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福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)乳腺癌组织中靶向质谱法定量HER2 * [S]

  • 克里丁斯·斯坦默
    一致
    应解决谁的通信:
    隶属关系
    日内瓦大学医学院,日内瓦大学医院,Rue Gabrielle-Perret-Gentil 4,CH-1211日内瓦,瑞士;

    翻译技术和生物信息学,医药科学,罗氏制药研究&早期发展(PRED),Roche Innovation Center Basel,F.Hoffmann-La Roche AG,Grentacherstrasse 124,CH-4070巴塞尔,瑞士;
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  • Jean-Christophe Tille
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    临床病理学,日内瓦大学医院,Rue Gabrielle-Perret-Gentil 4,CH-1211日内瓦,瑞士;
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  • Jens Lamerz.
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    翻译技术和生物信息学,医药科学,罗氏制药研究&早期发展(PRED),Roche Innovation Center Basel,F.Hoffmann-La Roche AG,Grentacherstrasse 124,CH-4070巴塞尔,瑞士;
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  • Sabine Kux Van Geijtenbeek
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    翻译技术和生物信息学,医药科学,罗氏制药研究&早期发展(PRED),Roche Innovation Center Basel,F.Hoffmann-La Roche AG,Grentacherstrasse 124,CH-4070巴塞尔,瑞士;
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  • 托马斯A. McKee.
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    临床病理学,日内瓦大学医院,Rue Gabrielle-Perret-Gentil 4,CH-1211日内瓦,瑞士;
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  • Miro Venturi.
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    肿瘤科,Roche Pharma研究&早期发展(PRED),Roche Innovation Center Penzberg,Roche Diagnostics GmbH,Nonnenwald 2,D-82377佩斯贝格,德国
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  • Laura Rubbia-Brandt
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    临床病理学,日内瓦大学医院,Rue Gabrielle-Perret-Gentil 4,CH-1211日内瓦,瑞士;
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  • Denis Hochstrasser.
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    日内瓦大学医学院,日内瓦大学医院,Rue Gabrielle-Perret-Gentil 4,CH-1211日内瓦,瑞士;
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  • 保罗切尔
    隶属关系
    翻译技术和生物信息学,医药科学,罗氏制药研究&早期发展(PRED),Roche Innovation Center Basel,F.Hoffmann-La Roche AG,Grentacherstrasse 124,CH-4070巴塞尔,瑞士;
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  • 皮埃尔·莱斯卡尔
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    日内瓦大学医学院,日内瓦大学医院,Rue Gabrielle-Perret-Gentil 4,CH-1211日内瓦,瑞士;
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  • Axel调整器
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    翻译技术和生物信息学,医药科学,罗氏制药研究&早期发展(PRED),Roche Innovation Center Basel,F.Hoffmann-La Roche AG,Grentacherstrasse 124,CH-4070巴塞尔,瑞士;
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  • 作者脚注
    * CS由罗氏博士审查员的支持支持。
    [S]本文含有补充材料和方法。 S1至S5,以及表S1至S9。
      使用靶向质谱法准确地定量福尔马林固定的石蜡包埋组织中蛋白质的能力打开了生物标志物发现的令人兴奋的透视图。我们已经开发出并评估了福尔马林固定的石蜡包埋乳腺肿瘤中的人受体酪氨酸蛋白激酶ERBB-2(HER2)的选择性反应监测测定。在相关细胞系中使用未定位的质谱法鉴定肽候选物。为六种最佳候选肽开发了多路复用的测定,并评估了线性,精度和量化限制。结果显示校准范围内的线性响应,校准范围为0.012至100个fmol(r2:0.99-1.00)。所有肽评估的柱上定量下限为0.155氟酚。通过侵入乳腺癌妇女的40份福尔马林固定的石蜡包埋的肿瘤组织群组中的选定反应监测量化了六个HER2肽,其显示出不同水平的HER2基因扩增,如临床病理学中使用的标准方法评估。六个HER2肽的量彼此高度且显着地相关,表明肽水平可以用作福尔马林固定的石蜡包埋组织中蛋白质量的替代物。样品尺寸标准化后,选择的反应监测肽测量能够根据美国临床肿瘤学会和美国病理学家学院所定义的HER2扩增来正确预测90%的病例。总之,发达的检测结果显示出良好的分析性能和免疫组织化学和荧光的高度协议原位杂交数据。本研究表明,所选反应监测允许精确地量化福尔马林固定的石蜡包埋组织中的蛋白质表达,因此代表了生物标志物发现研究的强大方法。未标准的质谱数据可通过ProteomeXchange获得,而选定的反应监测的定量数据可在全景公共网站上获得。
      基于MS的蛋白质组学传统上用于研究复杂的生物体系,例如细胞系,血浆或新冷冻组织(
      • 郭t.
      • Aeberberold R.
      >基于质谱的蛋白质组学寻求糖尿病生物标志物。
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      • Diamandis E.P.
      >朝着蛋白质生物标志物发育的一体化管道。
      )。然而,在过去十年中,MS蛋白质组学已经扩展到福尔马林固定石蜡嵌入式(FFPE)的分析1 tissues (
      • Gustafsson o.j.
      • Arentz G.
      • Hoffmann P.
      >福尔马林固定组织分析中的蛋白质组学发展。
      )。福尔马林固定是临床病理学中样品储存的金标准,因为它允许最佳保存组织的形态特征,并且在经济上具有吸引力(在室温超过几年或几十年的储存)(
      • 福克斯C.H.
      • 约翰逊F.B.
      • j.
      • 滚筒P.P.
      >甲醛固定。
      )。几项研究表明,尽管从新鲜冷冻和FFPE组织中检索和鉴定的单个肽可能不同,但在鉴定的蛋白质数量,细胞位置和分子功能的数量方面,从两种类型材料获得的生物学信息非常相似(
      • Tanca A.
      • Pagnozzi D.
      • addis m.f.
      >设定蛋白质:进展和成就福尔马林固定,石蜡包埋组织的蛋白质组学。
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      >微放射型福尔马林固定和石蜡包埋组织标本的蛋白质组分析。
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      >从福尔马林固定的石蜡包埋和冷冻组织中获得的蛋白质清单的等价性 - 串联质谱霰弹枪蛋白质组学分析。
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      >通过GELC-MS / MS与配对存档新鲜冷冻和福尔马林固定样品产生的差分蛋白质组学数据的可比性和光谱计数。
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      • Lucacchini A.
      >福尔马林固定石蜡包埋组织的蛋白质组学研究。
      )。报告了许多蛋白质组学研究,它在FFPE组织上使用了未标准的MS,以比较患病和健康样本在寻找潜在的新型生物标志物(
      • Giusti L.
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      >福尔马林固定石蜡包埋组织的蛋白质组学研究。
      )。然而,这些未标准的MS工作流程不允许在大量样品上进行准确的蛋白质量化。一种选择是使用目标MS方法,例如所选的反应监测(SRM),其在许多样本上高度定量和可重复(
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      >通过靶向质谱法定量蛋白质定量:从生物标志物炼狱出来的方式。
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      >改善生物标志物管道。
      )。另外,SRM测定允许高水平的复用(可以在单一分析中并联测量几百个肽)(
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      >选择定量蛋白质组学策略时的选择和考虑因素。
      )。缺乏使用全面临床数据集注释的足够数量的高质量样本可能是临床前探索期生物标志物研究的限制因素(
      • Hinestrosa M.C.
      • Dickersin K.
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      >塑造乳腺癌生物标志物研究的未来,以确保临床相关性。
      )。因此,对MS的蛋白质组学的使用FFPE样品,特别是对于定量的目标方法,因此将开放巨大的追溯生物标志物发现和验证研究的巨大观点。实际上,除了广泛可用的外,大多数FFPE组织都用临床数据注释。此外,应用于FFPE样品的靶向MS工作流程与需要高质量抗体的技术互补,例如免疫组织化学(IHC)或反相蛋白阵列(RPPA)。这些技术均依赖于靶蛋白的测量,SRM测量一个或理想的几种肽作为蛋白质的替代物(
      • Lange V.
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      >定量蛋白质组学的选定反应监测:教程。
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      >选择的反应监测适用于蛋白质组学。
      )。然而,在对IHC和RPPA的反对中,SRM不依赖于对分析物检测的特异性抗体的存在,从而避免交叉反应问题并使测定发育相对快速和成本效益。虽然SRM对蛋白质分析的较少高于小分子量化,但该技术被证明是对蛋白质的大型动态范围的选择性,可重复性和高度定量的(
      • kuzyk m.a.
      • 史密斯D.
      • 杨杰。
      • 十字架。
      • 杰克逊上午
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      >基于多重反应监测,多路复用,人血浆中45个蛋白的绝对定量。
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      >甲状腺功能亢进患者血清1-84甲状旁腺激素的定量原位消化液相色谱 - 串联质谱法。
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      >血清和血浆中液相色谱 - 串联质谱法测量抗血清和血浆中抗血糖素自身抗体的测量。
      )。然而,虽然已经研究了对新鲜冷冻和FFPE样品进行的定性分析的等同物,但是在FFPE样品中仅评估了一些研究评价定量靶向MS的研究(
      • Steiner C.
      • ucret a。
      • Tille J.C.
      • 托马斯米
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      >使用质谱法的绝对定量使用质谱临床应用:测定精度,稳定性和与FFPE肿瘤组织中的达到基因扩增的相关性。
      )。对FFPE组织进行的靶向蛋白质组学仍处于其早期,并且该技术的已知局限性包括组织的形态特征和广泛的样品制备,引起低样品吞吐量(
      • Steiner C.
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      >质谱法在福尔马林固定石蜡包埋组织中定量蛋白质分析的应用。
      )。此外,靶向蛋白质组学量化肽作为蛋白质的替代物,前者不一定与后者的绝对术语同意。这对于自下而上的蛋白质组学,这是真实的,但对FFPE组织特别重要。
      在这项研究中,我们将统治性评估了在FFPE组织中施用肽定量的靶向MS的有效性。我们开发和评估了SRM测定的SRM测定,用于定量人受体酪氨酸蛋白激酶ERBB-2(HER2)的六种肽,并将得到的结果与临床病理学中使用的标准方法进行比较,即IHC和荧光 原位 杂交(鱼)。选择HER2作为候选蛋白,因为其过表达在乳腺肿瘤中经常评估,以确定对抗HER2治疗的易感性(
      • Gradishar W.J.
      • 安德森B.O.
      • 布莱尔S.L.
      • Burstein H.J.
      • CYR A.
      • elias a.d.
      • Farrar W.B.
      • FORERO A.
      • Giordano S.H.
      • Goldstein L.J.
      • Hayes D.F.
      • HUDIS C.A.
      • isakoff s.j.
      • ljung下班。
      • 马尔康P.K.
      • Mayer i.a.
      • 麦考克斯B.
      • 米勒R.S.
      • PEGRAM M.
      • 皮尔斯L.J.
      • 芦苇re.c.
      • Salerno K.E.
      • Schwartzberg L.S.
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      • Soliman H.
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      • Wolff A.c.
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      • 羞耻D.A.
      • Kumar R.
      >乳腺癌3.2014。
      )。根据实验室,可以通过IHC评估HER2过表达或相应基因的扩增(ERBB2)可以通过鱼量化(
      • 希克斯D.G.
      • Kulkarni S.
      >Her2 +乳腺癌:审查生物相关性和诊断工具的最佳使用。
      )。几个实验室使用两种技术来决策,因为它们是互补的。
      在第一步中,我们开发了用于量化归档临床FFPE肿瘤组织中HER2肽的SRM测定,并评估其分析性能,包括线性,精度和定量的下限(LLOQ)。然后,我们通过在表达不同水平的HER2的40个FFPE肿瘤组织中量化HER2肽来证明该方法的适用性(基于ERBB2基因扩增状态选择)。样品源自侵袭性乳腺癌的妇女进行手术切除。从而调查了几种选项,以使结果规范化样本大小。最后,为了确认SRM作为FFPE组织中蛋白质定量的合适方法的有效性,我们确定了通过IHC或FISH生成的SRM和数据生成的数据之间的协议。

      实验步骤

      未确定的质谱蛋白质组学数据已被沉积在Proteomexchange联盟中(
      • VizCaino J.A.
      • 德意曲e.w.
      • 王R.
      • Csordas A.
      • Reinger F.
      • 里奥斯D.
      • 戴安斯J.A.
      • 太阳Z.
      • Farrah T.
      • Bandeira N.
      • binz p.a.
      • Xenarios I.
      • 艾森凯母线
      • Mayer G.
      • Gatto L.
      • 坎波奥A.
      • Chalkley R.J.
      • Kraus H.J.
      • Albar J.P.
      • 马丁内斯 - 巴尔多洛姆És。
      • APWEILER R.
      • OPENN G.S.
      • 玛特L.
      • 琼斯A.R.
      • Hermjakob H.
      >Proteomexchange提供全球协调的蛋白质组学数据提交和传播。
      )通过具有数据集标识符PXD002281的骄傲合作伙伴存储库,并在项目名称下“甲醛固定的石蜡嵌入乳腺癌组织中的鉴定HER2肽”。包含目标质谱数据的天际线文献(包括群组样本,线性和LLOQ数据中HER2肽的定量)已经沉积在Panorama Server上(
      • 沙姆达五。
      • eCkels J.
      • 泰勒G.K.
      • 舒尔曼N.J.
      • stergachis a.b.
      • Joyner S.A.
      • 闫诗
      • Whiteaker J.R.
      • Halusa G.N.
      • 席克宁B.
      • 吉布森B.W.
      • Colangelo C.M.
      • Paulovich A.G.
      • carr s.a.
      • Jaffe J.D.
      • maccoss m.j.
      • 麦克莱恩B.
      >全景:一个有针对性的蛋白质组学知识库。
      )。可以使用以下链接在全景公共网站上访问数据: //panoramaweb.org/labkey/Steiner.url.

       未确定的MS分析

      通过未处理和福尔马林固定HER2-过表达细胞系(SKBR-3和BT-474)的未确定MS分析来鉴定用于靶向MS分析的合适HER2肽。(SKBR-3和BT-474)(
      • Subik K.
      • 李J.F.
      • Baxter L.
      • Strzepek T.
      • Costello D.
      • 克劳利P.
      • xing l.
      • 挂米。
      • Bonfiglio T.
      • 希克斯D.G.
      • 唐诗
      >ER,Pr,HER2,CK5 / 6,EGFR,KI-67和AR的表达模式通过免疫组织化学分析在乳腺癌细胞系中的免疫组化分析。
      )。在具有来自水域公司(Milford,MA)的Thermo Electron(Waltham,MA)的LTQ Orbitrap Velos上进行纳米射线LC-MS / MS。肽被捕获在自制100μm×20mm的预柱上,并在重力拉动的自制发射器上分开75μm×150mm(两个柱填充5μm200埃魔法C.18 来自Michrom的AQ色谱相(Bruker,Billerica,MA)。在H中使用0.1%甲酸的梯度,将分析分离为65分钟2O(溶剂A)和0.1%的甲酸3CN(溶剂B)。梯度如下:5%B,在54分钟,5-35%B,5-80%B以220nl / min的流速,10分钟。电喷雾电压设定为1800 V.对于MS测量扫描,玻璃岩分析仪分辨率设定为60,000,将离子群设定为5×105m/z 400至2000的窗口。选择最多8个前体离子用于LTQ分析仪中的碰撞诱导的解离(CID),其动态排除时间设定为45秒。离子积聚在7×10的目标值3 隔离宽度为2 m/z 并且CID以标准化的碰撞能量为35%进行。
      使用来自仪器供应商(Extract_msn.exe)的嵌入式软件从原始数据生成峰值列表,随后提交给easyprot(v2.2),该平台使用phenyx(Genebio,Geneva,Switzerland)进行蛋白质识别(
      • 闪闪发光
      • Hoogland C.
      • Antinori P.
      • 罗宾X.
      • Nikitin F.
      • Zufeey A.
      • Pasquarello C.
      • Fétaudv.
      • 天顿L.
      • Muller M.
      • Lisacek F.
      • Geiser L.
      • Hochstrasser D.
      • 桑切斯J.C.
      • Scherl A.
      >EasyProt-易于使用的蛋白质组学数据分析图形平台。
      )。针对UNIPROTKB / SWISSPROT数据库进行(11.01.2011和13.06.2012发布,其中包含20'252和20'237的审查条目)指定“HOMO SAPIENS.“ 分类。母离子耐受设定为10ppm。将半胱氨酸氨基甲酰化被设定为固定或可变改性,而氧化甲硫氨酸被设定为可变改性。选择胰蛋白酶作为蛋白水解酶,允许一个潜在的裂解脱髓。设立肽评分以使假阳性肽比低于5%。或者,使用续集搜索算法(续集27.0,修订版12,Thermo电子)和搜索使用UniProtkb / swissprot蛋白知识库数据库(版本2011_07)进行处理)进行处理原始质谱数据。HOMO SAPIENS.“(58,772个与诱饵条目串联的序列)。对母离子的质量耐受性的质量公差搜索,母离子和±1.0DA用于片段离子。甲硫氨酸(减少/氧化; +15.9949Da)被认为是差异修饰,而半胱氨酸被认为是完全氨基甲酰化的(+ 57.0199Da)。假发现率设置为1%。只考虑了没有超过一个错过的裂解的完全胰蛋白酶肽进行数据分析。

       有针对性的MS方法开发

      使用未明确的MS方法观察到的肽序列并适合于开发SRM测定(蛋白质型和不含甲硫氨酸),进入Skyline V1.3软件(Maccoss Lab,Seattle,WA)(
      • 麦克莱恩B.
      • Tomazela d.m.
      • 舒尔曼N.
      • Chambers M.
      • 芬尼G.L.
      • Frewen B.
      • 肯尼尔·
      • Tabb D.L.
      • Liebler D.C.
      • maccoss m.j.
      >天际线:用于创建和分析目标蛋白质组学实验的开源文档编辑器。
      )为了构建肽筛选的SRM方法。将天际线方法设置设置为允许双重和三次充电的前体离子和单个带电的“Y”片段离子,这是CID产生的最主要离子(
      • Lange V.
      • Picotti P.
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      >定量蛋白质组学的选定反应监测:教程。
      )。将天际线文件出口到质谱仪以构建SRM方法,用于分析来自三种不同Her2过表达肿瘤的FFPE组织提取物掺入光和重标记的合成肽。根据以下标准进行评估单个肽:视觉检测和共同洗脱的轻质和重量同位素标记的色谱峰,保留时间(RT)的再现性(对于给定的肽,所有重复的RT都在窗口内1分钟)和峰面积的再现性(所有峰面积的总峰面积为平均峰面积±〜30%)。选择六种最佳性能的肽以用于定量。
      通过配备Dionex Ultimate 3 000 RSLCNANO系统(Thermo电子)的热电子通过SRM通过SRM分析重组的FFPE组织提取物。肽在0.075×170mm柱(Wil,Wil,Switzerland)中分离,填充有3μm的Reprosil-pur C.18-aq(Maisch博士,Ammerbuch-Rentringen,德国)。使用0.5%乙酸/ 2%乙腈(溶剂A)和0.5%乙酸/ 80%乙腈(溶剂B)的梯度运行分析分离24分钟。梯度如下,如下:0-20%B在11分钟内,在13分钟内为20-45%B,45-100%B,0.1分钟,流速为450 nL / min。将喷射电压设定为1800V,分辨率设定为0.7的Q1和Q3(FWHM),而碰撞气体压力为1.5 mtorr。最终的SRM方法具有88转换的循环时间为1 s。为每种肽单独优化碰撞能量,并显示在 补充表S1.
      获取的SRM数据被导入Skyline V2.1以进行峰积分,并使用Microsoft Excel 2010进行峰积分,并使用Microsoft Excel进行肽量化和分析验证的所有进​​一步计算。此外,使用Tibco Spotfire 5.5版(Tibco Software Inc.,Boston)可视化数据,嘛)。
      通过在人工背景基质中使用轻质和重标记的肽评估SRM测定的线性和LLOQ,如其他人提出的细菌蛋白质消化(
      • Hembrough T.
      • Thyparambil S.
      • Liao W.L.
      • 达尔尔米M.
      • ABDO J.
      • 孟加拉夫
      • 泰勒P.
      • 桐j.
      • Lara-Guerra H.
      • Waddell T.K.
      • 莫兰姆。
      • Tsao M.S.
      • Krizman D.B.
      • 洞穴J.
      >表皮生长因子受体(EGFR)在福尔马林固定肿瘤组织中的选定反应监测(SRM)分析。
      ) (也可以看看 补充材料和方法),而从研究中包含的40个样品的重复分析计算精度。

        FFPE. 乳腺癌组织样本中的验证研究具有HER2扩增

      该研究得到了日内瓦行政委员会的批准(议定书NAC 13-109)。从2001年至2011年开始,回顾性FFPE乳腺肿瘤切除样本从日内瓦大学医院的临床病理分工档案中。样品包括来自新辅助治疗的肿瘤切除术或乳房切除术病例 - 患有侵入性乳腺癌的妇女,其中包括34个导管,三叶,一种微量,一种粘液,一个髓鞘。排除标准是男性性别和新辅助治疗的施用。

        IHC. 评估鱼类和HER2过表达的HER2扩增

      对于所有情况,通过鱼类评估HER2扩增作为临床病理分裂中的常规程序的一部分。队列包括40名患者,每组10名患者,每个患者都是由鱼类测量的SHER2扩增状态:10名没有HER2扩增的患者(鱼比<2,所有导管)和三组10名患者,每种患者随着HER2基因扩增水平增加,如鱼率为2-4(九个导管和一个髓内); 4-10(九个导管和一个小叶);和 >10(六个导管,两只叶叶,一种粘液,一种微杂种)。鱼类如下进行:切割4μm切片并安装在超级玻璃载玻片上。按照制造商推荐进行HER2鱼类测定(02J01-36,雅培分子,ABBOTT PARK,IL)。此外,IHC对所有病例评估了HER2过表达。在基准XT自动化抛光器(Ventana,Mannheim,Germany)上进行IHC进行抗原检索。按照制造商推荐使用预先使用的抗体,用于HER2(790-2291,克隆4B5,Ventana)的使用。根据美国临床肿瘤学会/美国病理学家(ASCO / CAP)建议(ASCO / CAP)建议(ASCO / CAP)建议(
      • Wolff A.c.
      • 哈蒙德M.E.
      • 希克斯D.G.
      • Dowsett M.
      • McShane L.M.
      • Allison K.H.
      • Allred D.C.
      • Bartlett J.M.
      • 乏硅
      • Fitzgibbons P.
      • 汉娜W.
      • Jenkins R.B.
      • Mangu P.B.
      • Paik s.
      • 佩雷斯e.a.
      • 按M.F.
      • 矛p.a.
      • Vance G.H.
      • 亚羊座G.
      • Hayes D.F.
      >人体表皮生长因子受体2在乳腺癌中试验的建议:美国临床肿瘤学会/美国病理学家学院临床实践指南更新。
      )。
      两位专家乳房病理学家独立对IHC和鱼分析进行了分析,在显微镜下没有数字量化。对于IHC:0的分数表示不完全的染色或膜染色,并且是微弱的/几乎不可知的,并且在侵入性癌的少于10%内;分数为1+代表不完全膜染色,这是微弱的/几乎不可察觉的,并且在侵入性癌的10%以上;分数为2+代表周向膜染色,其不完全和/或弱/中等,在侵入性肿瘤的较大和周向膜染色的大于10%以上,其在侵入性肿瘤的不到10%内;分数为3+代表周向膜染色,其在侵入性肿瘤的10%以上是完整的,强烈的浓度。对于鱼类,每根核的2和Centromere(Cep17)探针的数量在超过40个侵入性癌细胞中计算。没有HER2扩增对应于HER2 / CEP17比率<2.0平均HER2副本编号<4.0信号/细胞,而HER2扩增对应于HER2 / CEP17比例≥2.0或HER2 / CEP17比率<2.0平均HER2副本编号> 6.0 signals/cells.

        FFPE. 样品的肽提取

      对于肽萃取,使用根据以下方案使用切片体切割含有切除肿瘤的石蜡嵌段(Fig. 1):将4μm厚切片切割并安装在超冰玻璃载玻片上,首先使用苏木精和eosin染色(H.&e),第二秒储存在-20°C,直到IHC测量HER2表达。将三个在20μm厚的切片上切割并安装在玻璃滑块上,以解剖和蛋白质提取。最后4μm组织切片用h染色&E为了确认在所有收集的组织切片中存在肿瘤组织的存在。只有渗透肿瘤区域,省略导管或小叶 原位 然后,癌症专家在第一个h上由病理学家专家界定&e幻灯片。通过用H叠加每20μm切片来进行肿瘤的手术癌&E模板。将解剖区域用一系列超级超级醇浴和分级醇浴再水化,之后将再水化组织用针收集并储存在-80℃直至蛋白质提取。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1来自福尔马林固定的石蜡包埋的组织块的样品制备和肿瘤切除。
      提供了一种从FFPE组织切片产生和提取肽的详细方案 补充材料和方法。简而言之,将从20μm厚的切片中回收的收集的组织悬浮在Tris-Cl缓冲液中,含有Rapigest TM SF和1,4-二噻吩醇(DTE),并将管在100℃下加热20分钟。超声处理后,将样品再次在80℃下加热2小时,之后它们经历了第二轮超声处理,并用碘乙酰胺进行烷基化。在37℃下进行胰蛋白酶消化过夜。然后将样品酸化和脱盐,然后使用速度-AC度浓缩器蒸发洗脱液并在-20℃下保持直至使用。将提取物以0.5%(v / v)乙酸的50μl2%(v / v)乙腈重构,并进一步稀释1:50。将重标记的肽加入到0.2 fmol /μl的终浓度中。将5μl该溶液(将总提取物的0.2%表示在LC-MS系统中,用于使用上述最终SRM方法进行分析。

       用于标准化肿瘤大小的参数

      解剖区域中肿瘤细胞的百分比由病理学医生评估并用作所有样品的归一化因子。为了允许各种尺寸的肿瘤之间的比较,获得预期的四个附加参数,以代表肿瘤大小进行标准化。第一个归一化参数是解剖肿瘤区域的表面,并基于H计算&E模板幻灯片,使用Pannoramic 250 Flash II扫描仪(3dhistech,Budapest,Hungary)进行数字扫描,并使用Pannoramic Viewer软件(3Dhistech)以μm测量。第二归一化参数是在使用Pierce BCA蛋白质测定试剂盒(Thermo Fischer Scientific)中的20μm厚的组织切片中提取的肽的总量。作为第三个参数,在FullScan模式下通过MS进行第二次分析40个样本(500-1000 m/z;扫描时间1 s)具有相似但较短的梯度,如SRM方法(0-45%B在5分钟内,45-100%B以450 nL / min的流速为0.1分钟)。所产生的总离子电流(TIC)的曲线(AUC)下的面积整合在19.0和24.0分钟之间,并用作肿瘤大小的标准化的第三参数。第四归一化参数是细胞角蛋白19(KRT19),其在乳腺上皮中特异性表达(
      • 楚P.G.
      • Weiss L.M.
      >角蛋白在人体组织和肿瘤中的表达。
      )。在最终SRM方法中与六个HER2肽平行监测三个KRT19肽。校准曲线被制备为HER2肽,但在这种情况下,将重标记的肽在重构提取物中以2.0 fmol /μl掺入(塔上10摩尔)。绘制响应的方式与HER2相同的方式,并计算总肿瘤提取物中的肽的量。对三个KRT19肽的这种方式得到这种方式,以获得每个样品的单kRT19值(三个KRT19肽的值彼此明显相关:Spearman相关系数:0.899-0.924; p 值(双尾):1.72E-17-3.32E-15;数据未显示)。

       统计分析

      使用GraphPad Prism 6(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)进行相关性和盒绘图表示。
      如前所述进行统计分析(
      • assadi m.
      • 拉米尔j.
      • Jarutat T.
      • Farfsing A.
      • 保罗H.
      • Gierke B.
      • 布雷特e。
      • Templin M.F.
      • Essioux L.
      • arbogast s.
      • Venturi M.
      • Pawlak M.
      • langen h.
      • Schindler T.
      >具有反相蛋白阵列的福尔马林固定和石蜡包埋组织样品的多种蛋白质分析。
      )使用统计语言R 2.10.1(
      • R开发核心团队
      R:统计计算的语言和环境。
      )。使用封装“统计数据”进行主成分分析,Spearman相关和Mann-Whitney测试,并使用包装“格子”进行图形可视化(
      • R开发核心团队
      R:统计计算的语言和环境。
      )。所雇用的Kappa系数(k)是两位评估者协议的统计措施;在这种情况下,评估者是IHC得分或鱼类别以及归一化HER2肽浓度。 Kappa系数从0(分歧)到1(完美的协议)。根据完美协议的平方距离根据其平方距离而加权分歧(
      • 游戏玩家M.
      • 柠檬J.
      • 研究员我。
      IRR:各种Interray可靠性和协议系数。
      )。序序多项式逻辑回归:每个样本 i,IHC得分(或鱼类) 和标准化的HER2肽浓度 xi. 决心,决意,决定。 IHC得分(或鱼类) Y 通过定义是分类的。每个分数都遵循HER2表达水平的逻辑排序,来自类别 j = 0到3+(或鱼的1到4)。因此,IHC HER2得分是序列分类响应。归一化HER2肽浓度 xi. 是一个连续变量。 IHC评分与归一化HER2肽浓度之间的关系通过序数多项逻辑回归适当地建模,如前述(
      • Venaking W.n.
      • Ripley B.D.
      与S的现代应用统计
      ,
      • 遥远的J.J.
      使用R:广义线性,混合效果和非参数回归模型扩展线性模型。
      )。该模型旨在预测样品关联的概率 i 被分配到类别 j 基于 xi, 或者 PIJ. = P( = j)。因为同时对四个分数中的每一个预测每个样本的概率,所以要分配给四个分数中的每一个的样本的概率分布被称为多项式。从技术上讲,这通过拟合每个分数的二进制逻辑回归模型来解决 j 在哪个分数0到 j 结合形成单个类别和类别 j +1到3 + 形成第二类。在任何归一化的HER2肽浓度 xi. ,概率 Y 处于或低于特定分数 j 表示为累积概率,反映了HER2分数排序: P(Y £ 0) £ P (Y £ 1+ )£ P (Y £ 2+ )£ P (Y £ 3+)。最后是概率 P(Y = j)估计 P(Y = j )= P(Y £ j ) - P(Y £ j − 1) (
      • Agresti A.
      分类数据分析介绍(概率统计中的Wiley系列)。
      )。

      结果

       分析方法的发展

      为了鉴定由含有目的蛋白质的生物材料产生的HER2肽,对来自未处理和福尔马林固定细胞系(SKBR-3和BT-474)的肽提取物进行未确定的LC-MS分析。以这种方式鉴定的肽 表I. 补充表S2.
      表二分析方法精度和整个过程精度。 (a)在40例肿瘤中量化的六个HER2肽计算的分析方法精度。 (b)针对40颗肿瘤的九个HER2肽计算的全过程精度
      肽序列组织提取物中的范围肽量[pmol]再现性:变异范围系数[%]
      A。分析方法精度(n = 40)
      Elvsefsr.0.014-2.73.1.1-51.5.
      fvviqnedlgpaspldstfyr.0.026-4.703.0-58.1.
      giwipdgenvk.0.009-0.507.3.7-52.6
      glqslpthdpsplqr.0.011-2.25.1.3-40.5
      sgggdltlglepseeeapre.0.022-3.11.2.4-75.6
      SLETILK.0.007-2.65.0.6-29.9.
      B。整体过程精度,包括样品制备(n = 9)
      Elvsefsr.0.015-0.589.16.1-43.6
      fvviqnedlgpaspldstfyr.0.053-1.2214.7-59.6
      giwipdgenvk.0.011-0.141.10.2-64.0
      glqslpthdpsplqr.0.019-0.316.12.3-57.1.
      sgggdltlglepseeeapre.0.025-0.706.18.8-87.0
      SLETILK.0.010-0.549.6.8-31.9
      合成肽序列的肽序列的光和重标记的肽序列(含有甲硫氨酸的蛋白质序列(标记为斜体) 表I. )并掺入源自三种FFPE肿瘤的肽提取物,其过表达HER2,并使用如材料和方法部分中所述产生的SRM方法筛选。对于每种肿瘤,总共进行11个注射:相同的组织切片提取物的六种重复,并从相邻的组织切片中的五种额外提取物重复。使用以下标准在11分析中评估肽:存在明确定义的峰,光和重标记的色谱峰的共同洗脱,Rt的再现性(对于给定的肽,所有重复的RT需要在内1分钟的窗口)和峰面积的再现性(所有重复的总峰面积需要在平均峰面积内±30%)。不符合三个FFPE组织背景中的一个以上的这些标准的肽被排除在外。选择用于分析评估的六种肽以粗体标记为 表I. .

       校准校准曲线的选择和线性评估

      众所周知,生物基质中存在的组分可以影响SRM测定中的电离过程。为了定量药物及其代谢物,传统的用于基质效应的方法包括在含有未知分析物的“空白”矩阵中建立校准曲线。在药物的情况下,替代基质通常是源自没有服用感兴趣药物的患者的空白血浆或尿液。在组织中的蛋白质定量的情况下,这在组织中的情况更复杂,因为用于定量的蛋白质存在于内源水平。虽然可以在内源水平上尖头,但后来减去这些是可能的,但它引入了额外的步骤并在量化过程中提高了误差。此外,尽管为了建造校准曲线而获得大量的生物流体,但是重复使用组织样本以外的方法开发,用于在代表性矩阵中建立校准曲线的唯一目的,并不实用和道德合理的。因此,我们通过使用来自嗜热性古茶的市售蛋白质提取物选择替代方法 Pyroccoccus furiosus. 作为替代矩阵。通过制备校准曲线来评估这种人工基质的HER2定量的适用性 P. furiosus. 通过将信号线性和斜率与三个合并的导管三阴性乳腺癌(TNBC)中的蛋白质提取物中构建的信号线性和斜率进行比较,乳腺癌型未经抑制HER2(
      • Foulkes W.D.
      • 史密斯即
      • Reis-filho J.s.
      >三阴性乳腺癌。
      )。
      使用log10 / log10表示进行比较两个背景中的线性度(补充图。S1)。报告了平均斜坡和截距 补充表S3。在考虑整个校准域时,斜率系统地降低,并且与TNBC矩阵中的拦截更高 P. furiosus. 矩阵。这是因为TNBC基质的校准曲线下部的曲线的扁平曲线(校准器在0.012至0.391 fmol上的柱子上),可能是因为由于TNBC肿瘤中HER2的生理表达水平。但是,当省略关键点并仅考虑两个矩阵的校准域的占八个点时,在两个数据集之间观察到接近的协议,其中TNBC矩阵中的斜率范围为86%至93%所观察到的值在里面 P. furiosus. 提炼。此外,对整个校准范围的所有六种肽的响应是线性的 P. furiosus. 用log10 / log10表示提取(平均斜率:0.960 - 1.001;平均值 r2:0.9875 - 0.9984; 补充表S3)。因此,这是 P. furiosus. 随后用于执行方法评估和样本量化。
      结果,在线中评估了线性度 P. furiosus. 背景并绘制为log10 / log10表示。对于日内线性度,R Square(r2)对于所有6个肽,斜坡范围为0.990至1.000,斜坡范围为0.958至1.115。对于日内的线性度, r2 对于所有六种肽,值范围为0.952至1.000,斜坡范围为0.958至1.212。观察到线性程度超过四个数量级。显示了关于线性的详细信息,包括残留物的分散, 补充表S4。六肽的残留地块显示在 补充图S2.

       量化和精度下限

      lloq. 被定义为可以用低于20%的变异系数(CV)量化的最低肽浓度(
      • carr s.a.
      • Abbatiello S.E.
      • Ackermann B.L.
      • 博赫斯C.
      • Domon B.
      • 德意曲e.w.
      • 授予R.P.
      • Hoofnagle A.N.
      • HüttenhainR.
      • Komen J.m.
      • Liebler D.C.
      • 刘涛。
      • 麦克莱恩B.
      • MANI D.R.
      • 曼斯菲尔德E.
      • Neubert H.
      • Paulovich A.G.
      • 重新勒
      • Vitek O.
      • Aeberberold R.
      • 安德森L.
      • 贝瑟姆R.
      • Blonder J.
      • Boja E.
      • Botelho J.
      • Boyne M.
      • Bradshaw R.A.
      • 伯灵名A.L.
      • 陈德。
      • Keshishian H.
      • Kuhn E.
      • kinsinger c.
      • 李继夫
      • 李S.W.
      • 莫里茨R.
      • OSS-Prieto J.
      • rifai n。
      • 里奇J.
      • Rodriguez H.
      • srinivas p.r.
      • Townsend R.R.
      • van Eyk J.
      • Whiteley G.
      • Wiita A.
      • Weintraub S.
      >生物学和药物中的靶向肽测量:使用拟合方法的质谱法的质谱型测定显影的最佳实践。
      )基于三个复制注射。对于所有肽,LLOQ将LLOQ设置为31个AMOL /μL(塔),因为它们的CV始终低于20%的完整评价结构域(柱上的0.155 fmol-5.0 fmol)。
      通过计算研究中包含的40个肿瘤组织提取物中的每种肿瘤组织提取物的三次重复注射的CV来评价分析方法精度。总体而言,所有样品的CVS,包括LLOQ以下值的CV,范围为所有肽的0.6%至75.6%(表二A补充图S3)。仅考虑LLOQ以上的值,除了肽fvviqnedlgpaspldstfyr.和SGGGDLTLGLEEAPSEAPE之外,所有测量均有下调低于20%的CV。对于肽FVVIQNedLGPASPLDSTFYR,LLOQ的47.2%的测量值为20%,而肽SGGGDLTLGLEEAPSEAPSEA的81.5%的测量值低于20%。
      通过提取40个样本的子集(n = 9)的三个相邻的组织切片并通过从三个组织切片中的每一个来计算CVS来评估整个程序的整个程序(包括样品制备)的再现性 表2. B)。因为复制由三个相邻但略微不同的组织切片构成,所以将过程再现性评估的阈值设定为35%(
      • carr s.a.
      • Abbatiello S.E.
      • Ackermann B.L.
      • 博赫斯C.
      • Domon B.
      • 德意曲e.w.
      • 授予R.P.
      • Hoofnagle A.N.
      • HüttenhainR.
      • Komen J.m.
      • Liebler D.C.
      • 刘涛。
      • 麦克莱恩B.
      • MANI D.R.
      • 曼斯菲尔德E.
      • Neubert H.
      • Paulovich A.G.
      • 重新勒
      • Vitek O.
      • Aeberberold R.
      • 安德森L.
      • 贝瑟姆R.
      • Blonder J.
      • Boja E.
      • Botelho J.
      • Boyne M.
      • Bradshaw R.A.
      • 伯灵名A.L.
      • 陈德。
      • Keshishian H.
      • Kuhn E.
      • kinsinger c.
      • 李继夫
      • 李S.W.
      • 莫里茨R.
      • OSS-Prieto J.
      • rifai n。
      • 里奇J.
      • Rodriguez H.
      • srinivas p.r.
      • Townsend R.R.
      • van Eyk J.
      • Whiteley G.
      • Wiita A.
      • Weintraub S.
      >生物学和药物中的靶向肽测量:使用拟合方法的质谱法的质谱型测定显影的最佳实践。
      )反映这一事实。总体而言,所有值的CV都从6.8%到87.0%,包括LLOQ以下的值。两种肽,GIWIPDGENVK和SLTEILK显示出所有测量或高于LLOQ的35%以下的CV。对于两种肽,ELVSEFSR和SGGGDLTLGLEEAPSEAPR,LLOQ的66.7%的测量结果显示出低于35%的CV,而肽fvviqnedlgpaspldstfyr.和GLQSLPTHDPSPLQR分别在35%CV以下的14.3和0%的测量中表现较少。报告了所有样本的个体CVS 补充表S5.

       定量六个HER2肽

      报道了在40例肿瘤提取物中测量的平均肽量 补充表S6。给定肽的检索量跨越大约两个数量级。另外,在任何给定的样品中,在所有肽中测量的量是高度可变的,通常肽的量平均比最小肽的量高6倍(未显示的数据)。然而,Spearman等级相关性分析对所有样品的所有六种肽显示出显着且正相关(Spearman相关系数:0.832-0.977; p 值(双尾):4.40E-27-2.92E-11),表明每种肽获得的定量数据遵循类似的趋势(表III )。
      表III六HER2肽的刺客相关矩阵。相关系数(ρ)以粗体表示,而P值(双尾)以斜体字符表示
      FVVIQNedlgPaspldstfyr总肿瘤提取物[fmol]0.959
      1.67E-22.
      总肿瘤提取物中的Giwipdgenvk [fmol]0.9150.935
      1.52E-169.90E-19.
      总肿瘤提取物中的GLQSLPTHDPSPLQR [FMOL]0.9040.9380.903
      1.36E-15.5.15E-19.1.56E-15.
      总肿瘤提取物中的SGGGDLTLGLEPSEEAPREEAPREA0.9020.8950.8510.832
      1.80E-156.65E-15.3.67E-122.92E-11.
      总肿瘤萃取物的量SLTEILK [FMOL]0.9770.9680.9390.9010.896
      4.40E-27.2.13E-243.29E-19.2.37E-155.84E-15
      总肿瘤提取物的ELVSEFSR [FMOL]FVVIQNedlgPaspldstfyr总肿瘤提取物[fmol]总肿瘤提取物中的Giwipdgenvk [fmol]总肿瘤提取物中的GLQSLPTHDPSPLQR [FMOL]Tug Tu Mor提取物中的SGGGDLTLGLEPSEEEAPR [FMOL]

        SRM. 数据和IHC或FISH数据之间的协议

      在鱼类别中分配IHC分数 Fig. 2。虽然HER2鱼测定设计用于定量确定HER2基因扩增,并且HER2 IHC测定提供基于细胞膜染色的程度和强度的半定量评分,但HER2 SRM测定报告从宏观大麻肿瘤区域提取的绝对肽量。通过SRM的报告量需要纠正宏观细胞在宏观细胞,例如成纤维细胞,巨噬细胞和淋巴细胞中的存在。因此,我们将HER2肽量调节到肿瘤含量,以获得肽量,好像被取样区域含有肿瘤细胞。另外,为了与IHC和Fish进行比较,有必要为解剖区域的大小规范化,因为表达BAS2的基础水平的大肿瘤可能实际上含有比具有高过表达HER2的小肿瘤更大的绝对HER2肽量。因此,我们考虑了代表肿瘤大小的四个不同参数,并使用这四个参数中的任一个来标准化SRM数据。这些包括肿瘤表面(mm2),通过基于三次KRT19肽的SRM的平均测量,通过比色测定,通过全扫描质谱(任意单位)和KRT19量(PMOL)产生的TIC测量的总肽量(μg)。这导致了四个不同的标准化SRM数据集,又与IHC和鱼类数据匹配。可以在标准化之前和之后的所有样本的SRM数据以及归一化参数的措施 补充表S6,而IHC得分和鱼类比率可以找到 补充表S7。 Spearman等级相关性分析表明,所有四个归一化参数彼此显着呈正相关(Spearman相关系数:0.557-0.897; p 值(双尾):4.96E-15-1.87E-04)(Fig. 3)。然而,目的是,随着所有其他三个参数(Spearman相关系数:0.557-0.572,KRT19肽量较少相关。 p 值(双尾):1.15E-04-1.87E-04)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3标准化因子之间的相关性。 Spearman相关系数和 p 在插入中报告每对的值。
      为了确定SRM生成的数据是否与由IHC或FISH获得的数据匹配,如上所述计算和标准化的肽量被绘制针对IHC评分或鱼类别( 补充图S4A 和 S4B 分别)。发现当绘制IHC评分或鱼类比例时所获得的图案在六种肽之间可重现。正如相关分析所预期的那样,使用四个归一化因素中的任一个也导致了类似的分布模式。使用序数逻辑回归测试SRM HER2肽水平和IHC评分或鱼类比的协议。将预测的IHC或每种样品的鱼与使用Kappa系数的相应实验性IHC分数和鱼比进行比较(表IV.)。还确定了预测和观察得分之间的总体达成百分比。将SRM数据与IHC进行比较时,使用归一化参数3(TIC AUC)(AUC)(TIC的AUC)(95%CI(百分位数,10,000份引导)0.673-0.887)获得最高的κcha系数,达到77.5%( 95%CI(百分位数,10,000个举止)62.5-82.5%)。使用SRM预测鱼率类别时,使用归一化参数2(BCA测定)的肽GLQSLPTHDPSPLQR获得最高的Kappa系数(BCA测定):κ= 0.687(95%CI(百分位数,10,000个举止)0.265-0.705),协议为47.5% (95%CI(百分位数,10,000个举止)32.5-63.3%)。虽然当使用SRM预测鱼分数时,不同的组似乎遵循更清晰的趋势,但预测精度实际上低于使用SRM预测IHC时的预测精度(表IV.)。这可能是因为不同的鱼类比例之间的重叠越大,而不是不同的IHC分数。除了两种最佳性能肽(用于IHC和GLQSLPTHDPSPLQR的ELVSEFSR),该协议也分别为每个IHC得分或鱼类比计算(补充表S7)。肽ELVSEFSR最佳预测IHC分数0 +和3+,分别为88.9%和95.5%的正确分类率,而肽GLQSLPTHDPSPLQR最佳分类肿瘤在第一类(非填充)中有100%正确分类。然而,这种肽不太适合预测其他3个鱼类(正确分类为10-50%)。
      表IV. SRM. 肽金额和IHC评分(A)或鱼类比例(B)之间的同意。 k因素,P值(对于κ因子)和百分比协议为所有六种肽和所有四种正常化因子进行了测试。分别以粗体字符突出显示IHC评分和鱼类类别的最高κ因素
      肽序列归一化参数1(肿瘤表面)归一化参数2(BCA测定)归一化参数3(AUC总离子电流)标准化参数4(平均KRT19肽)
      κ 因素 P值 κ协议 [%]κ 因素 P值 κ协议 [%]κ 因素 P值 κ协议 [%]κ 因素 P值 κ协议 [%]
      A。 SRM肽数量与IHC得分的协议
      Elvsefsr.0.728 3.3E-06. 70.00.817 2.1E-07. 72.50.874 2.9E-08. 77.50.741 1.7E-06. 72.5
      fvviqnedlgpaspldstfyr.0.7153.5E-06.67.50.830 1.5E-07. 77.50.7122.6E-06.70.00.687 7.5E-06. 70.0
      giwipdgenvk.0.741 1.7E-06. 72.50.7122.6E-06.70.00.674 8.8E-06. 67.50.687 7.5E-06. 70.0
      glqslpthdpsplqr.0.707 5.3E-06. 67.50.809 3.0E-07. 80.00.8052.7E-07.77.50.622 6.0E-05. 67.5
      sgggdltlglepseeeapre.0.7122.6E-06.70.00.7122.6E-06.70.00.7262.2E-06.70.00.635 2.8E-05. 67.5
      SLETILK.0.728 3.3E-06. 70.00.8152.4E-07.72.50.779 7.6E-07. 72.50.789 1.9E-07. 75.0
      B。 SRM肽数量与鱼类的同意
      Elvsefsr.0.6027.0E-05.40.00.619 2.8E-05. 45.00.592 7.6E-05. 42.50.5895.8E-05.50.0
      fvviqnedlgpaspldstfyr.0.6422.6E-05.42.50.6033.9E-05.42.50.5681.5E-04.45.00.600 5.5E-05. 47.5
      giwipdgenvk.0.6472.4E-05.47.50.610 4.1E-05. 42.50.585 9.3E-05. 50.00.605 4.2E-05. 45.0
      glqslpthdpsplqr.0.667 1.2E-05. 47.50.688 3.3E-06. 47.50.634 2.9E-05. 42.50.593 6.8E-05. 47.5
      sgggdltlglepseeeapre.0.617 4.1E-05. 42.50.6649.3E-06.45.00.592 7.6E-05. 42.50.6143.7E-05.47.5
      SLETILK.0.664 1.2E-05. 45.00.625 2.3E-05. 45.00.6074.4E-05.45.00.623 2.5E-05. 42.5
      根据与IHC(ELVSEFSR)和FISH(GLQSLPTHDPSPLQR)的比较的最佳性能肽,我们还评估了SRM根据ASCO /帽标准来预测肿瘤分类的能力,用于定义HER2扩增的抗HER2治疗的资格(
      • Wolff A.c.
      • 哈蒙德M.E.
      • 希克斯D.G.
      • Dowsett M.
      • McShane L.M.
      • Allison K.H.
      • Allred D.C.
      • Bartlett J.M.
      • 乏硅
      • Fitzgibbons P.
      • 汉娜W.
      • Jenkins R.B.
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      • Hayes D.F.
      >人体表皮生长因子受体2在乳腺癌中试验的建议:美国临床肿瘤学会/美国病理学家学院临床实践指南更新。
      )( Fig. 4补充表S8)。 HER2扩增的分类定义如下:IHC评分0 +或1+或2+,并被鱼的非涂抹量被认为是HER2的非填充; IHC评分3+或2+和鱼类扩增被认为是HER2放大。两种肽的SRM数据敏感地预测肿瘤的HER2扩增状态(ASCO / CAP),分别具有24.2 fmol和1.002 FMOL的常规精化ELVSEFSR和GLQSLPTHDPSPLQR的阈值,如图所示 补充图S5A 和 S5B。使用这种分类,只有三个伪阳性用于肽ELVSEFSR和肽GLQSLPTHDPSPLQR的四种假阴性(Fig. 4补充表S7)。有趣的是,四或五种肿瘤(取决于所用的肽)被分类为被鱼类扩增但具有IHC评分≤1的≤1被SRM(标记为黄色) 补充表S7)根据考虑的肽,较常见的2+ IHC评分的四种肿瘤被归类为正或阴性。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4描绘肽(A)ELVSEFSR和(B)GLQSLPTHDPSPLQR水平与IHC评分,鱼类类别或HER2放大的肽(A)GLQSLPTHDPSPLQR水平:阴性:IHC分数0 +,1+和2+鱼无扩增;阳性:IHC得分3+,2+和鱼类放大。 使用适当的普通化参数调节每种肽的量。

      讨论

      使用靶向MS的FFPE组织中的蛋白质定量是一个相对较新的领域,只有少数研究报告评估SRM与其他技术(
      • Steiner C.
      • ucret a。
      • Tille J.C.
      • 托马斯米
      • 麦基T.A.
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      • Lescuyer P.
      • Cutler P.
      >质谱法在福尔马林固定石蜡包埋组织中定量蛋白质分析的应用。
      ,
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      • Liao W.L.
      • Thyparambil S.
      • 亨德森L.
      • 徐P.
      • 赵L.
      • rambo b.
      • 哈特J.
      • 萧S.Y.
      • 孟加拉克。
      • Uzzell J.
      • 达尔尔米
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      • CECCHI F.
      • Bottaro D.P.
      • Karrison T.
      • veenstra t.d.
      • Hembrough T.
      • 洞穴J.
      >使用质谱法的绝对定量使用质谱临床应用:测定精度,稳定性和与FFPE肿瘤组织中的达到基因扩增的相关性。
      )。在本文中,我们描述了对FFPE组织中的SRM测定的SRM测定的开发和评价,并评估了SRM与病理学中使用的两种标准方法之间的协议,即IHC和鱼类。与诸如IHC的技术相比,SRM具有允许高水平多路复用的优点,并且不依赖于抗体的可用性以检测分析物。与IHC相比,它也是更有量的定量,这只返回0到3之间的半定量分数。虽然先前的研究在FFPE组织中测量了HER2(
      • Hembrough T.
      • Thyparambil S.
      • Liao W.L.
      • 达尔尔米M.
      • ABDO J.
      • 孟加拉夫
      • 呵呵
      • BENDER R.A.
      • Krizman D.B.
      • 洞穴J.
      >选定反应监测在福尔马林固定的石蜡包埋肿瘤组织中临床验证生物标志物多重定量的应用。
      ),本研究以多种方式互补。主要差异在每种蛋白质监测的肽数量,归一化方面以及数据的统计分析中组成。
      在第一步中,我们对相关且越来越复杂的样品进行了发现蛋白质组学分析,以确定可以在未处理和福尔马林固定材料中提取和检测到哪种HER2肽。虽然这种方法更耗时,但它具有成本效益,因为它减少了合成的标准肽的数量,同时保持在质谱仪中选择良好的肽的高机会。从评价的18个合成的HER2肽,选择六种作为基于其分析性能的SRM测定的候选者。对于SRM测定的最佳特异性,通常应监测每种蛋白质的三种肽和每种肽的三种过渡(
      • Lange V.
      • Picotti P.
      • Domon B.
      • Aeberberold R.
      >定量蛋白质组学的选定反应监测:教程。
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      • 加利斯S.
      • Duriez E.
      • Domon B.
      >选择的反应监测适用于蛋白质组学。
      )。这不是在诸如HER2的大蛋白质的情况下限制,但它可能代表一个只有少数可观察的蛋白质肽的小蛋白质的障碍物。在这项研究中,我们故意选择专注于肽的未修饰形式,尽管HER2在UNIPROT数据库中注释,如含有多种磷酸化和糖基化位点。实际上,它是HER2的过表达,其在临床病理学中测量,用于诊断目的,而不是磷酸化程度。因此,虽然SRM测定中包含的两种肽含有磷酸化位点(SGGGDLTLGlepseeAPR和GLQSLPTHDPSPLQR),但我们没有试图评估这些肽磷酸化的程度。在测定中包括磷酸化肽可以和相对简单,并且技术上可以从FFPE组织中检索磷肽(
      • gámez-pozo A.
      • Sanchez-Navarro I.
      • Calvo E.
      • 迪亚兹E.
      • Miguel-Martin M.
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      • vara j.a.
      >霰弹枪临床癌症样本的蛋白质磷酸化分析由霰弹枪和靶向蛋白质组学方法方法。
      )。但是,问题仍然是FFPE组织的可靠方法。如前所述,与福尔马林固定(如缺血时间,固定持续时间或温度)相关的预分析因子不是标准化的,并且非常可能影响磷酸化水平(
      • 汤普森三。
      • Craven R.A.
      • Nirmalan N.J.
      • Harnden P.
      • Selby P.J.
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      >预分析因素对福尔马林固定石蜡包埋组织蛋白质组学分析的影响。
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      • Mason J.T.
      >朝来改善福尔马林固定的石蜡包埋组织的蛋白质组学分析。
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      • 哈克斯。
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      • Zatloukal K.
      • Becker K.F.
      >临床组织标本中蛋白质和磷蛋白水平的变异性。
      )。
      在第二步中,我们通过评估线性度,LLOQ和测定的再现性来评估分析方法的性能。我们验证了使用细菌蛋白提取物作为可靠基质的制备标准曲线。校准曲线在TNBC提取物中始终低于中 P. furiosus. 矩阵。该效果可以通过与细菌更复杂的人体组织发生的更强的信号抑制来解释 P. furiosus. 提炼。然而,信号线性度在 P. furiosus. 背景技术在三个注射曲线上的三个注射复制以及在不同的日子上单独准备的校准曲线注入三个。当比较在不同天或不同批次的样品中比较样本时,校准曲线的再现性特别重要。因此,这是 P. furiosus. 提取物被认为是适合定量的目的。
      lloq. 为所有六种肽确定,作为最低测定的浓度,精度低于20%,推荐用于开发基于MS的研究用途(第2层)(
      • carr s.a.
      • Abbatiello S.E.
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      • Townsend R.R.
      • van Eyk J.
      • Whiteley G.
      • Wiita A.
      • Weintraub S.
      >生物学和药物中的靶向肽测量:使用拟合方法的质谱法的质谱型测定显影的最佳实践。
      )。事实上,标准的简历飙升 P. furiosus. 背景下方在低于amol范围的低于20%以下。然而,在标准的标准浓度(未显示的数据)的标称浓度方面并不总是准确的,这将是如果将测定用于临床诊断或生物分析实验室(第1级)。在利息的FFPE组织中没有合适的内部蛋白标准来评估消化效率和恢复,真正的准确性可能仍然难以捉摸,并且可能在这种类型的测定中可以实现(
      • carr s.a.
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      >生物学和药物中的靶向肽测量:使用拟合方法的质谱法的质谱型测定显影的最佳实践。
      )。
      关于SRM测定的精度,六个HER2肽中的四种表现出低于20%的CV,对于LLOQ的肿瘤提取物上的所有复制测量值低于20%。评估样品制备方法对SRM测定精度的影响(间歇性精度)(
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      • rifai n。
      • 里奇J.
      • Rodriguez H.
      • srinivas p.r.
      • Townsend R.R.
      • van Eyk J.
      • Whiteley G.
      • Wiita A.
      • Weintraub S.
      >生物学和药物中的靶向肽测量:使用拟合方法的质谱法的质谱型测定显影的最佳实践。
      )。在该实验中,从相同的肿瘤获得样品重复,但从相邻的肿瘤中收集,因此从略微不同的组织切片中收集。与生物流体相比,这不可避免地引入更高的可变性,其中样品重复可以容易地从相同的管衍生,因此显示出相同的蛋白质组合物。因此,我们在这种情况下选择了35%的门槛,而不是20%,而是为了数据解释。如所预期的,当考虑整个样品制备程序时获得的CV比仅为SRM测定的分析精度观察到的那些。然而,对于六种肽中的两种,CV的均低于35%。所有六种肽的样品制备再现性的平均CV为32%,而中位数为30%。
      使用开发的SRM测定,在40个乳腺癌组织提取物中定量了六个HER2肽,改变了HER2基因扩增水平。将SRM产生的结果与标准临床病理方法的结果进行比较。从这些样品中获取的数据的首次观察是不同的肽在给定样品中返回不同的绝对量。这种差异可能反映在消化步骤期间对胰蛋白酶的差异可用性和/或给定肽的样品处理步骤中的较低恢复,从而导致从组织中提取的绝对量。然而,尽管不能用这种方法衍生绝对的组织蛋白质浓度(由于在提取之前掺入FFPE组织中的内标以补偿不完全消化的情况下不可能捕获内标),但是肽量相对变化的观察结果表明肽浓度是蛋白质浓度的合适蛋白质标记。工作正在进行中,开发统计方法,允许从数据组肽量化中可靠地外推。在某些情况下,提供验证研究证明了这种方法的有效性,可以考虑使用肽本身作为生物标志物而不是整个蛋白质。
      分析了40个肿瘤样品的大亚特色,具有低于LLOQ的肽浓度。这并不完全出乎意料,并且已知灵敏度是SRM技术的限制因素。通过该方法可以实现的动态范围确实受到蛋白质混合物的复杂性和柱上的样品载荷的限制。然而,尽管仅通过最佳精度量化具有高水平HER2(通常是IHC评分3+)的样品,但LLOQ以下的值应小心,而不是系统地被忽视,因为它们仍然可以提供有用的信息,特别是因为CVS低于20对于一些数据点观察%。
      在没有标准程序的情况下考虑样本大小,考虑了四种不同的参数进行标准化。所有四个参数彼此显着相关,尽管与三个其他归一化参数相比,KRT19显示较差的相关系数(Fig. 3)。预期代表提取的组织表面的一般参数,肽的总量或彼此彼此高度相关的提取肽的总量。 KRT19的相关性较差以及与IHC数据的较低协议的相关性可能是通过KRT19在癌细胞中表达但不在样品中存在的其他细胞中的事实来解释。宏观大麻肿瘤区含有大多数表达KRT19的肿瘤细胞,但也具有不表达KRT19的其他细胞(淋巴细胞,成纤维细胞等)。因此,KRT19不准确地表示样品中的细胞总量。根据样品,KRT19阳性细胞的比例将改变,解释KRT19与其他参数的较低相关性。有趣的是,使用肿瘤表面进行归一化以及其他程序。我们预期的肿瘤表面与在样品制备之前唯一获得的参数相比,因此不反映样品制备程序所引入的可变性。然而,由于除了KRT19之外彼此高度相互关联的归一化参数,使用肿瘤表面的尺寸标准化是一种方便的方法,因为它可以容易地测量并且不会受到样品制备引入的任何潜在偏差的影响。
      在我们的研究中,我们调查了SRM肽水平与IHC评分或鱼类比例的协议。所有六种肽显示出类似的趋势,并同意IHC和鱼类数据。尽管如此,SRM数据与IHC分数的比较显示,SRM无法成功区分较低的IHC评分(0 +,1+和2+)彼此。这些结果可以反映IHC评分的半定量(非线性)性质,其已经被校准和标准化,其表达已知数量的HER2分子以促进免疫抑制(
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      致谢

      我们感谢Tom Dunkley和Arno Friedlein在研究过程中进行建设性讨论。

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