磷脂蛋白酶体分析揭示了心肌细胞的主要途径中的调节部位*

  • 宁邓
    脚注
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    加利福尼亚州洛杉矶大卫格芬医学院生理和医学系,洛杉矶,加利福尼亚州洛杉矶90095

    浙江大学生物医学工程重点实验室生物医学工程系,杭州310027
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  • 张俊
    脚注
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    加利福尼亚州洛杉矶大卫格芬医学院生理和医学系,洛杉矶,加利福尼亚州洛杉矶90095
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  • 成功宗
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  • 岳州王
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    加利福尼亚州洛杉矶大卫格芬医学院生理和医学系,洛杉矶,加利福尼亚州洛杉矶90095
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  • 郝杰·卢
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    复旦大学生物医学科学化学与研究院,上海200433
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  • 彭源阳
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    复旦大学生物医学科学化学与研究院,上海200433
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  • 温海王
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  • Glen W. Young.
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    加利福尼亚州洛杉矶大卫格芬医学院生理和医学系,洛杉矶,加利福尼亚州洛杉矶90095
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  • y
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  • Paavo korge.
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  • Christopher Lotz.
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  • 菲利普多兰
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  • David A. Liem.
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  • rolf apweiler.
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    欧洲分子生物学实验室/欧洲生物信息学研究所,Hinxton,剑桥CB10F 1SD,英国
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  • 詹姆斯N. Weiss.
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  • 汇隆段
    一致
    可以解决对应的通信。电话:86-571-8795-1792;传真:86-571-8795-1960
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    浙江大学生物医学工程重点实验室生物医学工程系,杭州310027
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  • peipei ping.
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    可以解决对应的通信:UCLA,MRL BLDG的David Geffen医学院,MRL Bldg。,Suite 1609 CVRL,675 CE Young博士,洛杉矶,加利福尼亚州90095。电话。:310-267-5624;传真:310-267-5623
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    加利福尼亚州洛杉矶大卫格芬医学院生理和医学系,洛杉矶,加利福尼亚州洛杉矶90095
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  • 作者脚注
    *全国卫生研究院全部或部分支持这项工作得到了支持P01 HL80111和R01 HL80691(至P.P.)。
    本文包含补充图。 S1-S3和表S1-S4。
    ¶这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
      线粒体功能在心脏中动态调节。特别地,已显示蛋白质磷酸化是在不同心血管表型中调节线粒体功能的关键机制。然而,特定于现场的磷酸化信息对于该器官仍然是稀缺的。因此,我们在线粒体官能途径的背景下进行了小鼠心脏线粒体磷酸磷蛋白酶的综合表征。使用碰撞诱导的解离(CID)和电子转移解离(ETD)的互补碎片技术的平台证明了小鼠心脏中总共236个磷酸化位点的成功鉴定;这些位点的210个是新的。将这些236位点映射到181磷蛋白蛋白和203种磷酸肽。在鉴定的那些中,仅通过CID捕获45位磷酸化位点,而185个磷酸化位点,包括对泛醇 - 细胞色素的新改性c还原酶蛋白1(SER-212)仅通过ETD鉴定,强调了组合CID和ETD方法的优点。评价心脏线粒体磷蛋白酶的生物学意义。我们的研究表明了小鼠心脏线粒体途径中的关键调节位点作为磷酸化调控的靶标,包括电子传输链(ETC)复合物的组分和代谢途径中涉及的酶(例如三羧酸循环)。此外,钙过载受伤的心脏线粒体等功能,而通过施用磷酸酶抑制剂的增强磷酸化恢复钙衰减等复合物I和复合III活性,磷酸化证明了等功率的正常调节。而且,在Silico.鉴定的磷酸肽基序的分析照射了参与激酶的分子性质,其中包括几种已知的线粒体激酶(例如丙酮酸脱氢酶激酶以及预先监视线粒体位置的激酶(例如SRC)。总之,本文定义的磷酸化事件提前了我们对心脏线粒体生物学的理解,促进了对线粒体信号网络,代谢途径和心脏功能调节的内在机制的整合。
      线粒体是维持生命的能源来源。除了作为能源系统的进化来源之外,它们的功能还集成了生命的各个方面,包括细胞周期,ROS
      使用的缩写是:
      罗斯
      反应性氧气
      AMBC.
      碳酸氢铵
      蚂蚁
      腺嘌呤核苷酸易位器
      等等
      电子传输链
      ETD.
      电子转移解离
      QCR1
      Ubiquinol-cytochrome. c 还原酶核心蛋白1
      CI.
      复杂的I.
      CI.II.
      复杂三
      Omssa.
      开放质谱搜索算法
      基因本体论
      FPR.
      假阳性率
      GSK3
      糖原合成酶激酶3。
      1使用的缩写是:罗斯
      反应性氧气
      AMBC.
      碳酸氢铵
      蚂蚁
      腺嘌呤核苷酸易位器
      等等
      电子传输链
      ETD.
      电子转移解离
      QCR1
      Ubiquinol-cytochrome. c 还原酶核心蛋白1
      CI.
      复杂的I.
      CI.II.
      复杂三
      Omssa.
      开放质谱搜索算法
      基因本体论
      FPR.
      假阳性率
      GSK3
      糖原合成酶激酶3。
      生产,细胞凋亡和离子平衡(
      • 约翰逊D.T.
      • 哈里斯r.a.
      • 布莱尔P.V.
      • Balaban R.S.
      线粒体蛋白质组异质性的功能后果。
      ,
      • 麦克布莱德H.M.
      • Neuspiel M.
      • Wasiak S.
      线粒体:不仅仅是一个强国。
      )。我们对线粒体生物学的理解仍在增长。若干系统生物学方法致力于探索与该细胞器相关的功能多种能力的分子基础设施和动态(
      • kislinger t.
      • Cox B.
      • 坎南A.
      • Chung C.
      • 胡诗
      • Ignatchenko A.
      • 斯科特M.S.
      • Gramolini a.o.
      • 莫里斯Q.
      • Hallett M.T.
      • rossant J.
      • 休斯。
      • 弗雷B.
      • Emili A.
      小鼠器官和细胞器蛋白表达的全局调查:组合蛋白质组学和转录组分析。
      ,
      • Pagliarini D.J.
      • Calvo S.E.
      • 昌B.
      • sheth s.a.
      • vafai s.b.
      • ong s.e.
      • 沃尔福德G.A.
      • Sugiana C.
      • boneh a。
      • 陈W.K.
      • 山D.E.
      • vidal m.
      • 埃文斯J.G.
      • Thorburn D.R.
      • carr s.a.
      • Mootha V.K.
      线粒体蛋白质概要阐明了综合体疾病生物学。
      ,
      • 张继夫
      • 李X.
      • 穆勒M.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • 邓恩。
      • Vondriska下午
      • liem d.a.
      • 杨杰..
      • 韩格P.
      • 本田H.
      • Weiss J.N.
      • APWEILER R.
      • ping p.
      用功能验证的心肌细胞进行鼠线粒体蛋白质的系统特征。
      )。
      为了满足组织特异性功能需求,线粒体在单个器官中获得异质性质,其具有功能和蛋白质组组成中可塑性的第一个陈述(
      • 约翰逊D.T.
      • 哈里斯r.a.
      • 布莱尔P.V.
      • Balaban R.S.
      线粒体蛋白质组异质性的功能后果。
      ,
      • Mootha V.K.
      • Bunkenborg J.
      • 奥尔森J.V.
      • Hjerrild M.
      • wisniewski J.R.
      • 斯赫尔e.
      • Bolouri M.S.
      • 雷H.N.
      • Sihag S.
      • Kamal M.
      • 帕特森N.
      • 着陆器E.S.
      小鼠线粒体中蛋白质组成,组织多样性和基因调控的综合分析。
      )。即使在单个心肌细胞中,异质性也是显而易见的(
      • RIVA A.
      • Tandler B.
      • Loffredo F.
      • Vazquez E.
      • Hoppel C.
      两种生物学定义群心肌细胞群的结构差异。
      )。心脏线粒体蛋白质组目录通过联合努力出现(
      • kislinger t.
      • Cox B.
      • 坎南A.
      • Chung C.
      • 胡诗
      • Ignatchenko A.
      • 斯科特M.S.
      • Gramolini a.o.
      • 莫里斯Q.
      • Hallett M.T.
      • rossant J.
      • 休斯。
      • 弗雷B.
      • Emili A.
      小鼠器官和细胞器蛋白表达的全局调查:组合蛋白质组学和转录组分析。
      ,
      • Pagliarini D.J.
      • Calvo S.E.
      • 昌B.
      • sheth s.a.
      • vafai s.b.
      • ong s.e.
      • 沃尔福德G.A.
      • Sugiana C.
      • boneh a。
      • 陈W.K.
      • 山D.E.
      • vidal m.
      • 埃文斯J.G.
      • Thorburn D.R.
      • carr s.a.
      • Mootha V.K.
      线粒体蛋白质概要阐明了综合体疾病生物学。
      ,
      • 张继夫
      • 李X.
      • 穆勒M.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • 邓恩。
      • Vondriska下午
      • liem d.a.
      • 杨杰..
      • 韩格P.
      • 本田H.
      • Weiss J.N.
      • APWEILER R.
      • ping p.
      用功能验证的心肌细胞进行鼠线粒体蛋白质的系统特征。
      )。在多个水平下线粒体蛋白质组发育的动态,包括翻译后修饰,例如磷酸化。我们的调查目标是在生物学和功能背景下解码该细胞蛋白蛋白质组及其翻译后修饰。在心肌细胞中,线粒体也经常暴露于能量需求和离子条件下的波动。线粒体应对这种动态环境的能力对于线粒体在正常和疾病表型中的功能作用至关重要(
      • 福斯特D.B.
      • O'Rourke B.
      • 范艾克J.E.
      线粒体蛋白质组学可以告诉我们关于预处理提供的心脏保护的内容?
      ,
      • Weiss J.N.
      • 韩格P.
      • 本田H.M.
      • ping p.
      线粒体渗透率过渡在心肌疾病中的作用。
      ,
      • 张继夫
      • liem d.a.
      • 穆勒M.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • 邓恩。
      • Vondriska下午
      • 韩格P.
      • 劳动o.
      • Maclellan W.R.
      • 本田H.
      • Weiss J.N.
      • APWEILER R.
      • ping p.
      在应力条件下改变了心肌细胞的蛋白质组生物学。
      )。蛋白质组学工具可以询问有线粒体蛋白质以适应这些生物学变化的独特蛋白质特征(
      • 张继夫
      • liem d.a.
      • 穆勒M.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • 邓恩。
      • Vondriska下午
      • 韩格P.
      • 劳动o.
      • Maclellan W.R.
      • 本田H.
      • Weiss J.N.
      • APWEILER R.
      • ping p.
      在应力条件下改变了心肌细胞的蛋白质组生物学。
      ,
      • 梅尔米
      • Liem D.
      • 张继夫
      • 李X.
      • Avliyakulov N.K.
      • 杨杰..
      • 年轻的G.
      • Vondriska下午
      • Ladroue C.
      • Madhu B.
      • Griffiths J.R.
      • 戈麦斯A.
      • 徐Q.
      • ping p.
      心脏保护蛋白质组学和代谢组分分析:蛋白质激酶Cε的相互作用和δ在鼠心调节葡萄糖代谢中。
      ,
      • arrell d.k.
      • 艾略特S.T.
      • Kane L.A.
      • 郭y.
      • ko Y.H.
      • Pedersen P.L.
      • 罗宾逊J.
      • 村田M.
      • 墨菲上午
      • MarbánE.
      • 范艾克J.E.
      药理学预处理的蛋白质组学分析:新蛋白靶标会聚到线粒体代谢途径。
      )。蛋白质磷酸化作为快速和可逆的化学事件是这些蛋白质特征的一组成分(
      • arrell d.k.
      • 艾略特S.T.
      • Kane L.A.
      • 郭y.
      • ko Y.H.
      • Pedersen P.L.
      • 罗宾逊J.
      • 村田M.
      • 墨菲上午
      • MarbánE.
      • 范艾克J.E.
      药理学预处理的蛋白质组学分析:新蛋白靶标会聚到线粒体代谢途径。
      ,
      • Boja E.S.
      • 菲利普斯D.
      • 法国S.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      具有高能量碰撞解离的LTQ-壁毯上的定量线粒体磷蛋白酶。
      ,
      • 料斗r.k.
      • 卡罗尔S.
      • Aponte上午
      • 约翰逊D.T.
      • 法国S.
      • 沉R.F.
      • Witzmann F.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      线粒体基质磷酸酯:额外线粒体钙的影响。
      )。
      据估计,三分之一的细胞蛋白在磷酸化状态中存在至少一次在其寿命中(
      • 猎人T.
      蛋白激酶和磷酸酶:蛋白质磷酸化和信号传导的阴阳。
      )。然而,只鉴定了少数磷酸化事件来调整线粒体功能(
      • Boja E.S.
      • 菲利普斯D.
      • 法国S.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      具有高能量碰撞解离的LTQ-壁毯上的定量线粒体磷蛋白酶。
      ,
      • 料斗r.k.
      • 卡罗尔S.
      • Aponte上午
      • 约翰逊D.T.
      • 法国S.
      • 沉R.F.
      • Witzmann F.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      线粒体基质磷酸酯:额外线粒体钙的影响。
      ,
      • 李杰。
      • 徐Y.
      • 陈Y.
      • SP. rung R.
      • 金S.C.
      • 谢S.
      • 赵玉。
      通过改进的IMAC方法和MS / MS / MS揭示的线粒体磷酸酯。
      )尽管大于5年前在线粒体蛋白质上报告了第一次磷酸化演示(
      • 伯特G.
      • 肯尼迪e.p.
      蛋白质的酶促磷酸化。
      )。激酶和磷酸酶包含近3%的人类基因组(
      • Alonso A.
      • Sasin J.
      • Bottini N.
      • Friedberg I.
      • Friedberg I.
      • Osterman A.
      • Godzik A.
      • 猎人T.
      • 迪克森J.
      • 鼬T.
      蛋白质酪氨酸磷酸酶在人类基因组中。
      ,
      • 曼宁G.
      • 唠叨D.B.
      • 马丁内斯·
      • 猎人T.
      • sudarsanam s.
      人类基因组的蛋白激酶补体。
      )。在线粒体中,〜30激酶和磷酸酶已经迄今为止鉴定出几千的预期细胞蛋白蛋白质
      • kislinger t.
      • Cox B.
      • 坎南A.
      • Chung C.
      • 胡诗
      • Ignatchenko A.
      • 斯科特M.S.
      • Gramolini a.o.
      • 莫里斯Q.
      • Hallett M.T.
      • rossant J.
      • 休斯。
      • 弗雷B.
      • Emili A.
      小鼠器官和细胞器蛋白表达的全局调查:组合蛋白质组学和转录组分析。
      ,
      • Pagliarini D.J.
      • Calvo S.E.
      • 昌B.
      • sheth s.a.
      • vafai s.b.
      • ong s.e.
      • 沃尔福德G.A.
      • Sugiana C.
      • boneh a。
      • 陈W.K.
      • 山D.E.
      • vidal m.
      • 埃文斯J.G.
      • Thorburn D.R.
      • carr s.a.
      • Mootha V.K.
      线粒体蛋白质概要阐明了综合体疾病生物学。
      ,
      • 张继夫
      • 李X.
      • 穆勒M.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • 邓恩。
      • Vondriska下午
      • liem d.a.
      • 杨杰..
      • 韩格P.
      • 本田H.
      • Weiss J.N.
      • APWEILER R.
      • ping p.
      用功能验证的心肌细胞进行鼠线粒体蛋白质的系统特征。
      ,
      • 李杰。
      • 徐Y.
      • 陈Y.
      • SP. rung R.
      • 金S.C.
      • 谢S.
      • 赵玉。
      通过改进的IMAC方法和MS / MS / MS揭示的线粒体磷酸酯。
      )。鉴定的线粒体磷蛋白的数量远低于其蛋白质组大小的三分之一(
      • Pagliarini D.J.
      • 迪克森J.E.
      线粒体调制:可逆磷酸化需要中心阶段?
      )。因此,似乎报告的磷酸蛋白的当前池仅代表预期的线粒体磷蛋白酶的一小部分。来自几个群体的精髓研究(
      • arrell d.k.
      • 艾略特S.T.
      • Kane L.A.
      • 郭y.
      • ko Y.H.
      • Pedersen P.L.
      • 罗宾逊J.
      • 村田M.
      • 墨菲上午
      • MarbánE.
      • 范艾克J.E.
      药理学预处理的蛋白质组学分析:新蛋白靶标会聚到线粒体代谢途径。
      ,
      • Boja E.S.
      • 菲利普斯D.
      • 法国S.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      具有高能量碰撞解离的LTQ-壁毯上的定量线粒体磷蛋白酶。
      ,
      • 料斗r.k.
      • 卡罗尔S.
      • Aponte上午
      • 约翰逊D.T.
      • 法国S.
      • 沉R.F.
      • Witzmann F.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      线粒体基质磷酸酯:额外线粒体钙的影响。
      ,
      • 李杰。
      • 徐Y.
      • 陈Y.
      • SP. rung R.
      • 金S.C.
      • 谢S.
      • 赵玉。
      通过改进的IMAC方法和MS / MS / MS揭示的线粒体磷酸酯。
      )展示了心肌细胞粒细胞中磷酸化的患病率以及磷酸化的动态性质,这表明获得了线粒体磷蛋白酶组的综合图是可行的。
      在这项研究中,我们采取了系统的方法来解决小鼠心脏线粒体途径的磷酸化。我们将电子转移解离(ETD)和碰撞诱导的解离(CID)LC-MS / MS的独特优点应用于特异性时装的筛选磷酸化事件。鉴定了203个独特的磷酸肽中共236位磷酸化位点并映射到181磷蛋白质。在不同的线粒体生物学途径中发现了新的磷酸化修饰,包括离子平衡,蛋白水解和凋亡。与线粒体的作用一致作为在微妙的控制下作为能量产量的主要来源,代谢途径要求在该分析中捕获的三分之一的磷酸化位点。为了研究分子球员转向线粒体磷酸化,我们探讨了钙载荷对磷酸化的影响。此外,有许多具有先前未被覆富的线粒体住所的激酶被建议作为调节线粒体途径的潜在球员。在一起,本研究发现的新型磷酸化事件的群组构成了朝向心脏线粒体磷蛋白酶全部描绘的重要步骤。

      实验步骤

      所有程序均按照大型州大学委员会的动物研究委员会指导和国家卫生研究院出版的实验动物的护理和使用指南进行。

       材料

      N-DodeCylβ-d-maltoside(Avanti Polar脂质),蛋白酶抑制剂混合物(Roche Application Science),Fenvalerate和Calyculin A(EMD Chemicals),测序级修饰胰蛋白酶(Promega),单调TiO2 富集树脂(GL科学)从指定的来源获得。所有其他试剂都是从Sigma-Aldrich获得的。

       纯化线粒体和功能验证

      Mitochondria刚刚被孤立,并如前所述从小鼠心中纯化(
      • 张继夫
      • 李X.
      • 穆勒M.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • 邓恩。
      • Vondriska下午
      • liem d.a.
      • 杨杰..
      • 韩格P.
      • 本田H.
      • Weiss J.N.
      • APWEILER R.
      • ping p.
      用功能验证的心肌细胞进行鼠线粒体蛋白质的系统特征。
      )。在收集后立即汇集45只小鼠心(8-10周,ICR菌株,男性),并作为生物复制均化(隔离缓冲液:250米m sucrose, 1 mm EGTA, 20 mm HEPES,pH 7.5,蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂混合物)。除去核级分和组织碎片后,通过以4000×离心收集粗线粒体级分 g 20分钟。然后将所得颗粒重悬于分离缓冲液中的19%Percoll溶液,并分别在预先形成的不连续的偏振梯度,30和60%(v / v)上缓慢分层。 15分钟内离心10,000×后 g,在两层的界面处检索纯化的线粒体。所有程序均在4°C下进行。共制备九项生物学重复并独立检查。 ETD分析了四种独立的生物重复,每种生物重复三种技术复制。通过CID分析五种独立的生物重复,每个技术复制一次。如前所述验证了每种制剂的纯度以及结构/功能完整性(
      • 张继夫
      • liem d.a.
      • 穆勒M.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • 邓恩。
      • Vondriska下午
      • 韩格P.
      • 劳动o.
      • Maclellan W.R.
      • 本田H.
      • Weiss J.N.
      • APWEILER R.
      • ping p.
      在应力条件下改变了心肌细胞的蛋白质组生物学。
      )。

       线粒体电子传输链(ETC)活性测定

      为了检查磷酸化的功能后果,我们使心脏线粒体进行钙载荷,并表征磷酸化对等复杂活性的影响。通过施加三种不同的磷酸酶抑制剂来调节磷酸化:Fenvalate(主要针对PP2B家族),钙霉素A(主要针对PP2A和PP1)和冈卡酸(主要针对PP2A和PP1)。在反应缓冲液中重新悬浮新鲜分离的线粒体(100μg)(120米m KCl, 10 mm HEPES, pH 7.4, 2.5 mm 磷酸钾,5米m glutamate, 5 mm malate, 0.1 mm ADP, 2.5 mm MgCl2和0.5mg / ml BSA),随后用Ca处理5分钟2+ 浓度为40μmm 在环境温度下。在并行组中,线粒体用CA处理2+ 在磷酸酶抑制剂抑制剂(100 nm),Calyculin A(40 nm)或冈田酸(300 nm)。随后,用低渗缓冲液裂解线粒体(5米m Tris-HCl,pH 7.4)然后进行生化测定。
      等等复合物I(CI)和III(CIII)的特定活性以96孔微孔板格式测量(
      • Wittig I.
      • 布劳恩H.P.
      • SchäggerH.
      蓝色本机页面。
      ,
      • Zerbetto E.
      • Vergani L.
      • 达比比伊萨拉F.
      蓝地聚丙烯酰胺凝胶组织化学染色的肌肉线粒体氧化磷酸化酶的定量。
      )。简而言之,通过将100μl线粒体裂解物(15μg蛋白)与100μlCI测定缓冲液混合(5μm)来引发CI活性测定(5米m Tris-HCl,pH 7.4,0.2mg / ml Nadh,2.0 / ml硝基蓝四唑鎓,2米m KCN, and 2 μm 抗霉素A)。测定在环境温度和CI抑制剂(10μm 二苯内碘鎓) - 加长组用作阴性对照,以确定样品的抑制剂不敏感背景活动。分光块监测595nm处的吸光度。类似地,通过将​​线粒体裂解物(20μg蛋白质)与CIII测定缓冲液混合(50μm,通过混合线粒体裂解物(20μg蛋白)来引发CIII活性测定(50米m 磷酸钠,pH7.2,50μm 细胞色素 c,0.1%BSA,2米m KCN和1μg/ ml旋转龙龙酮)和100μm 新鲜降低的癸基醌(DBH2)。 CIII特异性抑制剂抗霉素A(2μm)应用于阴性对照组。将CIII活性在550nm处谱分析。

       制备性SDS-PAGE和凝胶消化

      纯化的心脏线粒体裂解0.5% N-DodeCylβ-d - 在冰上分离缓冲液中的摩尔苷。以13,000×离心后 g 对于30分钟,从上清液中收集线粒体蛋白,然后与Laemmli样品缓冲液孵育30分钟。变性蛋白质由12.5%SDS-PAGE分解(
      • raemmli u.k.
      在噬菌体T4头部组装过程中裂解结构蛋白。
      )。随后,将凝胶固定并用胶体Coomassie蓝色染色。每个车道都切除了总共21片凝胶切片。
      凝胶切片用25%乙腈(ACN)在50米中脱颖而出m 碳酸氢铵(AMBC)。用DTT依次减少蛋白质并用碘乙酰胺烷基化。用胰蛋白酶(1:100的胰蛋白酶比例,进行部分凝胶消化(用于ETD) 相对 protein in 50 mm AMBC,pH 8.0)在37℃下3小时。对于CID分析,将蛋白质在37℃下消化过夜(1:50的胰蛋白酶比例 相对 蛋白质)。从凝胶切片中萃取肽,其中50%ACN和0.1%TFA,然后仅用ACN萃取。

       磷酸富集

      将干燥的肽用100μl50%ACN重构0.1%TFA(v / v)。使用TiO富集磷肽2 如前所述的单调(
      • Pinkse M.W.
      • Uitto下午
      • hilhorst m.j.
      • OOM B.
      • Heck A.J.
      使用2D-Nanolc-ESI-MS / MS和氧化钛预训柱的蛋白水解消化的雌性磷酸磷肽的Femtomole水平的选择性分离。
      )。简而言之,TIO2 用三种解决方案顺序平衡单调:溶液1,50米m AMBC含有25%ACN;溶液2,50%ACN溶液,含有5%TFA(v / v);和溶液3,50%ACN溶液,含0.1%TFA(v / v)。随后,用50重复将肽装载到尖端上,然后用100μl50%ACN搅拌10个循环,含有0.1%TFA(v / v)。最后,用三次缓冲液依次洗脱富集的磷酸酯:缓冲液1,100μl含有5%TFA(v / v)的50%ACN;缓冲2,50米 m AMBC补充有25%ACN(pH1.1.5);和缓冲液3,1%氨水溶液。干燥所有洗脱的级分并进行质谱分析。

       LC-MS / MS操作

      在CID模式(LTQ-orbitrap)和ETD模式(LTQ-XL-ETD)中并联分析富集的磷酸肽。在预先包装的picofrit柱上实现了在线肽分离(生物缺卵C.18,75μm×10cm,5μm,300埃;新目标)。色谱法的流速设定为5μL/ min,用于分离(缓冲液A,0.1%甲酸和2%ACN;缓冲液B,0.1%甲酸和80%ACN)。将分辨梯度设定如下:5-40%缓冲液B超过90分钟至100%缓冲B超过10分钟,保持在100%10分钟,然后返回0%缓冲液B.质谱仪在a中操作数据相关的采集模式(
      • 好D.M.
      • Wirtala M.
      • Mcalister G.C.
      • Coon J.J.
      电子传递解离质谱的性能特征。
      );一个完整的MS扫描后跟五个MS2扫描。在三种并行技术复制中分析了每个生物样品。在ETD模式下,默认的前驱电荷状态设置为5+。 Fluoranthene的自动增益控制设定为4×105,将离子/离子反应时间设定为100ms。在CID模式下,LTQ-orbitrap在数据相关模式下操作,而不使用FT模块来确保分析的灵敏度和占空比。当中性损耗峰值为98,49或32.7时,自动触发MS3扫描 m / z. 在MS2光谱中的前10个最强烈的峰值内检测到。

       数据库搜索和数据分析

      对于ETD和CID分析,BioWorks 3.3.1用于.dta文件生成。将最小的离子阈值设定为10,强度阈值为1000,前体耐受性为1.4 Amu,质量范围为400-4500Da。
      使用开放质谱搜索算法(OMSSA)(版本2.2.1)搜索ETD光谱
      • Chi A.
      • HUTTENHOWER C.
      • geer l.y.
      • Coon J.J.
      • Syka J.E.
      • 白D.L.
      • Shabanowitz J.
      • Burke D.J.
      • troyanskaya o.g.
      • 狩猎d.f.
      电子转移离解(ETD)质谱法分析酿酒酵母酿酒酵母蛋白磷酸化位点。
      )。设置了以下搜索参数:部分酶消化(胰蛋白酶)允许三个错过的裂缝;固定修饰半胱氨酸羧酰胺甲酰化(+ 57 da);甲硫氨酸氧化(+ 16DA)和丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸磷酸化(+80A)的动态修饰。前体充电状态设定在1+和6+之间。前体离子质量耐受设定为±1.5 da;产品离子容差设定为±0.5 da。滤波器阈值(E值)的截止值被设定为优于0.1,然后用以下标准进行肽光谱进行手动检查:标准1,通过产生的特征前体信号确认前体的电荷状态用电荷剥离(
      • 莫里娜H.
      • 喇叭d.m.
      • 唐ñ。
      • Mathivanan S.
      • Pandey A.
      磷酸肽的全局蛋白质组学分析使用电子转移解离串联质谱法。
      );和标准2,质谱与从蛋白质新滴压器获得的理论片段化曲线一致(
      • 克劳瑟K.R.
      • 贝克P.
      • 伯灵名A.L.
      准确质量测量(+/- 10 ppm)在蛋白质识别策略中的作用,采用MS或MS / MS和数据库搜索。
      )。
      c MS2和MS3光谱与续集算法(BioWorks 3.3.1)一起搜索国际蛋白质指数鼠标数据库(版本3.34)。对于MS2光谱,设定了以下参数:部分酶消化,允许两个错过的裂解;固定修饰半胱氨酸羧酰胺甲酰化(+ 57 da);甲硫氨酸氧化(+ 16DA)和丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸磷酸化(+80A)的可变改性。对于MS3光谱,搜索参数与MS2的搜索参数相同,除了丝氨酸和苏氨酸水损失(-18Da)。将滤波器阈值的截止值设置为通过互相关的显着阈值 相对 charge state: Xcorr > 1.9 (z = 1+), 2.5 (z = 2+), and 3.0 (z = 3+) (
      • Contin G.T.
      • venable J.D.
      • Cociorva D.
      • yates 3rd,J.R.
      肿瘤坏死因子途径的定量磷蛋白蛋白酶分析。
      )。在所有潜在的磷酸肽上进行手动检查,以去除误报。实施了ETD和CID分析的这两步筛选过程,以最大限度地减少特定搜索引擎的偏差以及提高识别的置信度。

       功能注释

      借助于建立的生物信息工具进行了功能注释。使用G:Profiler进行基因本体(GO)注释(http://biit.cs.ut.ee/gprofiler/)(
      • Reimand J.
      • kull m.
      • 彼得森H.
      • 汉森J.
      • vilo J.
      G:Profiler-A基于Web的基因工具集,用于大规模实验的基因列表功能分析。
      )。首先过滤对应于所鉴定的磷蛋白的GO术语 p value threshold of <0.05使用超距测试。对于多个GO术语测试, p 用本杰里尼 - Hochberg算法调整值。不与GO术语通过G:分析器联系的磷蛋白使用以下知识库来手动注释:基因本体注释数据库(http://www.ebi.ac.uk/GOA/)(
      • Camon E.
      • Magrane M.
      • 巴克尔D.
      • 李五。
      • 调光e.
      • Maslen J.
      • Binns D.
      • Harte N.
      • Lopez R.
      • APWEILER R.
      基因本体注释(GOA)数据库:使用基因本体分享UNIPROT中的知识。
      ),Uniprot知识库(www.uniport.org.)(
      • 吴C.H.
      • APWEILER R.
      • Bairoch A.
      • Natale D.A.
      • Barker W.C.
      • Boeckmann B.
      • 菲罗斯
      • Gasteiger E.
      • 黄鹤
      • Lopez R.
      • Magrane M.
      • 马丁M.J.
      • Mazumder R.
      • O'Donovan C.
      • redaschi n。
      • Suzek B.
      通用蛋白质资源(UNIPROT):蛋白质信息的扩展宇宙。
      ),并找到数据库(www.scivee.tv/node/1413)(
      • 百婚酸科。
      • Haugk K.H.
      • 春天的C.C.
      • 尼尔森第3升
      • Tennant M.K.
      • 张Y.
      • Oberley L.W.
      • 钟W.
      • Drivdahl R.
      • oberley t.d.
      增加锰超氧化物歧化酶(SOD-2)是通过MAC25 /胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白-1的前列腺肿瘤抑制机制的一部分。
      )。

      结果

      在这项研究中,我们进行了系统的调查,以表征心脏中的线粒体磷酸磷蛋白酶总而言之 补充图。S1。我们合并TiO.2 亲和层析和ETD和CID质谱法的互补优点。我们的实验战略概述了 补充图S2。在203种独特的肽中鉴定了236个磷酸化位点,其被映射到181个线粒体蛋白。此外,显示磷酸化治理心脏线粒体功能(补充表S1)。借助生物信息学算法,在线粒体途径的背景下系统地描绘了线粒体磷蛋白酶。

       小鼠心脏线粒体多样性途径新磷酸化事件的鉴定

      在236内鉴定的磷酸化位点,先前未通过小鼠的研究报告210,并且以前未在哺乳动物中报告202。在该数据集中,仅小部分相对较低:在相应肽的末端捕获三个磷酸化位点,并且六种磷肽光谱可归因于同一肽内的两个替代位点的磷酸化(补充表S2)。与心脏线粒体代谢的主要调节作用一致,心脏线粒体中的大部分磷酸化事件位于代谢途径。
      在线粒体等中,在泛素醇 - 细胞色素中鉴定了一种新型磷酸化位点(丝氨酸212) c 还原酶核心蛋白1(QCR1),ETC Complex III的亚基(Fig. 1A)。有限胰蛋白酶消化和ETD技术的组合对这种鉴定至关重要。磷酸化的丝氨酸212残基在精氨酸残基的簇中编码。完整的胰蛋白酶消化将使丝氨酸212限制成不适合于LC-MS / MS分析的短肽。 QCR1是11-MER等复杂III内的两个核心亚基之一。迄今为止,肝脏线粒体中唯一报告的QCR1后翻译后修饰形式是乙酰化(
      • 金S.C.
      • SP. rung R.
      • 陈Y.
      • 徐Y.
      • 球H.
      • PEI J.
      • 诚龙
      • Kho Y.
      • 肖H.
      • 肖L.
      • 格兰顿N.V.
      • 白云
      • 杨X.J.
      • 赵玉。
      蛋白质组学调查显示的赖氨酸乙酰化的基材和功能多样性。
      )。这种磷酸化事件的捕获揭示了一种新的调节机制,调整等等复合物的吞吐量。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1鉴定心肌细胞粒细胞多样性途径的新型磷酸化事件。 A,Ubiquinol-cycochrome的质谱 c 还原酶核心蛋白1,在线粒体电子传输链中复合III的亚基。肽在丝氨酸残基212磷酸化(SP. )如ETD分析所检测到。 B,是线粒体中的基本能量代谢蛋白的肌酸激酶通过CID分析显示在丝氨酸319中磷酸化。在MS2光谱中观察到强的中性损耗信号(最佳)。分离具有磷酸盐中性损失的肽前体,并进一步表征MS 3(底部)。 C,通过ETD鉴定了氧杂物脱氢酶,是线粒体三羧酸循环的重要组成部分(最佳cid(底部)在苏氨酸残基502处磷酸化。
      用CID,在线粒体肌酸激酶的丝氨酸319鉴定磷酸化部位(Fig. 1B),证实最近在猪心脏的该监管部位的报告(
      • Boja E.S.
      • 菲利普斯D.
      • 法国S.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      具有高能量碰撞解离的LTQ-壁毯上的定量线粒体磷蛋白酶。
      )。在其MS2光谱中观察到磷酸盐基团的特征中性损失,其中肽片段表明丝氨酸319作为改性位点。 MS3光谱证实了该指示。在心肌细胞中,磷酸胆碱和ATP之间的平衡用作瞬时适应对能量需求波动的基本分子基础。在压力条件下,保存能量的水平决定了生命或死亡。因此,肌酸激酶的功能不仅会影响整体心脏稳态,而且影响心脏病的发病机制。除了丝氨酸319,使用ETD在肌酸激酶的丝氨酸343中鉴定另一个调节部位(补充图。S3,频谱41和光谱42)。
      三羧酸(TCA)循环是能量代谢和代谢物生物合成的基础。在该功能模块内的酶阵列中,Okoglutarate脱氢酶用作关键调节毂。已经报道了几种平行的功能调节机制,包括底物抑制(
      • Rokutan K.
      • 卡威克。
      • 亚达克。
      其基质和叔丁基氢过氧化钛肝线粒体在大鼠肝线粒体中的灭活。
      )和氧化后翻译后修改(
      • Applegate M.A.
      • Humphries K.M.
      • szweda l.i.
      过氧化氢的α-酮戊酸脱氢酶的可逆抑制:谷胱甘肽和硫辛酸保护。
      )。其他研究人员的先驱研究捕获了具有特异性亲和探针的磷酸化形式的氧化或脱氢酶(
      • Boja E.S.
      • 菲利普斯D.
      • 法国S.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      具有高能量碰撞解离的LTQ-壁毯上的定量线粒体磷蛋白酶。
      ,
      • 料斗r.k.
      • 卡罗尔S.
      • Aponte上午
      • 约翰逊D.T.
      • 法国S.
      • 沉R.F.
      • Witzmann F.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      线粒体基质磷酸酯:额外线粒体钙的影响。
      )。在这项研究中,通过ETD和CID将新的磷酸化位点定位于鼠心肌细胞粒细胞中的苏氨酸502(Fig. 1C)。

       可逆磷酸化调节的心脏线粒体功能

      钙是心脏细胞功能的母细胞稳压因子,在心脏收缩函数中发挥着重要作用以及心能代谢中的不可或缺的作用。自由钙对线粒体代谢途径的功能影响已反复记录(
      • 料斗r.k.
      • 卡罗尔S.
      • Aponte上午
      • 约翰逊D.T.
      • 法国S.
      • 沉R.F.
      • Witzmann F.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      线粒体基质磷酸酯:额外线粒体钙的影响。
      ,
      • Cortassa S.
      • AON M.A.
      • MarbánE.
      • winslow r.l.
      • O'Rourke B.
      心脏线粒体能量代谢与钙动力学的综合模型。
      ,
      • 特拉姆j.
      • Papageorgiou I.
      • Rosenblatt-Velin N.
      • Lerch R.
      钙介导的丙酮酸脱氢酶在严重受伤的外部血肿心肌中的活化。
      )。据报道,少数线粒体激酶和磷酸酶的效力是钙依赖性的,包括丙酮酸脱氢酶磷酸酶和蛋白激酶C(
      • 料斗r.k.
      • 卡罗尔S.
      • Aponte上午
      • 约翰逊D.T.
      • 法国S.
      • 沉R.F.
      • Witzmann F.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      线粒体基质磷酸酯:额外线粒体钙的影响。
      )。钙也是等等复合物的主要调节因子,这对于心脏线粒体中的氧化磷酸化和ROS产生至关重要。为了检查磷酸化和线粒体函数之间的分子链,我们确定钙调控对等等复合物I和复合III的活性的影响,使用磷酸酶抑制剂。
      钙载荷显着降低了等综合体的活性I〜30%(Fig. 2A)。三种不同的磷酸酶抑制剂,芬太化,钙霉素A和冈田酸,用于评估磷酸化对调节等功能的影响。所有三种磷酸酶抑制剂足以反转钙诱导的络合物抑制络合物I活性(Fig. 2A)。在平行实验中,钙载荷显着减弱等等综合III活性。有趣的是,钙受损的综合体III活性通过芬太利的治疗恢复,而钙霉素A和冈田酸有边缘影响(Fig. 2B)。连胜,三种磷酸酶抑制剂观察到的集体效应表明,在该过程中涉及多个激酶和磷酸酶,证明磷酸化作为固定分子机制以调节线粒体等功能。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2磷酸化在通过钙载荷诱导的线粒体复合体I和III活性下调下发挥重要作用。 线粒体复合体I(A)和III(B)通过钙处理抑制的活动(40μm)。复合物I活性的钙敏感抑制与三种磷酸酶抑制剂,氟戊酸酶抑制剂,戊戊酸,钙霉素A和冈卡酸相比,对络合物I活性逆转。钙敏感抑制络合物III的钙敏化抑制由Fenvalerate逆转,而Calyculin A和冈田酸显示出边际效应。 *, p < 0.05 相对 控制+车辆组; #, p < 0.05 相对 钙+载体组; n 每组= 6。误差栏代表标准偏差。

       将监管位点映射到主要线粒体途径中

      根据这项研究贡献的线粒体磷蛋白酶组数据集,存在许多关键线粒体途径的调节位点;将这些磷酸化事件映射到主要线粒体途径将促进蛋白质组学数据与生物学功能的整合,从而提供对鉴定的磷酸肽的潜在功能相关性的解释。新陈代谢是线粒体功能的重要因素;该功能类别包括鉴定的最多磷酸化位点。因此,致力于对每个代谢途径中鉴定的调控位点进行努力( Fig. 3A)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3在不同的线粒体途径中描绘磷酸化事件的工作方案。 A,许多调节部位都参与了代谢和运输的主要线粒体途径。通过组合ETD和CID技术,可以分别确定总共18和10个磷酸化位点,分别从TCA循环和等等复合物。还鉴定了另外12,2和一个磷酸化位点,分别用于脂肪酸代谢,肌酸激酶和尿素循环。在Ant中鉴定了许多额外的磷酸化位点(
      • 张继夫
      • 李X.
      • 穆勒M.
      • 王Y.
      • 宗C.
      • 邓恩。
      • Vondriska下午
      • liem d.a.
      • 杨杰..
      • 韩格P.
      • 本田H.
      • Weiss J.N.
      • APWEILER R.
      • ping p.
      用功能验证的心肌细胞进行鼠线粒体蛋白质的系统特征。
      ),烟酰胺核苷酸转氢酶(NNT.)(
      • 约翰逊D.T.
      • 哈里斯r.a.
      • 布莱尔P.V.
      • Balaban R.S.
      线粒体蛋白质组异质性的功能后果。
      )和电压依赖的阴离子通道(vdac.)(
      • 约翰逊D.T.
      • 哈里斯r.a.
      • 布莱尔P.V.
      • Balaban R.S.
      线粒体蛋白质组异质性的功能后果。
      ),这是参与运输的主要调节蛋白。参与ETC复合物和TCA循环的鉴定的磷蛋白在 BC, 分别。显示了鉴定的磷蛋白和鉴定的磷酸化位点的数量。括号中显示的数字表示为列出的蛋白质鉴定的磷酸化位点的数量。 MTCK.,线粒体肌酸激酶。
      在复合物中鉴定了总共10位的磷酸化位点,其中包含四种复合物I,两种复合物III,以及复杂V中的四个(Fig. 3B)。腺嘌呤核苷酸易位剂(蚂蚁)介导ADP和ATP交换,穿过线粒体膜;该蛋白质也被认为对线粒体渗透率过渡至关重要(
      • 墨菲E.
      • Steenbergen C.
      预处理:线粒体连接。
      )。蚂蚁磷酸化的生物学意义先前通过定点诱变评估(
      • 冯J.
      • 朱M.
      • Schaub M.C.
      • Gehrig P.
      • Roschitzki B.
      • Lucchinetti E.
      • Zaugg M.
      异氟醚保护心肌磷蛋白酶体分析线粒体:TYR194对腺嘌呤核苷酸转移剂-1的磷酸化调节线粒体功能。
      )。在这项研究中,我们确定了五个磷酸化位点,其中一个是新的(补充表S1)。烟酰胺核苷酸转氢酶,内部线粒体膜蛋白,催化NADH和NADPH的转化并影响质子渗透性。 NADPH脱氢酶NADPH的新陈代谢是心肌细胞中ROS生产的另一个重要来源。通过ETD和CID在烟酰胺核苷酸转氢酶中鉴定了一种新的磷酸化位点(补充图。S3,Spectrum 12和Spectrum 13)。健康心脏的主要能量基质是脂肪酸。在脂肪酸代谢途径中鉴定了总共九个磷酸化位点,并在脂肪酸转运液中鉴定了另外的三个磷酸化位点。
      三羧酸周期界面碳水化合物代谢和脂肪酸代谢以及能量代谢和生物发生。可以说,它代表了线粒体生物学的最多境内。在该研究中,在十二羧酸循环中鉴定了总共18位的磷酸化位点,其中15种是新的(Fig. 3C)。此外,发现这些新颖的鉴定的子集以已知通过磷酸化调节(
      • 料斗r.k.
      • 卡罗尔S.
      • Aponte上午
      • 约翰逊D.T.
      • 法国S.
      • 沉R.F.
      • Witzmann F.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      线粒体基质磷酸酯:额外线粒体钙的影响。
      )。

       ETD.和CID互补的心脏线粒体磷酸化的表征

      ETD.和CID片段磷酸肽通过不同的机制,从而表现出对独特肽的明显偏好。在这项研究中,组合ETD和CID的优点以最大化线粒体磷蛋白酶的覆盖率。精心实施两相验证程序,以确保通过ETD或CID对磷酸化鉴定的置信度。在第一阶段,通过使用序列反转数据库通过诱饵搜索进行假阳性率(FPR)的计算。对于ETD数据分析,OMSSA算法分配的电子值被绘制在FPR水平(Fig. 4A),而对于CID数据分析,由续集算法分配的XCorr值被绘制针对FPR(Fig. 4B)。第一阶段的统计阈值设定为置信水平,不小于90%。验证程序的第二阶段涉及借助蛋白质的辅助手动频谱检查(
      • 克劳瑟K.R.
      • 贝克P.
      • 伯灵名A.L.
      准确质量测量(+/- 10 ppm)在蛋白质识别策略中的作用,采用MS或MS / MS和数据库搜索。
      )。从第一阶段的大约50%的初始候选者存活第二阶段,并在最终数据集中报告(补充表S1)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4用两种碎裂,即ETD和CID进行鼠线粒体磷酸酯组的特征。 A,图表显示了基于ETD的识别和从omssa获得的e值之间的置信水平之间的相关性。 E值被表示为日志10。通过针对序列反转的诱饵数据库搜索所有光谱来检查置信水平。 B,绘图检查基于CID的识别与三个不同电荷状态的Xcorr值之间的相关性(z = 1+, z = 2+,和 z = 3+)。使用诱饵数据库以与ETD分析类似的方式审查置信水平。 C,来自ETD分析的鉴定的磷酸肽和磷酸化位点的累积数量绘制了我们的生物重复数。在使用四种生物重复后,观察到磷酸肽和磷酸化位点的鉴定没有显着增加。 D,绘制的识别数量的识别数符合CID分析的生物学重复的数量。使用五种生物重复后,未观察到鉴定的显着增加。 E,饼图通过ETD和CID表示线粒体磷酸化位点的互补鉴定。每个碎裂过程在肽测序中具有明显的偏好,强调了我们的组合方法来增加线粒体磷酸化位点的鉴定。 F,图表强调在本研究中鉴定的线粒体磷脂蛋白酶组数据集中的显着膨胀。 210磷酸化位点和82磷蛋白是新的鉴定。
      包含充分的生物学和技术复制是克服各种生物样品和分析抽样不足的重要策略。针对所识别的每种磷酸化位点绘制重复的数量(补充表S3)。我们ETD平台的能力饱和四次重复(Fig. 4C),而CID平台的鉴定高原有五次重复达到(Fig. 4D)。 ETD和CID的互补强度是明显的:191通过ETD获得鉴定,通过CID获得51个,具有六个共享识别(Fig. 4E)。在本研究中确定的236位磷酸化位点,先前报道了26个位点,并且210个位点是新的识别(Fig. 4F),这证明了该技术平台的独特特异性和能力。提供了完整的鉴定磷酸肽及其相应的质谱列表 补充表S1补充图S3, 分别。将这些磷酸化位点映射到181个磷蛋白,其中82个是新发现。
      概述了ETD和CID数据集的不同特征 Fig. 5。 ETD鉴定的超过98%的磷酸肽具有3+或更高的电荷状态(Fig. 5A)。 ETD对多元充电(⩾3+)肽的偏好是已知的,而电荷剥离效果可以支配用于双电荷肽的碎片动力学。为了最大限度地提高基于ETD的鉴定的效率,使用有限的胰蛋白酶消化来改善繁殖肽的产率。这种程序提供了额外的优点。一系列激酶,包括蛋白激酶A(PKA)和PKC,在底物共识术中的背景下,有利于精氨酸或赖氨酸(
      • Pearson R.B.
      • Kemp B.E.
      蛋白激酶磷酸化位点序列和共有特异性基序:表格。
      )。完整的胰蛋白酶消化可以将这些共有型基序置于非常短的肽,损害其对质谱法的检测灵敏度和特异性。 QCR1中的Serine 212已经证明了这种情况( Fig. 1A)。另一方面,CID在其双重电荷状态下鉴定了69%的磷酸肽,其三个充电状态下31%(Fig. 5B)。因此,ETD鉴定的磷酸肽的总质量与CID鉴定的磷酸肽的比率显着低于CID(Fig. 5, CD)。在散射图中,清楚地说明了这种区别(Fig. 5E)。 CID或ETD测序的独特特征支持了线粒体磷蛋白酶的互补鉴定,如图所示 Fig. 4E补充表S1.
      图缩略图GR5.
      Fig. 5该调查中ETD / CID的性能特征。 A,根据ETD分析的不同电荷状态,描绘了我们鉴定的磷酸肽的百分比的饼图。 ETD对于3+充电状态更好。 B,饼图描绘根据不同电荷态的鉴定磷酸肽的百分比进行CID分析。正如预期的那样,CID更好地表现出双重带电前体。 C,条形图描绘了作为前体的函数的鉴定磷酸肽的数量 m / z. 对于ETD分析。可以看出,ETD对前体进行更好的 m / z. 600或更少。 D,条形图描绘了作为前体的函数的鉴定磷酸肽的数量 m / z. 用于CID分析。可以看出,CID对前体进行更好的 m / z. 600或更多。 E,散点图比较前体的分布 m / z. 通过ETD和CID分析鉴定的磷酸肽。

       心脏线粒体磷蛋白酶组的功能注释和聚类

      进行了所识别的线粒体磷蛋白的系统功能作用,以使磷蛋白在其生物学功能的背景下对准(Fig. 6A)。新陈代谢和氧化磷酸化在一起代表了最大的功能类别,与线粒体对能量产生的基本贡献一致。转运蛋白和蛋白质结合/折叠是下一个最大的官能团。此外,加入第二尺寸以以“热图”(含量)的形式抵抗这些磷蛋白的主要细胞住院的这些功能类别(Fig. 6B)。表面上,大部分线粒体磷蛋白具有多于一个亚细胞命运。这种现象的生物学意义仍有待辨别。多人蛋白质的一种可能效用是支持线粒体蛋白质贩运和与其他细胞器的沟通。提供了更详细的鉴定的线粒体磷蛋白的功能诠释 补充表S2.
      图缩略图GR6.
      Fig. 6鉴定的线粒体磷蛋白的功能注释。 A,显示基于其蛋白质功能的181鉴定的磷蛋白的功能注释的饼图。在181个注释的磷蛋白中,38涉及临界代谢机制,这对于健康的心脏线粒体至关重要,包括TCA循环,脂肪酸输送/氧化和核酸代谢。 B,鉴定的磷蛋白为其细胞位置注释(水平的)它们的蛋白质功能(垂直的)以热图的形式。列出了每个功能类别内的线粒体磷蛋白的数量 括弧。呃,内质网。
      磷酸肽基序的序列共识反映了线粒体蛋白的激酶特异性调节以及相应激酶的同一性。共识主题列表在Netphosk中存档(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhosK/)(
      • Blom N.
      • Sicheritz-PonténT.
      • Gupta R.
      • Gammettoft S.
      • 布鲁纳克斯。
      从氨基酸序列的翻译后糖基化和蛋白质磷酸化的预测。
      )和人类蛋白质参考数据库(http://www.hprd.org/)(
      • Keshava Prasad T.S.
      • Goel R.
      • Kandasamy K.
      • Keerthikumar S.
      • Kumar S.
      • Mathivanan S.
      • Telikicherla D.
      • Raju R.
      • Shafreen B.
      • venumopal a。
      • Balakrishnan L.
      • Marimuthu A.
      • Banerjee S.
      • SOMANATHAN D.S.
      • 塞巴斯蒂安A.
      • rani s.
      • 雷斯
      • 哈里凯尔C.J.
      • Kanth S.
      • 艾哈迈德M.
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      • 莫霍族r.
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      • 莫汉S.
      • ranganathan p.
      • Ramabadran S.
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      • Pandey A.
      人类蛋白质参考数据库-2009更新。
      ),包括几种已知的线粒体激酶, 例如 丙酮酸脱氢酶激酶和氧化氟化酸脱氢酶激酶,以及预先监测线粒体位置的激酶, 例如 PKA,SRC激酶和糖原合成酶激酶3(GSK3)(
      • Das S.
      • 黄R.
      • Rajapakse N.
      • 墨菲E.
      • Steenbergen C.
      糖原合成酶激酶3抑制减缓线粒体腺嘌呤核苷酸输送并调节电压依赖性阴离子通道磷酸化。
      )(补充表S4)。实际上,总共29种磷酸肽与已知的线粒体住宅共有八个激酶的共分衬底主题(表I.)(
      • Boja E.S.
      • 菲利普斯D.
      • 法国S.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      具有高能量碰撞解离的LTQ-壁毯上的定量线粒体磷蛋白酶。
      ,
      • 李杰。
      • 徐Y.
      • 陈Y.
      • SP. rung R.
      • 金S.C.
      • 谢S.
      • 赵玉。
      通过改进的IMAC方法和MS / MS / MS揭示的线粒体磷酸酯。
      ,
      • 冯J.
      • 朱M.
      • Schaub M.C.
      • Gehrig P.
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      异氟醚保护心肌磷蛋白酶体分析线粒体:TYR194对腺嘌呤核苷酸转移剂-1的磷酸化调节线粒体功能。
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      • 戴J.
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      • 盛Q.H.
      • Shieh C.H.
      • 吴j.r.
      • 曾R.
      云阳多维液相色谱(银阳MDLC)质谱法蛋白质磷酸化和表达谱。
      ,
      • VillénJ.
      • Beausoleil S.A.
      • 格柏S.A.
      • Gygi S.P.
      小鼠肝的大规模磷酸化分析。
      ,
      • 李H.
      • xing x.
      • 丁G.
      • 李问:
      • 王C.
      • 谢L.
      • 曾R.
      • 李Y.
      SYSPTM:用于翻译后修改的蛋白质组学研究的系统资源。
      ,
      • 锅C.
      • GNAD F.
      • 奥尔森J.V.
      小鼠肝细胞系的定量磷脂蛋白酶体分析显示出磷酸酶抑制剂的特异性。
      ,
      • 穆罕默德下午
      • Oceandy D.
      • Prehar S.
      • alatwi n。
      • 哈格巴夫
      • baudoin f.m.
      • 纠察岛
      • zaki a.o.
      • Nadif R.
      • 咖啡架e.j.
      • Neyses L.
      神经元硝基氧化物合成酶在调节心肌中β-肾上腺素能信号的血浆膜钙泵时的特异性作用。
      )。由于尚未获得了对线粒体激酶的全部库存,提供了全面的分析 补充表S4 有29个共识匹配。
      表I.八个代表性衬底激酶基序与本研究中鉴定的磷肽匹配
      激酶和磷蛋白磷酸肽序列功能女士/女士参考。
      丙酮酸脱氢酶激酶
          丙酮酸脱氢酶E1-αyhghsmsdpgvsyr.TCA周期ETD.
      • 李杰。
      • 徐Y.
      • 陈Y.
      • SP. rung R.
      • 金S.C.
      • 谢S.
      • 赵玉。
      通过改进的IMAC方法和MS / MS / MS揭示的线粒体磷酸酯。
      ,
      • 冯J.
      • 朱M.
      • Schaub M.C.
      • Gehrig P.
      • Roschitzki B.
      • Lucchinetti E.
      • Zaugg M.
      异氟醚保护心肌磷蛋白酶体分析线粒体:TYR194对腺嘌呤核苷酸转移剂-1的磷酸化调节线粒体功能。
          Ubiquinol-cytochrome c 还原酶核心蛋白1rlsrtdltdylnr.等等Compled IIIETD.
          Netrin受体UNC5B.ICSSLDAPNSRGNDWR.凋亡ETD.
          RAS相关蛋白质RAB-3Bmasvtdgktgik.运输ETD.
          锌指蛋白811eilrnvvsigdirk. 转录ETD.
          微管相关蛋白6Asgaderdtrr.捆绑ETD.
          假设的ATP / GTP结合位点基质A(p环) - 含蛋白质rqgsdvdvlk.捆绑ETD.
      SRC激酶
          丙酮酸脱氢酶E1-αKggcak​​gkggsmhmygk.TCA周期ETD.
          泛酸激酶1lvkdiyggdyer.生物合成ETD.
          Cytosol氨肽酶mtkglvlgiyakdk.蛋白水解ETD.
          Aginase-2,线粒体nydiqyfsmr.尿素周期ETD.
          甲基甘油基-CoA异种gydsdnprvrgdvg.TCA周期c
          酶原颗粒膜蛋白16Tssysgeyggkggkr.其他ETD.
      SRC系列激酶
          黄酮醛结合蛋白1lqypelfdslsmealr.运输ETD.
          跨膜通道样蛋白2ltvsdmlvtyltilvgdfl.其他c
      支链α-酮酸脱氢酶
          2-氧代亚芳脱氢酶亚单位α,线粒体ighhstsddssayrsvdevnywdkqdhpisr.代谢ETD.
      • 李杰。
      • 徐Y.
      • 陈Y.
      • SP. rung R.
      • 金S.C.
      • 谢S.
      • 赵玉。
      通过改进的IMAC方法和MS / MS / MS揭示的线粒体磷酸酯。
      ,
      • 冯J.
      • 朱M.
      • Schaub M.C.
      • Gehrig P.
      • Roschitzki B.
      • Lucchinetti E.
      • Zaugg M.
      异氟醚保护心肌磷蛋白酶体分析线粒体:TYR194对腺嘌呤核苷酸转移剂-1的磷酸化调节线粒体功能。
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      • 戴J.
      • 金w.h.
      • 盛Q.H.
      • Shieh C.H.
      • 吴j.r.
      • 曾R.
      云阳多维液相色谱(银阳MDLC)质谱法蛋白质磷酸化和表达谱。
      ,
      • VillénJ.
      • Beausoleil S.A.
      • 格柏S.A.
      • Gygi S.P.
      小鼠肝的大规模磷酸化分析。
      GSK3,ERK1,ERK2,CDK5
          丙酮酸脱氢酶复合物的二氢甲酰基 - 残余物乙酰转移酶组分EGPGAPCGSPR.TCA周期ETD.
          载脂蛋白B100受体aegsitpometegllr.新陈代谢,运输ETD.
          40 S核糖体蛋白S20 rlidlhspseivk.RNA装订ETD.
          Junctophilin-2glgtglperprespkher.蛋白质结合ETD.
          Fyve和卷线圈域域1AEKGEKTPPDTELHQEPVPADLVLK.运输ETD.
      • VillénJ.
      • Beausoleil S.A.
      • 格柏S.A.
      • Gygi S.P.
      小鼠肝的大规模磷酸化分析。
          Bcl-2样13蛋白Aektsptpsvfvelgeeeleavtarpeaver凋亡ETD.
      • 李杰。
      • 徐Y.
      • 陈Y.
      • SP. rung R.
      • 金S.C.
      • 谢S.
      • 赵玉。
      通过改进的IMAC方法和MS / MS / MS揭示的线粒体磷酸酯。
          磁盘大相关蛋白5Elgnihetsqdlspek.信令ETD.
      • 李H.
      • xing x.
      • 丁G.
      • 李问:
      • 王C.
      • 谢L.
      • 曾R.
      • 李Y.
      SYSPTM:用于翻译后修改的蛋白质组学研究的系统资源。
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      • 锅C.
      • GNAD F.
      • 奥尔森J.V.
      小鼠肝细胞系的定量磷脂蛋白酶体分析显示出磷酸酶抑制剂的特异性。
          盘绕线圈螺旋螺旋盘螺旋螺旋型域蛋白2Rapaaqppaaaapsavggsaapr.生物合成ETD.
      • 李杰。
      • 徐Y.
      • 陈Y.
      • SP. rung R.
      • 金S.C.
      • 谢S.
      • 赵玉。
      通过改进的IMAC方法和MS / MS / MS揭示的线粒体磷酸酯。
      pkcε激酶
          锌手指,CCHC域5eprepsaiselr.捆绑ETD.
          心脏磷汉语rastiempqqar.运输c
      • Boja E.S.
      • 菲利普斯D.
      • 法国S.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      具有高能量碰撞解离的LTQ-壁毯上的定量线粒体磷蛋白酶。
      ,
      • 穆罕默德下午
      • Oceandy D.
      • Prehar S.
      • alatwi n。
      • 哈格巴夫
      • baudoin f.m.
      • 纠察岛
      • zaki a.o.
      • Nadif R.
      • 咖啡架e.j.
      • Neyses L.
      神经元硝基氧化物合成酶在调节心肌中β-肾上腺素能信号的血浆膜钙泵时的特异性作用。
      EGFR激酶
          泛酸激酶1lvkdiyggdyer.生物合成ETD.
          酶原颗粒膜蛋白16Tssysgeyggkggkr.外尿量ETD.
      GSK3激酶
          调节突触膜外毒性蛋白2SMQRSQSR.外尿量ETD.
      示出了预测与所鉴定的磷酸肽匹配的八种代表性衬底激酶基序的概述。总共29个鉴定的磷酸肽与这八个激酶的共有衬底基序相匹配。每个激酶的名称和所鉴定的磷蛋白(激酶和磷蛋白)的名称,实验鉴定的磷酸肽序列(磷酸肽序列),磷蛋白(功能)的功能,肽片段化方法(MS / MS)以及先前的参考文献报告了磷酸化位点(参考文献)列出。提供更全面的概述 补充表S4 有29个共识匹配。 EGFR,EGF受体。 Fyve,Fablp,YotB,ViRP和含EEA结构域的蛋白质。序列中的小写字母表示修改后的残留物。

      讨论

      该研究系统地表征了心脏中的线粒体磷酸酯。通过ETD和CID互补蛋白质组学技术的组合支持各种线粒体途径中调节部位的划分。通过这种方法,我们确定了具有210个新鉴定的236位磷酸化位点。这些调节部位被映射到181个不同的蛋白质,覆盖来自代谢的广泛的线粒体功能与细胞凋亡。用钙载荷和磷酸酶抑制剂说明了可逆磷酸化对线粒体函数调节的贡献。本研究中捕获的磷酸化事件有助于在功能性和生物学背景下对线粒体蛋白质组的散裂知识的整合。

       蛋白质组学平台综合表征心脏线粒体磷蛋白酶组的整合

      蛋白质组学技术在磷酸化事件的系统性表征方面具有显着提高。磷脂蛋白酶组分析的技术挑战包括低丰度磷酸肽的有限动态检测范围和磷酸酯键在质谱仪中的碰撞过程中的脆性性质。含有IMAC,TIO的富集树脂阵列显着延伸了磷酸肽检测的敏感性。2等等。个体亲和力树脂显示富集偏好的适度变化,这是通过选择申请程序的选择进一步影响(
      • 梁X.
      • Fonnum G.
      • Hajivandi M.
      • stene t.
      • kjus n.h.
      • ragnhildstveit E.
      • Amshey J.W.
      • Predki P.
      • 教皇r.m.
      调节,动态蛋白磷酸化研究中的IMAC和TiO2表面的定量比较。
      ,
      • Thingholm T.e.
      • Jensen O.N.
      • Larsen M.R.
      磷蛋白质的分析策略。
      )。李先生研究 等等。 (
      • 李杰。
      • 徐Y.
      • 陈Y.
      • SP. rung R.
      • 金S.C.
      • 谢S.
      • 赵玉。
      通过改进的IMAC方法和MS / MS / MS揭示的线粒体磷酸酯。
      )用IMAC在鼠肝线粒体中确定了84位磷酸化位点。用tio. 2,猪心脏线粒体中共报名了56位磷酸化位点(
      • Boja E.S.
      • 菲利普斯D.
      • 法国S.A.
      • 哈里斯r.a.
      • Balaban R.S.
      具有高能量碰撞解离的LTQ-壁毯上的定量线粒体磷蛋白酶。
      )。富集程序的应用也可能将我们的范围扩展到线粒体蛋白质组,导致捕获具有低丰度的蛋白质,以否则在线粒体中逃逸检测。
      c和ETD都有广泛的蛋白质组学应用。在磷脂蛋白组分析中,通常与CID相关的磷酸盐基团的中性损失用作特异性检查点,以牺牲检测灵敏度为代价。 ETD技术的成熟有助于保存不稳定的磷酸盐部分(
      • 好D.M.
      • Wirtala M.
      • Mcalister G.C.
      • Coon J.J.
      电子传递解离质谱的性能特征。
      ,
      • Syka J.E.
      • Coon J.J.
      • Schroeder M.J.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      通过电子转移解离质谱法分析肽和蛋白质序列分析。
      )。对磷酸肽和非磷酸肽的分析,反复观察到CID和ETD的独特优点(
      • 好D.M.
      • Wirtala M.
      • Mcalister G.C.
      • Coon J.J.
      电子传递解离质谱的性能特征。
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      • 宗C.
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      • Souda P.
      • 李X.
      • Whitelegge J.
      • 劳动o.
      • 杨p.Y.
      • ping p.
      揭示20S蛋白酶体磷蛋白蛋白酶组合的动力学:组合CID和电子转移解离方法。
      );因此,这两项认股权证的结合无偏见调查。
      在这项调查中,我们综合了TIO2 富集互补的ETD和CID蛋白质组学,以表征小鼠心中的线粒体磷蛋白酶(补充图S2)。概述了ETD和CID数据集的独特功能 Fig. 5。 ETD赞成多次带电(χ3+)磷酸肽,而由于电荷剥离效果,双电荷肽较低的效率较低。 CID在双电荷状态或三个带电状态下鉴定磷酸肽(Fig. 5B)。这种现象来自质谱仪的扫描范围的复合效果,完全消化的胰蛋白肽的长度以及色谱流动相的pH值。根据移动质子机制,完整的胰蛋白酶消化是CID的理想选择(
      • Pinkse M.W.
      • Uitto下午
      • hilhorst m.j.
      • OOM B.
      • Heck A.J.
      使用2D-Nanolc-ESI-MS / MS和氧化钛预训柱的蛋白水解消化的雌性磷酸磷肽的Femtomole水平的选择性分离。
      )。否则,由于肽获取超过两个电荷,碎片模式可能变得不那么随机,这损害了肽测序的效率。然而,对于ETD分析,有意减少胰蛋白酶消化效率以产生多种带电肽。因此,与ETD鉴定的磷酸肽的质量与CID相比显示出不同的趋势(Fig. 5, C-E.)。部分胰蛋白酶消化的应用有助于产生与ETD分析的肽和线粒体磷蛋白酶组的最大覆盖相容。此外,它还支持鉴定由独特的激酶组织治理的磷酸化位点(例如 PKA和PKC),具有与磷酸化位点相邻的赖氨酸或精氨酸残基。因此,部分胰蛋白酶消化支持对心脏线粒体磷蛋白酶的无偏见调查。或者,可以通过独立地用多重内瓣释放酶传导消化来增加适合于ETD的肽的量。这种程序将有利于有针对性的定量分析,以及为在其末端鉴定的磷酸化位点提供独立证据。
      已经组织了几种不同的蛋白质组学平台来探测线粒体磷蛋白酶组(
      • arrell d.k.
      • 艾略特S.T.
      • Kane L.A.
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      • Pedersen P.L.
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      • 墨菲上午
      • MarbánE.
      • 范艾克J.E.
      药理学预处理的蛋白质组学分析:新蛋白靶标会聚到线粒体代谢途径。
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      • Boja E.S.
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      具有高能量碰撞解离的LTQ-壁毯上的定量线粒体磷蛋白酶。
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      线粒体基质磷酸酯:额外线粒体钙的影响。
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      通过改进的IMAC方法和MS / MS / MS揭示的线粒体磷酸酯。
      )。每项研究确定了一组独特的磷酸蛋白,这表明仍然尚未获得线粒体磷蛋白酶组的综合肖像。在该研究中,包括足够的重复以达到ETD和CID程序的饱和点。

       心脏线粒体磷酸磷蛋白酶组和功能调节

      对于上述蛋白质组学平台,鉴定了236位磷酸化位点,其中210个是新的。除了集成多种技术方法,动物物种,组织样品收集和样品的生物功能阶段,所有这些都可能导致额外的新网站的鉴定。不同的生物信息学工具用于促进对此数据集的解释。最大的功能群是新陈代谢相关的蛋白质。这与心脏输出和代谢率之间存在动态平衡的共识得到了证实。在主要已知的线粒体代谢途径中鉴定了总共61个磷酸化事件,包括用于电子传输链复合物的10,对于TCA循环,12,用于脂肪酸代谢12,以及其他代谢途径的另外21例,包括核酸代谢途径,氨基酸代谢途径和尿素循环。
      线粒体信号网络的系统肖像需要描绘线粒体激酶和磷酸酶。尽管磷蛋白或磷酸肽富集的各种选择,但鉴定低丰度激酶和磷酸酶仍然是显着的技术挑战。针对已知的基质共识序列的鉴定的磷酸肽的爆炸检测表明,至少29个不同的激酶可能有助于线粒体磷蛋白酶的动态。
      用钙载荷的线粒体等复合物I和III的功能测定提供了鼠心脏线粒体功能可以通过磷酸化急性调节。利用三种不同的磷酸酶抑制剂,显示可逆磷酸化显着影响线粒体功能。最有趣的观察是通过磷酸化调节至少三分之一的线粒体能量产生率。芬太福,钙霉素A和冈田酸诱导的激烈效应提出了多种激酶和磷酸酶在线粒体等复合物功能调节中的累积。此外,相对于络合物I和复合III活性对Calyculin A和冈卡酸的敏感性观察到差异。鉴于复杂I和复杂III对ROS产生的关键贡献,这些数据表明,磷酸化事件也可能调整来自心肌细胞的ROS释放。线粒体磷蛋白蛋白质中动力学的精确测定是朝向彻底描绘分子调控机制的必要下一步。具有稳定同位素编码的内标的定量蛋白质组学将有助于以特定的场地的方式进行调查。
      一起服用,磷酸化是线粒体功能调节的必要因素。本研究中应用的技术平台提供了关于线粒体途径磷酸化的新信息,有助于心脏线粒体蛋白质组生物学的知识库。

      补充材料

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