全球蛋白质组学分析C.秀丽隐杆花的饥饿响应*

      动物的定期饥饿在代谢中诱导大变化,但也可能影响许多其他细胞系统,并且可以导致适应长期饥饿条件。迄今为止,有限地了解饥饿如何影响基因表达,特别是在蛋白质水平。在这里,我们使用了基于质谱的定量蛋白质组学来识别全局变化 caenorhabditis. elegans. 蛋白质组导致年轻成年动物的急性饥饿。衡量超过5,000个蛋白质的丰度的变化,我们表明急性饥饿快速改变了数百种蛋白质的水平,许多涉及中央代谢途径,突出了关键调节反应。令人惊讶的是,我们还检测染色质相关蛋白质丰富的变化,包括与基因表达的表观遗传控制相关的特定接头组蛋白,组蛋白变体和组蛋白发生后改变。为了最大限度地提高对这些数据的社区访问,它们将在在线可搜索数据库中呈现,蛋白质组动态的百科全书(http://www.peptracker.com/epd/)。
      食物不规则可用性为有机生存期提供了重大挑战。由于有限的食物来源,动物必须在生长和生存之间妥协。线虫 C。 Elegans. 提供了一个优秀的模型系统,用于研究节约的监管电路,将营养可用性,饥饿反应和长寿联系起来。在其自然环境中 C。 Elegans. 可以体验盛宴和饥荒的条件(
      • Felix M.A.
      • Braendle C.
      caenorhabditis. elegans.的自然历史。
      )。在线虫的3至4天生命周期内,胚胎发生通过母体提供营养,并在没有食物的情况下发生。然而,幼虫开发需要喂养并通过四个发展阶段进行(L1-L4)。饥饿的效果在这些不同的发育阶段内变化。在没有食物的情况下L1阶段幼虫的孵化导致饥饿反应而没有明显的形态发生,允许〜2周的存活(
      • Baugh L.R.
      生长或不生长:营养控制发展期间 caenorhabditis. elegans. L1 arrest.
      )。饥饿后,阶段和晚期L4幼虫,通过减少生殖细胞增殖,从而保持资源,从而保持有限数量的胚胎(
      • Angelo G.
      • van gilst m.r.
      饥饿保护种系干细胞并延长生殖寿命 C。 Elegans..
      ,
      • Seidel H.S.
      • kimble J.
      ocogalic种系饥饿反应 C。 Elegans..
      )。
      已经鉴定了保守的遗传途径,使养分可用性与代谢重塑,应力阻力途径和增强的寿命。这些途径中的许多重叠并包括Tor,AMPK,自噬和胰岛素/ IGF-1信号传导。 PHA-4是在粮食中灭活的Tor激酶下游的FOXA转录因子(
      • Sheaffer K.L.
      • updike d.l.
      • 芒果S.E.
      雷帕霉素途径的靶向拮抗PHA-4 / FOXA以控制发育和老化。
      )。在饥饿后,抑制TOR导致PHA-4活性的降级和转录调节对于饥饿应激存活率(
      • Sheaffer K.L.
      • updike d.l.
      • 芒果S.E.
      雷帕霉素途径的靶向拮抗PHA-4 / FOXA以控制发育和老化。
      )。胰岛素和胰岛素样信号传导也在饥饿反应中发挥作用,并且在没有食物的情况下,在没有食物的情况下,在没有食物的情况下,这种作用激活抗胁迫和相关的寿命途径(
      • 肯尼昂C.J.
      衰老的遗传学。
      ,
      • 董M.Q.
      • venable J.D.
      • Au n。
      • XU T.
      • 公园S.K.
      • Cociorva D.
      • 约翰逊J.R.
      • 迪林A.
      • yates j.r.
      定量质谱识别胰岛素信号传导靶标 C。 Elegans..
      )。其他途径,包括AMP激酶(
      • Narbonne P.
      • 罗伊r.
      caenorhabditis.eDegans Dairs需要LKB1 / AMPK到配给脂质储备,并确保长期存活。
      )和AP1(JUN / FOS) - 依赖性转录控制也与代谢重塑和长寿(
      • Uno M.
      • Honjoh S.
      • Matsuda M.
      • Hoshikawa H.
      • Kishimoto S.
      • Yamamoto T.
      • Ebisuya M.
      • Matsumoto K.
      • Nishida E.
      延长寿命的空腹信号通路 C。 Elegans..
      ,
      • Vellai T.
      • Takacs-Vellai K.
      • 张Y.
      • Kovacs A.L.
      • orosz l.
      • Muller F.
      遗传学:TOR激酶对寿命的影响 C。 Elegans..
      ,
      • 长X.
      • MüllerF.
      • Avruch J.
      在哺乳动物细胞中的扭矩和 caenorhabditis. elegans..
      ,
      • 亨德森S.T.
      • BONAFèM.
      • 约翰逊T.E.
      d-16保护线虫 caenorhabditis. elegans. 在食物剥夺期间。
      )。此外,DAF-16和线虫RB同源物(LIN-35)在L1发育阶段的饥饿时全球影响转录(
      • 崔米
      • Cohen M.L.
      • 滕C.
      • 韩米
      肿瘤抑制率RB致力于调节饥饿诱导的应力反应 C。 Elegans..
      )。然而,尚未检查饥饿对染色质重塑的影响。
      在任何生物体中,预先记录了对急性饥饿的响应响应的定量,蛋白质组变化。使用 果蝇, 研究幼虫体脂肪体响应氨基酸饥饿(
      • 昌y.c.
      • 唐人
      • 梁S.Y.
      • PU T.H.
      • 猛腾。
      • Khoo K.H.
      • 陈G.C.
      评估 果蝇 具有早期蛹形成和氨基酸饥饿的应用中的体内定量蛋白质组学分析的代谢标记策略。
      )。另一项研究分析~700蛋白报告的血小淋巴蜂上发生的变化,显示蛋黄,储存和脂肪体蛋白是响应饥饿而下调(
      • 携带B.
      • Poernbacher I.
      • Goetze S.
      • Ahrens C.H.
      • 省略美国。
      • 马蒂F.
      • Simigdala N.
      • Meyer I.
      • Wollscheid B.
      • 布伦纳E.
      • Hafen E.
      • Lehner C.f.
      喂养和饥饿的血淋巴蛋白质组 果蝇 larvae.
      )。啮齿动物的研究重点是从小鼠肝脏中提取的代谢和胰岛素信号传导中涉及的〜200种蛋白质。这种分析来自小鼠的肝脏,响应于饥饿与饥饿的脂肪饮食喂养的小鼠均呈现蛋白质水平的差异,这些蛋白质水平依赖于分析的小鼠菌株的遗传背景(
      • SabidóE.
      • 吴y.
      • Bautista L.
      • Porstmann T.
      • chang c.y.
      • Vitek O.
      • 斯福特M.
      • Aeberberold R.
      靶向蛋白质组学揭示了在持续高脂饮食后小鼠胰岛素和中央代谢途径的菌株特异性变化。
      )。
      我们使用稳定同位素标记与细胞培养物(Silac)方法中的氨基酸进行定量质谱型蛋白质组学(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
      )并提高先前线虫氧化铝型研究的效率(
      • 在努力硕士
      • 纾困
      • Pourkarimi E.
      • 干草r.t.
      • 布坎南G.
      • Coulthurst S.
      • Xirodimas D.P.
      • Gartner A.
      • Lamond A.I.
      用线虫中的氨基酸标记稳定同位素标记。
      ,
      • 弗雷斯J.
      • Engholm-Keller K.
      • Giessing A.
      • Pultz D.
      • Larsen M.R.
      • HOJRUP P.
      • Moller -Jensen J.
      • FAGERMEMAN N.J.
      氨基酸标记的定量蛋白质组学 C。 Elegans..
      )。本研究的重点是蛋白质丰富的变化,当所涉及的主要监管机制未知时尤为重要(
      • LY T.
      • Ahmad Y.
      • Shlien A.
      • Soroka D.
      • 磨坊A.
      • Emanuele M.J.
      • stratton m.r.
      • Lamond A.I.
      人霉菌白血病细胞循环基因表达的蛋白质组学年表。
      ,
      • 在努力硕士
      • Lamond A.I.
      细胞生物学的多维蛋白质组学。
      ,
      • 格兰D.
      • Kirchner M.
      • Thierfelder N.
      • Stoeckius M.
      • Selbach M.
      • Rajewsky N.
      培养在开发过程中mRNA和蛋白质表达 C。 Elegans..
      )。我们具有特定的蛋白质组,其丰度水平响应于饥饿而上调或下调,从而鉴定响应饥饿应激的代谢和信号通路。有趣的是,我们还检测响应于饥饿而调节的特定组蛋白变体和后翻透修饰。

      实验步骤

       材料

      EZQ.蛋白质测定和CBQCA测定来自Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)。三钟乳羧酸甲基膦(TCEP)(粘结断路器中性pH溶液)来自皮尔斯(Thermo Fisher Scientific)。胰蛋白酶MS级来自Promega。 SEP-PAKTC18μ-洗脱96孔板来自水。 Pepmap C18(2cm×75μm)陷阱柱和EasySpray C18柱(2μm颗粒,50cm×75μm)来自Thermo Fisher Scientific。完全蛋白酶抑制剂混合物片和奇异磷酸酶抑制剂片来自罗氏。所有其他材料都是从Sigma获得的。

      C。秀丽隐形菌株,维护和饥饿

      C。 Elegans. 除非另有说明,否则使用N2褐发醇菌株并保持在20℃。这 他-71 :: GFP 从CGC获得菌株。对于同位素标记, C。 Elegans. 如前所述,在NGM-N板上(
      • 在努力硕士
      • 纾困
      • Pourkarimi E.
      • 干草r.t.
      • 布坎南G.
      • Coulthurst S.
      • Xirodimas D.P.
      • Gartner A.
      • Lamond A.I.
      用线虫中的氨基酸标记稳定同位素标记。
      )。 C。 Elegans. 每天监测,L4幼虫阶段 C。 Elegans. 将以下一代(F1)挑选到新鲜板上(板2)。除非另有说明,否则遵循该程序。

      C。 Elegans Silac.

      SLE1型辅助营养衍生物 大肠杆菌 如前所述使用含有ORN-1 RNAi进料构建体的HT115(
      • 在努力硕士
      • 纾困
      • Pourkarimi E.
      • 干草r.t.
      • 布坎南G.
      • Coulthurst S.
      • Xirodimas D.P.
      • Gartner A.
      • Lamond A.I.
      用线虫中的氨基酸标记稳定同位素标记。
      ),具有基因型arga,Lysa,F-,McRA,MCRB,In(RRND-RRNE)1,Lambda - ,RNC14 :: TN10(DE3溶酶体:Lavuv5启动子-T7聚合酶)。

      寿命分析

      如前所述在20℃下进行寿命测定(
      • Hsin H.
      • kenyon c.
      来自生殖系统的信号调节寿命 C。 Elegans..
      )。

      l1饥饿试验

      如前所述进行L1饥饿测定,使用5天饥饿应力和计数前的50小时恢复时间(
      • 你是y.j.
      • kim J.
      • COBB M.
      • 艾弗里L.
      饥饿通过毒蕈碱乙酰胆碱途径激活地图激酶 caenorhabditis. elegans. pharynx.
      )。

      SDS-PAGE和免疫印迹

      如前所述进行SDS-PAGE和免疫印迹(
      • Pourkarimi E.
      • 格里斯S.
      • Gartner A.
      CED-9 / BCL2和CED-4 / APAF-1本地化的证据与当前模型不一致 C。 Elegans. apoptosis induction.
      )。

      M9最小媒体

      M9最小媒体(NA2HPO.4 5.8 g L−1,kh.24 3 g L−1,NaCl 0.5 g l−1,NH.4CL. 2 1 g L−1,葡萄糖0.2%(w / v),mgso4 1 mm,通过混合100ml 10×m 9盐来制备硫胺素0.01%(w / v)(420米m 磷酸二钠,240米m 磷酸单钾,90米m 氯化钠,190米m 氯化铵)和893ml去离子水,和高压灭菌(120℃,20分钟)。冷却至55℃后,5ml 40%(w / v)葡萄糖,1ml 1 m MgSO4 添加了1%的1%(w / v)硫胺素。将赖氨酸和精氨酸加入40μgml−1 从73mg ml的最终浓度−1 or 42 mg ml−1 股票(在PBS中)。使用从冷冻股票的LB板上进行新鲜条纹的单一细菌殖民地,用于开始200ml培养物。在搅拌下在37℃(220rpm)温育细菌直至OD600 nm 达到1。通过离心(8,000g 20分钟)来浓缩细菌到OD600 nm = 50和5ml镀到ngm-n板上。然后将板储存在20℃并在7天内使用。

      RNAi喂养

      根据进料方法进行RNA干扰实验,所述饲养方法具有以下修饰:携带相应进料载体的细胞在2mL的2ml M9最低培养基中生长,其补充有重或轻的精氨酸和赖氨酸(40μgmL−1)和氨基甲嘧啶(1μgml−1)在37°C直到OD600 nm = 1.通过添加IPTG诱导双链RNA表达(1米m 最终浓度)3小时。将细菌沉淀并重悬于1ml蠕虫M9缓冲液中,该缓冲液补充有IPTG 1 mm,碳皮尼林1μgml−1 加入了〜500 L1幼虫舞台蠕虫。将该混合物转移到50ml缩斗管中以允许氧合并在温和搅拌下在25℃下在25℃下孵育(150rpm)。蠕虫和细菌在第二天旋转,镀在9cm NgM-N板上,并在20℃下孵育。分析以下蠕虫生成(F1)的相应表型。

      标记C. elegans板块

      C。 Elegans. 在NGM板上生长,不含任何氮源(称为NGM-N板)。对于1L的NgM-N培养基,将3g NaCl和12g琼脂糖(Invitrogen,分子级)与970ml去离子水混合,并高压灭菌(120℃,20分钟)。冷却至55℃后,加入以下化合物:1毫升1 m CaCl2,1毫升1 m MgSO4,25毫升1 m KPO4,1ml胆固醇5mg ml−1 (在乙醇中),和1ml Nystatin(10,000单位ml−1)。使用9厘米的板。

      饥饿时间过程和野生型与突变线虫蛋白质组分析

       生成C. elegans总线虫裂解物

      C。 Elegans. 用PBS冲洗并用PBS洗涤三次通过平板收集。 C。 Elegans. 在含有完全蛋白酶抑制剂,奇异物和5米的冰冷100μlPBS中沉淀并重新悬浮在冰冷的100μlPBS中m N-乙基马来酰亚胺在液氮中冷冻液之前。裂解, C。 Elegans. 在冰上解冻,加入十二烷基硫酸钠(SDS)以产生2%(w / v)终浓度。将TCEP(还原剂)加入到25米的最终浓度m;将溶液涡旋,然后加热至65℃持续10分钟。将N-乙基马来酰亚胺加入50米m 在室温下最终浓度30分钟,用于烷基化半胱氨酸残基。加入氧化锆珠(0.7mm,BioPec产品)以制备〜50%(v / v)浆料,并将样品在室温下为珠子 - 被烘烤(迷你珠榫8,BioPec产品)。然后将裂解物在室温下以17,000g离心10分钟。在上清液和硅酸混合上进行BCA测定(Pierce,Rockford,IL);合并相同的蛋白质。

      离线肽强阴离子交换(SAX)色谱

      裂解物是氯仿 - 甲醇沉淀(
      • Wessel D.
      • flüggeu.i.
      洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质中蛋白质的定量回收的方法。
      )并重新悬浮于8 m urea, 100 mm Tris-HCl pH 8.0, 1 mm CaCl2。稀释至1后 m urea with 100 mm Tris-HCl,pH 8.0,1米m CaCl2, 用胰岛素消化裂解物:蛋白质比为1:50(Promega)。然后将肽脱盐500mg Seppak TC18盒(水),在离心蒸发器中干燥,并重新悬浮于50米m 硼酸盐,pH 9.3。加入NaOH以确保在分离前的样品中的pH在pH9.0上方。使用如前所述的最终3000个UHPLC(Thermo Fisher Scientific)用AS24强阴离子交换柱(Thermo Fisher Scientific)分离肽,如前所述,有一些修改(
      • Ritorto M.S.
      • 煮K.
      • Tyagi K.
      • Pedrioli P.G.
      • 胸衣M.
      亲水性强阴离子交换(HSAX)色谱,用于复合蛋白质素的高正交肽分离。
      )。简而言之,缓冲A A为10米m 硼酸钠 - NaOH,pH9.3和缓冲b为10米m 硼酸钠 - NaOH,pH 9.3,0.5 m 氯化钠。使用指数梯度洗脱肽,进入16×560μL级分。使用SEP-PAK 10mgTC18μ-洗脱96孔板(水)脱谷物脱盐,然后重悬于5%甲酸中,用于LC-MS / MS分析。

      饥饿16 h生物三次蛋白质组分析

       C。秀丽隐杆线虫的亚细胞分级

      Q甲基麦组细胞室分馏试剂盒(QIAGEN)根据制造商的组织分馏方案分配蠕虫。简要地, C。 Elegans. 通过用PBS冲洗并用PBS洗涤三次收集。新鲜收获 C。 Elegans. 在含有完全蛋白酶抑制剂的冰冷缓冲液1中沉淀并重新悬浮。加入氧化锆珠(0.7mm,BioPec产品)以制备〜50%(v / v)浆料,并将样品在4°C下珠 - 被搅拌(迷你珠宝架8,BioPec产品),并检查裂解通过显微镜检查。然后根据制造商的指示处理裂解物的剩余步骤。在每个级分之前在变性各自的凝胶过滤色谱之前进行BCA测定(Thermo Fisher Scientific)。

      变性凝胶过滤色谱,胰蛋白酶消化和肽清理

      使用DiONEX Ultimate 3000 HPLC系统(Thermo Fisher Scientific),亚细胞分数6 m 将胍 - HCl注射(每次注射-80μg蛋白质20μL)上的mabpacsec柱(Dionex),与6平衡 m 尿素,2 m 硫脲和0.1 m Tris-HCl,pH 7.0。流速为0.2毫升分钟−1 使用低蛋白质结合96-深孔板(EPPendorf)收集16×100μL级分。通过添加三个容积0.1,在pH8.0进行胰蛋白酶消化物 m Tris-HCl,pH 8.0,1米m CaCl2 每个级分稀释尿素。随后向每个孔中加入500 ng胰蛋白酶。用橡胶垫,涡旋的板密封板,并在37℃下孵育过夜。加入三氟乙酸至1%(v / v)终浓度,使用Oasis HLB 96-孔μ洗脱板纯化肽。在100μl50%(v / v)乙腈中在100μl50%(v / v)乙腈中洗脱,并在离心蒸发器中在5%(v / v)甲酸中的悬浮剂之前在离心蒸发器中干燥。使用CBQCA测定(Invitrogen)在10米的肽样品中稀释后的肽样品后测定肽浓度m 硼酸钠 - NaOH,pH9.3。

      LC-MS / MS和光谱分析

      使用Thermo Fisher Scientific 3000 Rslcnano UHPLC,将5%(v / v)甲酸(最终体积〜10μl)中的肽注射到适当的Pepmap C18纳米捕集柱上。用2%(v / v)乙腈和0.1%(v / v)甲酸洗涤后,在50cm×75μmc18easyspray逆相分析柱上将肽分解,用集成发射器从2%乙腈到35 %乙腈超过140分钟,流速为200 nL min−1。通过电喷雾电离在+ 2.0kV下电离肽。使用HCD碎片在Q-辐射质谱仪(Thermo Fisher Scientific)上进行串联质谱分析。数据相关的采集方法在梯度期间的任何一个点处的前10个最丰富的离子上使用了获取的MS / MS光谱。所有原始MS数据都已沉积在Proteomexchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过具有DataSet标识符PXD001723的自豪伙伴存储库。使用包括Andromeda搜索引擎(包括)的定量蛋白质组学软件MAXQUANT来分析由质谱仪产生的原始数据(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )(http://www.maxquant.org,版本1.3.0.5)。使用基于目标诱饵的策略,肽和蛋白质水平鉴定既设定为1%的错误发现率。提供给肽标识的搜索引擎的数据库都是 C。 Elegans.大肠杆菌 分别包含26,147和4,311个条目的UNIPROT数据库(24/10/13)。将质量耐受性设定为7ppm的前体离子,MS / MS质量耐受设定为20ppm。酶被设置为胰蛋白酶,最多两个错过的裂解。将Met,Pyro-glu(用N术语GlN)的氧化,蛋白N末端的氧化,Met,Pyro-Glu(用N-术语Gln)进行脱染。 Cys上的N-乙基马来酰亚胺被搜索为固定修改。 MaxQuant的输出提供肽级数据以及蛋白质同种型分组的蛋白质级数据。我们将蛋白质组定义为一组独特的肽,其在多种蛋白质同种型之间共用或属于单一蛋白质同种型。虽然这可能导致更高的冗余,但它使我们能够量化单个蛋白质同种型的变化。

      数据分析

      R语言(2.15.1版)用于数据分析。对于所有实验,基于一组独特的肽在多种蛋白质同种型之间或属于单一蛋白质同种型之间或属于单一蛋白质同种型之间的一组独特肽,肽水平数据被聚集以产生每个蛋白质组的数据。用于分析饥饿时间过程和野生型的饥饿反应 相对his-71 NULL突变体,根据每个条件下对应于每个蛋白质组的每种肽的氧化硅比计算平均值的平均值和标准误差。对于饥饿的三个生物学重复,中位数,标准偏差和 p 基于学生的价值 t 在每种病症和阴性对照蛋白PRO-1下的每种蛋白质组的氧化脂肪率计算测试(未配对,双尾,不平等方差),并且在饥饿后没有改变。为了聚类分析,氧化氧化率标准化为平均日志2 值0和标准偏差为1.分层聚类基于欧几里德距离测量,使用“完整”附聚方法。使用RChorBrewer库,群集分析的输出已作为热图呈现为热线图。使用David功能注释工具进行基因本体分析(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)用于生物过程(
      • 黄D.W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      )。全部 C。 Elegans. 由大卫提供的蛋白质组被选为背景列表。然后绘制这些数据以使用revigo套件减少冗余(
      • Supek F.
      • Bošnakm.
      • Škuncan。
      • ŠMUCT.
      Revigo总结并可视化了基因本体论术语的长列表。
      ),使用默认参数。

      QRT-PCR.

      使用三种生物重复,每次有三种技术复制。在20℃下从平板(10个每平板)(10平板)挑选成螺旋帽1.5ml管中的100μlmm盐缓冲液。在将动物沉淀到底部后,除去大部分液体。加入500μL三苯醇(寿命技术),并将样品在-80℃下立即冷冻。在室温下解冻后,加入〜100μl0.7mM氧化锆珠(BioPec),在室温下最大速度将样品在最大速度下搅拌2分钟。然后加入氯仿(每管100μL),并在4℃下以12,000g以12,000g离心15分钟,用手摇动15分。将200μl上相移动到卡盖1.5mL管,并加入200μL100%乙醇并涡旋。通过将上相乙醇混合物作为“样品”施加诸如乙醇混合物,并以制造商的后续步骤进行说明,将其使用RNEasy Mini Kit(Qiagen)清洁。在50μl水中洗脱后,使用纳米玻璃(Thermo Fisher Scientific)在260nm处的吸光度测定RNA含量和纯度。每QRT-PCR反应在96孔Roche光循环仪II上使用5 ng。根据制造商的说明,使用(每孔20μl反应量)使用一步量子Quancast Sybr绿色RT-PCR试剂盒(QIAGEN)。使用的底漆是 tbg-1 F:TCAACTGCTTCTCGGGGTTCG, tbg-1 R:TTGCGAAATCAACGTTTTTGCTC, gpd-2 F:GTACGACTCCACCACGGA, gpd-2 R:TTGTAGACCTTGATCTTGTGCTGCG, acs-3 F:gcgaaaaagaccaaggctcg, acs-3 R:CCCCACCAGAAGTGAGAACC, lys-4 F:AGAGCAGCTGCCTCACCG, lys-4 R:TCCTGCACTCTTCAAAGCATCAAG, daf-16 F:TTGCCAAAGCATTGGAATCG, daf-16 R:GGATCGAGTTCTTCCATCCG。 QRT-PCR程序如下:1)50°C 10分钟; 2)95°C 5分钟; 3)95°C 10 s; 4)60°C 30s(环回到步骤3 50个循环)。这 tbg-1 数据用于所有样本的标准化。

      结果

       C。 Elegans.蛋白质蛋白酶对急性饥饿胁迫的反应

      提供全面概述的响应 C。 Elegans. 蛋白质组饥饿,我们用硅酸标记的线虫进行了一系列食品剥夺。 Silac“Light”同位素标记的线虫被剥夺了食物(大肠杆菌)对于4,8,16或32小时,而“重”同位素标记的线虫在食物存在下对同一时期(Fig. 1A)。使用L4幼虫阶段晚期的发育线虫群开始启动饥饿。最新的L4幼虫阶段先前已被证明导致延长饥饿后的扰动最小,在食物去除超过24小时后评估(
      • Seidel H.S.
      • kimble J.
      ocogalic种系饥饿反应 C。 Elegans..
      )。将衍生自氧化硅酸盐标记的线虫的等量蛋白质(100μg),其在32小时定时过程中喂食或饥饿,并加工MS分析(Fig. 1A)。用胰蛋白酶消化混合蛋白质裂解物,并使用SAX色谱法分离所得肽(
      • Ritorto M.S.
      • 煮K.
      • Tyagi K.
      • Pedrioli P.G.
      • 胸衣M.
      亲水性强阴离子交换(HSAX)色谱,用于复合蛋白质素的高正交肽分离。
      )。随后通过LC-MS / MS分析每个级分和光的丰度 - 相对 量化重标记的肽(Fig. 1A)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1综合蛋白质组分析 C。 Elegans. 饥饿后胁迫。 (A)基于硅酸的定量质谱的工作流程,以鉴定饥饿调节蛋白质 C。 Elegans.。对于每次饥饿应激的每个时间点进行一次工作流程。 (B)蛋白质密度直方图,显示在所示时间段之后每次时间点对〜5,000个蛋白质组的饥饿的反应。平均氧化硅比L / h(饥饿/喂食)分别显示每个时间点 x 轴,具有相同的尺度用于每个图形。蛋白质密度显示在 y 轴。颜色表示每个图形顶部所示的每个时间点。 (C)在任何时间点在任何时间点改变多于双重的蛋白质的轮廓在分层聚集。通过红色阴影表示的丰度降低,通过绿色遮荫增加了丰富。每个蛋白质组(每条线一个)沿着 y 轴和饥饿应力后的时间显示在 x axis. (D)线图显示平均肽氧化体比率 相对 饥饿后应激后的时间,用于响应饥饿应激的选定蛋白质或阴性对照蛋白TBB-1(管蛋白β)。误差条显示肽氧化物比例的平均值的标准误差。 (E)线图显示平均肽氧化体比率 相对 饥饿应激后的时间,用于通过转录因子PHA-4(FOXA,TOR)或DAF-16(胰岛素/ IGF-1信号传导下游的FOXA)调节所选蛋白质。 PAR-5(14-3-3)用作负面控制。误差条显示肽氧化物比例的平均值的标准误差。
      使用MaxQuant软件套件鉴定并定量肽(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )。从整个时间课程分析的平均水平超过45,000个独特的肽,量化了超过5,500个蛋白质基团,这些蛋白质组被筛选的所有提取物和饥饿的线虫的所有提取物和所有时间点(补充表1 对于蛋白质级数据和 补充表2 用于肽级数据;请参阅方法)。这里使用的蛋白质基团的分类允许相关蛋白质同种型之间的定量判别(例如,通过替代剪接或代表密切相关的常规术而产生)。平均而言,每个时间点的每个蛋白质组由七种独特的肽定义。为确保高质量的数据集,我们使用肽和蛋白质鉴定的假发现率小于1%。总之,本研究标识和量化 C。 Elegans. 蛋白质组在时间课程中深入置信。
      为了概述蛋白质组的响应饥饿,产生直方图,显示在与检测到的蛋白质数量相关的蛋白质丰度水平的每个时间点的分布,其密度沿着它们的密度表示 x axis (Fig. 1B)。这表明饥饿导致了主要变化 C。 Elegans. 蛋白质组,蛋白质的数量响应(增加或降低)和丰度水平的变化程度,随着时间的推移逐渐增加,直到在〜8小时达到平台。我们采用分层聚类来表征通过饥饿引起的蛋白质组的变化,使用至少一个时间点发生的至少两倍变化的夹杂物阈值(Fig. 1C,见方法)。这是确定的>通过在时间课程期间的某个点在某些时候响应饥饿或减少丰富的500种蛋白质。
      大多数蛋白质在饥饿后的16小时内达到了最大反应。丰富的变化倾向于逐渐发生,尽管不同于不同蛋白质之间的变化率变化。例如,脂肪酰基去饱和酶(FAT-2)的丰度为下调8小时的饥饿发作~16倍,然后在时间路线的其余部分在该较低水平上保持相对稳定(Fig. 1D)。相反,分枝氨基酸氨基转移酶(BCAT-1)在整个时间课程中逐渐下降丰富(Fig. 1D)。同样地,脂肪酸结合蛋白FAR-7和DUR-1蛋白(DAUR-COFFICAL蛋白)均上调。 Dur-1在8小时内达到丰富,而FAR-7在饥饿后的16小时之前没有达到其最大丰度。相比之下,β-微管蛋白(TBB-1)在饥饿的时间过程中没有变化。
      众所周知的PHA-4的聚焦分析(
      • Raharjo W.H.
      • 洛根B.C.
      • Wen S.B.
      • Kalb J.m.
      • Gaudet J.
      体外和体内表征 caenorhabditis. elegans. PHA-4 / FOXA响应元素。
      )和DAF-16目标(
      • 墨菲C.T.
      • 麦卡尔尔S.A.
      • Bargmann C.I.
      • 弗雷泽A.
      • Kamath R.S.
      • Ahringer J.
      • 李H.
      • kenyon c.
      在DAF-16下游行动的基因以影响寿命 caenorhabditis. elegans..
      ),证实该研究检测对食品剥夺的预期调节这些蛋白质(Fig. 1E)。因此,HSP90-同源enpl-1(PHA-4调节)的蛋白质丰度和未知功能DOD-24(DAF-16调节)的蛋白质在饥饿后降低。相比之下,蛋白质超氧化物歧化酶4(SOD-4,DAF-16调节)和对流罗(LEV-11,PHA-4调节)的丰度增加(Fig. 1E)。
      基于上述时间课程实验的结果,我们选择专注于饥饿时间点的16小时,以便在深入分析变化的深度分析 C。 Elegans. 产生饥饿应激的蛋白质组。这种后续分析使用与前一课程实验中的16小时饥饿时间点相同的治疗条件,但现在包括三种生物重复和蛋白质水平分馏。我们分析了每种生物重复的〜45,000个独特的肽,屈服>5,200个蛋白质组可以在三个重复中至少两个中量化( 补充表3. 用于蛋白质水平定量数据和 补充表4. 对于蛋白质级序列覆盖数据和 补充表2 用于肽级数据)。这些数据用于执行学生 t 在生物复制中测试,比较每个蛋白质组的氧化硅比与氧化蛋白质的对照蛋白质,其被广泛表达,并且在饥饿胁迫后没有变化。这些数据显示>600个蛋白质组上调和>490响应于16小时的饥饿,使用a p 截止值 p < .05 (Fig. 2A 红色和绿色点, 补充表3.)。结果与检测到的蛋白质蛋白质在饥饿时间课程实验中饥饿的16小时后变化,表明对蛋白质组的影响是可再现的。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2重点分析 C。 杆状杆菌在16小时后饥饿的压力。 (A)~5,000蛋白的饥饿应激反应表明,每个蛋白质组的中值比例(n = 3)。这 y 轴显示A. p value (-log10 转化)来自学生的 t 与阴性对照蛋白质Pro-1的生物复制相比,对每种蛋白质的三种生物重复进行测试。相对折叠变化显示在 x axis using the log2 氧化硅比L / H(饥饿/喂食)。日志上的唯一肽的平均数量2 尺度由光斑直径表示,尺寸较大,表明更独特的肽。蛋白质与A. p <.05以红色显示和有的人 p <.01以绿色显示。对丰富增加的蛋白质组内富集的生物过程的富集分析(B)或减少(C)饥饿后16小时。超过双重变化的阈值和一个 p <使用David数据库使用,使用,使用David数据库进行.01
      • 黄D.W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      )。使用Revigo Suite绘制这些数据(
      • Supek F.
      • Bošnakm.
      • Škuncan。
      • ŠMUCT.
      Revigo总结并可视化了基因本体论术语的长列表。
      )。这 xy 轴表示用于分组相关生物过程的语义空间。每个气泡的颜色和大小表示易于分数(日志10 每个GO术语转换) 相对 整体 C。 Elegans. 蛋白质组。随着日志的增加,大小增加10 (p 值)和颜色从红色变为蓝色随着日志的增加10 (p 价值)。密切接近的气泡表示相关的GO条款。

      急性饥饿影响的主要生物过程分析

      我们分析了蛋白质的子集,满足于16小时的饥饿和a的富裕变化的严格阈值的严格阈值 p 的价值 p <.01评估不同使用GO术语注释定义的不同生物过程的调节(Fig. 2A,绿点, 补充表3.)。所指出的GO条款是那些在上调(Fig. 2B)或下调(Fig. 2C)蛋白质子集。由相关易于分数反映的转入富集富集的重要性也由着色表明(
      • 黄D.W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      )。红色表示显着性水平较低,而蓝色表示较高的意义。上调的GO条款包括“运动的调节”,“喂养行为”,“肌肉细胞分化”,“成人寿命,”和“染色质组织”的测定。下调的GO条款包括“细胞周期”,“DNA复制”,“脂质生物合成过程”,“积极调节生长速度”,“减数分裂调节”,“生殖器发育”和“出生中的胚胎发育”孵化。“考虑到饥饿后的生殖细胞增殖降低,预期观察到与转入术语“细胞周期”相关的蛋白质和其他生长相关的GO术语的减少。
      • Seidel H.S.
      • kimble J.
      ocogalic种系饥饿反应 C。 Elegans..
      )。
      储能需要脂质允许生物应对有限的营养可用性。此外,它们是膜的核心组分,并提供信号功能。作为评估整个途径的响应的数据集的一个例子,我们在脂质合成和崩溃所涉及的酶水平的变化方面提供了脂质代谢对饥饿应激的响应的全部概述由亚细胞定位分组(Fig. 3A, 补充表3.)。用于脂肪酸合成的进入点的关键酶是乙酰CoA羧化酶(POD-2)(Fig. 3A, 补充表3.)。该酶利用乙酰-CoA产生丙基-CoA,其用作脂肪酸合成酶(FASN-1)的中间体,其负责脂肪酸的逐步组装至16个碳的长度。我们的数据集表明POD-2蛋白的丰度由~Threefold下调(图。 3.A3B, 补充表3.)。脂肪酸去饱和酶FAT-5,FAT1 / 2,脂肪-4和FAT-6/7,所有这些都位于内质网中,在饥饿后大量下降都是强烈的降低;例如,脂肪-6级别减少到〜30倍( 图。 3.A3B, 补充表3.)。这些数据进一步表明,其他酶通常在内质网中局部地定位,包括ELO-2,HPO-8和ART-1蛋白质,其全部需要脂肪酸伸长率,但在丰度中也降低(Fig. 3A, 补充表3.)。通常,我们观察到,负责合成所有链长的脂肪酸和去饱和度所需的酶的富含酶的丰富酶。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3饥饿胁迫后脂质代谢途径的分析。 (A)基于先前出版物的组合来表示脂质代谢蛋白的亚细胞定位 C。 Elegans. lipid metabolism (
      • van gilst m.r.
      • Hadjivassiliou H.
      • 快乐A.
      • Yamamoto K.R.
      核激素受体NHR-49控制脂肪消耗和脂肪酸组成 C。 Elegans..
      ,
      • van gilst m.r.
      • Hadjivassiliou H.
      • Yamamoto K.R.
      A caenorhabditis. elegans. 营养响应系统部分依赖于核受体NHR-49。
      ),本地化预测工具和其他物种中已知位置的蛋白质的同源性。细胞质蛋白在绿色背景上,线粒体蛋白质在蓝色背景上,内质网蛋白质在粉红色的背景上,过氧化物蛋白质在灰色的背景上。边界所示的蛋白质介导亚细胞间隔物之间​​代谢物的运动,或者可以驻留在多个位置。每种蛋白质嵌段的颜色表明蛋白质为16小时的饥饿,绿色表明饥饿后的丰度和红色的增加,表明饥饿后的稳定率下降。途径由黑色箭头表示,圆圈表示途径可以迭代地处理相同的基板。 (B)线图显示平均肽氧化体比率 相对 饥饿胁迫后的时间,用于关键的细胞质,内质网和参与脂肪酸合成或降解途径的线粒体蛋白。误差条显示肽氧化物比例的平均值的标准误差。 (C)线图显示平均肽氧化体比率 相对 饥饿后的时间,用于脂肪酸降解的关键线粒体蛋白。误差条显示肽氧化物比例的平均值的标准误差。
      通过脂质的能量产生需要β氧化的脂肪酸降解。这通常发生在线粒体中,但在过氧化物组中也会降解非常长的链脂肪酸。我们观察到,从细胞质转移到线粒体中的脂肪酸所需的丰富酶,例如酰基 - CoA合酶(ACS2)和肉氨基 - 棕榈酰转移酶(CPT-1),增加后饥饿(图。 3.A3B, 补充表3.)。这些数据显示,非常长,长和中链酰基-CoA基材的β-氧化途径所需的四种酶, IE。 酰基 - 辅助脱氢酶(ACDH-7 / 8/10 / 12),ENOYL-COA水解酶-1(ECH-1),β-酮溶胶酶(F53A2.7)和3-酮酰基-COA硫醇酶(KAT-1),做不要因饥饿而改变他们的丰富(Fig. 3C)。这些结果意味着脂肪酸分解代谢可能主要通过增加传输到线粒体来增强。相比之下,CoAβ氧化短链途径中的前两种酶, IE。 酰基 - 辅助脱氢酶(ACDH-1)和ENOYL-COA水解酶-7(ECH-7)在丰度中均强烈降低。这表明对培养基和长链脂肪酸的β-氧化能量产生而不是短链脂肪酸的强烈偏好。

      组蛋白H3变体的丰度受急性饥饿的影响

      饥饿可能潜在地引发染色质景观的全局变化,具有对基因表达调节的主要后果。我们观察了许多组蛋白变体和高迁移率组(HMG)染色质蛋白在饥饿后16小时增加了丰度(图。 4.A4B)。检测到的饥饿诱导的组蛋白变体包括 C。 Elegans. HTZ-1 H2A.Z变体与转录激活相关,并且已被证明与PHA-4主转录调节器一起动作以驱动器官发生 C。 Elegans. pharynx (
      • updike d.l.
      • 芒果S.E.
      HTZ-1 / H2A.Z和PHA-4 / FOXA的临时调节前述开发。
      ,
      • 削弱C.M.
      • 麦克林K.N.
      • ercan s.
      • 张凌。
      • 绿色r.d.
      • 凯利W.G.
      • 谎言J.D.
      组蛋白变体HTZ-1的基因组分布与功能 C。 Elegans. embryogenesis.
      )。此外,三个H1接头组蛋白(IE。 他的24,HIL-1和HIL-3)在丰富的后饥饿中也增加了。 H3.3组蛋白变体仅不同四个氨基酸来自规范H3.1蛋白(Fig. 4D),后者在DNA复制期间加载(
      • OOI S.L.
      • Pries J.R.
      • Henikoff S.
      组蛋白H3.3种系中的变体动态 caenorhabditis. elegans..
      )。我们的数据集显示核心H3.1组蛋白(HIS-2)特异的肽在饥饿后的丰富增加。我们还观察到H3.1(Nematode HIS-2蛋白)和H3.3(NEMATODE HIS-71 / HIS-72蛋白)之间共享的肽饥饿后的丰富增加了丰富的丰富。来自H3.3的单一独特肽不存在于H3中.1( 图。 4.A4C, 补充图S2, 补充表2和3)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4染色质应力诱导的染色质变化。 (A)条形图显示选择染色质相关蛋白或阴性对照蛋白(RPS-6,PAR-5,MRPS-5)的响应于16小时的饥饿应激。这 y 轴表示每种蛋白质。棒是彩色绿色,以指示是否 p 价值,来自学生的 t 测试每种蛋白质的三个生物重复 p <.05。相对折叠变化显示在 x axis using the log2 比率L / H(STARVED / FED),误差栏指示标准偏差(n = 3). (B)线图显示平均肽氧化体比率 相对 饥饿后的时间过后,用于选定的染色质相关蛋白。误差条显示肽氧化物比例的平均值的标准误差。 (C)质谱显示来自在16 H三份饥饿实验中检测到的肽的代表性氧化酶的前体完整肽离子,如部分(A),其特异于组蛋白H3.3(剩下)或h3.1(正确的)。 (D)对高度相似的组蛋白-H3相关蛋白(HIS-2/71/72/74)的对准。每个序列图案的保存由蓝色覆盖层的阴影表示。肽序列周围的红色盒子表明在我们的饥饿实验中检测到的肽。 (E)免疫印迹总额 C。 Elegans. 来自线虫的裂解物饥饿,或喂食16小时。伤害 C。 Elegans. 用过含有稳定的转基因 他-71 :: GFP 表达GFP标记的组蛋白H3.3 Type-1(HIS-71)蛋白。使用抗GFP抗体进行免疫印迹以检测他-71-GFP或针对α-管蛋白的抗体作为负载控制。 (F[显示含有乙酰化赖氨酸5和乙酰化赖氨酸8的双改性组蛋白H4肽的响应对16小时的抑制抑制抑制应激的曲线图。相对折叠变化显示在 x axis using the log2 比率l / h(starved / ed / ed),误差栏表示标准偏差(n = 3).
      利用可用的融合构建体和删除突变体,我们接下来的表征 his-71 H3.3更详细的变体。他-71已被证明可以在整个中表达 C。 Elegans. 开发,在原始生殖细胞中没有检测到表达(
      • OOI S.L.
      • Pries J.R.
      • Henikoff S.
      组蛋白H3.3种系中的变体动态 caenorhabditis. elegans..
      )。用一个 his-71:: GFP基因融合,我们通过定量免疫印迹确认他-71在饥饿后(Fig. 4E)。我们还确认先前报告了使用荧光显微镜的核的本地化(补充图S3)。此外,我们还在赖氨酸5和8(即)在赖氨酸5和8的组酮H4(HIS-1)的双乙酰化形式的显着降低(Fig. 4F补充图。S1)。

      通过蛋白质组动态的百科全书分享数据共享

      蛋白质组动力学(EPD)的百科全书 - http://www.peptracker.com/epd/)(
      • 在努力硕士
      • Ahmad Y.
      • Kirkwood K.J.
      • LY T.
      • Lamond A.I.
      使用定量蛋白质组学的蛋白质降解的全局亚细胞表征。
      ) - 将自由访问,可搜索的在线资源进行可视化和探索本研究中描述的所有定量蛋白质组学数据(Fig. 5)。 EPD提供了方便的分析和显示Nematode蛋白质数据,具有来自蠕虫基,UNIPROT和串的集成链接和数据,适用于每种蛋白质。这些数据库中的每一个都为蛋白质组宽的数据集提供了独特的资源,并补充了对饥饿反应的蛋白质水平丰度数据。用户可以搜索感兴趣的蛋白质,并立即观察来自蛋白质相关的字符串和基本功能的已知相互作用(Fig. 5A)。本研究的数据显示为每个蛋白质,图表类似于显示的图表 图。 1D2A。此外,图表显示了与单独的蛋白质同种型的组合衍生的数据,分别与特异性的定量数据。例如,Tropomyosin具有许多剪接同种型,具有许多重叠的蛋白质区域。这使得这种蛋白质的分析更复杂。 EPD分别显示此类蛋白质的定量信息,具有同种型和多同种型数据显示为时序数据的不同彩色线条(Fig. 5B)三份数据集的不同颜色点(Fig. 5C)。对于所示的原鸡蛋白质 Fig. 5,这使我们能够遵守这些同种型之间的饥饿响应的定量差异。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5蛋白质组动力学基于Web的数据共享工具百科全书。 用于示例性蛋白质(Tropomyosin)的数据显示的屏幕截图。 (A显示从多个数据库的数据,如UNIPROT和String派生,链接到这些和其他外部资源。 (B)线图表明对原鸡蛋白基团的单独定量,以产生蛋白质同种型特异性分析,每组蛋白质组数据被示出为不同的彩色线。平均肽硅酸比用误差条绘制,误差棒显示该比率的平均值的标准误差。 (C)16小时饥饿生物三份数据集的火山图。每个蛋白质组由不同的有色点表示,并在本实验中分析的所有蛋白质基团的上下文中显示出来(有色灰色)。水平线表示 p < .05 (green) or p < .01 (pink).

      讨论

      使用深入,定量蛋白质组分析和蛋白质功能的遗传破坏的组合,我们表征了全球响应 C。 Elegans. 蛋白质组至急性饥饿。本研究代表了对任何生物体中饥饿的蛋白质水平反应日期最详细的分析,并且还提供了目前对蛋白质表达的最佳分析 C。 Elegans.。该分析揭示了饥饿引发了蛋白质丰富的快速变化,其重组了大部分蛋白质组。这包括广泛的生物过程和响应机制,包括对染色质相关蛋白的变化。这揭示了饥饿的潜在机制,以产生对蛋白质丰度和功能的表观遗传效应。
      我们的数据集的深度提供了整个途径内的响应概述,例如脂质代谢酶,这对饥饿应激反应至关重要。饥饿后,这些改变脂质代谢的变化使生物能够通过β-氧化培养基和长链脂肪酸的β-氧化,从代谢物到分解代谢状态迅速地从代谢态转向。该数据集可以类似地分析从代谢到蛋白质合成的血清途径。为了提供方便地访问我们的数据,我们已将这些数据存放在蛋白质组动态的百科全书的扩展版本中,这是一种可搜索的基于Web的资源,专为高吞吐量蛋白线的数据集提供了最佳呈现。我们还将本研究中分析的所有原始MS数据文件存入ProteomexChange联盟,其中数据集标识符PXD001723。

      染色质反应饥饿

      本研究的显着观察是许多染色质相关蛋白,包括接头组蛋白,高迁移率组蛋白和组蛋白H3.3,在饥饿后的丰富迅速增加。据我们所知,这是第一个调节染色质相关蛋白质丰富的模型生物急性饥饿的第一份报告。有趣的是,最近的蛋白质组分析了老化 C。 Elegans. 表明,组蛋白H3.3(HIS-71)蛋白质丰度〜旧(5天)〜三倍 相对 年轻的成人线虫(
      • 梁五。
      • Ullrich M.
      • 林H.
      • 咀嚼Y.L.
      • 君主S.
      • 歌曲X.
      • Zaw T.
      • 卡西奥米
      • gotz J.
      • 尼古拉斯H.R.
      改变老化和热休克反应的蛋白质 C。 Elegans. 通过分析全球和DE Novo合成蛋白质组。
      )。我们自己的初步实验表明,他-71h3.3变体确实对饥饿后的存活是重要的,并且对于线虫也需要实现正常的寿命(数据未显示)。这些数据在一起表明在未来的研究中更详细地分析他-71和其他染色质相关蛋白的作用将是重要的。
      与主要作用的规范组蛋白不同,以促进DNA包装的规范组蛋白,在不同的过程中具有作用,包括染色体隔离,DNA修复和重组和转录沉默和活化(
      • McBryant S.J.
      • lu x.
      • 汉森J.C.
      链接组团的多官能团:蛋白质 - 蛋白质相互作用的新出作作用。
      )。这些染色质蛋白质中的改变具有调节染色质结构的可能性,从而影响转录速率并导致基因组的基因转录大规模变化。我们发现急性饥饿导致赖氨酸残留物K5和K8下的H4乙酰化,对潜在机制具有深远的影响,所述潜在机制可以允许食品剥夺在可能的长期后果中引发基因表达中的表观遗传变化。这些组蛋白乙酰化先前已与转录激活相关,并充当表观遗传标记,以允许有丝分裂后快速转录激活(
      • 赵立
      • Nakamura T.
      • 傅y.
      • 拉扎尔Z.
      • Spector D.L.
      基因书签加速了丝分裂后转录重新激活的动力学。
      )。最近的一项研究表明,饥饿应激可以通过小RNA介导的机制来影响后代(
      • rechavi o.
      • HOUII-ZE'EVI L.
      • Anava S.
      • Goh W.S.
      • Kerk S.Y.
      • Hannon G.J.
      • 霍特奥。
      饥饿诱导的小RNA的转基因遗传 C。 Elegans..
      )。我们现在的研究结果表明,线虫可以提供有用的模型系统,以将营养状况与下游表观效果联系在基因表达和活力的下游表观效应中的解剖。

      代谢途径对饥饿的反应

      该分析突出显示急性饥饿胁迫后脂质代谢酶发生的显着丰度变化。这表明这些途径的重塑,以最大限度地减少能源消耗并最大限度地提高能源生产。这种反应的另一个方面是需要最小化对动物的进一步应激,例如来自活性氧物质(ROS)和感染。可以通过线虫利用以实现从ROS产生保护的有趣途径是饥饿后甘油酯途径的上调。植物,细菌,真菌和线虫中的乙醛酸途径存在,并通过三羧酸循环的旁路将乙酰-CoA转化为琥珀酸盐至琥珀酸盐(在线粒体电子传输链中的复合II的底物),涉及多官能酶Gei- 7 / ICL-1。每个循环的使用该途径产生较少的NADH(在线粒体电子传输链中的复合物I的基材)。据报道,与复合物I(
      • yankovskaya V.
      • 马菲尔德R.
      • Törnroths。
      • Luna-Chavez C.
      • Miyoshi H.
      • 柠檬C.
      • BYRNE B.
      • CECCHINI G.
      • 岩田S.
      琥珀酸脱氢酶和反应性氧物种的结构。
      )。这可以解释为什么我们在只有4小时的饥饿应激后观察到ICL-1丰度的显着增加。因为,在能源生产的费用中,有利于减少ROS水平的生存优势。有趣的是,ICL-1蛋白已被证明在胰岛素受体中上调(d-2零)突变线虫,并且该上调取决于FOXO转录因子DAF-16;也是长寿表型 daf-2 通过ICL-1耗尽部分抑制空突变体(
      • 沉E.Z.
      • 歌曲C.Q.
      • 林Y.
      • 张W.H.
      • 苏p.f.
      • 刘W.Y.
      • 张P.
      • 徐J.J.
      • 林第n。
      • 詹C.
      • 王X.
      • 谢尔。
      • 程H.
      • 董M.Q.
      成年早期的MITOFLASH频率预测了寿命 caenorhabditis. elegans..
      )。我们在本研究中观察到的ICL-1蛋白的上调也可能导致瞬时饥饿的线虫的寿命增强(
      • Kaeberlein T.L.
      • 史密斯e.d.
      • Tsuchiya M.
      • Welton K.L.
      • 托马斯J.H.
      • 领域S.
      • 肯尼迪B.K.
      • Kaeberlein M.
      寿命延伸 caenorhabditis. elegans. 完全去除食物。
      )。
      迄今少数研究已经使用了大规模的定量蛋白质测量来分析急性饥饿反应。关于线虫的热量限制(不是急性饥饿)的先前报告鉴定了许多蛋白质,这些蛋白质随着有限的蛋白质组分辨率(
      • 袁Y.
      • Kadiyala C.S.
      • ching t.t.
      • Hakimi P.
      • 萨哈斯。
      • 徐H.
      • 元C.
      • mullangi V.
      • 王L.
      • Fivenson E.
      • Hanson R.W.
      • ewing r.
      • HSU A.L.
      • Miyagi M.
      • 冯Z.
      增强的能量代谢有助于卡路里限制的延长寿命 caenorhabditis. elegans..
      )。在该研究中调节几种蛋白质,其中赋予了卡路里限制 eat-2 突变,与我们现在的数据一致。此外,先前关于饥饿对小鼠和苍蝇中蛋白质的影响的研究,尽管仅包括蛋白质组的小比例的分析,或者通过靶向MS方法(
      • 昌y.c.
      • 唐人
      • 梁S.Y.
      • PU T.H.
      • 猛腾。
      • Khoo K.H.
      • 陈G.C.
      评估 果蝇 具有早期蛹形成和氨基酸饥饿的应用中的体内定量蛋白质组学分析的代谢标记策略。
      ,
      • 携带B.
      • Poernbacher I.
      • Goetze S.
      • Ahrens C.H.
      • 省略美国。
      • 马蒂F.
      • Simigdala N.
      • Meyer I.
      • Wollscheid B.
      • 布伦纳E.
      • Hafen E.
      • Lehner C.f.
      喂养和饥饿的血淋巴蛋白质组 果蝇 larvae.
      ,
      • SabidóE.
      • 吴y.
      • Bautista L.
      • Porstmann T.
      • chang c.y.
      • Vitek O.
      • 斯福特M.
      • Aeberberold R.
      靶向蛋白质组学揭示了在持续高脂饮食后小鼠胰岛素和中央代谢途径的菌株特异性变化。
      ),总体上与我们的数据一致,表明急性饥饿抑制脂肪酸合成并增加线粒体中脂肪酸的β-氧化。相比之下,在线虫中饥饿导致的mRNA丰度变化的先前研究表明,关于饥饿胁迫对基因表达的报告的影响,表现出许多差异(
      • van gilst m.r.
      • Hadjivassiliou H.
      • 快乐A.
      • Yamamoto K.R.
      核激素受体NHR-49控制脂肪消耗和脂肪酸组成 C。 Elegans..
      ,
      • van gilst m.r.
      • Hadjivassiliou H.
      • Yamamoto K.R.
      A caenorhabditis. elegans. 营养响应系统部分依赖于核受体NHR-49。
      )。这些差异影响了关于基因如何应对饥饿的结论,特别是显而易见的,例如,在编码脂质代谢的基因的响应中(Fig. 3)。因此,对于乙酰-CoA羧化酶(POD-2)和涉及脂肪酸生物合成途径的大部分酰基-CoA去饱和酶(脂肪基因),对于我们的研究结果,MRNA丰富水平的报告变化与我们的研究结果非常不同蛋白质丰富后期的变化。鉴于我们目前关于饥饿对蛋白质组影响的数据,结合蛋白质可能是大多数监管和信号传导途径的主要调解体和目标,以及涉及饥饿压力的反应,我们提出了重要的是未来专注于直接评估蛋白质丰度,PTM和其他蛋白质特性的变化,优先于专门测量mRNA水平。
      总之,这项研究 C。 Elegans. 提供蛋白质组水平的饥饿反应的第一次综合分析,记录蛋白质丰度水平和PTM的变化。这里描述的大规模数据集提供了用于未来研究的有价值的资源,用于线路系统和其他模型生物,包括人类。确定在导线中检测到的哪种效果是非常有趣的,这两者都是通过急性饥饿调节的靶标的靶标的靶标和介导这些反应的信号传导机制而受到节省。我们设想,随着蛋白质组学仪表和数据分析技术的持续改进,例如在开发期间的蛋白质组级响应的全球分析,老化和对环境压力的反应将越来越多地为生物学家提供有价值的资源,以了解基本生物的控制回复。这些研究也可以在将来扩展到包括额外的蛋白质组学尺寸,例如蛋白质组的亚细胞定位变化的平行分析,蛋白质复合物的变化,以及更全面的分析各种PTM。一个重要的未来目标是确保通过开发开放数据共享的有效资源为研究界提供最大的影响,如同蛋白质组动态的百科全书所示。

      致谢

      我们感谢Grahame Hardie和Vikram Narayan进行有用的讨论,并为稿件评论。我们感谢Akinori Endo寻求QRT-PCR测定。 M.L.是爱丁堡和苏格兰政府个人研究员的皇家学会。 A.I.L.是一位惠康信托校长研究员,A.G.是一家康复信任高级研究员。我们感激不尽 caenorhabditis. 遗传中心(GCG)用于发送菌株。

      补充材料

      参考

        • Felix M.A.
        • Braendle C.
        caenorhabditis. elegans.的自然历史。
        Curr。 BIOL。 2010; 20: R965-R969.
        • Baugh L.R.
        生长或不生长:营养控制发展期间 caenorhabditis. elegans. L1 arrest.
        遗传学。 2013; 194: 539-555
        • Angelo G.
        • van gilst m.r.
        饥饿保护种系干细胞并延长生殖寿命 C。 Elegans..
        科学。 2009; 326: 954-958
        • Seidel H.S.
        • kimble J.
        ocogalic种系饥饿反应 C。 Elegans..
        Plos一个。 2011; 6: e28074
        • Sheaffer K.L.
        • updike d.l.
        • 芒果S.E.
        雷帕霉素途径的靶向拮抗PHA-4 / FOXA以控制发育和老化。
        Curr。 BIOL。 2008; 18: 1355-1364
        • 肯尼昂C.J.
        衰老的遗传学。
        自然。 2010; 464: 504-512
        • 董M.Q.
        • venable J.D.
        • Au n。
        • XU T.
        • 公园S.K.
        • Cociorva D.
        • 约翰逊J.R.
        • 迪林A.
        • yates j.r.
        定量质谱识别胰岛素信号传导靶标 C。 Elegans..
        科学。 2007; 317: 660-663
        • Narbonne P.
        • 罗伊r.
        caenorhabditis.eDegans Dairs需要LKB1 / AMPK到配给脂质储备,并确保长期存活。
        自然。 2009; 457: 210-214
        • Uno M.
        • Honjoh S.
        • Matsuda M.
        • Hoshikawa H.
        • Kishimoto S.
        • Yamamoto T.
        • Ebisuya M.
        • Matsumoto K.
        • Nishida E.
        延长寿命的空腹信号通路 C。 Elegans..
        细胞代表。 2013; 3: 79-91
        • Vellai T.
        • Takacs-Vellai K.
        • 张Y.
        • Kovacs A.L.
        • orosz l.
        • Muller F.
        遗传学:TOR激酶对寿命的影响 C。 Elegans..
        自然。 2003; 426: 620
        • 长X.
        • MüllerF.
        • Avruch J.
        在哺乳动物细胞中的扭矩和 caenorhabditis. elegans..
        Curr。最佳。微生物。免疫素。 2004; 279: 115-138
        • 亨德森S.T.
        • BONAFèM.
        • 约翰逊T.E.
        d-16保护线虫 caenorhabditis. elegans. 在食物剥夺期间。
        J.Gerontol。一个生物。 SCI。 Med。 SCI。 2006; 61: 444-460
        • 崔米
        • Cohen M.L.
        • 滕C.
        • 韩米
        肿瘤抑制率RB致力于调节饥饿诱导的应力反应 C。 Elegans..
        Curr。 BIOL。 2013; 23: 975-980
        • 昌y.c.
        • 唐人
        • 梁S.Y.
        • PU T.H.
        • 猛腾。
        • Khoo K.H.
        • 陈G.C.
        评估 果蝇 具有早期蛹形成和氨基酸饥饿的应用中的体内定量蛋白质组学分析的代谢标记策略。
        J.蛋白质组。 2013; 12: 2138-2150
        • 携带B.
        • Poernbacher I.
        • Goetze S.
        • Ahrens C.H.
        • 省略美国。
        • 马蒂F.
        • Simigdala N.
        • Meyer I.
        • Wollscheid B.
        • 布伦纳E.
        • Hafen E.
        • Lehner C.f.
        喂养和饥饿的血淋巴蛋白质组 果蝇 larvae.
        Plos一个。 2013; 8: e67208
        • SabidóE.
        • 吴y.
        • Bautista L.
        • Porstmann T.
        • chang c.y.
        • Vitek O.
        • 斯福特M.
        • Aeberberold R.
        靶向蛋白质组学揭示了在持续高脂饮食后小鼠胰岛素和中央代谢途径的菌株特异性变化。
        摩尔。系统。 BIOL。 2013; 9: 681
        • ong s.e.
        • Blagoev B.
        • Kratchmarova I.
        • 克里斯滕森D.B.
        • 斯丁H.
        • Pandey A.
        细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达蛋白质组学的简单且准确的方法。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2002; 1: 376-386
        • 在努力硕士
        • 纾困
        • Pourkarimi E.
        • 干草r.t.
        • 布坎南G.
        • Coulthurst S.
        • Xirodimas D.P.
        • Gartner A.
        • Lamond A.I.
        用线虫中的氨基酸标记稳定同位素标记。
        NAT。方法。 2011; 8: 849-851
        • 弗雷斯J.
        • Engholm-Keller K.
        • Giessing A.
        • Pultz D.
        • Larsen M.R.
        • HOJRUP P.
        • Moller -Jensen J.
        • FAGERMEMAN N.J.
        氨基酸标记的定量蛋白质组学 C。 Elegans..
        NAT。 meth。 2011; 8: 845-847
        • LY T.
        • Ahmad Y.
        • Shlien A.
        • Soroka D.
        • 磨坊A.
        • Emanuele M.J.
        • stratton m.r.
        • Lamond A.I.
        人霉菌白血病细胞循环基因表达的蛋白质组学年表。
        Elife。 2014; 3: e01630
        • 在努力硕士
        • Lamond A.I.
        细胞生物学的多维蛋白质组学。
        NAT。 Rev. mol。在印刷之前,细胞BIOL epub。 2015; 10.1038 / NRM3970
        • 格兰D.
        • Kirchner M.
        • Thierfelder N.
        • Stoeckius M.
        • Selbach M.
        • Rajewsky N.
        培养在开发过程中mRNA和蛋白质表达 C。 Elegans..
        细胞代表。 2014; 6: 565-577
        • Hsin H.
        • kenyon c.
        来自生殖系统的信号调节寿命 C。 Elegans..
        自然。 1999; 399: 362-366
        • 你是y.j.
        • kim J.
        • COBB M.
        • 艾弗里L.
        饥饿通过毒蕈碱乙酰胆碱途径激活地图激酶 caenorhabditis. elegans. pharynx.
        细胞元。 2006; 3: 237-245
        • Pourkarimi E.
        • 格里斯S.
        • Gartner A.
        CED-9 / BCL2和CED-4 / APAF-1本地化的证据与当前模型不一致 C。 Elegans. apoptosis induction.
        细胞死亡有所不同。 2012; 19: 406-415
        • Wessel D.
        • flüggeu.i.
        洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质中蛋白质的定量回收的方法。
        肛门。生物学习。 1984; 138: 141-143
        • Ritorto M.S.
        • 煮K.
        • Tyagi K.
        • Pedrioli P.G.
        • 胸衣M.
        亲水性强阴离子交换(HSAX)色谱,用于复合蛋白质素的高正交肽分离。
        J.蛋白质组。 2013; 12: 2449-2457
        • Cox J.
        MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
        NAT。 Biotechnol。 2008; 26: 1367-1372
        • 黄D.W.
        • 谢尔曼B.T.
        • LEMPICKI R.A.
        用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
        NAT。 protoc。 2009; 4: 44-57
        • Supek F.
        • Bošnakm.
        • Škuncan。
        • ŠMUCT.
        Revigo总结并可视化了基因本体论术语的长列表。
        Plos一个。 2011; 6: e21800
        • Raharjo W.H.
        • 洛根B.C.
        • Wen S.B.
        • Kalb J.m.
        • Gaudet J.
        体外和体内表征 caenorhabditis. elegans. PHA-4 / FOXA响应元素。
        开发。动力。 2010; 239: 2219-2232
        • 墨菲C.T.
        • 麦卡尔尔S.A.
        • Bargmann C.I.
        • 弗雷泽A.
        • Kamath R.S.
        • Ahringer J.
        • 李H.
        • kenyon c.
        在DAF-16下游行动的基因以影响寿命 caenorhabditis. elegans..
        自然。 2003; 424: 277-283
        • updike d.l.
        • 芒果S.E.
        HTZ-1 / H2A.Z和PHA-4 / FOXA的临时调节前述开发。
        Plos Genet。 2006; 2: 1500-1510
        • 削弱C.M.
        • 麦克林K.N.
        • ercan s.
        • 张凌。
        • 绿色r.d.
        • 凯利W.G.
        • 谎言J.D.
        组蛋白变体HTZ-1的基因组分布与功能 C。 Elegans. embryogenesis.
        Plos Genet。 2008; 4: E1000187.
        • OOI S.L.
        • Pries J.R.
        • Henikoff S.
        组蛋白H3.3种系中的变体动态 caenorhabditis. elegans..
        Plos Genet。 2006; 2: 883-895
        • 在努力硕士
        • Ahmad Y.
        • Kirkwood K.J.
        • LY T.
        • Lamond A.I.
        使用定量蛋白质组学的蛋白质降解的全局亚细胞表征。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2013; 12: 638-650
        • 梁五。
        • Ullrich M.
        • 林H.
        • 咀嚼Y.L.
        • 君主S.
        • 歌曲X.
        • Zaw T.
        • 卡西奥米
        • gotz J.
        • 尼古拉斯H.R.
        改变老化和热休克反应的蛋白质 C。 Elegans. 通过分析全球和DE Novo合成蛋白质组。
        细胞摩尔。生活SCI。 2014;
        • McBryant S.J.
        • lu x.
        • 汉森J.C.
        链接组团的多官能团:蛋白质 - 蛋白质相互作用的新出作作用。
        细胞res。 2010; 20: 519-528
        • 赵立
        • Nakamura T.
        • 傅y.
        • 拉扎尔Z.
        • Spector D.L.
        基因书签加速了丝分裂后转录重新激活的动力学。
        NAT。细胞生物。 2011; 13: 1295-1304
        • rechavi o.
        • HOUII-ZE'EVI L.
        • Anava S.
        • Goh W.S.
        • Kerk S.Y.
        • Hannon G.J.
        • 霍特奥。
        饥饿诱导的小RNA的转基因遗传 C。 Elegans..
        细胞。 2014; 158: 277-287
        • yankovskaya V.
        • 马菲尔德R.
        • Törnroths。
        • Luna-Chavez C.
        • Miyoshi H.
        • 柠檬C.
        • BYRNE B.
        • CECCHINI G.
        • 岩田S.
        琥珀酸脱氢酶和反应性氧物种的结构。
        科学。 2003; 299: 700-704
        • 沉E.Z.
        • 歌曲C.Q.
        • 林Y.
        • 张W.H.
        • 苏p.f.
        • 刘W.Y.
        • 张P.
        • 徐J.J.
        • 林第n。
        • 詹C.
        • 王X.
        • 谢尔。
        • 程H.
        • 董M.Q.
        成年早期的MITOFLASH频率预测了寿命 caenorhabditis. elegans..
        自然。 2014; 508: 128-132
        • Kaeberlein T.L.
        • 史密斯e.d.
        • Tsuchiya M.
        • Welton K.L.
        • 托马斯J.H.
        • 领域S.
        • 肯尼迪B.K.
        • Kaeberlein M.
        寿命延伸 caenorhabditis. elegans. 完全去除食物。
        老化细胞。 2006; 5: 487-494
        • 袁Y.
        • Kadiyala C.S.
        • ching t.t.
        • Hakimi P.
        • 萨哈斯。
        • 徐H.
        • 元C.
        • mullangi V.
        • 王L.
        • Fivenson E.
        • Hanson R.W.
        • ewing r.
        • HSU A.L.
        • Miyagi M.
        • 冯Z.
        增强的能量代谢有助于卡路里限制的延长寿命 caenorhabditis. elegans..
        J. Biol。化学。 2012; 287: 31414-31426
        • van gilst m.r.
        • Hadjivassiliou H.
        • 快乐A.
        • Yamamoto K.R.
        核激素受体NHR-49控制脂肪消耗和脂肪酸组成 C。 Elegans..
        Plos Biol。 2005; 3: e53
        • van gilst m.r.
        • Hadjivassiliou H.
        • Yamamoto K.R.
        A caenorhabditis. elegans. 营养响应系统部分依赖于核受体NHR-49。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2005; 102: 13496-13501