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蝎子钾毒素毒素的分子多样性和功能演变*

  • 顺义朱
    一致
    应解决对应的通信:Inst。中国科学院动物学,1北京朝阳区北京北部北京北北京北北京100101电话:86-010-64807112;传真:86-010-64807099。
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    北京100101,北京100101,北京100101,北京100101,北京100101北京100101北京100101北京虫虫和啮齿动物综合管理国家重点实验室
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  • 史蒂夫·佩尼尔
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    毒理学实验室,Leuven大学,O和N 2,Postbus 922,赫斯特劳特49,3000 Leuven,Belgium
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  • 斌高
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    北京100101,北京100101,北京100101,北京100101,北京100101北京100101北京100101北京虫虫和啮齿动物综合管理国家重点实验室
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  • 兰罗
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    北京100101,北京100101,北京100101,北京100101,北京100101北京100101北京100101北京虫虫和啮齿动物综合管理国家重点实验室
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  • 迪金
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    中国科学院动物学研究所生物膜和膜生物技术国家重点实验室,北京100101
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  • 永钊
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    中国科学院动物学研究所生物膜和膜生物技术国家重点实验室,北京100101
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  • Jan Tytgat.
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    毒理学实验室,Leuven大学,O和N 2,Postbus 922,赫斯特劳特49,3000 Leuven,Belgium
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了中国自然科学基金的支持30730015和30921006;中国国家基础研究计划(2010CB945300)30921006;中比利安科技混合委员会第16届会议的双边合作(对Z.);和Fonds Wetenschappelijk onderzoek-vlaanderen补助金G.0330.06和G.0257.08,Katholieke Universiteit Leuven Grant OT-05-64,环境景点景点Poles Program-Belgian State-Belgian科学政策拨款P6 / 31和Bil Grant 07/10(中国) (到JT)。
    本文包含补充图。S1和表S1-S3。
      影响k的蝎子毒素+频道(KTX)代表重要的药理学工具和潜在的药物候选者。在这里,我们在蝎子中报告了七个新KTX的分子表征mesobuthus eupeus.通过cDNA克隆结合生化方法。比较建模支持,尽管蛋白质序列和尺寸的差异,所有这些KTX都仍共享保守的半胱氨酸稳定的α-螺旋/β-片状结构。我们调查了两个正交α-KTX的功能多样化(Meutxkα1来自M. eupeus..和bmp01mesobuthus. Martensii.)通过比较他们的k+彩易福彩阻止活动。药理学上,Meutxkα1选择性地阻止了纳米摩尔亲和力的KV1.3彩易福彩(IC50,2.36±0.9 nm),而只有35%的KV1.1电流抑制了3μm 浓度,显示超过KV1.1的kV1.3的1271倍的选择性。这种肽效果薄弱 果蝇振动器频道和kv1.2,kv1.4,kv1.5,kv1.6和人类没有活动ethet-a-go-go - 相关基因(Herg)k+渠道。虽然BMB01和Meutxkα1具有类似的信道光谱,但它们对这些彩易福彩的亲和力和选择性在很大程度上变化。与meutxkα1相比,BMP01仅表现出亚亚摩洛尔亲和力(IC50,133.72±10.98 nm)对于KV1.3,表现出比Meutxkα1更少的活动57倍。此外,它缺乏区分KV1.1和KV1.3的能力。我们还发现Meutxkα1抑制了Microolar浓度的Phorbol Mertirtate醋酸盐和离子霉素诱导的活性T细胞的增殖。我们的结果表明,加速的演化驱动KV彩易福彩上的正交α-KTX的亲和变化,并表明Meutxkα1是开发用于人类自身免疫疾病的免疫调节剂的有希望的候选者。
      钾(K.+)彩易福彩是一种大型膜蛋白质,普遍存在于可激发和非纯洁的细胞。该家庭的成员参与不同的生理过程,包括行动潜在的复极化,加利福尼亚州2+ 信号,细胞增殖和迁移和细胞体积调节(
      • Shieh C.C.
      • Coghlan M.
      • Sullivan J.P.
      • Gopalakrishnan M.
      钾彩易福彩:分子缺陷,疾病和治疗机会。
      )。一些K.+ 渠道已被验证为发展新治疗药物的理想目标。例如,KV1.3,电压门控k+ 在人效应记忆记忆T淋巴细胞上表达的彩易福彩,是免疫系统治疗调节的靶标(
      • Wulff H.
      • 城堡N.A.
      • Pardo L.A.
      电压门控钾彩易福彩作为治疗靶标。
      )。鉴定和表征高选择性药剂以调节KV1.3的功能将有助于为人类自身免疫疾病产生新的药物。
      作为地球上最古老的毒性植绒,蝎子已经发展了大量影响k的毒素+ 频道(称为KTXS
      使用的缩写是:
      ktx.
      毒素影响K.+ channels
      CSαβ.
      保守α-螺旋/β-纸
      人类 ethet-a-go-go-Leled基因
      PMA.
      Phorbol Myristate醋酸盐
      rp.
      反向阶段
      IR.
      灭活去除
      chtx.
      Charybdotoxin
      aam-ktx.
      Androctonus Amorexi. kaliotoxin
      NTX.
      noxiustoxin。
      1使用的缩写是: ktx.
      毒素影响K.+ channels
      CSαβ.
      保守α-螺旋/β-纸
      人类 ethet-a-go-go-Leled基因
      PMA.
      Phorbol Myristate醋酸盐
      rp.
      反向阶段
      IR.
      灭活去除
      chtx.
      Charybdotoxin
      aam-ktx.
      Androctonus Amorexi. kaliotoxin
      NTX.
      noxiustoxin。
      )作为阿森纳的一部分(
      • possani l.d.
      • 毕业化B.
      • Delepierre M.
      • Tytgat J.
      蝎子毒素特异性+-Channels。
      )。根据Tytgat提出的广泛接受的命名 等等。 (
      • Tytgat J.
      • Chandy K.G.
      • 加西亚M.L.
      • Gutman G.A.
      • Martin-eauclaire M.F.
      • van der Walt J.J.
      • possani l.d.
      从蝎子静脉中分离的短链肽的统一命名法:α-KTX分子亚壳。
      ),KTX可以进一步分为四组:α,β,γ和κ(
      • Tytgat J.
      • Chandy K.G.
      • 加西亚M.L.
      • Gutman G.A.
      • Martin-eauclaire M.F.
      • van der Walt J.J.
      • possani l.d.
      从蝎子静脉中分离的短链肽的统一命名法:α-KTX分子亚壳。
      ,
      • Gurrola G.B.
      • 罗莎利B.
      • 罗克蒂米
      • Pimienta G.
      • 扎扎A.
      • Arcangeli A.
      • Olivotto M.
      • possani l.d.
      • WANKE E.
      神经,心脏和内分泌ERG K的毒素+ 渠道孤立的 Centruroides Noxius. scorpion venom.
      ,
      • Srinivasan K.N.
      • Sivaraja V.
      • Huys I.
      • Sasaki T.
      • 诚湾
      • Kumar T.K.
      • 佐藤K.
      • Tytgat J.
      • yu c.
      • SAN B.C.
      • ranganathan s.
      • Bowie H.J.
      • kini r.m.
      • Gopalakrishnakone P.
      κ-hefutoxin1,来自蝎子的新型毒素 异常磨损 具有独特的结构和功能。功能副在钾彩易福彩选择性中的重要性。
      )。除了采用由两种二硫桥稳定的双骨质支架的κ-kTx,所有其他毒素组含有由单个α-螺旋和一个β-薄片组成的保守的α-螺旋/β-片材(CSαβ)结构基序两个反平行的股线(
      • Bontems F.
      • Roumestand C.
      • Gilquin B.
      • MénezA。
      • Toma F.
      Charybdotoxin的精致结构:蝎子毒素和昆虫防御素中的共同主题。
      )。 α-KTX组包括23-42个氨基酸的短链肽,其三种或四种二硫化物桥梁并主要影响电压门控 摇机 - 相关和 ethet-a-go-go - 相关基因(ERG)k+ 频道以及加利福尼亚州2+ - 活化的K.+ 高,中间或小电导的频道(
      • Rodríguezde la Vega R.C.
      • possani l.d.
      关于k的蝎子毒素目前的视图+-Channels。
      )。大多数肽在该组中具有涉及封锁的功能二元 摇机 -Leled kV频道(
      • Dauplais M.
      • LECOQ A.
      • 宋J.
      • 棉j.
      • 贾米娜。
      • Gilquin B.
      • Roumestand C.
      • VITA C.
      • de medeiros c.l.
      • 罗文e.g.
      • 哈维A.L.
      • MénezA。
      论动物毒素的收敛演变。不相关结构储存钾彩易福彩阻断毒素官能残留的副探测。
      )。 β-KTX基团含有50-75个氨基酸的长链毒素,其可以被认为是α-KTX支架上的N-末端延伸。一些例子包括BMTXKβ,HGEβKTX,TCOKIK,TDIKIK,TSTβKTX和TTRKIK(
      • 迭戈 - 加西亚E.
      • Schwartz e.f.
      • d'suze g。
      • gonzálezs.a.
      • Batista C.v.
      • garcíab.i.
      • de la Vega r.c.
      • possani l.d.
      蝎子和长链β-KTX样肽在蝎子静脉中的宽系统分布:鉴定“孤儿”组分。
      )。重组BMTXKβ已经证实是瞬态向外k的阻挡剂+ current (I)在兔心房肌细胞中,与kV4.2和kV4.3亚基的异统彩易福彩快速活化和与异统的彩易福彩相关(
      • 曹Z.
      • 肖F.
      • 彭F.
      • 江泽民
      • 毛X.
      • 刘H.
      • 李W.
      • 胡d.
      • 王T.
      重组蝎毒毒性肽BMTxKβ的表达,纯化和功能表征。
      ),而NativeTstβktx是kv1.1的阻挡者,IC50 of 96 nm (
      • 迭戈 - 加西亚E.
      • Schwartz e.f.
      • d'suze g。
      • gonzálezs.a.
      • Batista C.v.
      • garcíab.i.
      • de la Vega r.c.
      • possani l.d.
      蝎子和长链β-KTX样肽在蝎子静脉中的宽系统分布:鉴定“孤儿”组分。
      )。
      在这项工作中,我们在蝎子中报告了七个新的KTX基因 mesobuthus eupeus. 基于序列,结构和进化分析,毒腺和它们与其他已知毒素的关系。提供实验数据以支持通过加速氨基酸取代的两个正交毒素之间的功能多样化。我们发现Meutxkα1,一个正直的 mesobuthus. Martensii. 毒素BMP01,具有使其具有治疗潜力的人类自身免疫疾病的免疫调节剂的有吸引力的候选者。这些性质包括1)在KV1.3上的高亲和力(IC50,2.36±0.9 nm); 2)在KV1.1上的kV1.3的kV1.3的选择性超过1271倍; 3)KV1.2,KV1.4,KV1.5,KV1.6和人缺乏活动 ethet-a-go-go - 相关基因(Herg)k+ 渠道; 4)抑制Phorbol Mertirtate醋酸酯(PMA)和离子霉素诱导的活性T细胞的增殖。

      材料和方法

       cDNA文库的构建和筛查

      CDNA文库的构建来自 M. eupeus.. 毒液之前已描述(
      • 朱S.
      • 高B.
      新蝎子毒液脂解肽的分子表征:肽二硫化桥介导的功能开关的证据。
      )。选择携带300-1000bp潜在编码毒液肽前体的克隆用于通过引物T25V进行DNA测序。这里报道的核苷酸序列已沉积在Genbank中 TM值 database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)在加入号码下 EF442060 ( meutxk. α1),EF445085( meutxk. α2),EF442052( meutxk. α3),ef442053(长脚本 meutxk. α3),EF445083( meutxk. α4),EF442047( meutxk. β3),EF445099( meutxk. β4)和ef445076( meutxk. β5 )。

       新型钾彩易福彩毒素的生物信息鉴定

      BERTARTP(BLAST 2.2.23)对Genbank数据库(GenBank版本177.0)的相似性搜索(BLAST 2.2.23)来寻找新的同源物 M. eupeus.. 毒液肽。蛋白质序列通过Clustalx 1.83对齐(http://www.ebi.ac.uk)。这里报道的系统发育树从Mega 4.0的对齐重建(http://www.megasoftware.net/mega.html),并且它们是基于泊松校正的邻近算法的1000个重复的引导共识树。分支上的数字是引导百分比。这里描述的所有毒素的三维结构是由Swiss-Model的比较建模构建的,一个全自动蛋白质结构同源性建模服务器(http://swissmodel.expasy.org/)除了由Meutxkβ5-NHD之外预测的 AB Initio. I-Tasser服务器上的建模方法(http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/)由于缺乏延长的n末端的合适模板。在比较建模中,将目标和模板的对齐序列应用于通过“对准模式”选项构建模型,并通过验证3D评估模型质量。使用MultiProt进行结构叠加(http://bioinfo3d.cs.tau.ac.il/MultiProt/)识别保守的功能图案。 Molmol(Molmol-2k.2.0)(
      • Koradi R.
      • 黑啤酒
      • Wüthrichk.
      Molmol:一种用于显示和分析大分子结构的程序。
      )用于显示,分析和操纵毒素结构,其中通过“简单”命令计算模型结构表面上的静电电位,蓝色和红色表面积分别表示正极和负电荷。

       Meutxkα1和BMP01的隔离和纯化

      这里已经描述了这里使用的净化方法(
      • 朱S.
      • 高B.
      • Aumelas A.
      • del carmenrodríguezm。
      • Lanz-Mendoza H.
      • Peigneur S.
      • 迭戈 - 加西亚E.
      • Martin-eauclaire M.F.
      • Tytgat J.
      • possani l.d.
      Meutxkβ1,蝎子毒液衍生的双结构型钾彩易福彩毒素状肽,具有细胞溶解活性。
      )。简要地, M. eupeus.. 或者 M. Martensii. (以前被称为 Buthus Martensii. (
      • Goudet C.
      • chi c.w.
      • Tytgat J.
      亚洲蝎子毒液中毒素和基因概述 Buthus Martensi. Karsch.
      ))通过电刺激方法收集的粗毒脉重悬于0.1%三氟乙酸(TFA; v / v)中并直接进行RP-HPLC分离。安捷伦Zorbax 300sb-c18 (4.6×150mm,5μm)在水(v / v)中,在水(v / v)中平均平衡,从柱子中洗脱肽组分,线性梯度在0.1%TFA中在水中的0至60%乙腈(v / v)在60分钟内,流速为1ml / min。遵循紫外光吸收痕迹,在225nm处。单独收集所有明确的峰,并在同一柱上重新定位以进一步纯化这些肽。 MATXKα1和BMP01的纯度由MALDI-TOF和EDMAN降解鉴定,其确定其N-末端序列。 MeutxKα1的氨基酸序列已沉积在Uniprotkb蛋白质数据库中(http://www.ebi.ac.uk/uniprot/)在加入号码下 P86400.

       表达在卵爪蟾卵母细胞中

      用于表达电压门控k+ 彩易福彩(RKV1.1,RKV1.2,RKV1.3,HKV1.3,RKV1.4,RKV1.5,RKV1.6, 摇机 IR和Herg)在 Xenopus. 卵母细胞,使用T7或SP6 mmessage-mmachine转录试剂盒(Ambion)转录线性化质粒(补充表S1)。从麻醉的女性收获阶段V-VI卵母细胞 Xenopus. laevis. Frog如前所述(
      • liman e.r.
      • Tytgat J.
      • HESS P.
      哺乳动物K的亚基化学计量+ 通过构建多聚体CDNA来确定的彩易福彩。
      )。使用微内注射器(搅拌科学)以浓度为1ng / nl的浓度注射卵母细胞。将卵母细胞孵育在含有96米的溶液中m NaCl, 2 mm KCl, 1.8 mm CaCl2, 2 mm MgCl2和5米m HEPES(pH7.4)补充有50毫克/升庆大霉素的硫酸甘氨酸。

       电生理记录

      使用由PCLAMP数据采集系统(轴突仪器)控制的Geneclamp 500放大器(轴突仪器)在室温(18-22°C)的室温(18-22°C)下进行两电极电压钳位。卵母细胞的全细胞电流在注射后4-5天记录。浴溶液组合物为96米m NaCl, 2 mm KCl, 1.8 mm CaCl2, 2 mm MgCl2和5米m hepes(ph 7.4)。电压和电流电压填充3 m KCL。两种电极的电阻尽可能低(<1.0兆头)。引发电流在1kHz下过滤,并使用四极低通贝塞尔过滤器在2kHz下取样。使用P / 4协议进行泄漏减法。 kv1.1-kv1.6和 摇机 将电流唤起500 ms去偏振至0 mV,然后从-90mV的保持电位到-50 mV,500 ms脉冲。通过施加+ 40mV的Prepulse 2 s,然后进行步骤-120mV,引发电流的HERG彩易福彩。为了评估MeutxKα1诱导的抑制作用的浓度依赖性,构建了剂量 - 反应曲线。作为增加毒素浓度的函数绘制封闭电流的百分比。每个实验至少进行3次(n ≥3)。所有数据都显示为平均值±S.E.

        PMA. /离子霉素对T细胞的增殖测定

      C57BL / 6只小鼠(6周龄,男性)购自北京实验室动物研究中心(中国北京)。将所有小鼠保持在特定的无病原体设施中,并被容纳在含有灭菌的饲料,高压灭菌的床上用品和水的微透光器笼中。通过将脾组织用5ml一次性注射器的柱塞研磨并悬浮在RPMI 1640培养基中来制备单细胞悬浮液。用溶血缓冲液处理脾细胞(17米m Tris-HCl and 140 mm NH4Cl(pH7.2))以前除去之前(
      • 王H.
      • 赵L.
      • 太阳Z.
      • 太阳L.
      • 张B.
      • 赵玉。
      环孢菌素A的潜在副作用:CD4的抑制作用+CD25+ 小鼠中的调节性T细胞。
      )。
      脾细胞(2×105在加入10ng / ml PMA和1μ时,在用各种浓度的毒素预处理,在扁平底板中培养细胞/孔。m 在5%CO中的37℃下离子霉素72小时2。 0.4μCI的[3H]胸苷(185gbq / mmol)在最后12小时中加入每个孔中。用自动细胞收割机(Tomtec,Toku,Finland)收获细胞在玻璃纤维过滤器上。在液体闪烁分析仪(Beckman Instruments)中测定样品。值作为三份孔的每分钟计数(CPM)呈现。

       Meutxkα1/ BMP01和KV1.3结构模型的构建

      Meutxkα1/ BMP01和人KV1.3的初始复杂模型是通过用Rodríguezdeavega和同事(
      • Corzo G.
      • PAPP F.
      • varga z.
      • 巴拉佐奥。
      • Espino-solis P.G.
      • Rodríguezde la Vega R.C.
      • 加油
      • 潘燕G.
      • possani l.d.
      来自蝎子毒液的KV1.2和KV1.3钾彩易福彩的选择性阻滞剂 Centruroides suffusus. suffusus.
      )基于毒素结构相似性使用Meutxkα1/ BMP01的结构。为了在初始模型中缓解空间冲突,我们使用DeepView程序进行了能量最小化(Swiss-PDB查看器, http://www.expasy.ch/spdv/)。仅详细分析BMP01-HKV1.3复杂模型。

      结果

       M. Eupeus k的分离与表征+ 彩易福彩毒素转录物

      从cDNA图书馆准备 M. eupeus.. 毒性腺,我们被隔离并确定编码七种KTX样肽的前体的新转录物(Fig. 1A)。根据其序列和结构特征,我们将这些肽Meutxkα1,Meutxkα2,Meutxkα3,Meutxkα4,Meutxkβ3,Meutxkβ4和Meutxkβ5命名。其中,MeutxKα1-4属于α-KTX亚家族,并且Meutxkβ3-5分为β-KTX亚家族。除了不完全的meutxkβ5转录物(由于RNA降解5'端),所有这些新的KTX前体含有由SignalP 3.0预测的典型信号肽(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)。成熟的毒素由29-49个氨基酸组成,具有广泛的氨基酸变化;然而,它们均含有六个半胱氨酸,其对准模式类似于已知KTX(
      • Rodríguezde la Vega R.C.
      • possani l.d.
      关于k的蝎子毒素目前的视图+-Channels。
      ),表明它们可以采用典型的CSαβ折叠。结构分析显示出几种诱导突变 mesobuthus. K+ 彩易福彩毒素主要位于三个环(Fig. 1B)。总的来说,由于存在1.7-7.7净阳性电荷,这些新的毒素样肽中的大部分是阳离子。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1M. eupeus.. KTxs. A,蛋白质前体的序列比对。介绍了差距来改善对齐,和 小点 代表由于CDNA序列不完全确定的残留物。半胱氨酸被遮蔽 黄色的 。酸性和碱性残留物如图所示 红色的 蓝色的 , 分别。这 斜体下划线 在翻译后加工期间可能除去Meutxkα3中的甘氨酸。净充电( NC. )使用蛋白质计算器V3.3在pH7.0下计算(http://www.scripps.edu/∼cdputnam/protcalc.html)。从其实验结构中提取BEKM-1的二级结构元素(蛋白质数据库代码 1J5J)通过步幅(http://webclu.bio.wzw.tum.de/stride/ )。 B,莫尔摩尔图示出了Bekm-1的带结构。

       α-KTX8亚家族的新成员

      α-KTX8亚家族由五种高度相似的成员(α-8.1-α-8.5)组成,包括AMP01,BMP01,LPII,LPIII和ODK-1(Fig. 2, AB )(
      • Romi-Lebrun R.
      • Martin-eauclaire M.F.
      • Escoubas P.
      • 吴F.Q.
      • 勒布伦B.
      • 他的田径
      • Nakajima T.
      四种毒素的表征 Buthus Martensi. 蝎子毒液,其在Apamin敏感的CA上行动2+ - 活化的K.+ channels.
      ,
      • Buisine E.
      • Wieruszeski J.M.
      • LIPPENS G.
      • 韦特D.
      • 塔尔塔尔A.
      • SAUTIERE P.
      从蝎子毒液中表征新的毒素样肽 Leiurus Quinquestriatus. hebraeus。 Leiuropeptide II的1H-NMR结构。
      ,
      • Abdel-Mottaleb Y.
      • Clynen E.
      • Jalali A.
      • Bosmans F.
      • Vatanpour H.
      • Schoofs L.
      • Tytgat J.
      来自伊朗蝎子的毒液的第一个毒素毒素 odonthobuthus doriae..
      ,
      • 汤普森C.H.
      • Olivetti P.R.
      • 富勒米德。
      • 弗里曼C.S.
      • 麦克马斯特D.
      • 法国R.J.
      • Pohl J.
      • Kubanek J.
      • mccarty n.a.
      CLC-2氯化物彩易福彩高亲和力肽抑制剂的分离与表征。
      )。 Meutxkα1(α-8.6)和MeutxKα2(α-8.7)是两种新的α-KTX8肽,只有一个残留物变化(Fig. 2A)。它们都表征为毒素的正交毒素 M. Martensii. BMP01,一种无毒成分,对SK的弱活动 加利福尼亚州 渠道 (
      • Romi-Lebrun R.
      • Martin-eauclaire M.F.
      • Escoubas P.
      • 吴F.Q.
      • 勒布伦B.
      • 他的田径
      • Nakajima T.
      四种毒素的表征 Buthus Martensi. 蝎子毒液,其在Apamin敏感的CA上行动2+ - 活化的K.+ channels.
      )。这两种肽通过其中至少五个氨基酸与其它三个氨基酸不同,其中三个氨基酸在连接α-螺旋和第一β股的转弯上,其特征在于与KV彩易福彩相互作用是重要的。 18位的赖氨酸在亚家族中保守(Fig. 2A)。这种赖氨酸已被认为是许多α-KTX中KV彩易福彩阻断最重要的氨基酸(
      • Rodríguezde la Vega R.C.
      • possani l.d.
      关于k的蝎子毒素目前的视图+-Channels。
      )在某些情况下,还需要在〜6-7的距离处的疏水部分(通常phe或tyr)以形成功能性Dyad(
      • Dauplais M.
      • LECOQ A.
      • 宋J.
      • 棉j.
      • 贾米娜。
      • Gilquin B.
      • Roumestand C.
      • VITA C.
      • de medeiros c.l.
      • 罗文e.g.
      • 哈维A.L.
      • MénezA。
      论动物毒素的收敛演变。不相关结构储存钾彩易福彩阻断毒素官能残留的副探测。
      )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2 ktx. 的亚家族8。 A,多序列对齐。 meutxkα1/ 2之间的发散序列和其他毒素是 盒装。 B.,系统发育。只有引导百分比>这里显示了50。这 尺度条 显示总氨基酸分歧。 C,Meutxkα1的静电潜在地图,其结构基于BMP01构建(蛋白质数据库代码 1WM7 )。
      对比建模证实,MeutxKα1的总体折叠与BMP01的总折叠非常类似,BMP01由跨越残基3-12的α-螺旋区域和两条β-瓣膜跨越残基16-19和24-27组成。 Molmol计算的MeutxKα1的静电电位,其特征在于Glu周围的大负区4 ,ASP. 5 ,glu. 8和ASP.22 和一个由Lys组成的小带电区域13 和 Lys23 (Fig. 2C )。

       Meutxkα3:具有典型Dyad基序和阳离子表面的新型毒素状肽

      MeutXKα3的前体含有60个氨基酸,包括22个残基的N-末端信号肽,37个残基的成熟肽,以及可以在翻译后的处理中除去的额外C末端Gly以形成酰胺化肽,如观察到在两只蜂毒素,apamin和mellitin(
      • Gmachl M.
      • Kreil G.
      蜂毒液成分的前体是由两个基因编码的,其串联分享相同的3'-外显子。
      ,
      • 加州j.
      • 汉森·赫姆。
      • Rumjanek F.D.
      • Shipolini R.A.
      • vernon c.a.
      蜜蜂毒液的肽组分。
      )。 Meutxkα3是一种新型毒素状肽,其迄今为止表征的KTX序列相似非常低(Fig. 3, AB)。然而,该肽具有用于形成CSαβ折叠的典型结构残留物,其包括六个半胱氨酸和GKC主题中的一个甘氨酸(
      • Bontems F.
      • Roumestand C.
      • Gilquin B.
      • MénezA。
      • Toma F.
      Charybdotoxin的精致结构:蝎子毒素和昆虫防御素中的共同主题。
      )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3Meutxkα3和相关的KTX。 A,多序列对齐。 DYAD残留物被指示 最佳。 B. ,系统发育。 C,Meutxkα3的静电潜在地图,其结构是基于CHTX构建的(蛋白质数据库代码 2CRD )。 D,Meutxkα3的结构叠加和CHTx,与Dyad显示在 球棒 楷模。 IBTX. ,iberiotoxin; tmtx. ,滋油毒素。
      Meutxkα3的结构模型提供了支持其可能的k的证据+ 彩易福彩阻止功能。 1)从+7.7净电荷预测,该分子在arg周围拥有相当大的带电分子表面12 ,lys. 13 ,arg. 16 ,arg. 25 ,lys. 27和arg.34。在该分子的相对表面上,存在小型带电区域,由位点17,21和22位(Fig. 3C)。 2)包含Lys的二元27 和 Phe36 可以很好地叠加与charybdotoxin(chtx),是从毒液中分离的很好的蝎子α-ktx Leiurus Quinquestriatus. (
      • Bontems F.
      • Roumestand C.
      • Gilquin B.
      • MénezA。
      • Toma F.
      Charybdotoxin的精致结构:蝎子毒素和昆虫防御素中的共同主题。
      ),在赖氨酸Cα原子与PHE的芳香环中心之间的理想距离为6.32Å36 (Fig. 3D )。

       Meutxkα4:一种新型毒素样肽,其n末端中的双半胱氨酸

      Meutxkα4的前体由63个残基组成,其中N-末端信号肽为28个氨基酸,其与BMK86的64%相似(
      • 毛X.
      • 曹Z.
      • 尹斯。
      • 可能。
      • 吴y.
      • 李W.
      BMK86的克隆与表征,一种小说K.+ - 从蝎子毒液中阻塞。
      ),一种新特征的毒素靶向KV1.3 M. Martensii. (Fig. 4A)。总体而言,成熟的Meutxkα4表示具有低序列相似性与来自α-KTX3亚家族和BMK86的几种毒素的新肽(Fig. 4, BC);然而,它具有六个半胱氨酸,其对准模式类似于其他已知KTX的对准模式,其可以使其折叠成CSαβ结构,如通过比较建模的确认(Fig. 4D)。静电潜力分析表明,该肽在arg周围有一个大的正区21 ,lys. 23和arg.29 (Fig. 4D )。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4Meutxkα4和相关的KTX。 A,Meutxkα4和BMK86前体序列的比较。 B,多序列对齐。 C,系统发育。 D,Meutxkα4的静电潜在地图,其结构基于OSK-1(蛋白质数据库代码 1SCO )。

       BMTXKβ相关肽

      Meutxkβ3-Meutxkβ5是具有30-80%的序列同一性的三种高度相似的肽,与BMTXKβ和相关的毒素(Fig. 5, AB)。除去信号肽后,可以释放66-68个残基的成熟肽。考虑到Tcokik的高度序列相似度(
      • 迭戈 - 加西亚E.
      • Schwartz e.f.
      • d'suze g。
      • gonzálezs.a.
      • Batista C.v.
      • garcíab.i.
      • de la Vega r.c.
      • possani l.d.
      蝎子和长链β-KTX样肽在蝎子静脉中的宽系统分布:鉴定“孤儿”组分。
      ),我们假设这些肽前体还可以具有额外的处理模式以在信号肽之后去除N-末端19残基。因为没有合适的模板通过比较建模,计算来构建这些分子的全长结构 AB Initio. 选择预测作为替代方案,表明这些肽采用了先前在蝎子毒液衍生的抗微生物肽的βSPN系列中提出的双域架构(
      • 朱S.
      • 高B.
      • Aumelas A.
      • del carmenrodríguezm。
      • Lanz-Mendoza H.
      • Peigneur S.
      • 迭戈 - 加西亚E.
      • Martin-eauclaire M.F.
      • Tytgat J.
      • possani l.d.
      Meutxkβ1,蝎子毒液衍生的双结构型钾彩易福彩毒素状肽,具有细胞溶解活性。
      ,
      • 迭戈 - 加西亚E.
      • Abdel-Mottaleb Y.
      • Schwartz e.f.
      • de la Vega r.c.
      • Tytgat J.
      • possani l.d.
      cytolytic和K.+ β-KTX和蝎子样肽的彩易福彩阻断活动从蝎子静脉中纯化。
      )其中N-末端部分是无胱内半胱氨酸的,并且可以形成α-螺旋构象,而C末端部分是典型的CSαβ折叠(Fig. 5C),与基于氏菌毒素结构的比较建模获得的C末端部分的模型结构一致(蛋白质数据库代码 1SCY )( Fig. 5D)。有趣的是,Dyad基序可以在Meutxkβ5的C末端的结构中识别,其中位点22和位点31的疏水残留Leu的保守液体可以很好地叠加,用CHTx(Fig. 5E )。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5BMTXKβ相关的毒素。 A,多序列对齐。相同的残留物被遮蔽 黄色的 ,保守替代品 红色的 对于酸性残留物, 绿色 用于疏水性残留物,和 蓝色的 对于基本残留物。 NHD(L) ,长N末端螺旋域; nhd(s) ,短N末端螺旋域; CCD. ,C末端CSαβ结构域。 B,系统发育。 C,Meutxkβ5短n末端螺旋结构域的整体折叠。 D,梅特克斯克β5C-末端CSαβ域的静电势图,其结构是基于ScallaToxin的构建(蛋白质数据库代码 1SCY )。 E,Meutxkβ5C末端CSαβ结构级结构叠加和CHTx,具有DYAD 球棒 models.

       Meutxkα1和BMP01的生化表征和功能评价

      Meutxkα1和BMP01是两个直系毒素,其具有促进的氨基酸取代,如成熟肽编码区的非唯一点位点的较高的取代率鉴定,而不是信号肽编码区(补充图。S1)。为了研究加速替代的功能意义,我们比较了其渠道阻塞活动。首先,我们纯化了Meutxkα1 M. eupeus.. 毒液通过RP-HPLC,其特征在于MALDI-TOF和EDMAN降解。 Meutxkα1在17.5分钟后洗脱( Fig. 6A),检测到的分子量为3251Da,其精确地与从其氨基酸序列预测的分子量匹配(3250Da)(Fig. 6B)。 Edman降解确定纯化组分的N-末端前五个残基,其被VSCED,与通过cDNA克隆确定的MeutxKα1完全一致。通过使用相同的方法,我们还纯化了BMP01 M. Martensii. venom (Fig. 6, CD )。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6MeutxKα1和BMP01的纯化和表征。 RP-HPLC分析显示粗毒液的分离 M. eupeus.. (A ) 和 M. Martensii. (C在17.5和17分钟的情况下,梅特克克α1和BMP01分别被洗脱(由 )。 MAUTXKα1的MALDI-TOF(B)和bmp01(D)显示。 ,毫米吸毒单位。
      在九个电压门控K的面板上评估Meutxkα1和BMP01的药理功能+ 彩易福彩(RKV1.1,RKV1.2,RKV1.3,HKV1.3,RKV1.4,RKV1.5,RKV1.6, 摇机 IR和Herg)。所有渠道都表达在 Xenopus. 通过使用双电极电压钳位技术记录卵母细胞及其电流。 Fig. 7 显示meutxkα1在不同k上的阻塞效果+ currents. At 3 μm 浓度,MeutxKα1抑制约35,100和70%的RKV1.1,HKV1.3和HKV1.3和 摇机 红外渠道分别。在这种浓度下,RKV1.2,RKV1.4,RKV1.5,RKV1.6和HERG彩易福彩不受影响。为了比较,我们还在同一信道上并行评估BMP01的KV彩易福彩阻断活动。结果表明,它表现出与Meutxkα1相同的信道谱,但在RKV1.1比Meutxkα1上更有效,因为在3μm 浓度BMP01抑制了100%的RKV1.1电流(Fig. 8 )。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7MEUTXKα1对KV彩易福彩同种型表达的差异影响 X. Laevis. oocytes. 表达克隆kV彩易福彩的卵母细胞的代表性全细胞电流(Kv1.1-Kv1.6,Herg和 摇机 IR)显示。这 虚线 表示零电流级别。 *施用3μ后,标记稳态电流痕迹m MeuTXKα1.
      图缩略图GR8.
      Fig. 8BMP01对KV彩易福彩同种型的差异效应 X. Laevis. oocytes. 表达克隆kV彩易福彩的卵母细胞的代表性全细胞电流(Kv1.1-Kv1.6,Herg和 摇机 IR)显示。这 虚线 表示零电流级别。 *施用3μ后,标记稳态电流痕迹m MeuTXKα1.
      随后,我们比较了Meutxkα1和BMP01对HKV1.3的亲和力。结果表明,Meutxkα1是一种高效的HKV1.3彩易福彩阻滞剂,具有纳米摩尔亲和力(IC50,2.36±0.9 nm )( Fig. 9)显示超过KV1.1的KV1.3的1271倍的选择性,而BMP01仅表现出对HKV1.3(IC的亚硫摩尔亲和力50,133.72±10.98 nm)和rkv1.3(IC50,467.68±28.37 nm )( Fig. 9)。总体而言,BMP01在HKV1.3上显示57倍,而不是Meutxkα1。对于这两个正交毒素的亲和力和选择性的变异支持它们在物质之后支持其功能演化。
      图缩略图GR9.
      Fig. 9Meutxkα1和BMP01的KV1.3电流块的浓度依赖性。 The yielded IC50 值为2.36±0.90 nm 在HKV1.3上的Meutxkα1,133.72±10.98 nm 对于HKV1.3的BMP01,467.68±28.37 nm for BmP01 on rKv1.3.
      鉴于MeutxKα1对KV1.3彩易福彩的选择性效力,因此我们测定了抑制抑制kV1.3表达介导的T细胞增殖的潜在能力。结果表明,Meutxkα1以剂量依赖的方式抑制PMA和离子霉素诱导的活化T细胞的增殖( 图10. )。
      图缩略图GR10
      图10. Meutxkα1抑制PMA /离子霉素诱导的T细胞的增殖。 数据显示为平均值±S.D. (n = 3)。学生的未批准 t 用于比较手段的测试用于比较群体。 ***, p <0.001(与不添加肽的对照相比)。

      讨论

      M. eupeus.. 是一个最广泛研究的兄弟姐妹种类 M. Martensii. (
      • Goudet C.
      • chi c.w.
      • Tytgat J.
      亚洲蝎子毒液中毒素和基因概述 Buthus Martensi. Karsch.
      );但是,它的KTX很少知道。从该蝎子中分离的一种这样的肽是BEKM-1,一种特异性毒素,其与CHTX分享结构相似之处,但具有类似于Ergtoxin的作用机制,蝎子毒液衍生的γ-KTX系列的成员(
      • Korolkova Y.v.
      • Kozlov S.A.
      • Lipkin A.v.
      • Pluzhnikov K.A.
      • 哈德利J.K.
      • Filippov A.K.
      • 棕色D.A.
      • Angelo K.
      • Strøbaekd。
      • jespersen t.
      • olesen s.p.
      • Jensen B.S.
      • 格兰林E.v.
      来自蝎子的ERG彩易福彩抑制剂 Buthus eupeus..
      )。该物种(命名Meuktx)的另一kTx最近被鉴定为kV频道的非选择性抑制剂(
      • 高B.
      • Peigneur S.
      • Tytgat J.
      • 朱S.
      有效的钾彩易福彩阻挡者 mesobuthus eupeus. scorpion venom.
      )。从毒液中搜索新的ktxs M. eupeus..,我们首先从其毒腺构建一个cDNA文库,我们通过随机DNA测序策略确定了编码七个推定KTX的克隆。其中,五个被归类为两个已知的正交 M. Martensii. 毒素,包括meutxkα1,me​​utxkα2,meutxkβ3,meutxkβ4和meutxkβ5,以及两个(meutxkα3和meutxkα4)与所述肽共享低序列相似性。
      据估计,世界上有大约有1500种已知的蝎子,并且每个不同的物种具有约70个肽(
      • possani l.d.
      • 毕业化B.
      • Delepierre M.
      • Tytgat J.
      蝎子毒素特异性+-Channels。
      )。我们在这里呈现的工作表明,即使在两个兄弟种类之间,它们的正交毒素也可能具有适应性地演变的新功能,具有给定K的差异亲和力和选择性+ 渠道。这支持概念,即应在药理功能方面完全评估每种物种的毒液(
      • possani l.d.
      • Merino E.
      • 电晕M.
      • 玻利瓦尔F.
      • 毕业化B.
      肽和基因编码,用于影响离子彩易福彩的蝎子毒素。
      )。 BMP01和Meutxkα1提供了一个很好的例子,以观察到在成熟肽编码区的加速取代后如何在物质化之后发散的毒素。 BMP01和MeutxKα1的五个位点的加速氨基酸取代具有功能多样化。首先,Meutxkα1在HKV1.3(57倍差异)上表现出比BMP01更多的效力,而第二种情况下,Meutxkα1在与BMP01相比时显示出在KV1.1(1271倍差异)上的KV1.3上的更多选择性。
      尽管由于天然存在的生物活性成分蝎子毒液衍生的KTX在抑制KV1.3中显示出高度有效的活性,但是这些肽的大部分缺乏足够的特异性以区分该彩易福彩和其他相关kV1.x,特别是kv1.1给出了高度在KV1.1和KV1.3彩易福彩之间的毒素相互作用孔区域中的序列相似性(
      • 汉科。
      • yi h.
      • 尹S.J.
      • 陈Z.Y.
      • 刘H.
      • 曹Z. J.
      • 吴y.l.
      • 李W.X.
      为KV1.3彩易福彩设计的高效肽抑制剂的结构基础,自身免疫疾病的治疗靶标。
      )。例如,AGTX-2,OSK-1,NTX和KTX与PICOMOLAR亲和力结合KV1.3,但它们对KV1.1的选择性非常低,范围为2.6至110倍(
      • possani l.d.
      • 毕业化B.
      • Delepierre M.
      • Tytgat J.
      蝎子毒素特异性+-Channels。
      ,
      • Mouhat S.
      • Visan V.
      • Ananthakrishnan S.
      • Wulff H.
      • Andreotti N.
      • Grismer S.
      • Darbon H.
      • De Waard M.
      • 萨巴蒂尔准噶米。
      K+ 由合成OSK1定位的频道类型,来自的毒素 矫形症状疤痕丝状 scorpion venom.
      ,
      • Abdel-Mottaleb Y.
      • Vandendriesche T.
      • Clynen E.
      • Landuyt B.
      • Jalali A.
      • Vatanpour H.
      • Schoofs L.
      • Tytgat J.
      ODK2,来自伊朗蝎子的毒液的KV1.3频道选择性毒素 odonthobuthus doriae..
      ,
      • Takacs Z.
      • 符号M.
      • Kollewe A.
      • 约翰逊E.
      • Cuello L.G.
      • DRIESSENS G.
      • Biancalana M.
      • koide A.
      • ponte c.g.
      • Perozo E.
      • gajewski t.f.
      • Suarez-Kurtz G.
      • Koide S.
      • Goldstein S.A.
      从蝎子神经毒素的文库中专用于KV1.3彩易福彩的设计者配体。
      )( 表I. )。其他肽,例如ADWX-1,HSTX1,AAM-KTX,Mokatoxin-1和CHTx对KV1.1具有高选择性,但它们也活跃在其他相关的KV彩易福彩上( 例如 Kv1.2) (
      • 汉科。
      • yi h.
      • 尹S.J.
      • 陈Z.Y.
      • 刘H.
      • 曹Z. J.
      • 吴y.l.
      • 李W.X.
      为KV1.3彩易福彩设计的高效肽抑制剂的结构基础,自身免疫疾病的治疗靶标。
      ,
      • Takacs Z.
      • 符号M.
      • Kollewe A.
      • 约翰逊E.
      • Cuello L.G.
      • DRIESSENS G.
      • Biancalana M.
      • koide A.
      • ponte c.g.
      • Perozo E.
      • gajewski t.f.
      • Suarez-Kurtz G.
      • Koide S.
      • Goldstein S.A.
      从蝎子神经毒素的文库中专用于KV1.3彩易福彩的设计者配体。
      ,
      • Regaya I.
      • 贝顿C.
      • 法人G.
      • Andreotti N.
      • Darbon H.
      • De Waard M.
      • 萨巴蒂尔准噶米。
      MTX. 和HSTX1蝎子毒素的SK和KV频道的具体域特定识别证据。
      ,
      • ABBAS N.
      • Belghazi M.
      • Abdel-Mottaleb Y.
      • Tytgat J.
      • Bougis P.E.
      • Martin-eauclaire M.F.
      一种新的kaliotoxin选择性朝Kv1.3和Kv1.2选择性,但不是在卵母细胞中表达的kv1.1彩易福彩。
      )。在这方面,Meutxkα1具有比上述肽更大的优势,因为它在低纳米粗浓度下工作,但在KV1.1上显示超过1000倍的选择性的KV1.1。重要的是,即使在微摩尔浓度下,它缺乏其他相关kV彩易福彩的活动。
      表I. 我知道了 的比较50 values (nm)KV1.3和KV1.1彩易福彩上的蝎子α-KTX和类似物
      毒素 α-KTX. Kv1.3Kv1.1 我知道了 50(kv1.1) /我知道了 50(kv1.3)
      Meutxkα18.62.36>3000>1271
      chtx. 1.10.9>1000>1111
      Mokatoxin-1设计1>1000>1000
      aam-ktx.3.121.1>750>682
      HsTx16.30.0117636
      ADWX-1设计∼0.002 0.6 5340
      ktx. 3.10.011.1110
      AgTx-13.41.713680
      NTX. 2.10.312477
      OsK-13.70.014 0.6 43
      OdK-23.117.2>35>4.9
      AgTx-23.20.050.132.6
      Css202.137.2>10>1.4
      meuktx. 3.130.170.201.2
      MTX. 2.215037>0.6
      数据源如下:meutxkα1(这项工作); CHTX,Mokatoxin-1,AGTX-2和KTX(
      • Takacs Z.
      • 符号M.
      • Kollewe A.
      • 约翰逊E.
      • Cuello L.G.
      • DRIESSENS G.
      • Biancalana M.
      • koide A.
      • ponte c.g.
      • Perozo E.
      • gajewski t.f.
      • Suarez-Kurtz G.
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      K+ 由合成OSK1定位的频道类型,来自的毒素 矫形症状疤痕丝状 scorpion venom.
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      • Vatanpour H.
      • Schoofs L.
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      ODK2,来自伊朗蝎子的毒液的KV1.3频道选择性毒素 odonthobuthus doriae..
      ); CSS20(
      • Corzo G.
      • PAPP F.
      • varga z.
      • 巴拉佐奥。
      • Espino-solis P.G.
      • Rodríguezde la Vega R.C.
      • 加油
      • 潘燕G.
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      来自蝎子毒液的KV1.2和KV1.3钾彩易福彩的选择性阻滞剂 Centruroides suffusus. suffusus.
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      • 高B.
      • Peigneur S.
      • Tytgat J.
      • 朱S.
      有效的钾彩易福彩阻挡者 mesobuthus eupeus. scorpion venom.
      ); Maurotoxin(MTX)(
      • Kharrat R.
      • Mabrouk K.
      • 冠冕
      • Darbon H.
      • oughideni R.
      • Martin-eauclaire M.F.
      • 雅克G.
      • El Ayeb M.
      • van Rietschoten J.
      • Rochat H.
      • 萨巴蒂尔准噶米。
      体育毒素的化学合成与表征,一种短蝎毒素,其四种二硫化物桥接作用于K.+ channels.
      )。
      由于其总带负电的表面,α-KTX8亚家族中的成员被认为是相对较弱的毒液组分。 MeutxKα1至Kv1.3的高亲和力结合的发现扩增了这种独特的亚家族的药理靶标。事实上,α-KTX8亚家族中的所有成员都有两个相同的残留物(LYS 18 和 Asn21,根据Meutxkα1编号,这些是相当于Lys的27 和 Asn30 在AGTX2和许多其他KV彩易福彩靶向α-KTX中。在AgTX2中,这两个关键残留物的突变具有最大的稳定性效果(
      • Mackinnon R.
      • 科恩S.L.
      • Kuo A.
      • 李阿。
      • Chait B.T.
      原核和真核钾彩易福彩的结构保护。
      )。由于这两个关键残留物中的守恒,Meutxkα1和BMP01可能采用普遍接受的作用方式来与KV1.3相互作用,其中保守李的侧链18 可以直接插频孔。
      提供有利于我们意见的结构证据,我们建立了一个复杂的BMP01模型(
      • 吴G.
      • 李Y.
      • 魏D.
      • 姜S.
      • 拥抱。
      • 吴H.
      来自蝎子毒液的BMP01的溶液结构 Buthus Martensii. Karsch.
      )通过结构叠加和能量最小化HKV1.3。如图所示 图11.,BMP01可以通过结构互补来堵塞彩易福彩,其中LYS18 略微进入彩易福彩孔隙。这种复杂的模型使我们能够识别ALA之间的两个疏水性相互作用1 (BmP01) or Val1 (MeuTXKα1) and Val406 链(HKV1.3)和Pro之间28 (bmp01 /meutxkα1)和val406 链C(HKV1.3)。在部位406(根据HKV1.3编号)的这种缬氨酸仅存在于四个敏感的kV频道( 摇机 ,RKV1.1,RKV1.3和HKV1.3),而在所有抵抗kV频道中,该网站由Thr,Ile或满足该网站。该VAR在AGTX2绑定中的关键作用 摇机 以前突出过(
      • Mackinnon R.
      • 科恩S.L.
      • Kuo A.
      • 李阿。
      • Chait B.T.
      原核和真核钾彩易福彩的结构保护。
      )。
      图缩略图GR11.
      图11.梅绍克α1/ BMP01选择性kV彩易福彩阻断活性解释的假设模型。 A,kv1.1-kv1.6的孔区域的序列对准和 果蝇振动器 渠道。 Val406在敏感的kV频道之间保守,如图所示 绿色 并遮蔽了 黄色的 。在大鼠和人KV1.3之间存在不同的残留物 红色的。 B. ,Meutxkα1/ BMP01的带状模型与人KV1.3的结合。 黄色的 ,bmp01; 薰衣草,Meutxkα1。 C,BMP01-HKV1.3复合物的分子表面表示。为清楚起见,这里仅显示KV1.3的链A和C. D,bmp01通过lys绑定到kv1.3的外前庭18 插入彩易福彩孔和两个疏水残留物(ALA1 和 Pro2)分别与val相互作用406 从链A和C导出。在这种模式中,α-螺旋和第一β-链之间的转弯在Meutxkα1和BMP01之间含有三个非相同的残基,并且与彩易福彩转塔相邻。氨基酸颜色代码如下: 蓝色的 , 基本的; 绿色 ,疏水; 青色 ,极性。
      在我们的复杂模型中,连接α-螺旋和毒素的第一β-股的区域接近炮塔,该区域是ADWX-1至KV1.3的高亲和力结合的已知沟道区(
      • 尹S.J.
      • 姜L.
      • yi h.
      • 汉科。
      • 杨D.W.
      • 刘M.L.
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      • 曹Z. J.
      • 吴y.l.
      • 李W.X.
      沟道塔塔中的不同残留物测定KV1.1和KV1.3彩易福彩之间ADWX-1抑制剂肽的选择性。
      )和agtx2到 摇机 (
      • Mackinnon R.
      • 科恩S.L.
      • Kuo A.
      • 李阿。
      • Chait B.T.
      原核和真核钾彩易福彩的结构保护。
      ),这可能考虑MeutxKα1和BMP01之间的差异亲和力,因为这两个毒素在该区域中具有三个氨基酸取代。为了提供支持沟道塔塔与毒素相互作用的实验证据,我们将BMP01与HKV1.3和RKV1.3的活性进行了比较,两者在炮塔中只有两个氨基酸。结果表明,该毒素在人和大鼠KV1.3上表现出3倍不同的亲和力(Fig. 9),支持Kv1.3塔塔在毒素结合中的重要性。
      总之,我们的工作基于cDNA克隆和生化纯化和功能测定,描述了影响k的蝎子毒素的分子多样性+ 在较少学习的物种中的频道(M. eupeus..)透明毒素之间的功能多样化。 KV1.1的KV1.1的极高选择性使Meutxkα1成为人类自身免疫疾病的免疫调节剂设计的有吸引力的候选者。

      致谢

      我们感谢O. Pongs提供大鼠KV1.2彩易福彩的cDNA。用M.L.Garcia友好提供人KV1.3克隆。 Mark Keating教授慷慨地捐赠了疱疹克隆。我们还感谢Rodríguezdeava博士提供CSS20-HKV1.3复杂型号。

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