(Fig. 5B)。这表示高再现性和最小的“缺失值”问题。通过优异的再现性进一步支持这一结论(R.2 = 0.998)在运行之间的成对比较中确定的无标签强度(maxquant lfq值(
      • Cox J.
      • 嘿m.y.
      • Luber C.A.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      通过延迟标准化和最大肽比例提取的精确的蛋白质组无标记量化,称为MAXLFQ。
      ,
      • 王Y.
      • 杨F.
      • 格里尼科米。
      • 王Y.
      • 克劳斯T.
      • 刘涛。
      • 沉Y.
      • Monroe M.E.
      • Lopez-Ferrer D.
      • 里诺T.
      • 摩尔r.j.
      • klemke r.l.
      • 营2nd,D.G.
      • 史密斯r.d.
      具有多级分阶层替代策略的反相色谱,用于人MCF10A细胞蛋白质组分析。
      ))(Fig. 5C)。我们还确定了在1μg酵母消化的单一射击中鉴定的蛋白质数量。平均而言,每单次射击测量时,我们每单单次,90分钟梯度和总共3627蛋白鉴定3352蛋白(Fig. 5D)。
      表I.使用标准90分钟梯度识别HeLa和酵母裂解物三份分析
      MS扫描同位素模式MS / MS扫描识别率[%]确定的肽序列蛋白质确定
      HeLa_17002759,77479,70447.0935,5474870
      HeLa_27181769,35579,87647.2235,5724864
      HeLa_37272796,08681,38946.5735,6214828
      全部的46.9648,1725210
      yeast_14873528,68263,68231.0817,0663361
      yeast_2.4732541,19466,44130.8816,9213325
      yeast_3.4691556,675.66,97831.9817,4943369
      全部的31.3224,1313627
      图缩略图GR5.
      Fig. 5用90分钟梯度进行一次射击分析的Hela和酵母消化的三重分析。 A,每次重复的蛋白质鉴定数1μghela消化和 B,蛋白质标识的重叠。 C,在副拷贝1(hela_01)和replicate2(hela_02)中的等级有序的无序量化值之间的级别无序量化值之间的相关性(log10 lfq强度)。 D,蛋白质鉴定1μg酵母消化。 E,跨海程摘要三重分析的再现性。所有三个重复的CV,代表了99%的数据点。 F,量化准确性。峰值实验结果显示UPS-2标准(橙色)和酵母蛋白质组背景(灰色)。酵母裂解物以相等的量存在于样品1中,并样品2,并且UPS2蛋白标准在样品2中的两倍中存在。

      定量的再现性和准确性

      为了评估无标记量化方法的再现性,我们确定了无标记强度的变化系数(CV),在三个技术HELA复制之间的配对比较中确定(见上文)。超过90%的量化蛋白质,CV小于10%(Fig. 5E)。对于最低强度定位,中位数为0.05,最高为0.03(Fig. 5E, 补充图S3)。这显示了超过四个数量级的可再现量化。
      不同表达蛋白质的准确定量仍然在广泛的浓度范围和来自一个非常稳定的分析平台的益处来挑战。 QTOF仪器已广泛用于无标记量化,原则上可以方便地分析和比较任意数量的样品。为了评估抗冲击II平台的无标记定量能力,在复杂的混合物中,我们希望使用具有已知比例的参考样品,用于小蛋白质的小蛋白。我们掺入了通用蛋白标准2(UPS-2),由48个蛋白质组成,覆盖5个数量级的动态范围,两种不同浓度进入酵母蛋白质组。该产生的两个样品,其中酵母肽应为1:1,而UPS-2肽的比例应为1:2。为了增加所鉴定的肽的数量,我们将使用Equimolar UPS-1,我们也将其飙升在酵母背景中。这使得肽鉴定将肽标识转移到酵母中的UPS-2中的未曲线肽通过MaxQuant中的“运行”算法之间的“匹配”。我们鉴定了含有等摩尔UPS-1标准含有酵母的样品中的所有48个人UPS蛋白。在这些蛋白质中,在12个单次酵母测量中的每一个中,用动态UPS-2标准鉴定23例,通过MS / MS直接通过MS / MS或通过这些蛋白质中的运行和18个之间的匹配显示Welch-Informance( Fig. 5F)。在这些相对较快的测量(90分钟梯度)中,我们在超过三个数量级上鉴定和量化了UPS-2蛋白。 UPS-2蛋白的平均折叠变化为0.49(±0.06),接近理论比为0.5。

      量化酵母蛋白质组的变化

      要测试系统生物学背景下的工作流程,我们分析了二倍体和单倍体(Matα细胞)的蛋白质组变化 S. Cerevisiae.。我们用标准的90分钟梯度分析了从技术四倍体中的单倍体和二倍体细胞的2μg酵母消化。这鉴定了3769个蛋白质,使用“运行之间的匹配”。对于统计分析,我们仅考虑在单倍体或二倍体的至少三种重复中检测到的LFQ强度。过滤后,3222个蛋白仍有进一步分析(实验程序)。剩余的缺失值从正态分布避阻。技术复制与其他基因型相关的相互关联(R.2 大0.98 相对 R2 约0.92; Fig. 6A)。与我们以前关于Silac标记的单倍体和二倍体酵母的大规模分析(
      • De Godoy L.M.
      • 奥尔森J.V.
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      综合质谱型蛋白质组定量单倍体与二倍体酵母。
      ),我们发现比单倍体细胞更丰富的转座子(Fig. 6B)。 STE3,信息素A因子受体是特异于单倍体酵母的,从其交配状态预期。同样在二倍体中缺席,但在单倍体细胞中存在是SST2,GPA1的GTP酶活化蛋白质(
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      SST2是用于GPA1的GTPase-is-活化蛋白:酵母中的同源RGS-GALPHA蛋白对的纯化和表征。
      ),始终如一地显示出单倍体细胞中表达更高的表达。相反,作为特定孢子化的壁成熟蛋白的SPS100是特异性的二倍体细胞。通过传统方法进行这样的系统范围广泛的比较将需要成千上万的单个免疫印迹。甚至与通过定量MS进行的以前的大规模研究相比(
      • De Godoy L.M.
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      综合质谱型蛋白质组定量单倍体与二倍体酵母。
      ),我们在这里使用的酵母输入材料的少于1%和测量时间。这说明了基于MS的蛋白质组学成为一种回答生物学问题的可行方法的快速度。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6A,单次LIS LC-MS / MS测量的单次HAPOID(H)和二倍体(D)酵母样品的相关性。 所有技术复制相关值都是> 0.98. B,单倍体与二倍体酵母蛋白质组之间的定量差异。红细胞标记为红色的蛋白质在单倍体细胞中显着丰富。 C,小鼠肝癌(HEPA 1-6),小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和运动神经元细胞系(NSC-34)的LFQ蛋白表达水平的主要成分分析(PCA)。 D,从PCA获得的前两个主成分绘制在 C。插图表示沿PC轴的显着富集注释(FDR<0.05)。各自的富集分数在括号中规定。

      不同细胞系的全局蛋白质组学比较

      作为典型蛋白质组学实验的第二个例子,我们将基于QTOF的工作流程应用于常见细胞疾病模型系统的表征。为此目的,我们将脊髓神经细胞母细胞瘤(NSC-34),小鼠肝癌(HEPA 1-6)和小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞系的蛋白质组进行了比较。使用90分钟的梯度在单射下分析所有细胞裂解物,然后使用最大的无标记量化算法进行量化。观察到的LFQ强度在Pearson相关系数所示的生物和技术复制之间是高度可重复的> 0.97 (补充图S4)。
      经过严格的过滤(实验程序),我们进行了主要成分分析(PCA),以评估细胞系在全球范围内的相似性和异化。从PCA空间中非常紧密地群集的单个单元线复制,前两个主要成分占我们数据集中的累积方差的71%(Fig. 6C)。有趣的是,在第一原理组分中,Motoneuronal细胞系NSC-34清楚地与HEPA 1-6和MEF细胞分离,而两种正交的主成分描述了两种非神经元细胞系之间的差异。在后一组分中,NSC-34位于HEPA 1-6和MEF之间的半路。
      为了评估作为三个细胞系之间分离的主要驱动器的个体蛋白质,我们绘制了前两个主要成分的负载(Fig. 6D)。 HEPA 1-6细胞的特征在于参与调节和代谢过程的基因产物。正如我们之前所发现的那样(
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      细胞系和原发性细胞的比较蛋白质组学表型评估细胞类型特异性功能的保存。
      ),与糖酵解途径相关的蛋白质,例如醛脱氢酶(ALDH)家族,在HEPA 1-6中高度代表。毫不奇怪,驱动MEF的分离的蛋白质主要与胶原合成相关,例如Col基因家族和预胶原C-胚乳酶增强剂1(Pcolce)。沿着主成分1分化的蛋白质包括细胞骨架轴突的各种组分,包括PRPH和神经细胞的重链和轻链(NEFH和NEFL)。此外,参与轴突引导(ENAH,DYPSL5和TUBB3)和神经元投影(UCHL1,GAP43)的基因产品对于NSC-34具有高度独特的。分离来自其他细胞系的NSC-34的蛋白质被显着富集神经递质转运,同时我们分别观察到MEF和HEPA 1-6细胞对组分2的富集,进一步展示了蛋白质组学如何突出生物学功能的富集。鉴于我们以前发现的,包括NSC-34缺乏独特的神经元特征,鉴于我们之前发现的蛋白质蛋白质缺乏独特的神经元特征,作为轴突生长和引导中的几个关键演员耗尽或低
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      初级和细胞系Motoneuron病模型的深层蛋白质组学评估界定了神经元特征的主要差异。
      )。结果,我们只在中途放置了运动神经元细胞系 体内 运动神经元和非神经元控制。尽管如此,我们的无标签QTOF的工作流程非常适合在短时间内分析生物系统中的微妙改变。

      细胞系深蛋白质组分析的影响II性能

      为了评估深度蛋白质组覆盖的影响II,我们在ref中描述了用部分倾斜进行了高pH反相预分馏,如ref(
      • dwivedi r.c.
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      2D HPLC方案的实际实施,具有高通量自下而上蛋白质组学尺寸的精确肽保留预测。
      )。我们装载了175μg的HeLa肽混合物,收集72个级分并将它们组合成24个级分(实验程序)。使用标准的90 min LC-MS / MS梯度(每次重复48小时的总测量时间),在技术三份酸盐中分析这些级分。而不是上面描述的简单TOP17方法,我们在此处使用具有固定循环时间的所谓的“动态方法”和适用于前体强度的MS​​ / MS集成时间。我们发现该方法有助于为低丰富的肽产生高质量的MS / MS光谱。
      图7.A 描绘作为分析的级分数函数鉴定的独特肽的累积数量。增加是几乎是线性的,表明使用高pH分馏的其他人观察到级分和良好的正交分离功率之间的肽鉴定的小重叠(
      • 王Y.
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      具有多级分阶层替代策略的反相色谱,用于人MCF10A细胞蛋白质组分析。
      )。该图还表明技术复制之间的再现性非常高。平均来,我们确定了107,038个独特的肽,映射到8995左右蛋白质(蛋白质FDR 1%; Fig. 7B)。总共确定了138,086个独特的肽,导致9515个不同的蛋白质组。这是我们了解用QTOF仪器测量的人体细胞系的最深蛋白质组覆盖。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7在24个高pH级分中的三份细胞系和单态组织分析。 A,Hela三份分析鉴定肽的累积次数。 BHela鉴定蛋白质的累积次数复制和小鼠小脑的单次分析(48小时总测量时间)。 C,等级有序的每种鉴定的蛋白质(log10强度)的细胞的强度。参与神经变性障碍的蛋白质标记为红色;小脑特异性表达的蛋白质标有蓝色和绿色的受体选择。 D,蛋白质丰富分布和 E,蛋白质组覆盖率(表达为小脑中不同神经元,代谢和疾病相关过程的百分比)。

      组织超深蛋白质组分析的影响II性能

      由蛋白质组学分析比细胞系更具挑战性,因为它们由不同的细胞类型,细胞外基质和其他结构和连接元件组成。在不同的组织中,大脑被认为是最复杂的。为了评估在这种情况下的影响II,我们将均质均质化一只小鼠的小脑,使用我们的标准工作流程消化,并使用高pH分级(实验程序)使用所得的胰蛋白酶的部分。总共鉴定了11,257个蛋白质,从单一分析24分数(测量时间2天)(Fig. 7B, 补充表S1)。据我们所知,这是TOF仪表所报告的任何组织的最深层蛋白质组测量。蛋白质丰富,如综合和归一化肽信号所示的多个大于五个大于五个级(Fig. 7C)。我们鉴定了许多高中含有神经变性障碍的中等丰富蛋白质(Fig. 7C 标记为红色)。转录因子和DNA粘合剂PAX6,LHX1 / 5,OTX1 / 2和Neurod1(Fig. 7C标记为蓝色)是据报道的蛋白质的实例是在小脑中特别表达(
      • Suzuki H.
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      中型实时RT-PCR鉴定成人小鼠脑中的区域特异性转录因子基因。
      )。与各种神经元受体一样,转录因子填充培养基到低丰度范围(Fig. 7C,标有绿色)。在整个丰度范围内分散的分子函数类似于先前研究中观察到的分子功能(Fig. 7D, 补充表S2)(
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      11普通细胞系的比较蛋白质组学分析显示大多数蛋白质的普遍性但不同的表达。
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      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      )。这种小脑蛋白质组的高度是神经元,一般代谢和疾病相关过程的几乎完全覆盖(Fig. 7E, 补充表S2)。单个小鼠脑区域中蛋白质丰度的快速估计可用于研究组织特征和疾病特异性改变。例如,关于完整蛋白质组的变化的知识将提供有关神经变性病理过程的额外信息层。

      结论

      在这里,我们已经描述了QTOF仪器状态的构造和性能,影响II。我们记录了离子路径,碰撞单元性能的显着改进,尤其在反射器和检测器的性能中。后者允许质量分辨率和质量准确度与复杂混合物的霰弹枪蛋白质组学的高要求相容。我们首次测量并模拟了从毛细管到探测器的离子传递,这揭示了大约10%的优异效率。冲击II的新特征允许在单次镜头中表征,在那里我们在Hela细胞中鉴定了超过5200个蛋白质和酵母中的3600个蛋白质。使用离线高pH反相相分级,我们在Hela细胞中鉴定了9500多种蛋白质,并在单个小脑组织分析中鉴定了11,250个蛋白质。这些是任何平台的极高数量,另外的方法开发应进一步提高这些结果。我们还以免费的格式记录出卓越的定量再现性和准确性。与他人的一致性(
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      离子迁移率串联质谱增强了自下而上蛋白质组学的性能。
      )我们得出结论,近年来QTOF技术的改进现已清楚地实现对非常复杂的蛋白质蛋白质的苛刻,深入分析。

      致谢

      我们感谢来自Bruker,特别是Christian Cyriacks,Christoph Gebhardt,Stefan Harsdorf,Wolfgang Jabs和Anja Wiechmann的同事。在Max-Planck生物化学​​研究所,您感谢Nagarjuna Nagaraj,Korbinian Mayr,Richard Scheltema和Gaby Sowa为技术支持和Kirti Sharma,Garwin Pichler和Marco Hein进行了富有成效的讨论。

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