蛋白质组学分析揭示了粒细胞 - 巨噬细胞群刺激因子(GM-CSF)和巨噬细胞群刺激因子(M-CSF)生长巨噬细胞衍生自鼠骨髓细胞的不同代谢差异*

      巨噬细胞对于控制传染性药物和组织稳态至关重要。巨噬细胞需要各种功能性能力,以满足我们体内不同的角色,一种是一种快速且稳健的免疫反应。为了深入了解巨噬细胞可塑性和治疗其特定功能的关键调节蛋白网络,我们对鼠主式GM-CSF和M-CSF生长骨髓衍生的巨噬细胞的蛋白质组和磷脂蛋白酶进行了定量分析(GM-BMMS和M-BMMS,分别使用基于最新的异级标签标签(TMT)标记和液相色谱 - 串联质谱(LC-MS / MS)。尖锐的,代谢过程被出现在这些巨噬细胞之间的主要区别。具体而言,GM-BMMS显示出涉及糖酵解,甲戊类化途径和氮化合物生物合成的显着富集的蛋白质。这种增强GM-BMMS的糖酵解能力的证据对其促炎反应特别重要,因为在GM-BMMS中LPS刺激的细胞因子增加了细胞因子的产生取决于它们的急性甘醇能力。相比之下,涉及内吞作用的M-BMMS上调蛋白质,其与稳态功能的趋势相关,例如清除细胞碎片。我们的数据在一起描述了一种蛋白质组学网络,使GM-BMMS的促炎动作和M-BMMS的稳态功能为基础。
      巨噬细胞是一种异质的免疫细胞群,对于起始和解决病原体或组织损伤诱导的炎症是必不可少的(
      • 戈登斯。
      • 泰勒P.R.
      单核细胞和巨噬细胞异质性。
      )。它们表现出显着的可塑性,使它们能够有效地对环境信号进行响应,并在细胞因子和微生物信号上改变它们的表型和生理学(
      • 搬运工D.M.
      • 爱德华兹J.P.
      探讨巨噬细胞激活的全谱。
      )。这些变化可以产生具有不同功能的细胞群,其特征在于产生促炎和抗炎细胞因子(
      • 戈登斯。
      巨噬细胞的替代活化。
      )。在影响巨噬细胞激活状态的生长因子中,两种细胞因子在控制炎症条件下巨噬细胞谱系群体的血液细胞血栓菌落刺激因子(GM-CSF)中似乎重要 1 和巨噬细胞殖民地刺激因子(M-CSF)(
      • Fleetwood A.J.
      • 厨师A.D.
      • 哈密​​尔顿J.A.
      粒细胞 - 巨噬细胞殖民地刺激因子的功能。
      )。尽管具有不同的角色,但这些CSF对适当的维护是至关重要的稳态巨噬细胞发展至关重要。 GM-CSF在诱导应急造血中不处于稳定状态的作用,影响各种炎症和自身免疫疾病的发病机制(
      • 哈密​​尔顿J.A.
      炎症和自身免疫中的殖民地刺激因子。
      )。在这一行, 体外 生成的GM-CSF生长的巨噬细胞现在被认为是促炎巨噬细胞,与M-CSF生长的巨噬细胞相比,在LPS刺激上显示鲁棒免疫应答(
      • Fleetwood A.J.
      • 劳伦斯T.
      • 哈密​​尔顿J.A.
      • 厨师A.D.
      粒细胞 - 巨噬细胞菌落刺激因子(CSF)和巨噬细胞依赖性巨噬细胞表型显示细胞因子谱和转录因子活动的差异:CSF阻滞在炎症中的影响。
      )。相比之下,M-CSF有助于维持大多数常驻巨噬细胞,包括破骨细胞 体内 已知影响巨噬细胞的稳态抗炎特征。 M-CSF成长巨噬细胞被广泛接受 体外 - 生成的巨噬细胞来源是因为它们显示出相对均匀且稳定的巨噬细胞表型(
      • 默里P.J.
      • Allen J.E.
      • Biswas S.K.
      • 费舍尔E.A.
      • Gilroy D.W.
      • Goerdt S.
      • 戈登斯。
      • 哈密​​尔顿J.A.
      • ivashkiv l.b.
      • 劳伦斯T.
      • Locati M.
      • Mantovani A.
      • 马丁内斯F.O.
      • Mege J.L.
      • 搬运工D.M.
      • Natoli G.
      • Saeij J.P.
      • 舒尔兹J.L.
      • Shirey K.A.
      • SICA A.
      • Suttles J.
      • Udalova I.
      • van ginderachter J.A.
      • Vogel S.N.
      • Wynn T.A.
      巨噬细胞激活和极化:命名和实验指南。
      )。已经进行了许多基因组研究以响应促炎/抗炎刺激而分析巨噬细胞活化。然而,迄今为止,目前没有关于全局蛋白质组学差异的明确报告,用于控制不同分化或活化巨噬细胞的功能特征(
      • 马丁内斯F.O.
      • 戈登斯。
      • Locati M.
      • Mantovani A.
      人单核细胞对巨噬细胞分化和极化的转录分析:基因表达的新分子与模式。
      ,
      • McDermott J.E.
      • Archuleta M.
      • thrall b.d.
      • Adkins J.N.
      • 水壶
      控制响应:在巨噬细胞激活中高中心,病原体靶向核心响应模块的预测建模。
      ,
      • NAU G.J.
      • 里士满J.F.
      • Schlesinger A.
      • 詹宁斯尤。
      • 着陆器E.S.
      • 年轻的R.A.
      细菌病原体诱导的人巨噬细胞激活计划。
      ,
      • Ramsey S.A.
      • klemm s.l.
      • zak d.e.
      • 肯尼迪K.A.
      • Thorsson V.
      • 李b.
      • Gilchrist M.
      • 黄金E.S.
      • 约翰逊C.D.
      • Litvak V.
      • 纳瓦罗G.
      • 蟑螂J.C.
      • 罗森伯格下午
      • 生锈A.G.
      • Yudkovsky N.
      • Aderem A.
      • Shmulevich I.
      通过从主题扫描和表达动态集成证据来揭示巨噬细胞转录程序。
      )。为了充分阐明促进炎症巨噬细胞的促进巨大免疫反应需要评估其全球细胞内蛋白质组织网络签名。
      长期以来一直是欣赏的,特别是在癌症领域,对于细胞活化的变化如何与细胞代谢态的变化重合(
      • vander heiden m.g.
      • 坎特利L.C.
      • 汤普森C.B.
      了解Warburg效果:细胞增殖的代谢要求。
      ,
      • 拉菲尔州A.
      • Rizzuto R.
      线粒体长寿途径。
      )。重要的是,在过去的几年中,它越来越明显,免疫细胞活化也偶联于细胞代谢的深刻变化,并且它们的命运和功能是代谢调节的(
      • Pearce E.L.
      • Pearce E.J.
      免疫细胞活化和静态中的代谢途径。
      )。符合这一点,在本研究中,我们发现GM-CSF生长的巨噬细胞通过上调糖酵解酶以及与M-CSF生长巨噬细胞相比的高脂质/氮化合物生物合成酶具有更高的糖醛容量。当足够的葡萄糖可用时,它们仅在TLR配体刺激时产生强大的炎症细胞因子。
      在这里,我们使用基于最新的等因素标签的TMT标记和LC-MS / MS进行了对初级GM-CSF和M-CSF生长巨噬细胞的蛋白质组/磷酸磷蛋白酶的定量分析。
      • 天顿L.
      • 桑切斯J.C.
      使用串联质量标签技术通过MS / MS进行相对蛋白质定量。
      )。这种具有高吞吐量技术的蛋白质组学方法是第一次显示原发性GM-CSF和M-CSF生长巨噬细胞之间的根本差异,最后显示先天细胞合成代谢代谢铺平诱导鲁棒免疫反应的方式。在这项研究中,我们描述了GM-CSF和M-CSF生长巨噬细胞的总网络地图中的个体差异表达蛋白,并预测它们是如何专门参与启动炎症或分辨率的研究。

      实验步骤

       巨噬细胞准备

      C57BL / 6J小鼠是从杰克逊实验室(Bar Harbor,Me)获得的。 5至10周龄的雄性小鼠用于分离骨髓细胞。小鼠在特定的无病原体(SPF)条件下,并根据护理和使用由首尔国立大学的动物护理和使用委员会制备的实验室动物的护理和使用指南进行照顾。所有实验都是由首尔国立大学动物护理和使用委员会批准(登录号码SNU-130311-2-2)批准。如前所述分离骨髓衍生的巨噬细胞(BMM)(
      • na y.r.
      • yoon y.n.
      • 儿子D.I.
      • Seok S.H.
      环氧氧酶-2抑制块M2巨噬细胞分化并抑制鼠乳腺癌模型中的转移。
      )。为了丰富巨噬细胞人口,我们补充了25 ng / ml鼠GM-CSF(Miltenyi Biotech,Bergisch Gladbach,德国)的完整培养基,用于GM-CSF种植骨髓衍生的巨噬细胞(GM-BMMS)或20%L929鼠纤维肉瘤细胞系M-CSF种植骨髓衍生巨噬细胞(M-BMMS)的培养上清液。分化7天后,用脂多糖刺激GM-BMMS和M-BMMS( 大肠杆菌 lps,sigma)100ng / ml 2小时。处理四组(GM-BMM,GM-BMM / LPS,M-BMM,M-BMM / LPS)进行进一步分析。

       流式细胞仪

      用稀释至FACS缓冲液(PBS,5%FBS,5米的PBS,5%FBS的最佳浓度,将巨噬细胞捕获并孵育20分钟。m EDTA和1%NAN3)。对于细胞分选和蛋白质组学分析,抗体包括抗CD45(30-F11),F4 / 80(BM8),CD11b(M1 / 70)和IA / IE(M5 / 114.15.2)。对于表面标志物表达分析,附加抗体包括CD11C(HL3),CD80(L307.4),MERTK(克隆125518,R&除非表明,否则D Systems,Minneapolis,Mn)和CD64(X54-5 / 7.1,BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ)是从埃比科购买的。将细胞分类在体积素上,或在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上获得数据。使用Flowjo软件分析表面标记表达式。

       胰蛋白酶消化,TMT标记和脱凝胶分馏

      使用过滤辅助样品制备(FASP)方法消化等同的蛋白质量(
      • am V.O.S.
      • Dominin S.G.
      • Kutepov E.N.
      • Leonov A.v.
      • Lobov A.v.
      • Maimulov V.G.
      • Nesvizhskii IU V.
      • Semenova V.v.
      • Fokin M.V.
      • Tselykovskaia n。
      [医疗专业培训医师:问题和前景]。
      )。简而言之,用8洗涤裂解物 m 尿素,然后用50米烷基化m 碘乙酰胺(室温20分钟)。烷基化后,用8洗涤过滤器 m 尿素两次,0.1 m 用TMT试剂标记两次Teab两次。以1μg胰蛋白酶的比例加入胰蛋白酶:50μg蛋白质,并在37℃下孵育过夜。通过Thermo Fisher Scientific(Rockford,IL)描述的协议,分别在TMT Sixplex试剂中具有四种不同的质量标签,在TMT Sixplex试剂中标记了四种细胞裂解物的胰蛋白酶摘要。由此产生的TMT标记的肽受肽等电池(IEF)分馏,根据制造商的说明,具有“低分辨率试剂盒”pH 3-10(Agilent Technologies,Santa Clara,CA)的3100个Effigel分级。

       使用TiO的磷肽富集2

      磷酸富集富集如钛席中所述进行 Tm值 Phos-TiO2 套件手册。简而言之,用5%氢氧化铵水溶液和来自Phos-TiO的5%吡咯烷溶液洗脱磷酸肽2 (3毫克/200μl,泰卢佩雷,GL Sciences Inc,东京,日本)旋转柱。

       质谱分析和数据库搜索

      使用Q-辐射质谱仪(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Germany)分析提取的胰蛋白酶肽,与Easy-NLC系统(Thermo Fisher Scientific,Odense,Denmark)相结合。在0.1%甲酸中重新悬浮胰蛋白酶肽并在易喷雾柱上分离(C18,2μm粒径,孔径,75μm×50cm长,Thermo Fisher Scientific)。用溶剂B的线性梯度(100%ACN,0.1%甲酸)分解样品;超过76分钟的5-50%,超过12分钟的50-90%以300 nl / min的流速。在2.1kV的电喷雾电压下将从分析塔洗脱的分离的肽离子进入质谱仪。所有MS / MS光谱都是以数据相关模式获取的,用于从全MS扫描的10个最丰富的峰的碎片,具有30%的归一化碰撞能量。动态排除持续时间设定为20 s,隔离质量宽度为2.5 da。 MS光谱在M / Z 200的400-1800m / z和70,000分辨率的质量范围内获得,以17,500的分辨率获得MS / MS分辨率。获取的MS / MS光谱是针对通用蛋白质资源小鼠蛋白质数据库(Uniprot发布2013_09,50287条目, http://www.uniprot.org/)蛋白质组发现者的续集算法1.4(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Bermany)。搜索参数如下:胰蛋白酶特异性,最多两个错过的裂解位点,前体离子和片段离子的质量公差分别设定为10ppm和0.8Da,固定改性氨基甲酰 - 半胱氨酸,TMT 4-Plex的赖氨酸和N甲硫氨酸氧化的终末和可变改性。在数据库搜索之后,将输出文件导入脚手架Q +(版本Scaffold_4.3.2,Proteome Software Inc.Portland,Or)。使用支架来组织所有数据,以定量蛋白质并使用肽先知算法验证肽鉴定(
      • 凯勒阿。
      • nesvizhskii a.i.
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
      )。我们选择具有FDR截止的肽= 0.01和肽阈值95%。然后,我们鉴定了99.9%的蛋白质。验证的数据在肠内通道和TMT信号之间归一化,显示出至少1.5倍的丰度变化用于蛋白质的定量分析。质谱蛋白质组学数据已经沉积在Proteomexchange联盟(
      • VizCaino J.A.
      • 德意曲e.w.
      • 王R.
      • Csordas A.
      • Reinger F.
      • ríosd.
      • 戴安斯J.A.
      • 太阳Z.
      • Farrah T.
      • Bandeira N.
      • binz p.a.
      • Xenarios I.
      • 艾森凯母线
      • Mayer G.
      • Gatto L.
      • 坎波奥A.
      • Chalkley R.J.
      • Kraus H.J.
      • Albar J.P.
      • 马丁内斯 - Bartolome S.
      • APWEILER R.
      • OPENN G.S.
      • 玛特L.
      • 琼斯A.R.
      • Hermjakob H.
      Proteomexchange提供全球协调的蛋白质组学数据提交和传播。
      )通过具有DataSet标识符PXD002582的自豪伙伴存储库。

       去分析

      使用David软件确定由蛋白质组表示的基因本体生物过程(Gobps)(
      • 黄达W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      )。对于每组蛋白质,我们鉴定了基因代表的GOBP p 价值 <0.05使用String V9.1(
      • Franceschini A.
      • Szklarczyk D.
      • 弗里兰德尔
      • Kuhn M.
      • Simonovic M.
      • 罗斯A.
      • 林J.
      • Minguez P.
      • Bork P.
      • von mering c.
      • Jensen L.J.
      串V9.1:蛋白质 - 蛋白质相互作用网络,覆盖率和集成增加。
      )。使用百分点计算中心(k)和最短路径中心(SP)(
      • Scardoni G.
      • Petterlini M.
      • 劳娜C.
      用百分点分析生物网络参数。
      ),除去具有Sp = 0或k = 1的非蛋白质。具有相同GOBP的节点被分组为相同的模块,每个模块由相应的GOBP命名。使用Cytoskape(v.2.8.3)可视化网络(
      • smoot m..
      • ono K.
      • Ruscheinski J.
      • 王P.L.
      • IDEKER T.
      Cytoscape 2.8:数据集成和网络可视化的新功能。
      )。

       RNA分离和基因表达分析

      使用AffymetrixGeneChip®小鼠基因1.0 ST寡核苷酸阵列进行全局基因表达分析。样品制备根据制造商提供的指示和建议进行。根据制造商的说明,通过Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)提取总RNA。表达数据由Affymetrix表达式控制台软件版本1.1生成。对于归一化,RMA(鲁棒多平均)算法在Affymetrix表达式控制台软件中实现。

       Western Blotting.

      如前所述,裂解分选的GM-BMMS和M-BMMS进行蛋白质表达(
      • 儿子D.
      • na y.r.
      • Hwang E.S.
      • Seok S.H.
      血小板衍生的生长因子-C(PDGF-C)通过AKT和磷酸化致癌巨噬细胞诱导抗凋亡作用。
      )。在1/2000稀释液中使用抗筛脱氢酶B链(Thermo),抗磷酸异常-1(Santacruz,TX),抗癫痫磷酸异构酶A(Abcam,Cambridge,UK)和Antacta rus(Santacruz)和抗生素(Santacruz)以1/2000稀释。

       细胞因子生产

      将GM-BMMS和M-BMMS在5×10的96孔板上播种5/200μl具有完整介质并休息6小时。用LPS(100ng / ml)刺激巨噬细胞4小时和24小时。收集上清液并在-80℃下储存直至TNFα,IL-6和IL-10定量。对于IL-1β定量,细胞在RIPA缓冲液中裂解并储存在-80℃。分析每个孔中的细胞使用BCA测定试剂盒(Thermo,Waltham,MA)分析它们的蛋白质浓度,并且用作细胞因子定量的归一化因子。使用Duoset ELISA试剂盒测定细胞因子浓度(R.&D Systems,Minneapolis,Mn)。

       乳胶珠吞噬作用

      将GM-BMMS和M-BMMS在12孔板上播种为106/ ml完整介质并休息6小时。将每孔细胞与10孵育7 Alexa 350标记的胶乳珠子(分子探针,eugene,或),直径为1μm。在LSRII流式细胞仪(BD Biosciences)上分析吞噬细胞珠的数量,并使用Flowjo软件进行分析。

       Ecar和OCR测量

      Seahorse XF-24代谢细胞外助焊剂分析仪(Seahorse Bioscience,Billerica,MA)用于分析Ecar(MPH / min)和OCR(在PMOL / min)(
      • 丝波Z.
      • 吴j.x.
      谷胱甘肽和过氧化氢酶在LPS活化的肝内皮和Kupffer细胞中的H2O2解毒中的作用。
      )。简而言之,GM-BMMS和M-BMMS在Seahorse Cells板中分化7天(5×105 每孔细胞)。在板读数之前,用葡萄糖自由测定介质(Seahors Bioscience)洗涤细胞三次,并在含葡萄糖的测定介质中评估OCR和Ecar。通过添加葡萄糖(10米)实现了GM-BMMS和M-BMMS代谢途径的扰动分析(10米m),低聚霉素(5μm),2-脱氧葡萄糖(100米m)或LPS。使用以下测定条件进行海马系统的实验:2分钟混合物; 2分钟等; 4-5分钟测量。然后计算代谢参数。

       统计分析

      除非另有说明,否则所有数据显示为平均值±S.E.并使用双尾学生进行测试 t 使用GraphPad Prism 4进行测试或双向ANOVA。

      结果

       GM-BMMS蛋白质组和磷酸磷蛋白酶和M-BMMS的定量分析

      根据所示的门控策略进行蛋白质组学分析的巨噬细胞分选 Fig. 1A。我们首先表征了 体外 GM-CSF种植骨髓衍生的巨噬细胞(GM-BMMS)和M-CSF生长骨髓衍生的巨噬细胞(M-BMMS)。 GM-GMMS是CD45+ ,f4 / 80 +,和mhcii.+。 M-BMMS显示均匀群体,表达了CD45,F4 / 80和CD11B。 GM-BMMS表示CD11C,CD80以及巨噬细胞标记CD64(Fig. 1B )(
      • Gautier E.L.
      • Shay T.
      • 米勒J.
      • Greter M.
      • Jakubzick C.
      • Ivanov S.
      • 他的J.
      • 周A.
      • ELPEK K.G.
      • Gordonov S.
      • mazloom a.r.
      • Ma'ayan A.
      • chua w.j.
      • 汉森T.H.
      • 托利S.J.
      • Merad M.
      • randolph g.j.
      免疫基因组基因表达谱和转录调节途径,提出小鼠组织巨噬细胞的身份和多样性。
      )。相反,M-BMMS表达了MHCII,CD11c和CD80,表明抗原呈现能力不良。相反,它们表达了相对较高的偏置,其被M-CSF进一步上调(
      • Zizzo G.
      • 希尔第B.A.
      • 纪念碑M.
      • 科恩P.L.
      通过人巨噬细胞的早期凋亡细胞的有效间隙需要M2C偏振和MERTK诱导。
      )。根据上述Gating策略,进一步的实验使用了分类的GM-BMMS和M-BMM。在GM-CSF培养细胞的情况下,CD45的小人口+F4/80 低的 MHCII. 高的 在整个实验中排除树突细胞。为了富集早期的TLR响应性蛋白以及核心偏振特异性蛋白质,我们有四种GM-BMMS和M-BMMS的实验组,其中没有LPS刺激2小时(Fig. 1C)。通过将蛋白质提取物组合每组5只小鼠的蛋白质提取物产生三种生物学复制。 TMT标记(FourPlex)定量蛋白质组学方法用于在整个细胞提取物中谱系蛋白质丰度和磷酸化化学计量的变化。对Q-辐射质谱仪上这些提取物的比较MS分析导致390蛋白的鉴定为33,472个独特的肽,平均序列覆盖率为23%(Fig. 1D, 补充表S12-S13)。尽管对于大多数GM-BMMS和M-BMMS的大多数鉴定的蛋白质,表达水平仍未受到TLR刺激,但是294个蛋白的子集显示出超过1.5倍的丰度变化(补充表S1和S2 )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1GM-BMMS / M-BMMS的定量蛋白质组学/磷肝蛋白酶分析。 A,GM-BMMS和M-BMMS分别与GM-CSF或M-CSF补充的C57BL / 6J雄性小鼠骨髓细胞分别为7天。细胞由CD45分选+F4/80+ MHCII. + GM-BMMS的人口或CD45+F4/80+CD11b+ M-BMMS的人口。 B,表面标记检查GM-BMMS和M-BMMS。用适当的抗体染色附着的细胞,并分析了每个门控群的表面MHCII,CD11C,CD80,CD64和MERTK表达式 A。进行了三个独立的实验。 **, p < 0.01, ***, p < 0.001 by Student t 测试。 C,实验策略。合并巨噬细胞蛋白以产生每种GM-BMM / M-BMM / gm-BMM + LPS / M-BMM + LPS实验组的生物重复。 D,蛋白质表达实验的结果。 E,磷脂蛋白酶组的结果。 F,在蛋白质组和微阵列分析中检测到的基因符号的散点图。数据表示日志的折叠变更2(GM-BMM / M-BMM)2491基因。回归 p 值= 2.1987E-242,R-SQUE = 0.31352。 G,去分析差异表达蛋白质和磷酸肽。热图显示了重要的GO生物过程术语(p <0.05)对于GM-BMM / M-BMM和GM-BMM + LPS / M-BMM + LPS之间的差异表达蛋白质/磷蛋白。红颜色表明GM-BMM或GM-BMM / LPS中增加的蛋白质/磷蛋白丰度,蓝色表明M-BMM或M-BMM / LP中增加的丰富。星标记显示热爱中最丰富的Go类别。
      我们接下来检查了GM-BMMS和M-BMMS之间蛋白质磷酸化状态的差异以及GM-BMMS / LPS和M-BMMS / LPS(Fig. 1E)。该分析导致鉴定来自1274磷蛋白(4844磷酸化位点,肽概率的2239个独特的磷酸肽 >95%和蛋白质概率>99%)。将鉴定的磷酸化位点与来自Phosida的那些进行比较(
      • GNAD F.
      • Gunawardena J.
      Phosida 2011:翻译后修改数据库。
      ),磷化普普(
      • 哈贝克P.V.
      • Kornhauser J.M.
      • TKachev S.
      • 张B.
      • Skrzypek E.
      • 默里B.
      • Latham V.
      • Sullivan M.
      磷化普普斯:一种综合资源,用于研究实验确定人和小鼠的翻译后修饰的结构和功能。
      )和磷酸盐(
      • Dinkel H.
      • Chica C.
      • 通过A.
      • gould c.m.
      • Jensen L.J.
      • 吉布森T.J.
      • Diella F.
      Phospho.elm:磷酸化站点的数据库 - 更新2011。
      )表明,先前尚未报告2541位点(〜52%)。我们还使用概率得分函数评估了网站本地化的置信水平,并确定了34%的已识别的网站(1635个站点)对应于高置信分配(补充表S11)。其中450和899族磷酸肽,对应于228和481蛋白,分别在GM-BMMS和M-BMMS之间差异调节LPS刺激(补充表S8 )。
      散射蛋白丰度和mRNA表达(Geo Incession Number) GSE63245. )显示微阵列数据与项目蛋白质数量的一般预测能力(Fig. 1F),但仍然有限于代表具有回归的确切整个蛋白质巨噬细胞 p 价值 of 2.1987e−242 和0.31352的R范围。这意味着大量巨噬细胞蛋白通过翻译后修改,我们的蛋白质组学数据可以在相反表征巨噬细胞之间提供有价值和精确的洞察力。

       GO分析显示了代谢作为巨噬细胞功能的关键调节因子

      要深入了解每种巨噬细胞类型的功能差异,我们对来自差异表达蛋白质(Deps)和差异磷酸化蛋白(DPP)的生物过程的基因本体(GO)注释在GM-BMMS / M-BMMS和GM中进行了比较-BMMS / LPS M-BMMS / LPS对(Fig. 1G)。共富集了52个类别,并以热爱图呈现。有趣的是,GM-BMMS和GM-BMMS / LPS巨噬细胞最明显的丰富类别是代谢过程( 表I. )。这些包括碳水化合物分解代谢,葡萄糖代谢,醇分解代谢,脂质生物合成和氨基酸代谢过程( 表I. )。与GM-BMMS相比,GO术语大分子复合亚基组织以GM-BMMS / LPS增强。这些能量消耗方法可能通过GM-BMMS中的葡萄糖代谢/氮化合物生物合成和脂质合成途径来支持,与迅速增殖的癌细胞(
      • Imamura K.
      • Ogura T.
      • Kishimoto A.
      • Kaminishi M.
      • Esumi H.
      通过P53活化蛋白激酶活化剂,5-氨基咪唑-4-甲酰胺-1-Beta-D-核尿尿苷中的P53磷酸化通过P53磷酸化,在人肝细胞癌细胞系中。
      )。分泌,染色质组织和凋亡在GM-BMMS / LPS中特别上调。
      表I. 在基因本体学中富集的蛋白质列表从GM-BMMS与M-BMMS之间的差异表达蛋白质丰富和GM-BMMS + LPS VS M-BMMS + LPS:在GM-BMMS中上调
      基因符号蛋白质名称比率gm-bmm / m-bmmp value富于富集
      葡萄糖代谢过程0.000067.84
      aldoc 果糖 - 双磷酸醛磷酸酶C.2.22
      ENO1alpha-enolase.1.57
      FABP5脂肪酸结合蛋白,表皮2.64
      GYS1糖原γ合成酶,肌肉1.68
      LDHB. l - 递乳脱氢酶B链2.00
      PFKP. 6-磷蛋白酶1.80
      Pygl. 糖原磷酸化酶,肝脏形式1.62
      RPIA. 核糖-5-磷酸异构酶1.62
      氮复合生物合成过程0.021973.18
      ASS1精氨酸琥珀酸合成酶13.03
      ATP6V0D2V型质子ATPase亚单位D22.93
      Kynu. kynureninase.1.62
      PADI4蛋白质 - 精氨酸脱氨酶型-41.74
      PHGDH. d-3-磷酸性脱氢酶2.00
      RRM1核糖核苷 - 二磷酸还原酶大亚基1.93
      SLC7A2低亲和力阳离子氨基酸转运蛋白21.68
      脂质生物合成过程0.000214.80
      ac ATP-柠檬酸合酶1.62
      ALOX5arachidonate 5-脂脂酶1.68
      CD74H-2类II组组织相容性抗原γ链2.46
      FABP5脂肪酸结合蛋白,表皮2.64
      Fasn. 脂肪酸合成酶1.62
      FDPS. 法呢基焦磷酸合成酶2.00
      HMGCS1羟甲基戊芳基合成酶,细胞质1.68
      IDI1异戊基二磷酸二磷酸二磷酸三磷酸二苯甲酸酯11.93
      LTA4H白三烯A4水解酶2.00
      MVD. 二磷甲醛脱羧酶2.00
      相比之下,M-BMMS和M-BMMS / LPS具有不同的富集功能,因为它们显示出更高的内吞作用和稳态流程。值得注意的是,“通过氧化有机化合物的能量衍生”在M-BMMS中高度上调(Fig. 1G),显示一种代谢状态,即GM-BMMS的逆转(表二)。这对LPS刺激降低,意味着从氧化到其他过程的代谢变化。 DEPS的亚细胞分布还表明,与GM-BMMS相比,在M-BMMS中高度富集的线粒体组分,表明氧化过程作为其蜂窝能源的偏差(补充表S9)。与内吞咽症/吞噬作用有关的几种信号途径,包括小GTP酶和RA,富含M-BMMS和M-BMMS / LPS。
      表二在基因本体学生物过程中富集的蛋白质列表来自GM-BMMS与M-BMMS与M-BMMS和GM-BMMS + LPS vs M-BMMS + LPS的差异表达蛋白质丰富:在M-BMMS中上调
      基因符号蛋白质名称比率m-bmm / gm-bmmp value富于富集
      通过氧化有机化合物的能量衍生0.001806.82
      催化剂1.80
      Gaa. 溶酶体α-葡糖苷酶1.57
      SDHC 琥珀酸脱氢酶细胞色素B560亚基,线粒体1.74
      SLC37A2 糖磷酸交换器21.74
      SOD2超氧化物歧化酶[Mn],线粒体2.46
      SUCLG2琥珀酰基CoA连接酶[GDP成形]亚基β,线粒体1.57
      内吞作用0.000045.9
      ABCA1ATP绑定盒,子家庭A(ABC1),成员11.57
      arhgap27rho gtpase激活蛋白271.57
      BET1Bet1 Golgi膜贩运蛋白1.52
      CD36CD36分子(血栓间素受体)1.80
      EHD1EH-域包含12.22
      ELMO1吞噬和细胞运动11.52
      FNBP1L甲状腺结合蛋白1状2.00
      赫克 血液发作细胞激酶1.74
      ITSN1相结合1(SH3结构域蛋白质)2.14
      TFRC. 转铁蛋白受体2.46
      VAV1VAV 1鸟嘌呤核苷酸交换因子1.57
      在GM-BMMS和GM-BMMS / LPS或M-BMMS和M-BMMS / LPS之间的DPP的综合途径分析(IPA)中也获得了类似的结果。 GM-BMMS / LPS显示出用于细胞因子信令,MAPK信号,TLR4级联以及与基础GM-BMMS相比的MTOR信令事件的增强蛋白质磷酸化(补充表S4)。符合此,与GM-BMMS相比,58个蛋白质上调,与GM-BMMS相比,大多数与免疫应答有关,包括IL-1β,Lactotransfrin,TNF,铜转运蛋白ATOX-1和IL-1α(补充表S3)。 M-BMMS / LPS在DPP的IPA中显示出增强的RHO GTP酶和RAC1活性,与内吞活性相关。 M-BMMS / LPS仅显示七种上调蛋白相对于基础M-BMMS(补充表S7),与GM-BMMS相比,表明显着的下调免疫应答。携带在一起,GM-BMMS具有增强的合成代谢和炎症活动的LPS。相反,M-BMMS具有增强的内纤维过程,并且没有显示出LPS刺激后明显的炎症活性。

       糖酵解签名GM-CSF种植巨噬细胞

      在GM-BMMS上调节葡萄糖代谢的八种蛋白质中,五个是直接糖酵解酶(RPIA,PFKP,LDHB,ENO1,ALDOC)和一个,脓脂,间接相关的糖溶解(Fig. 2A)。其中,通过Western印迹与M-BMMS相比,我们在GM-BMMS中确认了核糖5磷酸异构酶(RPIA)和6-磷质不能(PFKP)的丰富蛋白表达,表明我们的蛋白质组学方法论的可靠性(Fig. 2B )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2GM-BMMS具有比M-BMM更高的糖合容量。 A与M-BMMS相比,GM-BMMS中糖酵解基因和蛋白质的表达谱。 ***, p <双向ANOVA 0.001。 B,RPIA,PFKP和Actin的Western印迹结果。 C,GM-BMMS和M-BMMS的基础OCR和Ecar。使用XF-24细胞外助焊剂分析仪获得的数据。进行了三个独立的实验。 **, p < 0.01 by Student t 测试。 D,GM-BMMS和M-BMMS的最大糖酵母容量。通过加入葡萄糖(10米)实现乳酸盐产生(ecar)的扰动剖析(10米m),低聚霉素(5μm)和2-脱氧葡萄糖(2-dg,100米m)。进行了三个独立的实验。 ***, p <双向ANOVA 0.001。 E,表示GM-BMMS和M-BMMS的平均最大糖型容量的定量图。进行了三个独立的实验。 *, p < 0.05 by Student t 测试。 F,LPS诱导急性糖酵解。用100ng / ml刺激GM-BMMS和M-BMMS 大肠杆菌 LPS并记录Ecar变化。显示相对eCar(%)的数据从基线发生变化。进行了三个独立的实验。 ***, p <双向ANOVA 0.001。 G,对LPS刺激急性糖酵解的葡萄糖效应。 GM-BMMS用带有或没有培养葡萄糖的LPS刺激GM-BMM,并记录Ecar变化。 H-K. ,GM-BMMS以替代依赖性方式产生比M-BMM更多的炎症细胞因子。 GM-BMMS和M-BMMS在5×10的96孔板中进行了分类并叠在96孔板上5 密度。用LPS(100ng / ml)处理细胞或没有2-DG(100μmm)和细胞因子以4小时(TNFα)和24小时(IL-6,IL-1β,IL-10)测量。 ELISA进行量化TNFα(H),IL-6(I),IL-10(K)在培养上清液中生产,或IL-1β合成(J)在细胞裂解物中。进行了三个独立的实验。 **, p < 0.01, ***, p <双向ANOVA 0.001。
      接下来,我们假设GM-BMMS具有比M-BMM更高的最大糖酵母容量。为了评估代谢差异,我们记录了GM-BMMS和M-BMMS的细胞外酸化速率(ECAR)和氧气消耗率(OCR)。虽然OCR是相似的( Fig. 2C)。接下来,我们用葡萄糖和低聚霉素治疗巨噬细胞,以最大化糖酵解,如图所示 Fig. 2D。这证实了GM-BMMS比M-BMMS具有更高的糖蛋白容量(Fig. 2E)。这种差异有助于LPS刺激对急性糖酵解的不同程度,GM-BMMS在LPS处理后显示比M-BMM更突出和延长的核磁曲线(Fig. 2F)。 LPS后巨噬细胞中的急性糖酵解完全依赖于葡萄糖摄取,因为Ecar在没有媒体中没有葡萄糖(Fig. 2G)。总之,这些结果表明,GM-CSF生长巨噬细胞具有与M-CSF生长巨噬细胞具有高于M-CSF的糖型容量,以使葡萄糖转化为响应于LPS而加强血糖转化。

       代谢差异与巨噬细胞中的细胞因子反应有关

      最后,为了测试GM-BMMS和M-BMMS对细胞因子产生的影响,我们使用2-脱氧葡萄糖(2-DG)干扰葡萄糖代谢并测量细胞因子产生作为功能读数。与以前的报告一致(
      • Fleetwood A.J.
      • 劳伦斯T.
      • 哈密​​尔顿J.A.
      • 厨师A.D.
      粒细胞 - 巨噬细胞菌落刺激因子(CSF)和巨噬细胞依赖性巨噬细胞表型显示细胞因子谱和转录因子活动的差异:CSF阻滞在炎症中的影响。
      ),GM-BMMS产生更多TNFα,IL-6和IL-1β而不是M-BMMS(Fig. 2H, 2I , 和 2J)。重要的是,溶解的糖酵解显着降低了GM-BMMS和M-BMMS的基础水平的LPS诱导的TNFα,IL-6和IL-1β产生。巨噬细胞在LPS刺激后产生了类似的IL-10水平,但这也抑制了2-DG(Fig. 2K)。这些结果证实了糖酵解在LPS诱导的促炎细胞因子反应中的重要作用。鉴于LPS诱导的细胞因子产生在很大程度上依赖于糖酵解,所以它推出的是,较甘油的活性GM-BMMS可以比稳态M-BMMS合成大量炎性细胞因子。

       内吞作用占M-CSF成长巨噬细胞的占主导地位

      与GM-BMMS相比,与内吞作用相关的11个与内吞作用有关的蛋白质(Fig. 3A)。 LPS在M-BMMS中进一步上调的内吞作用蛋白(补充表S5)。与GM-BMMS相比,M-BMMS中的上调11个蛋白质中,我们证实转运素受体,CD71(TFRC),其在细胞内传输转铁蛋白并由CSF1上调(
      • Lokeshwar B.L.
      • 林H.S.
      增长因子依赖性调节转化素受体在增殖和静止巨噬细胞中。
      ),在M-BMMS中表达比GM-BMMS更高(Fig. 3B)。 M-BMMS显示蛋白质表达和磷蛋白富集的增强的内吞过程。因此,我们进行了乳胶珠子吸收实验(Fig. 3C)。在GM-BMMS和M-BMMS按照中排序之后 Fig. 1A,用1μm直径为2小时的X350标记的胶乳珠孵育隆起的巨噬细胞。预期的40%的M-BMMS每种细胞有超过四个珠子,但只有20%的GM-BMMS(Fig. 3D)。这些结果证实了我们蛋白质组/磷酸磷蛋白酶组分析与上述巨噬细胞功能特性之间的关系。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3M-BMMS吞噬比GM-BMMS更多的珠子。 A与GM-BMMS相比,N-BMMS中的内吞炎参与者的相对mRNA和蛋白表达水平。 **, p < 0.01, ***, p <双向ANOVA 0.001。 B,TFRC和Actin的Western印迹结果。 C,直方图显示每个细胞的珠子数量。将分选的巨噬细胞恢复并与Alexa350标记的乳胶珠孵育2小时。每巨噬细胞群分析珠吞噬作用(GM-BMMS:F4 / 80 + MHCII. +,M-BMMS:F4 / 80+CD11b+)使用FACS。在两个直方图中表明含有多于四个珠粒的细胞百分比。 D,定量图显示每种细胞超过四个珠子的细胞百分比。进行了三个独立的实验。 *, p < 0.05 by Student t test.

       巨噬细胞蛋白质相互作用网络分析

      为了深入了解GM-BMMS和M-BMMS的蛋白质组和磷脂蛋白,我们使用DEPS和DPP进行了综合调节生物过程的DEPS和DPP,GM-BMMS和M-BMMS之间的六个主要组:( 1)葡萄糖新陈代谢,(2)脂质代谢,(3)氨基酸代谢,(4)DNA复制,(5)内吞作用,(6)rhO / GTP酶信号传导。提供总网络地图 Fig. 4,其描绘了彩色图中的145型DEPP或DPP,以及预测调节转录因子,转运蛋白,酶和用白色圆圈的信号分子。注意,调节糖酵解的转录因子,如HIF1a,myc,foxo1,foxa2,atf4,hnf1a和hnf1b,基于GM-CSF种植巨噬细胞的各种其他方法,包括葡萄糖/脂/氨基酸代谢,免疫应答以及DNA复制。在M-CSF生长的巨噬细胞中,RHO / GTPA酶信号通孔与内吞作用和粘合良好。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4在GM-BMMS中调节蛋白质网络 相对 M-BMMs. 通过使用145种差异表达的蛋白质和磷蛋白在GM-BMMS和M-BMMS之间的差异调节的生物过程中涉及差异的蛋白质和磷蛋白分析蛋白质丰度和磷酸化数据。葡萄糖新陈代谢,脂质代谢,氨基酸代谢,DNA复制,内吞作用和rhO / GTPase信号是最显着影响的子网。蛋白质/节点根据其功能进行分组。红颜色表示GM-BMMS上调和绿色是M-BMMS上调。圆圈意味着DEP,Diamond意味着DPP。预测白圆圈是相互作用的信号分子以及转录因子。所有这些都由基因符号表示。

      讨论

      在这项研究中,我们使用了最新的基于异级标签的多重蛋白质组学/磷蛋白酶定量分析方法,以鉴定GM-CSF和M-CSF生长巨噬细胞之间的关键分子差异。我们发现GM-BMMS具有有效的糖酵解/脂质生物合成途径以及氮化合物生物合成方法。这些增强的合成代谢途径直接链接到它们的促炎细胞因子生产能力。我们还提出了用于破坏巨噬细胞功能的有价值的目标,以及巨噬细胞蛋白的新型磷酸酯(补充表S11)。据我们所知,这是GM-CSF和M-CSF生长巨噬细胞的第一个大规模蛋白质组/磷脂蛋白酶体分析。我们可靠的数据深入了解巨噬细胞中细胞代谢极化的重要性及其功能结果。
      异常的碳水化合物代谢是肿瘤细胞的典型特征(
      • rolfe d.f.
      • 棕色G.C.
      哺乳动物中的细胞能量利用和标准代谢率的分子起源。
      )。通常,正常细胞通过氧化磷酸化产生葡萄糖的大部分ATP。然而,许多癌细胞通过葡萄糖转化为乳酸羟糖产生ATP,因此表现出较低的氧化磷酸化活性。这种“糖酵解表型”确保了快速细胞生长和划分所需的足够大分子生物合成(
      • Mazurek S.
      • eigenbrodt E.
      肿瘤代谢物。
      )。迫使,我们发现GM-BMMS显示出类似于癌细胞的代谢状态。我们证实上调糖酵解酶集体参与LPS诱导的糖酵解,从而与炎性细胞因子制作连接。这些数据给出了我们对受影响的巨噬细胞的巨大影响的深刻影响通常在我们的身体受微生物或无菌炎症刺激的影响时产生(
      • Becker L.
      • 刘n
      • 灵活下午
      • 袁W.
      • PAMIR N.
      • 彭y.
      • Irwin A.D.
      • 傅X.
      • Bornfeldt K.E.
      • Heinecke J.W.
      独特的蛋白质组学签名区分巨噬细胞和树突细胞。
      )。鉴于GM-CSF疗法已被认为是减轻关节炎(
      • 厨师A.D.
      • Pobjoy J.
      • Steidl S.
      • DürrM.
      • Braine E.L.
      • 特纳。
      • Lacey D.C.
      • 哈密​​尔顿J.A.
      粒细胞 - 巨噬细胞殖民地刺激因子是实验性骨关节炎疼痛和疾病发展中的关键介质。
      ),GM-CSF生长巨噬细胞的增强糖酵解途径可能是巨噬细胞介导的炎症疾病的替代特异性有价值的目标。
      值得注意的是,糖醇分解在GM-BMMS中的作用与树突细胞中LPS刺激后的急性糖粘性开关不同,这是IKKε/ TBK1介导的AKT激活(
      • 奥尼尔L.A.
      糖酵解在树突细胞中的TLR重编程。
      ),因为在没有TLR信号传导的情况下,GM-CSF引发的巨噬细胞存在基础增强糖醛。似乎,糖醇的这种偏差不源于TLR介导的诱导型氧化氮合酶(INOS)表达,其产生一氧化氮(NO)并抑制氧化磷酸化(
      • EVERTS B.
      • Pearce E.J.
      树突细胞活化和功能的代谢控制:最近的进展和临床意义。
      )。相反,我们的网络分析预测GM-BMMS具有上行上游葡萄糖调节因子,如HIF1A,MYC,HNF1A(
      • 王H.
      • antinozzi p.a.
      • Hagenfeldt K.A.
      • Maechler P.
      • Wollheim C.B.
      负责胰腺β细胞功能障碍的人HNF1α突变的分子靶标。
      )或foxa2(
      • Wolfrum C.
      • shih d.q.
      • Kuwajima S.
      • Norris A.W.
      • KAHN C.R.
      • 斯福特M.
      FOXA-2在脂肪细胞代谢和分化中的作用。
      )。鉴于已知GM-CSF增加 l24小时后树突状细胞中的myc表达(
      • KC W.
      • satpathy a.t.
      • Rapaport A.S.
      • BRISEÑOC.G.
      • 吴X.
      • Albring J.C.
      • russler-germain e.v.
      • Kretzer n.m.
      • 杜亚五。
      • Persaud S.P.
      • Edelson B.T.
      • Loschko J.
      • Cella M.
      • 艾伦下午
      • Nussenzweig M.C.
      • Colonna M.
      • Sleckman B.P.
      • 墨菲T.L.
      • 墨菲的小墨泥
      最佳T细胞引发需要树突细胞的L-Myc表达。
      ),GM-CSF生长巨噬细胞的糖酵解可能是MYC的进一步上调,因为许多糖酵解酶在其启动子中具有Myc结合位点(
      • Gordan J.D.
      • 汤普森C.B.
      • Simon M.C.
      HIF和C-MYC:控制癌细胞代谢和增殖的兄弟姐妹竞争对手。
      )。 1995年,布里斯特 等等。 据报道,GM-CSF Primes小鼠响应LPS的增强细胞因子产生,我们的结果表明了一个可能的底层机制(
      • 布兰特W.H.
      • 面包师D.A.
      • stam e.j.
      • 嗯J.P.
      • Griffiths R.J.
      GM-CSF. 响应于LPS和TNF,快速引用小鼠以增强细胞因子产生。
      )。
      另一个有趣的结果是GM-BMMS在甲戊类化途径中有上调酶。它们包括在Go术语脂质生物合成过程中:二膦醇脱羧脱羧酶(MVD),法牛糖焦磷酸盐合酶(FDP),羟甲基戊齐芳基合酶(HMGCS1)和异戊基二磷酸二磷酸二磷酸二异构酶1(IDI1)( 表I. )。类似于糖酵解,在肿瘤细胞中失调了甲丙酮途径(
      • 致密的J.W.
      • Pandyra A.
      • Boutros P.C.
      • el ghamrasni s.
      • Khosravi F.
      • 特伦丁G.A.
      • Martirosyan A.
      • 哈克姆A.
      • Hakem R.
      • jurisica I.
      • Penn L.Z.
      甲羟戊酸途径的失调促进转化。
      )几个研究人员试图靶向这种途径以抑制癌症细胞恶性肿瘤(
      • Swanson K.M.
      • HOHL R.J.
      抗癌治疗:靶向甲戊二醇盐途径。
      )。甲戊二醇酯途径是一种复杂的生化途径,产生几种基本产品,包括胆固醇,异戊二烯,多胆,泛醌和异戊烯腺嘌呤(
      • Swanson K.M.
      • HOHL R.J.
      抗癌治疗:靶向甲戊二醇盐途径。
      )。实际上,当巨噬细胞被激活时,糖酵解级联进入甲羟戊酸途径,因为TLR活化诱导的糖酵解产生丰富的丙酮酸和乙酰-CoA,然后在细胞内进行脂质积累(
      • Feingold K.R.
      • Shigenaga J.K.
      • Kazemi M.R.
      • 麦当劳下午
      • Patzek S.M.
      • 十字架。
      • Moser A.
      • Grunfeld C.
      活化巨噬细胞甘油三酯积累机制。
      )。因此,研究甲丙酮途径是否有助于巨噬细胞促炎表型。
      免疫系统由非均相细胞群组成,即大多数情况下,在稳定状态下相对静态,但分享快速响应感染,炎症和其他扰动的能力。对静态和活化状态之间的转变产生了越来越大的欣赏,需要营养成分进入不同的途径,因此,对代谢途径受到调节以支持或直接功能变化的影响存在强烈的兴趣。已经注意到巨噬细胞代谢状态对极化的重要性,并试图靶向各种代谢途径,例如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(
      • 火腿
      • 李约。
      • 崔A.H.
      • jang h.
      • 崔G.
      • 公园J.
      • Kozuka C.
      • 西尔斯D.D.
      • Masuzaki H.
      • 金J.B.
      巨噬细胞葡萄糖-6-磷酸脱氢酶刺激氧化胁迫的促炎反应。
      ),carkl(
      • 哈希米A.
      • 科斯玛P.
      • Gille L.
      • 埃文斯C.R.
      • 鲍恩C.F.
      • Starkl P.
      • KNAPP B.
      • Haas R.
      • 施密德J.A.
      • Jandl C.
      • amir s.
      • Lubec G.
      • 公园J.
      • Esterbauer H.
      • Bilban M.
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      Sedoheptulose激酶Carkl通过控制葡萄糖代谢引导巨噬细胞极化。
      ),PGC-1β(
      • VATS D.
      • Mukundan L.
      • odegaard j.i.
      • 张L.
      • 史密斯K.L.
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      • greaves d.r.
      • 默里P.J.
      • ch
      氧化代谢和PGC-1Beta衰减巨噬细胞介导的炎症。
      ),trap1(
      • 吉达斯。
      • Tsutsumi S.
      • Muhlebach G.
      • 酸奶C.
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