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探测位置彩易福彩组学彩易福彩组学的彩易福彩溶解事件的效率*

  • 金拉斯曼
    脚注
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    医疗彩易福彩研究,VIB,B-9000根特,比利时

    格伦大学生物化学系,B-9000格伦蒂姆
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  • Petra Van Damme.
    一致
    所有通信都应解决:医疗彩易福彩研究部,法兰德斯生物技术生物技术研究所,根特大学,A.Baertsoenkaai 3,B9000格伦,比利时。电话:+ 32-92649274;传真:+ 32-92649496。
    脚注
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    医疗彩易福彩研究,VIB,B-9000根特,比利时

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  • 迪翁Kaiserman.
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    澳大利亚维多利亚3800的生物化学与分子生物学系
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  • 弗朗西斯赋予局征
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  • kimberly demeyer.
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  • 肯尼赫尔森
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  • Marc痛苦
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  • Phillip I. Bird.
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    澳大利亚维多利亚3800的生物化学与分子生物学系
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  • joëlvandekerckhove
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  • Kris Gevaert.
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    所有通信都应解决:医疗彩易福彩研究部,法兰德斯生物技术生物技术研究所,根特大学,A.Baertsoenkaai 3,B9000格伦,比利时。电话:+ 32-92649274;传真:+ 32-92649496。
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    格伦大学生物化学系,B-9000格伦蒂姆
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  • 作者脚注
    * K.P.和K.H.通过佛兰德斯(IWT-Vlaanderen)的科学和技术促进创新研究所的博士补助金提供支持。 P.V.D.和f.i.是研究基金会的博士后研究员 - Flanders(FWO-Vlaanderen)。我们进一步确认支持科研基金的研究拨款 - 弗兰德斯(比利时)(项目编号G.0077.06和G.0042.07),这是根特大学和大学的协调一致的研究行动(项目BOF07 / GOA / 012)吸引力杆(iuap06)。
    本文包含补充图。 1-4和表1。
    †这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
      几种质谱驱动技术允许映射底物曲目和蛋白酶的特异性。这些技术通常产生长期的蛋白酶基材和具有(潜在)生理相关性的加工位点,但为了理解蛋白酶的主要功能,重要的是从临界基材辨别旁面的旁边底物。由于前者通常以较低的效率处理,所以实际底物切割效率的数据可以有助于分类蛋白酶基材。在该研究中,通过组合分数对角线色谱法分离代谢彩易福彩标记(Silac)之后的定量质谱法将通过组合的分数对角线色谱法分离,用于监测蛋白酶产生的Neo-n-termini浓度的助熔剂。在我们的实验设置中,用人丝氨酸蛋白酶Granzyme B(HGRB)处理Jurkat细胞裂解物,用于三个不同的孵育期。以前由N-末端组合分数对角线色谱法映射的人类颗粒酶B基质的广泛名单(
      • van damme p.
      • Maurer-Stroh S.
      • Plasman K.
      • van durme J.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • de bock p.j.
      • 潮气米
      • 卢梭F.
      • Schymkowitz J.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      N-末端彩易福彩组学彩易福彩处理分析揭示了Granzzyme B orthologs的新型特异性底物测定簇。
      然后用于在86个蛋白中分配101个独特的HGRB特异性新N-N-末端。通过这种方式,我们能够将几个站点定义为有效地切割 体外因此,识别潜在的生理学上更相关的基质。其中,众所周知的HGRB底物BID被证实是HGRB诱导细胞凋亡的若干其他潜在调节剂旁边的有效的HGLB基底,例如BNIP2和AKAP-8。我们的一些彩易福彩组学结果通过底物免疫印迹和使用与人颗粒酶B孵育的肽底物进行进一步证实。
      蛋白水解是一种方法,在此期间将靶蛋白部分地将其部分加工成(稳定)片段(通常将信号传导事件的蛋白酶介导的传播)或通过蛋白水解酶或蛋白酶完全切入其复合氨基酸(彩易福彩分解代谢)中。蛋白酶在人类稳态,发病机制和自身免疫中具有关键效应作用,令人惊讶的是,在这些过程中阐明其特定功能的最重要的是,通过分析他们的生理学基础曲目(
      • Trapani J.A.
      • Smyth M.J.
      穿孔素/颗粒酶细胞死亡途径的功能意义。
      ,
      • Romero V.
      • 安德拉德F.
      颗粒酶的非凋亡函数。
      )。因为蛋白水解裂解导致新彩易福彩的形成N-和C-Termini,最近致力于新末端肽的特定分离的许多努力。这导致了几种彩易福彩组学技术的发展,以研究蛋白酶酶衬底特异性或目录底物曲目( 例如 最近审查(
      • 赋予F.
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • Plasman K.
      • van damme p.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      MS驱动蛋白酶底物降解组。
      )))。
      由于这种高度不断不断发展的植物彩易福彩组学的领域,出现了丰富的蛋白酶特异性底物切割数据,其通常源自来自 离体 分析; 例如 我们组报告的数百个潜在的颗粒酶B基质(
      • van damme p.
      • Maurer-Stroh S.
      • Plasman K.
      • van durme J.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • de bock p.j.
      • 潮气米
      • 卢梭F.
      • Schymkowitz J.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      N-末端彩易福彩组学彩易福彩处理分析揭示了Granzzyme B orthologs的新型特异性底物测定簇。
      )。已经表明,质谱仪的高灵敏度也可能导致鉴定非常罕见和低效的切割事件( 例如 (
      • van damme p.
      • Maurer-Stroh S.
      • Plasman K.
      • van durme J.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • de bock p.j.
      • 潮气米
      • 卢梭F.
      • Schymkowitz J.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      N-末端彩易福彩组学彩易福彩处理分析揭示了Granzzyme B orthologs的新型特异性底物测定簇。
      ,
      • Enoksson M.
      • 李杰。
      • 象征米..
      • Timmer J.C.
      • Wildfang E.
      • eroshkin A.
      • Salvesen G.S.
      • 陶w.a.
      用定量彩易福彩组学鉴定彩易福彩水解裂解位点。
      )))。这些通常被认为是由于蛋白酶浓度的非物质学条件和底物定位的结果而发生(特别是在 离体 研究)因此影响可能对理解蛋白酶的生理功能至关重要的彩易福彩。因此,对这种屏幕中鉴定的蛋白酶的关键目标进行了非常重要的是,为了揭示蛋白酶作用的初级信号传导途径或彩易福彩组件。因为还显示出导致函数损失的基板处理比加工效果更快(
      • Timmer J.C.
      • Salvesen G.S.
      Caspase基材。
      ),明确挑战以区分效率低下,并且在大规模蛋白酶研究中的晚期基质处理事件的早期正在出现。
      从人类颗粒酶B(HGRB)的关键切割事件中辨别旁观者
      使用的缩写是:
      (h)grb
      (人类)Granzyme b
      (h)出价
      (人类)BH3 - 相互作用的域死亡激动剂
      AcD3
      Trideutero-乙酰基
      Akap-8
      A-kinase锚蛋白8
      Bnip2
      BCL2 /腺病毒E1B 19 KDA蛋白 - 相互作用蛋白2
      cofradic.
      组合分数对角线色谱
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      SRM.
      选择的反应监测。
      1使用的缩写是: (h)grb
      (人类)Granzyme b
      (h)出价
      (人类)BH3 - 相互作用的域死亡激动剂
      AcD3
      Trideutero-乙酰基
      Akap-8
      A-kinase锚蛋白8
      Bnip2
      BCL2 /腺病毒E1B 19 KDA蛋白 - 相互作用蛋白2
      cofradic.
      组合分数对角线色谱
      萨拉克
      细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记
      SRM.
      选择的反应监测。
      -A蛋白酶通过先天和自适应免疫系统的细胞涉及颗粒介导的细胞死亡 - 我们在这里使用了三重细胞(时间基)N-末端组合分数对角线色谱(CoFradic)位置彩易福彩组学设置。 N-末端CoFradic采用连续反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离肽混合物,并将N-末端肽从全部彩易福彩组消化物中分类出来(
      • Staes A.
      • van damme p.
      • 赫尔森K.
      • Demol H.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过组合分数对角线色谱(CoFradic)改善彩易福彩组信息性彩易福彩N-末端肽的回收率。
      ,
      • Gevaert K.
      • 潮气米
      • 玛特L.
      • van damme J.
      • Staes A.
      • 托马斯G.R.
      • vandekerckhove J.
      探索彩易福彩谱和分析彩易福彩处理的质谱法鉴定分选N-末端肽。
      )。通过精氨酸的同位素变体引入代谢彩易福彩组标记,因为通过使用的化学改性反应的性质,所有的N-末端肽都是分类的,所有的末端都在精氨酸上。在这里,使用三重格隆的彩易福彩组学使用 12C6, 13C6 , 和 13C615N4 细胞培养氨基酸(Silac)标记的精氨酸稳定同位素标记(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达彩易福彩组学的简单且准确的方法。
      ),引入提供足够间距的标签,从而允许直接定量单个肽离子(参见结果部分)。我们的一般假设是以下情况。对于每个鉴定的彩易福彩N-末端肽和HGRB产生的新N-末端肽,可以预期三种可能的同位素变体。可以容易地从其MS光谱读取不受HGRB的彩易福彩N末端,并且其中浓度保持恒定的彩易福彩N末端。另一方面,在我们的时间为基础的彩易福彩组学设置中,预计HGRB产生的Neo-N-Termini的不同趋势是预期的。我们展示了HGRB切割位点在孵育的最短时间上完全切割 - 并且由于基于MS光谱中的同位素标记的肽离子的模式,容易与效率较低的位点分化。除了监控之外,通过免疫斑点分离,通过免疫斑点检测完成了几个分类的HGRB网站的解理效率的验证,除了监控之外 体外 RP-HPLC的肽加工。此外,分析了几种代表性基质的加工动力学。所有这些生化表征实验的结果非常顺利,与从彩易福彩组学筛查中获得的数据一致,等等证实已知的人BH3相互作用的结构域死亡者作为至关重要的,有效地裂开的HGLB基材,从而验证我们的目标彩易福彩组学方法确定蛋白酶的原始靶标。

      实验步骤

       细胞培养

      人为Jurkat T细胞来自ATCC(TIB-152,美国型培养物收集,Manassas,VA),并在补充有10%透析胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,Ca),100个单位/ ml青霉素的RPMI 1640培养基中生长(Invitrogen)和100μg/ ml链霉素(Invitrogen)。细胞在含有天然的培养基中生长(12C6 ), 13C6 , 或者 13C615N4 l-Arginine(剑桥同位素实验室,andover,ma)(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达彩易福彩组学的简单且准确的方法。
      )浓度为230μm ( IE。 RPMI中存在的建议浓度的20% l-Arginine对脯氨酸转化率是不可检测的)。将细胞在37℃和5%CO中培养2 对于至少六个人口倍增,以确保完全掺入标记的精氨酸。

       N-末端CoFradic分析的细胞裂解物的制备

      洗涤硅酸盐标记的细胞 d-pbs并重新悬浮在7×106 cells per ml in 50 mm Tris-HCl and 100 mm NaCl在pH 8.0时。用50μ的终浓度将细胞与Pan-Caspase抑制剂N-苄氧基羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮预热m 在37℃下持续15分钟,然后通过三轮冻融裂解。上清液,通过离心10分钟以16,000×清除10分钟 g (将彩易福彩浓度确定为1.3mg / ml),用200 n处理m 人重组颗粒酶B(HGRB)在37℃下不同时间点。表达并纯化重组人体颗粒酶B. Pichia Pastoris.,并如前所述确定其活动(
      • 太阳J.
      • 鸟C.H.
      • Thia K.Y.
      • 马修A.Y.
      • Trapani J.A.
      • 鸟p.i.
      由常见的人Rah等位基因编码的Granzyme B保留了促凋亡活性。
      ,
      • 太阳J.
      • 鸟C.H.
      • Buzza M.S.
      • 麦基K.E.
      • 威士忌J.C.
      • 鸟p.i.
      从毕赤酵母中重组人体颗粒酶B的表达和纯化。
      )。将固体盐酸胍加入到终浓度为4 m 为了灭活HGRB并使所有彩易福彩变性。在将样品混合等量的情况下,使用Tris(2-羧乙基)磷碱的同时同时烷基化彩易福彩(TCEP.HCL; 1米m 最终浓度)和碘乙酰胺(2米m 终浓度分别在30℃下持续1小时。如前所述进行N末端CoFradic协议的后续步骤(
      • Staes A.
      • van damme p.
      • 赫尔森K.
      • Demol H.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过组合分数对角线色谱(CoFradic)改善彩易福彩组信息性彩易福彩N-末端肽的回收率。
      )。将彩易福彩组在37℃下在37℃下消化过夜,进行测序级,改性胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)(酶/底物为1/100 w / w)。

       液相色谱(LC) - 用于MS(MS / MS)分析和数据处理

      电离喷雾电离(ESI)LC-MS / MS分析在ESI-Quadrupole(Q) - 飞行时间(TOF)(Waters Corporation)质谱仪上进行(如前所述)(
      • ghesquièreb.
      • van damme J.
      • 玛特L.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      对角色谱法的彩易福彩全组鉴定N-糖基化事件。
      )。 ESI-Q-TOF MS / MS肽片段化光谱使用MassLynx®软件(版本4.1,Waters Corporation)转换为PKL文件。使用局部安装的吉祥物数据库搜索引擎2.2.1版本识别N-末端肽( www.matrixscience.com.)和瑞士人的数据库(Uniprotkb / swiss-prot彩易福彩数据库的57.11版,含有512,994个序列条目,其源于人类彩易福彩的限制。 dbtoolkit制作的截断的肽数据库(
      • 玛特L.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      dbtoolkit:处理肽中心彩易福彩组学的彩易福彩数据库。
      ),并行搜查以更有效地拾取彩易福彩处理事件( 例如 (
      • van damme p.
      • 玛特L.
      • van damme J.
      • Hugelier K.
      • Staes A.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      在FAS诱导的细胞凋亡期间的Caspase特异性和非特异性的体内彩易福彩加工。
      )))。使用以下搜索参数。用ESI-QUAD-TOF作为所选仪器的肽片段规则,将肽质量耐受设定为0.2DA和肽片段质量耐受性,以Q-TOF总理数据的肽片段规则。内蛋白酶Arg-C / P(=没有限制精氨酸 - 脯氨酸裂解)被设定为允许一个错过的切割的酶。可变修饰是焦蛋白形成N-末端谷氨酰胺的形成,N-末端烷基化半胱氨酸的吡哆酰胺甲基形成,亚氨酰胺,乙酰化和三甲酰甲酰化的α-N-末端的脱酰胺。固定修饰是甲硫氨酸氧化(亚砜),用于半胱氨酸的氨基甲酰基,赖氨酸的三氘代乙酰化和鉴定重标记肽,[ 13C6 ] 或者 [ 13C615N4] -Arginine另外设置为固定修改。只有MS / MS-Spectra和相应的标识超过相应的吉祥物的身份阈值评分(在95%的置信水平)并且被排名第一。此外,还进一步询问了接受低吉祥物离子评分(上述阈值的五个或更少的阈值)的光谱,并且仅考虑覆盖覆盖3个连续三个氨基酸的B型和Y碎片离子的光谱(参见 补充数据 清单标识的MS / MS-Spectra)。通过搜索诱饵数据库的估计假发现率通常被发现在频谱水平上的2%和4%之间(
      • Staes A.
      • van damme p.
      • 赫尔森K.
      • Demol H.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过组合分数对角线色谱(CoFradic)改善彩易福彩组信息性彩易福彩N-末端肽的回收率。
      )。每当肽与彩易福彩家族的多个成员匹配(冗余)时,报告的彩易福彩进入(柱“彩易福彩描述,” 补充表1)根据其字母排序。在每种情况下,在“同种型”栏中报告了其他匹配的彩易福彩条目。相应的正向性小鼠裂解位点(如)确定(
      • van damme p.
      • Maurer-Stroh S.
      • Plasman K.
      • van durme J.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • de bock p.j.
      • 潮气米
      • 卢梭F.
      • Schymkowitz J.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      N-末端彩易福彩组学彩易福彩处理分析揭示了Granzzyme B orthologs的新型特异性底物测定簇。
      ),报告说 补充表1.
      从MassLynx®软件版本4.1环境中的MS数据单独计算肽强度比。为了纠正初始彩易福彩浓度的小变异, 12C6/13C612C6/13C615N4 使用基质-2对数值的比率,首先经受其比率的基本-2对数值(1或1)的1788个数据库注释的彩易福彩N-末端肽(在位置1或2时开始的肽)的比率(
      • Huber P.J.
      • ronchetti e.m.
      )。相应的比率是指0.0115( 12C6/13C6)和-0.0209(12C6/13C615N4然后,然后用于校正所鉴定的所有肽的计算比率。然后,我们使用R软件包进行统计计算以计算第一和第二时间点之间的Rog2变换的N-末端肽比的概率分布(N(0.0115,0.1416)(平均值,标准偏差))和第二和第三时间点(N(-0.0209,0.1890))。落在99.5%彩易福彩N-末端肽强度比的99.5%概率间隔内的蛋白酶衬底强度比被认为是衍生自有效的切割位点(参见结果部分)。

       免疫印迹分析

      灭活内源性胱天蛋白酶,因此除了对照样品外,所有彩易福彩样品之外,所有彩易福彩样品都排除了测试衬底的Caspase介导的裂解,除了对照样品和100n孵育的样品m 2小时的HGRB(后一种样品表明在使用烷基化彩易福彩裂解物时未妨碍GRB活性电位),用碘乙酰胺预处理在黑暗中以5米的终浓度在黑暗中进行15分钟m (
      • 恶魔D.
      • van damme p.
      • 万民贝尔格特
      • DECEUNINCK A.
      • van durme J.
      • Verspurten J.
      • 赫尔森K.
      • 赋予F.
      • Wejda M.
      • Schymkowitz J.
      • 卢梭F.
      • 德文德·艾德。
      • vandekerckhove J.
      • 拒绝W.
      • Gevaert K.
      • Vandenabeele P.
      彩易福彩组 - 宽的基材分析表明基板排除作为产生Caspase-7的机制,与Caspase-3特异性产生。
      ,
      • Casciola-Rosen L.
      • 加西亚 - 卡尔沃姆
      • 公牛率。
      • Becker J.W.
      • Hines T.
      • Thornberry N.A.
      • 罗森A.
      小鼠和人类颗粒酶B具有不同的四肽特异性和能力来招募竞争途径。
      )。随后,制备所有彩易福彩样品并在不同浓度下用HGRB处理,并针对不同的时间点(参见结果部分)。在HGLB孵育后,加入样品加载缓冲液并等量的彩易福彩(50μg/样品;使用来自Bio-rad(德国慕尼黑,德国)的DC彩易福彩测定试剂盒测量彩易福彩浓度)在4%-12%或12时分离出来在MOPS缓冲液(Bio-rad)中的%聚丙烯酰胺标准XT-凝胶在150 V.随后,将彩易福彩转移到PVDF膜上。在含有Tris缓冲盐水的5%脱脂乳粉和0.1%Tween-20(TBS-T)中封闭膜30分钟,并在TBS-T中的5%脱脂奶粉中的一抗探测1小时。在TBS-T中三次10分钟洗涤,将膜与含有TBS-T的5%脱脂奶粉中的1小时孵育膜。在TBS-T或TBS中的三倍清洗后,使用增强的化学机构试剂盒(PerkinElmer Life Sciences,Boston,MA),在ECL Hyperfilms(Amersham Biosciences,Buckinghamshire)上可视化频段。 Caspase-3抗体来自Calbiochem(AAP-113),来自R的抗体&D系统(AF860)(Minneapolis,Mn),来自ABCAM(AB16940)(剑桥,MA),AKAP-8和来自ABCAM的α-4抗体的核仁抗体(AB32822和AB6038)。重组谷胱甘肽S-转移酶(GST)-AGGedBNIP2来自亚联符(台北,台湾),并从ABCAM(AB6649)用GST抗体测定。通过在用各种浓度的人GRB处理的各种基材的彩易福彩印迹分析并在各种时间孵育后,通过密度测定法测定处理程度。使用Chemigenius成像系统(Syngene,Cambridge,UK)进行定量,并且使用Genetools 3.07图像分析软件(Syngene)量化信号强度。

       通过用HGRB治疗合成肽来确认HGRB特异性切割事件

      在应用的生物系统433A肽合成器上使用FMOC化学在房屋内合成以下持有HGRB切割位点的肽:NH2。 rlgrieadsesqediiry.(NO2)R.OH(BID),NH2.Lpeddsieadilaitgy(NO2)R.OH(BNIP2),NH2.ketpeeva advlaeviy.(NO2)R.OH(AKAP-8),NH2.vphedicedsdidgdy.(NO2)R.OH(Importinα-4)和NH2.fvkglsedtteetlky.(NO2)R.OH(核仁)。将底物肽在37℃下测定2小时,各种HGL浓度(10,50,200和500 nm)在底物浓度为100μm。通过将三氟乙酸加入1%的最终浓度来终止反应。通过反相 - HPLC分离通过监测前体肽及其片段的UV吸光度信号(214nm)来评估HGRB的裂解。通过将产物峰的强度与未加工前体的强度进行比较来确定水解程度。

       缓冲液和细胞裂解物中荧光肽AC-IEPD-AMC的Granzzyme B切割效率分析

      AC-IEPD-AMC购自Bachem(Bubendorf,Switzerland)和20米m 在DMSO中制备股票溶液。在含100米的缓冲液中制备人Jurkat T细胞的冻融裂解物m NaCl, 50 mm 如上所述,Tris-HCl pH 7.9和这些裂解物是S-烷基化的和脱盐。在黑色96孔板上进行测量,在温度控制的生物TEK FLX800荧光微孔板读取器(在360nm处激发,460nm处发射)。 400 n的40μl等分试样m Granzyme B溶液(150米m NaCl, 50 mm 在每孔中加入Tris-HCl,pH7.9),同时将板保持在冰上。在不同的板中,将AC-IEPD-AMC稀释至缓冲液或细胞裂解物中所示的最终浓度的两倍(细胞裂解物(细胞裂解物中的彩易福彩浓度为2.6mg / ml)。然后将40μL等份的稀释的AC-IEPD-AMC加入到含颗粒酶B的孔中。将板短暂混合并置于37℃的微孔板读数器中。在50分钟的时间内,每78秒测量荧光。

      结果

       彩易福彩组学设置的一般描述

      人的Jurkat细胞在含有三种不同的氧化培养基中生长 12C6,13C6 , 或者 13C615N4 l-Arginine(Fig. 1A)。在冻融裂解之前,用细胞进行处理 N - 苄氧基羰基 - Val-Ala-Asp-氟甲基酮,以防止已知通过Granzyme B激活的半胱天冬酶进行底物处理(
      • 安德拉德F.
      • 罗伊斯。
      • Nicholson D.
      • Thornberry N.
      • 罗森A.
      • Casciola-Rosen L.
      Granzyme B直接且有效地切割了几种下游胱天蛋白酶基质:对CTL诱导的细胞凋亡的影响。
      )。将这些不同的细胞裂解物分别与HGRB孵育10,30或60分钟(三个Plex设置, Fig. 1A)和蛋白酶失活,混合等样量,并通过N-末端CoFradic分选程序分离N-末端肽(
      • Staes A.
      • van damme p.
      • 赫尔森K.
      • Demol H.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过组合分数对角线色谱(CoFradic)改善彩易福彩组信息性彩易福彩N-末端肽的回收率。
      )。随后的LC-MS / MS分析导致鉴定为与992肽相关的2666ms / MS-Spectra。其中295肽(29.7%)在261例蛋白中存在三相酸乙酯 - 乙酰化,未在彩易福彩位置开始,因此形成了我们的主要潜在的HGRB识别的裂解位点和基材。此列表是通过我们先前报告的GRB处理事件目录进行交叉检查(
      • van damme p.
      • Maurer-Stroh S.
      • Plasman K.
      • van durme J.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • de bock p.j.
      • 潮气米
      • 卢梭F.
      • Schymkowitz J.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      N-末端彩易福彩组学彩易福彩处理分析揭示了Granzzyme B orthologs的新型特异性底物测定簇。
      )以这种方式,在86个彩易福彩中101个独特的新N-Termini( IE。 由于HGLB介导的加工产生的,分配了本研究中鉴定的所有新N个末端的34.2%(补充表1 )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1实验设置以探测HGRB底物蛋白水解程度。 A,Silac使用 12C6, 13C6 , 和 13C615N4 l-Arginine用于标记Jurkat细胞,然后监测ZVAD-FMK预处理Jurkat冻融(FT)细胞裂解物的(Neo-)N-Termini的浓度助熔剂。 12C6, 13C6 , 和 13C615N4 l-Arginine标记的裂解物是 体外 incubated with 200 nm HGRB分别为10,30和60分钟。通过加入盐酸胍孵育和灭活HGRB后,混合了相等量的彩易福彩组制剂,N-末端CoFradic分选程序分离N-末端肽(
      • Staes A.
      • van damme p.
      • 赫尔森K.
      • Demol H.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过组合分数对角线色谱(CoFradic)改善彩易福彩组信息性彩易福彩N-末端肽的回收率。
      ),指示的不同关键步骤。 B,表示HGRB不受影响并因此未改变的N-Terminus AC-的代表性MS-Spectrum2mlgpeggegfvhklr.16 (AC表示来自异质核核糖核糖蛋白F(HNRNPF)的α-乙酰化氨基。 C,针对HGRB产生的NEO-N-Terminus(ACD3-692sggntspgvtangear.707 (ACD3表示来自rho / Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子2(ARHG2)的三氘液 - 乙酰化α-氨基),表明有效的切割事件。 D为ACD3观察到增加离子强度484sglitpggfssvpagometpelielr.508 从拼接因子3b亚基2(sf3b2)暗示到较少有效地切割的HGLB位点。
      我们的假设是在最短孵育时间下有效的HGRB位点被切割为完整性,因此预计不会在延长HGLB孵育时增加它们相应的新N-末端肽的浓度(Fig. 1C)。因此,预期这些肽的MS模式类似于彩易福彩N-末端肽(Fig. 1B),而较少有效地切割的HBRB部位应在稍后的时间点(以下)在稍后的时间点()产生MS光谱中的离子强度的增加(Fig. 1D)。考虑到彩易福彩N-末端的实验性离子信号变异,以这种方式在这种方式中鉴定了一类有效的裂缝的HGRB位点,在99.5%的置信区间内。实际上,计算并用于描绘最有效的HGRB切割位点(含有彩易福彩开始彩易福彩N-末端肽(彩易福彩开始位置的彩易福彩开始位置的肽)的平均值值(彩易福彩开始位置)。Fig. 2)。 HGRB诱导的Neo-N-Termini,其离子强度变化在孵化时间进行检查时,并在其有效或更少有效地点进行分配 表I. 。除了良好表征和高效的HGRB基质BH3 - 相互作用的结构域死亡激动剂或BID之外,发现促凋亡BCL-2家族成员BNIP2和蛋白激酶A锚蛋白8(AKAP-8)持有有效地切割的HGRB网站(在10到30分钟之间观察到的折叠变化,30和60分钟分别为0.97和1,1.31和1.21)。值得注意的是,先前据报道所有这些彩易福彩在生理条件下在凋亡执行过程中发挥着突出的作用(
      • Trapani J.A.
      • 萨顿v.r.
      Granzyme B:促凋亡,抗病毒和抗肿瘤功能。
      ,
      • kamada s。
      • Kikkawa U.
      • Tsujimoto Y.
      • 猎人T.
      A-激酶锚定彩易福彩95用作通过酶底物结合的活性胱天蛋酶3的核转位的潜在载体。
      ,
      • 斯科特G.B.
      • 鲍斯帕。
      • 威尔逊e.b.
      • Meade J.L.
      • 低于B.C.
      • 达维森A.
      • 布莱尔G.E.
      • 厨师G.P.
      在人类自然杀伤细胞介导的杀灭期间,鉴定Bcl2 /腺病毒E1b-19k蛋白 - 相互作用蛋白2(bnip-2)作为颗粒酶B靶标。
      )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2分类最有效地切割的HGRB网站。 506个独特彩易福彩n-termini的分布从位于一个或两个(三角形)和101个独特的HGRB特定Neo-n-termini(圆圈)开始的 13C6/12C613C615N4/13C6 可以计算比率,绘制。不受影响的彩易福彩N-Termini的比例值的扩散用于设定含有最有效的裂解的HGRB位点的区域(p 99.5%)。 neo-n-termini或数据库注释了与所描绘的MS-Spectra相对应的N-Termini B-D. A-E. are indicated.
      表I. 分类101 HGRB-生成的Neo-N-Termini及其相应的基材。给出了Uniprot数据库的主要登录号,彩易福彩描述,P10-P10'序列和Neo-n-Termini的折叠变化在10至30分钟至30分钟至30分钟之间。对于每个类别,彩易福彩根据其彩易福彩描述按字母顺序排列
      Swissprot加入彩易福彩描述人类切割遗址P10-P10'折叠变化10-30分钟折叠改变30-60分钟
      高效的HGRB网站
      P6322040s核糖体蛋白S21 MQND. (4)↓agefvdlyvp.0.891.33
      O43823A-kinase锚蛋白8Ketpeevaad.(576)↓vlaevitaav.1.311.12
      Q14562ATP依赖性RNA Helicase DHX8deddvkvavd.(144)↓vlkelealmp.0.981.03
      Q12982BCL2 /腺病毒E1B 19 KDA蛋白 - 相互作用蛋白2lpddsiead.(28)↓iLaitgpedq.0.971.00
      P55957BH3 - 相互作用的域死亡激动剂hsrlgriead.(75)↓sesqediirn.1.301.06
      Q9NUL3双链RNA结合蛋白Staufen Homolog 2pkgilhlspd.(418)↓vyqemeasrh.1.031.02
      P29083一般转录因子IIE亚基1 马普德 (5)↓vltevpaalk.1.211.24
      Q6PKG0LA相关蛋白1kdqdeqeeld.(606)↓flfdeemeqm.1.191.09
      P18615负伸长因子eSDRLRELGPD.(149)↓geeaegpgag.0.861.29
      P26599聚酰亚胺酰胺染色蛋白1 MDGIVPD. (7)↓iavgtkrgsd.1.221.16
      Q92733富含脯氨酸的彩易福彩PRCClvppqeiapd.(385)↓asfiddeafk.1.000.72
      Q92974Rho / Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子2repalplepd.(689)↓sggntspgvt.1.060.97
      O75533拼接因子3B亚基1LDEAQGVGLD.(34)↓Stgyydqeiy.0.951.27
      Q9Y2W1甲状腺激素受体相关蛋白3Reaqvnvrmd.(574)↓sfdedlarps.1.201.13
      Q9Y5J1U3小核仁RNA相关蛋白18同源物rcleelvfgd.(98)↓vendandallr.1.220.84
      O43395U4 / U6小核核糖核蛋白PRP3Krelkevfgd.(97)↓DSeiskessg.0.911.02
      O95365锌手指和含BTB域的彩易福彩7aQilaadagad.(139)↓agqldlvdqi.1.151.10
      Q6NZY4锌手指CCHC含域的彩易福彩8RTASGAVED.(513)↓altleeleeq.1.161.20
      效率较低的HGRB网站
      P6228040s核糖体蛋白S11qnkkrvllge.(27)↓tgkeklpryy.1.452.45
      P6284140s核糖体蛋白S15kftyrgvdld.(23)↓qlldmsyeql.1.170.67
      RGVDLDQLLD.(27)↓msyeqlmqly.1.311.67
      ldqlldmsye.(31)↓qlmqlysarq.1.602.00
      P6224440s核糖体蛋白S15amvrmnvlad.(9)↓alksinnaek.2.251.47
      P6124740s核糖体蛋白S3aGrvfevslad.(73)↓lqndevafrk.1.261.64
      P6270140s核糖体蛋白S4,x同种型vaapkhwmld.(21)↓kltgvfaprp.1.172.08
      rfavhritpe.(117)↓oakyklckvr.2.002.53
      P6208140s核糖体蛋白S7rsrtltavhd.(127)↓ailedlvfps.1.641.51
      P1080960 KDA热休克蛋白,线粒体前体rkplviiaed.(277)↓vdgealstlv.1.962.49
      P2763560S核糖体蛋白L10fplcghmvsd.(55)↓eyeqlsseal.1.461.19
      kwgftkfnad.(179)↓efedmvaekr.1.081.71
      P2637360S核糖体蛋白L13rkpsapkkgd.(138)↓ssaeelklat.1.511.78
      P8409860S核糖体蛋白L19gkkkvwldpn.(27)↓etneianans.1.232.18
      P6125460S核糖体蛋白L26nvrsmpirkd.(52)↓devqvvrghy.1.413.40
      P3902360s核糖体蛋白L3vpvnqvfgqd.(214)↓emidvigvtk.1.661.27
      P4677760S核糖体蛋白L5yegqvevtgd.(128)↓IENVESIDGQ.1.411.99
      Q018136-磷酸氨基酶C型nmgglaagad.(601)↓aayifeepfd.1.782.65
      P178586-磷果糖酶,肝脏型pgtdfslgsd.(542)↓tavnaamesc.2.452.35
      P082376-磷酸氨基酶,肌肉型PGSDFSVGAD.(543)↓talnticttc.1.551.76
      P60709肌动蛋白,细胞质1Keklcyvald.(222)↓feqemataas.1.228.26
      Q9UG63ATP绑定盒子族F成员2Angrettevd.(54)↓lltkeledfe.2.271.17
      Q92499ATP依赖性RNA Helicase DDX1nctisqvepd.(676)↓ikvpvdefdg.0.981.79
      P55210Caspase-7前体Telddgiqad.(198)↓sgpindtdan.1.350.77
      Q99459细胞分裂周期5样蛋白PARPDPIDMD(145)↓edelemlsea1.131.94
      Q14839Chromodomain-Helicase-DNA结合蛋白4edddldvesd.(320)↓FDDSINSYS1.451.28
      O00273DNA碎片因子亚基α Mevtgd. (6)↓agvpesgeir.1.922.42
      P49736DNA复制许可因子MCM2rdyraipeld.(88)↓ayeaeglald.1.982.09
      P33992DNA复制许可因子MCM5fddpgifysd.(13)↓sfggdaqade.1.741.92
      P68104伸长因子1-alpha 1dgpkflksgd.(398)↓aaivdmvpgk.1.472.60
      mvpgkpmcve.(413)↓sfsdypplgr.1.322.41
      Q04637真核翻译开始因子4伽玛1rlqgincgpd.(665)↓ftpsfanlgr.1.191.52
      Q92945远程上游元素结合蛋白2rqiaakiggd.(91)↓aattvnnstp.1.082.03
      P85037叉口箱蛋白k1Sggssgvsgd.(80)↓savagaapal.1.341.04
      P14314葡糖苷酶2亚基β前体Aeaqallsgd.(260)↓tqtdatsfyd.1.221.76
      Q14527幽皮酶样转录因子IPPDDFLTSD.(52)↓eevdsvlfgs.1.711.67
      P61978异质核核糖核蛋白kGefgkrpaed.(26)↓meeeqafkrs.1.421.53
      Q00839异质核核糖核糖蛋白Uvagfkkqmad.(547)↓tgklntllqr.1.673.65
      P0C0S5组蛋白H2A.Z.Maggkagkd.(9)↓sgkaktkavs.5.771.14
      O00629Importin亚基α-4nvphediced.(59)↓sdidgdyrvq.1.331.21
      Q12906白细胞介素增强剂结合因子3lfpdtplald.(597)↓ankkkrapvp.1.272.44
      Q32MZ4富含亮氨酸的重复飞行相互作用蛋白1aaeevladgd.(675)↓tldfeddtvq.1.492.11
      O60711 leupaxin. 梅尔德 (5)↓allexerst.1.702.77
      Q15046溶酶-TRNA合成酶httdngvgpe.(67)↓eesvdpnqyy1.492.40
      P56192甲硫氨酸-TRNA合成酶,细胞质TPQQTKitqd.(368)↓IFQQLLKRGF.2.362.25
      P27816微管相关蛋白4kkcslpaeed(642)↓svleklgerk.1.572.23
      Q9BQG0MYB结合蛋白1Algdeammald.(790)↓qslaslfaeq.1.492.09
      P67809核酸酶敏感元素结合蛋白1qysnppvqge.(216)↓vmegadnqga.1.551.88
      Q9NR30核仁RNA Helicase 2 MPGKLRSD. (8)↓aglesdtamk.1.031.65
      P19338核仁 knlpykvtqd.(407)↓elkevfedaa.1.521.29
      ayiefktead.(441)↓aektfeekqg.2.061.74
      tlfvkglsed.(582)↓tteetlkesf.2.202.09
      P55209核心组装蛋白1状1NKEQSELDQD(15)↓lddveeveee.2.071.88
      O75475PC4和SFRS1相互作用彩易福彩KNMFLVGEGD.(433)↓svitqvlnks.1.372.08
      Q8WUA2肽基 - 脯氨酰顺式 - 反式异构酶样4qldsgrigad.(194)↓eeiddfkgrs.1.431.62
      O60828聚谷氨酰胺结合蛋白1Pepeeeiiae.(31)↓dydddpvdye.1.411.83
      P26599聚酰亚胺酰胺染色蛋白1Alaasaaavd.(172)↓agmamagqsp.1.171.47
      Q96GQ7可能的ATP依赖性RNA Helicase DDX27adeniltkad.(187)↓tlkvkdrkk.1.060.54
      Q9UQ80增殖相关蛋白2G4ritsgpfepd.(341)↓lyksemevqd.2.192.52
      Q8N163彩易福彩Kiaa1967.etepteqapd.(469)↓Aleqaadtsr.1.202.00
      O15355彩易福彩磷酸酶1GDneeaallhe.(147)↓eatmtieell.1.672.38
      Megkeeggsd.(326)↓sgttavvali.2.243.42
      P06454prothymosin alpha [含有:胸腺素alpha-1] msdaavd. (7)↓tsseittkdl.2.132.48
      P06400视网膜母细胞瘤相关彩易福彩pppeedpeqd.(36)↓sgpedlplvr.1.841.83
      Q9H814RNA U小核RNA出口适配器蛋白eqnqdavate.(133)↓lgilgmegti.1.802.39
      P98175RNA结合蛋白10德雷斯坦(691)↓agyailekkg.1.211.65
      O75533拼接因子3B亚基1yfdkllvdvd.(483)↓estlspeeqk.1.531.42
      Q13435拼接因子3B亚基2tkpkltihgd.(566)↓lyyegkefet.1.392.03
      Detgfitpad.(719)↓sglitpggfs.1.533.04
      Q86YP4转录阻遏物P66-αKSERRPPSPD.(102)↓vivlsdneqp.2.502.58
      Q71U36管蛋白alpha-1a链khvpravfvd.(69)↓Leptvidevr.0.903.54
      gtyrqlfhpe.(90)↓qlitgkedaa.2.312.38
      lrfdgalnvd.(251)↓ltefqtnlvp.1.682.48
      P07437管蛋白β链子Idptgtyhgd.(39)↓sdlqldrisv.2.712.45
      Q14694泛素羧基末端水解酶10Eyqriefgvd.(62)↓evifepsdtlp.1.001.98
      Q9NZ63无表达蛋白C9ORF78qmlsgipevd.(177)↓lgidakikni.1.882.40
      P53990无表达彩易福彩Kiaa0174.AEAPPGVETD.(194)↓lidvgftddv.1.042.24
      P54725紫外线切除修复彩易福彩Rad23同源物Ladisdvege.(300)↓vgaigeapq.1.802.25
      P46459囊泡 - 融合ATP酶ikastkvevd.(466)↓mekaeslqvt.2.101.88
      P08670 v qdsvdfslad.(90)↓aintefkntr.1.232.66
      Qiqeqhvqid.(257)↓vdvskpdlta.1.072.05
      QEQHVQIDVD.(259)↓vskpdltaal.1.512.16
      Q9UHR6锌手指达到含域的蛋白2eeldnapgsd.(150)↓aaelelapar.2.221.13
      当在高效且较低有效地切割的位点之间搜索氨基酸序列偏差时,P4对P1氨基酸的检测分类为高效地点的裂解位点显示了与从位置扫描基板组合库数据推导的相同的共识识别基序(
      • Thornberry N.A.
      • rano t.a.
      • 彼得森e.p.
      • Rasper d.m.
      • Timkey T.
      • 加西亚 - 卡尔沃姆
      • houtzager v.m.
      • nordstrom p.a.
      • 罗伊斯。
      • Vaillancourt J.P.
      • 查普曼K.T.
      • Nicholson D.W.
      组合方法定义了Caspase系列和Granzzyme B的特异性。为凋亡的关键介质建立的功能关系。
      ); IEPD(数据未显示)。在我们的研究中,对于高效地切割位点观察到底物P2位置的脯氨酸的相对发生增加:这些优选位点中的18个中的6个(33%)中的18个,其中83个(10.8%)的较低的位置有专业版P2。此外,考虑到异亮氨酸,亮氨酸和缬氨酸的相对出现,这些氨基酸占据18个(77.78%)优选位点中的14个,并且仅有42个优选位点。进一步注意事实上,如(1所述)(inc)中所述,替代P1残基裂解如谷氨酸(
      • van damme p.
      • Maurer-Stroh S.
      • Plasman K.
      • van durme J.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • de bock p.j.
      • 潮气米
      • 卢梭F.
      • Schymkowitz J.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      N-末端彩易福彩组学彩易福彩处理分析揭示了Granzzyme B orthologs的新型特异性底物测定簇。
      ),从未归类以有效地切割裂开部位(83个少有效位点的11个谷植物在P1上谷氨酸)。然而,这些微妙的差异表明,至少用于HGRB,实验分析而不是 在Silico. 预测仍然是分配切割效率的先决条件。

       底物免疫印迹分析人晶型B处理效率的生化特征

      为了确认我们的彩易福彩组学数据,通过施加彩易福彩免疫印迹分析后施用彩易福彩免疫斑分析,测定底物切割的效率,所述BID,BNIP2,AKAP-8,IMPORTINα-4和核仁含量。用各种浓度的HGRB和各个孵育的评估底物处理。 Caspase-3及其衍生的蛋白水解片段的免疫印迹分析证实了HGRB在天然基质上的活性,并显示了用HGRB的碘乙酰胺介导的下游胱天蛋白酶活化的抑制(补充图1 )。
      MS-Spectrum Fig. 3A 被分配给HGRB推出的Neo-N-Terminus 76Sesqediir.84 出价,代表HGRB介导的凋亡途径中的早期,信号诱导的切割事件和已建立的键基质(
      • 巴里姆
      • Heibein J.A.
      • Pinkoski M.J.
      • 李S.F.
      • Moyer R.W.
      • 绿色D.R.
      • BLEACKLEY R.C.
      Granzyme B短路通过直接裂解培育颗粒介导的细胞毒性T淋巴细胞杀死颗粒酶8活性。
      )。根据彩易福彩组学数据,在观察到稍后的时间点的离子信号强度的进一步增加,BID的免疫印迹显示在200 n处的最早时间点的完全前体裂解m HGRB孵化。除了相同的P4-P1切割现场识别基序(IEAD)之外还存在类似的MS模式(IEAD28以ne-n-末端肽观察到), 29Ilaitgpedqpgslevngnkvr.50,来自bnip2(Fig. 3B)。 63kDa n末端谷胱甘肽S-转移酶(GST)标记重组BNIP2前体蛋白的免疫印迹显示出30kDa n末端片段在IEAD下切割28 如在彩易福彩组学设置中确定的那样。此外,与出价相比,密度测定法证实了BNIP2作为高效的HGLB底物,因为BNIP2前体已经在2小时后裂解95%,与10 n孵育后m HGRB虽然出价在相同的条件下被割裂为76%(Fig. 4)。离子信号 577vlaevitaavr.587 Akap-8显示时间的适度增加(Fig. 3C),并且因此观察到的MS模式仍然属于统计学上描绘的高效HGLB切割位点(Fig. 2)。至于出价,通过免疫斑分析可以观察到蛋白水解AKAP-8片段,但是通过在添加10℃后通过完全不存在前体基质的前体基质确认有效裂解m of hGrB (Fig. 3CFig. 4)。发现Importinα-4的处理位于有效的切割事件区域之外(Fig. 2)确实被证实是较少效率地切割的HGRB位点(在孵育2小时后检测到48%的乳化剂)m hGrB (Fig. 4)从冰时产生的50kDa蛋白片段的逐渐增加59 在以后的时间点裂解(Fig. 3D)。最后,鉴定了三种不同的核仁Neo-n-termini,在延长HGLB孵育时显示了MS信号强度的大差异(这里显示 Fig. 3E 对于neo-n terminus 476tteetlkesfdgsvr.490)。虽然预计所有三种鉴定的裂解事件是相当低效的,但HGRB对所有裂解位点的组合作用仍然导致在用HGRB攻击时仍然显着减少前体彩易福彩,然而发现核仁含有较低的核苷酸脱落的底物较低与BID,BNIP2和AKAP-8相比。在彩易福彩印迹上靠近前体带的切割片段的存在闭合直接的密度计量分析,这意味着无法确定裂解程度。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3生物化学表征HGRB底物BID,BNIP2,AKAP-8的分类效率(全部分类为“有效地切割”),Importinα-4和核仁(分类为“较低有效地切割”)。 MS-Spectra中所示的肽离子三体代表用人重组GRB处理的Jurkat冻融裂解物中鉴定的HGRB特异性新N-末端肽(12C6,*,m / z值和指示灯指示),30(13C6,+)或60(13C615N4, #) 分钟。相应的肽是ACD3-76Sesqediir.84 from Bid (A ),ACD3- 29Ilaitgpedqpgslevngnkvr.50 from Bnip2 (B ),ACD3- 577vlaevitaavr.587 from Akap-8 (C ),ACD3- 60 Sdidgdyr. 67 来自Importin亚基α-4(D)和ACD3-476tteetlkesfdgsvr.490 from nucleolin (E)。通过使用针对这些基材的抗体的抗体进行彩易福彩印迹测定相应底物的GRB介导的处理(参见方法部分)。在每个面板中,右侧所示的彩易福彩印迹来自细胞裂解物,其预温育与碘乙酰胺,并用不同浓度的HGRB处理,用于各种孵育期。当彩易福彩片段的分子量(用条纹箭头表示)与由降解筛网确定的片段尺寸同意时,表示分子量值。显示在左侧的彩易福彩印迹来自对照细胞裂解物,其未预孵育与碘乙酰胺。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4在针对BID,BNIP2,AKAP-8和Importinα-4确定的各个时间点处的HBRB处理程度。 使用10 n的彩易福彩印迹分析后,通过密度测定确定底物切割的百分比m HGRB为10,30,60和120分钟。所有分类的HGRB MS / MS Spectra以PDF格式提供。评分谱(n = 101)和相应的更低评分光谱(n = 130)在PDF文件中可用:“MS-MS_HIGHEST_SCORINGS_SPECTRA”和“MS-MS_LOWER_SCORINGS_SPECTRA”。

       使用肽模拟物验证切割事件

      对于一些底物,在彩易福彩印迹上观察到的产生的蛋白水解片段的尺寸不是基于所鉴定的裂解位点的预期理论分子量。与一些这些底物的存在额外的碎片一起,这是针对单一蛋白水解事件观察到的毫不含糊的分配和验证HGLB切割效率( 例如 Fig. 3E)。因此,在RP-HPLC测定中测定保持所识别的裂解位点的肽底物的切割程度。对于持有鉴定的BID,BNIP-2和AKAP-8的合成肽,在用500 n孵育后观察到完全切割m of hGrB for 2 h (补充图2 A-C. ),同意我们的彩易福彩组学数据和免疫印迹分析。持有Importinα-4的HGRB位点的肽也被发现减少有效地加工( IE。 59%的500 n加工m HGRB, 补充图2D),再次同意我们的彩易福彩组学和免疫斑数据。对于一些其他肽底物,其中彩易福彩组学分析产生偏离彩易福彩N-末端的折叠变化,未观察到或仅发现HGRB切割,或者甚至发现在HGRB的最高浓度下也仅发现小于5%(实施例是彩易福彩磷酸酶) 1g,核仁和微管相关蛋白4(数据未显示和 补充图2E)),验证这些效率低下切割的HBRB网站。总体而言,肽裂解程度遵循彩易福彩组学筛选的彩易福彩筛选程度并伴随着彩易福彩组学筛选的结果。

      讨论

      在该研究中,使用一种与N-末端CoFradic组合代谢标记的无凝胶方法,用于通过人颗粒酶B族的底物蛋白分解的定量方面。以前分配的HGRB特异性Neo-N-Termini的基于时间的浓度通量(
      • van damme p.
      • Maurer-Stroh S.
      • Plasman K.
      • van durme J.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • de bock p.j.
      • 潮气米
      • 卢梭F.
      • Schymkowitz J.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      N-末端彩易福彩组学彩易福彩处理分析揭示了Granzzyme B orthologs的新型特异性底物测定簇。
      )针对数据库注释的分布,HGRB不受影响的蛋白N-Termini进行了测定。 101 HGLB的Neo-N-Termini根据其裂解效率分类为86人Jurkat蛋白。我们的测定分配了促凋亡的BCL-2家族成员竞标,其位于HGRB诱导的细胞凋亡中的关键点,属于HGRB最有效的网站。这说明我们的方法能够揭示含有蛋白酶介导的信号传导的关键衬底切割事件。在这方面,拟凋亡Bcl-2家族成员BNIP2和AKAP-8,已知在凋亡的执行中发挥着突出的作用(
      • 瓦伦西亚C.A.
      • Cotten S.W.
      • 刘R.
      通过半胱天冬酶切割BNIP-2和BNIP-XL。
      ,
      • kamada s。
      • Kikkawa U.
      • Tsujimoto Y.
      • 猎人T.
      A-激酶锚定彩易福彩95用作通过酶底物结合的活性胱天蛋酶3的核转位的潜在载体。
      ),这里也识别为持有有效地切割的HGRB特异性位点。
      在天然杀伤细胞毒性颗粒介导的K-562细胞死亡的模型中,确定了14个HGRB的生理切割位点(
      • van damme p.
      • Maurer-Stroh S.
      • Plasman K.
      • van durme J.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • de bock p.j.
      • 潮气米
      • 卢梭F.
      • Schymkowitz J.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      N-末端彩易福彩组学彩易福彩处理分析揭示了Granzzyme B orthologs的新型特异性底物测定簇。
      )。有趣的是,在我们目前的研究中,鉴定了这些网站的六种,并进行了三种加工,含有含锌CCHC域蛋白8-分类为有效的HGRB切割事件。这些结果再次提示可能的生理更重要的切割位点。人们可以争辩说,类似的动力学研究可以应用于在这种生理学更相关的细胞设置中监测底物处理,然而,在蛋白分解的总体减少的动力学和可能的减少的总体减少的动力学旁边的情况下,穿孔蛋白介导的递送的可变性完整细胞中产生的蛋白水解片段的稳定性将使临界切割事件的分配在细胞系统中更麻烦。
      值得注意的是,观察到的单个裂解事件的效率不能直接推断到基材水平。本身,前体基底的换档反映了在为核仁(以下)观察到的不同位点处的总效率(Fig. 3E)。另一方面,鉴定一个有效的裂解事件足以考虑基板作为有效切割的衬底。然而,相反的是,鉴定反射裂开良好的基底的相当低效的切割事件,并不一定保持真实。
      我们方法的另一种缺点是通过在40s核糖体蛋白S15中的三个相邻的HGRB切割位点(VDLD24 ↓QLLD. 28 ↓msye. 32↓qlmqlysar.40, 补充图3)。这是识别出额外的嵌套的HGRB切割位点的Neo-N-Termini的情况。因此,在保持这种间接切割位点的新N-末端肽的MS光谱中观察到的折叠变化可能导致这种裂解的错误分类。在相同的方面,尽管Caspase-7没有使其到效率的基质列表中,由Adrain执行的Western Blot分析 等等。 证明BID和Caspase-7具有同等效率的HGRB裂解,并进一步揭示了Caspase-7至少在两个不同的位点(
      • adrain c.
      • 墨菲的光明
      • 马丁S.J.
      由细胞毒性T淋巴细胞/天然杀伤剂(CTL / NK)蛋白酶Genzyme B引发的胱天蛋白酶激活级联的分子序排序。
      )。因此,Caspase-7可能会在我们的有效切割的基材列表中进行,而是由于次级切割事件,从初级切割产生的MS-Spectrum中的Caspase-7切割效率的外推。这种观察结果进一步提示混杂蛋白酶的衬底处理效率将通过我们的方法进行挑战。
      低效蛋白酶B识别位点下切割的表观加速度(Fig. 2)没有遵循预期的标准一阶动力学,是不明的。我们推理在诸如本研究中测定的彩易福彩组的复杂混合物中,最初通过Grenzyme B消耗的有效底物,之后颗粒酶B是“释放”,并开始越来越多的过程。我们通过在蛋白酶组和在我们的彩易福彩组学研究中使用的类似颗粒酶B和彩易福彩组中使用的Grenzyme B缓冲液以及Jurkat细胞裂解物中的荧光肽AC-IEPD-AMC的荧光肽AC-IEPD-AMC的Granzzyme B.和彩易福彩组学中使用的彩易福彩组学研究中使用的彩易福彩组学研究来测试我们的假设。 AC-IEPD-AMC报道 km. value of 370 μm ± 70 μm - 我们在这里测量了一个 km. value of 461 μm ± 26 μm因此是一种低效的底物,对颗粒酶B具有低亲和力(
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      Granzyme B结构决定簇的表征揭示了延长底物特异性的有效介质。
      )。总之,当肽在细胞裂解物中测定时,从肽测定时观察到在早期的时间点的加速度所观察到的AC-IEPD-AMC的一阶切割。补充图4),对应于我们在彩易福彩组学设置中的观察结果(Fig. 2[因此,一旦加工有效的位点,就确认完整彩易福彩谱系中的低效位点的处理是加速的。
      所选反应监测(SRM)似乎是探测蛋白水解程度的有吸引力和替代的MS基方法。 SRM允许通过靶向预定的设定的肽 - 片段转变来定量肽(
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      )。当与尖刺内标肽结合时,SRM允许特异性(绝对)定量适度的肽混合物中存在的高量肽。然而,对于降级研究的研究然而,裂解事件的先验知识是强制性的,因此可以更适合在几种细胞设置中研究选择和已经表征的蛋白水解事件的研究。
      总体而言,并且由于生物化学相关蛋白水解途径的无细胞重建已被证明在细胞背景下是代表性的(
      • adrain c.
      • 墨菲的光明
      • 马丁S.J.
      由细胞毒性T淋巴细胞/天然杀伤剂(CTL / NK)蛋白酶Genzyme B引发的胱天蛋白酶激活级联的分子序排序。
      ),我们在这里表明,通过探测蛋白酶切割事件的效率可能是映射临界蛋白酶基材的段的有趣资产来探测我们的多路复用药物筛网。

      致谢

      我们要感谢Niklaas Colaert for BioInformatics帮助。

      补充材料

      参考

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