用于鉴定和定量蛋白质组的快速工作流程*

  • 陈鼎
    脚注
    隶属关系
    北京北京辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室。国家工程研究中心蛋白质药物,北京102206

    国家蛋白质药物工程研究中心,北京102206;
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  • 景江
    脚注
    隶属关系
    北京北京辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室。国家工程研究中心蛋白质药物,北京102206

    国家蛋白质药物工程研究中心,北京102206;
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  • 君莹威
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    北京北京辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室。国家工程研究中心蛋白质药物,北京102206

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  • 刘林刘
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    北京北京辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室。国家工程研究中心蛋白质药物,北京102206

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  • 魏张
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  • 明伟刘
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  • 天翼福
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  • 天元陆
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  • 雷松
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  • WANTAO Ying.
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  • 程昌
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  • 杨军张
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  • 杰马
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  • 莱伟
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    国家蛋白质药物工程研究中心,北京102206;
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  • Anna Malovannaya.
    隶属关系
    分子发现中心,Verna和Marrs Mclean生物化学系和分子生物学系,分子和细胞生物学系,贝勒医学院,休斯顿,德克萨斯州德克萨斯州77030;
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  • 李俊嘉
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    中国复旦大学上海医学院免疫学系,中国上海
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  • 北珍
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    北京北京辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室。国家工程研究中心蛋白质药物,北京102206

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  • 易王
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    分子发现中心,Verna和Marrs Mclean生物化学系和分子生物学系,分子和细胞生物学系,贝勒医学院,休斯顿,德克萨斯州德克萨斯州77030;
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  • 富楚他
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    北京北京辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室。国家工程研究中心蛋白质药物,北京102206

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  • 小东倩
    一致
    应讨论谁对应:北京南辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室;国家工程研究中心蛋白质药物,北京102206。电话:86-010-80727777-1231;电子邮件:,和中心,用于分子发现,Verna和Marrs Mclean生物化学系和分子生物学系,分子和细胞生物学系,贝勒医学院,休斯顿,TX 77030。电话:713-798-1507;传真:713-798-1625
    隶属关系
    北京北京辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室。国家工程研究中心蛋白质药物,北京102206

    国家蛋白质药物工程研究中心,北京102206;
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  • 君琴
    一致
    应讨论谁对应:北京南辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室;国家工程研究中心蛋白质药物,北京102206。电话:86-010-80727777-1231;电子邮件:,和中心,用于分子发现,Verna和Marrs Mclean生物化学系和分子生物学系,分子和细胞生物学系,贝勒医学院,休斯顿,TX 77030。电话:713-798-1507;传真:713-798-1625
    隶属关系
    北京北京辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室。国家工程研究中心蛋白质药物,北京102206

    国家蛋白质药物工程研究中心,北京102206;

    分子发现中心,Verna和Marrs Mclean生物化学系和分子生物学系,分子和细胞生物学系,贝勒医学院,休斯顿,德克萨斯州德克萨斯州77030;
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了国家重点基础研究项目的支持(973计划,2012CB910300,2012CB910600);国家高科技r&D节目(863计划,2012AA020200,2012AA020201);国家国际合作补助金(2012年DFB30080);国家自然科学基金(31200582)和北京自然科学基金(5132012)。
    本文包含补充图。 S1至S4和表S1至S5。
    ‡‡作者平等为这项工作贡献。
      当前的深度蛋白质组学利用长色谱梯度来获得更多肽的蛋白质鉴定,导致在3天的质谱仪运行时间内覆盖多达8000哺乳动物基因产物。在这里,我们报告了使用双反相高效液相色谱 - 质谱(HPLC-MS)的快速测序(FAST-SEQ)工作流程,具有短梯度,以在0.5天内达到相同的蛋白质组覆盖率。我们将此工作流程调整为与大规模蛋白质量化兼容的定量版本(快速量化,快速Quan)。我们将两个相同的样本与快速的工作流程进行了两个相同的样本,使我们能够系统地评估影响工作流程灵敏度和精度的不同参数。使用显着测试的统计数据,我们解开了基本的虚假定量差异蛋白的存在和估计存在于无标记量化中的假量化率和参数的相关性。我们优化了可以大大最小化虚假量化差分蛋白的速率的参数的设置,并进一步应用于真实的生物过程。随着效率和吞吐量的提高,我们预计快速SEQ / FAST-QUAN工作流程,允许成对在1天内的两种蛋白质体比较可能使MS可用于群众和影响生物医学研究以积极的方式。
      在过去几年中,质谱的性能已经提高了(
      • Michalski A.
      • 达莫e.
      • Hauschild J.P.
      • lange O.
      • Wieghaus A.
      • Makarov A.
      • Nagaraj N.
      • Cox J.
      • 角horn
      基于质谱的蛋白质组学使用Q辐射,高性能台式四轴锻体质谱仪。
      ,
      • 安德鲁斯G.L.
      • 西蒙斯B.L.
      • 年轻J.B.
      • 霍克里奇上午
      • Muddiman D.C.
      新型混合Quadriupole飞行时间串联质谱仪的性能特征(三重岩5600)。
      ,
      • Michalski A.
      • 达莫e.
      • lange O.
      • Denisov E.
      • 挖掘D.
      • MüllerM.
      • Viner R.
      • 施瓦茨J.
      • 弥补P.
      • 贝尔福德米
      • DUNYACH J.J.
      • Cox J.
      • 角horn
      • Makarov A.
      超高分辨率线性离子捕集器(orbitrap Elite)(orbitrap Elite)促进顶部下降LC MS / MS和通用肽碎片模式。
      ),使大众光谱法的蛋白质组学成为生物研究中大规模蛋白质分析的可行方法。世界各地的科学家正在努力满足识别和定量几乎所有在细胞系或组织中表达的基因产物的承诺。这将使基于质谱的蛋白质分析与第二代MRNA Deep-SEQ技术相容的方法(
      • Nagalakshmi U.
      • 王Z.
      • WAERN K.
      • Shou C.
      • 拉哈D.
      • Gerstein M.
      • 斯奈德米
      RNA测序定义的酵母基因组的转录景观。
      ,
      • mortazavi a。
      • 威廉姆斯B.A.
      • MCCUE K.
      • Schaeffer L.
      • WOLD B.
      通过RNA-SEQ映射和定量哺乳动物转录om。
      )。
      两种液相色谱(LC)-MS策略已经采用,以实现深蛋白质组覆盖率。一个是单个运行,具有长色谱柱和梯度,以利用HPLC的分辨率,以降低肽混合物的复杂性;另一个是具有二维分离(通常离子交换和反相)的顺序运行,以减少肽复杂性。由两个实验室报道,在双压力线性离子 - 捕集物质谱仪(LTQ orbitrap Velos)上用10小时色谱梯度鉴定2761和4500蛋白。
      • KöcherT.
      • Swart R.
      • Mechtler K.
      超高压RPLC连字符到LTQ-ORBITRAP VELOS显示峰值容量和鉴定的肽数之间的线性关系。
      ,
      • KöcherT.
      • Pichler P.
      • Swart R.
      • Mechtler K.
      单次纳米 - MS / MS使用超响梯度分析全细胞提取物的蛋白质混合物。
      ,
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
      • Fröhlichf.
      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      )。类似地,在2米长柱上使用8小时梯度鉴定3734个蛋白质,其中杂交三重四极杆 - 飞行时间(Q-TOF,AB SCIEX 5600 Q-TOF)(
      • iwasaki m.
      • Sugiyama N.
      • 塔卡卡N.
      • Ishihama Y.
      使用具有增强灵敏度的逆相单片二氧化硅毛细管柱的人蛋白质组分析。
      )质谱仪。二维方法已经产生了更长的时间识别。例如,10,006个蛋白质(代表超过9000个基因产物,GPS)
      使用的缩写是:
      全球定位系统
      基因产品
      小姐
      质谱仪
      FDR.
      假发现率
      女士/女士
      串联质谱
      RP-LC.
      反相液相色谱。
      1使用的缩写是:全球定位系统
      基因产品
      小姐
      质谱仪
      FDR.
      假发现率
      女士/女士
      串联质谱
      RP-LC.
      反相液相色谱。
      在U2OS细胞中鉴定出来(
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • Malmstroem J.
      • Claassen M.
      • ori a。
      • Szymborska A.
      • 赫罗特F.
      • rinner o.
      • Ellenberg J.
      • Aeberberold R.
      人细胞系的定量蛋白质组。
      )和10,255个蛋白(代表9207 gps),来自Hela细胞(
      • Nagaraj N.
      • wisniewski J.R.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • Kircher M.
      • Kelso J.
      • PääboS.
      人癌细胞系的深层蛋白质组和转录组映射。
      )。需要数周(例如,2-3周)的机器运行时间来实现这种蛋白质组覆盖,将蛋白质组分析推向与mRNA-SEQ相当的水平。随着引入更快的机器,人类蛋白质组覆盖率现在已在3天内达到7000-8500蛋白(代表7000-8000 GPS)(
      • 盖尔特T.
      • Wehner A.
      • Schaab C.
      • Cox J.
      11普通细胞系的比较蛋白质组学分析显示大多数蛋白质的普遍性但不同的表达。
      )。尽管有了令人印象深刻的改进,但使用长柱和长渐变的目前方法遭受了固有的限制:它需要长时间的运行时间,并且在重复运行中保持重复性是挑战性的。因此,目前的产量和再现性阻碍了深入蛋白质组学在传统生物研究中的应用。令人惊叹的方法是迫切需要。
      在这项研究中,我们使用了第一维(1D)短pH 10 RP预提样以降低蛋白质组的复杂性(
      • 酸林P.
      • Markuszewski M.J.
      • Kaliszan M.
      • Kaliszan R.
      pH /有机溶剂双层梯度反相HPLC。
      ),随后是序列30分钟的第二尺寸(2D)短pH 3反相 - (RP)-LC-MS / MS用于蛋白质鉴定(
      • delmotte n。
      • Lasaosa M.
      • Tholey A.
      • 海z e.
      • HUBER C.G.
      二维反相X离子对反相HPLC:一种替代方法,用于霰弹枪蛋白质组分析的高分辨率肽分离。
      )。结果表明,通过施加该双短路2D-RPLC-MS / MS策略(快速测序,快速SEQ),可以在12小时内从哺乳动物细胞中鉴定来自哺乳动物细胞的8000个基因产物。通过不同MS系统的并行测试揭示了该策略的稳健性,包括四极炮玻璃质谱仪(Q-辐射),杂交Q-TOF(Triple-TOF 5600)和双压线性离子捕集射网质谱仪(LTQ-orbitrap螺丝螺旋),表示仅利用更好的MS仪器的方法的固有强度。该策略提高了单位时间测量的MS测序鉴定蛋白质的效率。我们在LTQ-orbitrap Velos,2800蛋白/ 30分钟上鉴定了2200蛋白/ 30分钟,分别在Q-辐射和三级TOF 5600上。我们进一步优化了Fast-SEQ并制定了快速SEQ工作流程的定量版本:快速定量(快速QUAN),并将其应用于用药物候选MLN4924(一种药物)处理的HUVEC细胞中的蛋白质丰度定量。 III期临床试验)。我们能够量化>在MS运行时间的1天内6700 GPS,发现99个蛋白质以高信心上调。我们预计这种有效的替代方法对于深入的蛋白质组学分析将使生物应用更可获得基于MS的蛋白质组学的应用。

      材料和方法

       蛋白质样品的制备

      用8提取Hela,HepG2或Huvec细胞的蛋白质 m 通过加入2.96μL0.1减少了尿素和200至400μg蛋白质 m 通过加入3.29μl0.5,在37℃下烷基化烷基化二硫醇4小时,然后用0.5 m 碘乙酰胺在黑暗中在室温下达到60分钟。最后在37℃下以1:50酶/蛋白质/蛋白质的质量比以质量比在37℃下消化蛋白质样品,并通过加入1%甲酸(FA)终止。

       第一尺寸高pH rp色谱

      Microolc的第一维RP分离是对 l-3000 HPLC系统(RIGOL)使用Durashell RP柱(5μm,150埃,250mm×4.6mm i.d.,agela)。移动相A(2%乙腈,使用NH调节pH至10.03·H20)和B(98%乙腈,使用NH调节pH至10.03·H20)用于开发梯度。溶剂梯度设定如下:5-8%B,2分钟; 8-18%B,11分钟; 18-32%B,9分钟; 32-95%B,1分钟; 95%B,1分钟; 95-5%B,2分钟。以1.5ml / min的洗脱液流速分离胰蛋白酶肽,并在214nm处监测。柱烤箱设定为60℃。 eluent每分钟收集。将样品在真空下干燥并在水中以15μl0.1%(v / v)乙腈在水中重建,以供水溶性分析。

       第二尺寸低pH rp色谱耦合与MS / MS测量

      将来自第一尺寸RPLC的级分溶于加载缓冲液,然后用C18柱(75μm内直径,360μm外径×10cm,3μmC18)分离。流动相A由水溶液中0.1%的甲酸组成,流动相B在乙腈溶液中由0.1%甲酸组成;根据在1D LC中洗脱的级分的疏水性的一系列调节的线性梯度,施加了350nl / min的流速。 MS条件如下:对于LTQ-orbitrap Velos,源极在1.8 kV下运行,没有鞘气流,并在350℃下使用离子转移管。质谱仪被编程为在数据相关模式中获取。调查扫描来自 m/z 375到1600,分辨率为60,000 m/z 400.通过碰撞诱导解离55%,5ms的激活时间,500分,500毫秒,碰撞诱导解离50个具有充电状态2和上述的50个最强烈的峰值。2 在LTQ普通扫描模式下获取光谱。对于Triple-ToF 5600:应用了2600 V的喷射电压。 MS扫描范围是 m/z 350-1250。在每个MS扫描中选择前50个前体离子,用于随后具有高分辨率的MS / MS扫描。 MS扫描进行0.25秒,随后进行50ms / MS扫描,每次进行0.04秒。 MS / MS的动态排除设置为12S。通过分析器TF 1.5.1的轧制CID功能自动调节碰撞诱导的解离(CID)能量。对于锻造Q-辐射:源在1.8 kV下运行。对于全MS调查扫描,自动增益控制(AGC)目标是3E6,扫描范围为300至1400,分辨率为70,000。选择具有充电状态2和上面的最强烈峰,用于通过较高能碰撞解离(HCD)进行碎片化,其常规碰撞能量为27%。女士2 通过17,500分辨率获得光谱。

       蛋白质鉴定

      来自orbitrap q-afactive和ltq-orbitrap velos的原始文件被蛋白质组发现版本1.3使用吉祥物搜索引擎与患者对人Ref-序列蛋白质数据库(34,361蛋白,在07-04-2012更新的)。对于前体的预耐受性设定为20ppm。至于产品离子的耐受性,QE设定为20mmu,Velos设定为0.5 da。氧化(得到),选择乙酰基(N末端)作为可变修饰;选择氨基甲酰(Cys)作为固定改性;并且允许一个错过胰蛋白酶的切割。 Triple-ToF 5600的WIFF文件首先由蛋白质保值版4.2使用Paragon搜索引擎对人的Ref-序列蛋白数据库(34,361蛋白,更新于07-04-2012)。然后,包含MS峰值列表的吉祥物通用格式(MGF)文件由蛋白单托导出,并传递给蛋白质组发现版本1.3,以与QE的相同的参数搜索。

       蛋白质组发现中的彻底和严格的数据分析

      我们还重新分析另一个平台中的所有数据,该平台允许计算蛋白质假发现率(FDR)。
      (步骤1)使用MSCONVERT模块将质谱的所有原始文件转换为MGF文件(
      • Kessner D.
      • Chambers M.
      • Burke R.
      • agus d。
      • Mallick P.
      Proteowizard:开源软件,用于快速蛋白质组学工具开发。
      )在反式蛋白质组学管道中(TPP v4.5.2)(
      • 德意曲e.w.
      • 门多萨L.
      • Shteynberg D.
      • Farrah T.
      • 林H.
      • 塔斯曼N.
      • 太阳Z.
      • Nilsson E.
      • 普拉特B.
      • Prazen B.
      • ENG J.K.
      • 马丁D.B.
      • nesvizhskii a.i.
      • Aeberberold R.
      Trans-Qualeomic管道的导游。
      )。使用Mascot V2.3.2本地服务器搜索MS / MS峰值列表(MGF文件)(
      • Perkins D.N.
      • Pappin D.J.
      • 皱褶D.M.
      • Cottrell J.s.
      使用质谱数据搜索序列数据库来搜索基于概率的蛋白质识别。
      )对包含来自NCBI参考序列数据库的所有人蛋白序列的数据库。搜索参数是:前体和产物离子峰分别以初始质量公差和0.05Da的初始质量公差搜索。使用胰蛋白酶的酶特异性。允许最多两个错过的裂解,保留至少七个氨基酸的肽。将氨基甲酰胺甲基化半胱氨酸(+ 57.0215da)设定为固定改性,并将蛋氨酸氧化(+ 15.9949DA)设定为可变改性。
      (步骤2)识别质量控制:施用目标 - 诱饵的策略,用于控制低于1%的肽和蛋白质水平FDR(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
      )。 Pepdistiller(
      • 李恩
      • 吴S.
      • 张C.
      • 昌C.
      • 张继夫
      • 马杰。
      • Li L.
      • 钱X.
      • 徐P.
      • 朱y
      Pepdistiller:一种质量控制工具,可提高霰弹枪蛋白质组学肽鉴定的敏感性和准确性。
      )用于计算每种肽谱匹配(PSM)的诱饵次数低于1%的诱饵点测量的概率值(Q值)。然后除去比七个氨基酸短的所有肽长度。肽鉴定的切断离子评分为20.所有部分中的所有PSM都组合用于蛋白质质量控​​制,这是一种更严格的质量控制策略(
      • 彭J.
      • eliasj.e.
      • Thororen C.C.
      • Licklider L.J.
      • Gygi S.P.
      多维色谱评价与串联质谱(LC / LC-MS / MS)进行大规模蛋白质分析:酵母蛋白质组。
      )。靶和诱饵肽序列的Q值被动态地增加,直到相应的蛋白质FDR小于1%的蛋白质FDR,占用截例:
      • 杨X.
      • Dondeti V.
      • Dezube R.
      • Maynard D.M.
      • geer l.y.
      • 爱普斯坦J.
      • 陈X.
      • 马克S.P.
      • Kowalak J.A.
      DBParser:用于霰弹枪蛋白质组学数据分析的基于Web的软件。
      )。

       蛋白质量化和绝对量估计

      对于每个LC-MS / MS运行,我们首先从MZXML文件加载标识结果和原始数据。然后,对于每个鉴定的肽,我们通过基于其识别信息搜索MS1来提取其XIC,并通过使用自制的程序计算提取的XIC曲线下的区域来估计其丰度,从而改善蛋白发现的蛋白发现1.3作为所提供的蛋白质发现1.3由制造商。对于蛋白质丰度计算,我们首先通过使用副纤维原理来使用非还原肽清单来组装蛋白质。蛋白质被分类为等同物,子集,超集,可供选择,可分辨率和不同的蛋白质(
      • 杨X.
      • Dondeti V.
      • Dezube R.
      • Maynard D.M.
      • geer l.y.
      • 爱普斯坦J.
      • 陈X.
      • 马克S.P.
      • Kowalak J.A.
      DBParser:用于霰弹枪蛋白质组学数据分析的基于Web的软件。
      )。保留了具有多于一个独特肽的可分化,不同的和等同的蛋白质。然后,通过使用IBAQ算法估计蛋白质丰富(
      • Schwanhausser B.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      )。为了估计蛋白质“绝对量”,总结了总蛋白质的IBAQ值作为代理。同样地,我们将负载在塔上的蛋白质量(400μg×20%负载)分割为平均分子量(60kDa),以计算蛋白质总量的摩尔质量。这两种量应等于彼此等于,这使我们可以从其归一化MS信号估计每种蛋白质的“绝对量”。

       定量蛋白质组数据集的统计分析

      数据集的差分蛋白由如前所述的方法确定(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )。简而言之,我们采用了所有归一化蛋白质比率的天然对数,并计算了15.87,50和84.13百分位数 r-1, r0, 和 r1。我们定义 r1-r0r0-r-1 作为右侧和左侧的强大标准偏差。比例的合适措施 r>r0 远离主要分布的显着远远将是距离 r0 根据正确的标准偏差测量
      z=rr0r1r0


      同样,对于比例 r<r0 one would take
      z=rr0r1r0


      p value
       significanceA =12ERFC(z2)=12πzet2/2dt


      数量 p 价值 <0.01 (NO.p 价值<0.01)。
      在1重复方案中,只有1 p 计算价值集(RP2-Repop1 / RP1-Repeat1),而4组和9组在2重复方案中计算(RP2-Repop1 / RP1-Repop1,RP2-Repop1 / RP1-Repeat2,RP2-Repect2 / RP1 -repeat1,RP2-Repop2 / RP1-Repop2)和3重复(RP2-Repop1 / RP1-Repop1,RP2-Repop1 / RP1-Repop2,RP2-Repop1 / RP1-Repop3,RP2-Repop2 / RP1-Replod1,RP2-重复2 / RP1-Repop2,RP2-Repop2 / RP1-Repop3,RP2-Repeat3 / RP1-Repop1,RP3-Repect3 / RP1-Replap2,RP3-Repord3 / RP1-Reporm3)方案。否。 p 价值<0.01 被设置为过滤器以进行差异蛋白质。例如,“不。p 价值<0.01 ≥5“表示具有至少5的蛋白质 p 值低于0.01。

      结果

       简化的快速SEQ工作流程

      我们使用了二维色谱 - MS / MS进行肽测序。我们首先使用高pH(pH10)RP-LC(
      • 酸林P.
      • Markuszewski M.J.
      • Kaliszan M.
      • Kaliszan R.
      pH /有机溶剂双层梯度反相HPLC。
      ,
      • 歌曲C.
      • 悬挂。
      • 江X.
      • 王F.
      • yu z.
      • 陈R.
      • zou h.
      具有高正常性的磷酸磷肽的多常态逆相液相色谱方法。
      )降低Hela总细胞裂解物的胰蛋白酶消化的复杂性。我们在72分钟梯度的第一尺寸RP-LC中收集了24个级分。然后用在pH-3的60分钟的RP-LC梯度与Q-辐射的MS耦合的60分钟的RP-LC梯度运行中运行每个级分。该实验组需要1天的仪器时间(24分数×60分钟)和8586个蛋白质(8406GPS)(补充图S1A和1B.补充表S1)。我们修改了工作流程,将RP尺寸的运行时间降低到30分钟(补充图1C)。在该实验中,收集22个级分,并在Q-辐射(QE),三-TOF 5600(5600)和LTQ-绕螺旋VELOS(VELOS)上并平行测量,其中具有30分钟的第二尺寸LC-MS / MS坡度 (Fig. 1)。调整第二尺寸LC的梯度以匹配从第一维RP-LC洗脱的级分的疏水性(补充图S1D)。在QE,5600和Velos上分别在MS运行的12小时内发现总共8154,8145和6763蛋白(代表8032,8031和6683 GPS)(Fig. 2A2B补充表S2)。我们通过将第一个RP分数汇集为11种分数,进一步降低了MS运行时间,导致所有三台机器在6小时内鉴定超过6000个基因产物(补充图。S2A和S2B)。这些结果表明,12小时MS在蛋白质组覆盖范围和MS运行时间之间运行良好的折衷。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1简化快速SEQ策略的工作流程。 在尿素溶液中提取总蛋白质,然后通过胰蛋白酶消化。使用30分钟的pH 10条件具有30分钟梯度的反相色谱法将肽复合物预分级。将一系列第二尺寸反相色谱法,在pH 3条件下,并在线递送肽以不同类型的MS进行鉴定。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2深度蛋白质组覆盖中快速SEQ策略的高效率。 A,在12小时模式下,通过三种不同MS平台测量的第一尺寸RP级分的个体鉴定的蛋白质计数。 B,在12小时模式下由三毫秒鉴定的累积蛋白质。 C,来自三毫秒的鉴定蛋白的Venn图。 D,由三毫秒鉴定的Hela细胞的快速SEQ分析的动态范围。根据其绝对量排名蛋白质。定量基于如材料和方法部分中所述的蛋白质的添加肽强度。
      通过应用更严格的质量控制策略(参见材料和方法,肽长度≥7,吉祥物离子评分>20, peptide FDR < 1%, protein FDR <1%,申请分析原理(
      • 杨X.
      • Dondeti V.
      • Dezube R.
      • Maynard D.M.
      • geer l.y.
      • 爱普斯坦J.
      • 陈X.
      • 马克S.P.
      • Kowalak J.A.
      DBParser:用于霰弹枪蛋白质组学数据分析的基于Web的软件。
      )在肽分组中)并获得7700多种蛋白质(代表7593GPS)鉴定。使用MaxQuant,我们也识别出来> 7600 proteins with <肽和蛋白质水平的1%FDR(补充表S2),确认我们的分析。我们得出结论,需要12小时的MS运行时间的快速SEQ是蛋白质组覆盖的深入和有效的方法(在线资源具有注释光谱信息。 http://61.50.134.133/browseOneExperiment.jsp?experiment=Hela)。

       快速SEQ策略提高了MS识别效率

      快速SEQ工作流程对所有三个测试的MS仪器上的蛋白质ID效率高效率,包括较慢的Velos仪器。在12小时模式下,鉴定的蛋白质的平均数量为2223±356,2439±392和1454±226,并且在30- QE,5600和Velos上的鉴定蛋白质的最大数量为2533,2862和1737分别分别运行MIS(图。 2A2B)。在6小时的模式下,在三个MS平台上每30分钟增加到2398±155,2553±104和2065±133的平均蛋白质数量增加到2398±155,2553±104和2065±133(补充图。S2A和S2B)。在该工作流中识别的蛋白质数量与30分钟的梯度不少于来自更长梯度的工作流程(
      • KöcherT.
      • Pichler P.
      • Swart R.
      • Mechtler K.
      单次纳米 - MS / MS使用超响梯度分析全细胞提取物的蛋白质混合物。
      ,
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
      • Fröhlichf.
      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      )。我们从12小时运行中检测到73,680个独特的肽,导致鉴定的蛋白质的21.26%序列覆盖率。在5600个数据集中,独特的肽数和覆盖率百分比为70,552和19.86%,展示了类似MS平台上的快速SEQ方法的类似表现。检测8000基因产品意味着数据集中涵盖的高动态范围。结果,对于6小时和12小时模式的鉴定肽的前体强度,实现了5.5和6个级的动态范围(补充图。S2C )。结果表明,快速SEQ工作流程确实是蛋白质数量的有效和深度蛋白质组策略,而且还具有蛋白质序列覆盖率。
      结合三个数据组12小时运行,我们发现9037蛋白(代表8823个基因产物)在蛋白质水平的1%FDR处,代表哺乳动物细胞系覆盖的最有效的深入蛋白质组,最短的MS测量时间(
      • 贝克米
      • 施密特A.
      • Malmstroem J.
      • Claassen M.
      • ori a。
      • Szymborska A.
      • 赫罗特F.
      • rinner o.
      • Ellenberg J.
      • Aeberberold R.
      人细胞系的定量蛋白质组。
      ,
      • Nagaraj N.
      • wisniewski J.R.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • Kircher M.
      • Kelso J.
      • PääboS.
      人癌细胞系的深层蛋白质组和转录组映射。
      )(12 H×3仪器)(Fig. 2C补充表S3)。将这些数据覆盖到基因和基因组的京都百科全书的路径数据库上(Kegg)(
      • Kanehisa M.
      • goto s.
      Kegg:Kyoto Encyclopedia的基因和基因组。
      ),我们发现了196个覆盖了196个,其中100多个具有超过50%的覆盖率,表明我们的数据集具有良好的蛋白质组/基因组的覆盖率。来自不同仪器的三个数据集具有相似的KEGG路径覆盖,如图所示 补充图S3.
      使用基于强度的绝对量化(IBAQ)算法(
      • Schwanhausser B.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      ),我们估计蛋白质丰度的分布长达6个数量级(Fig. 2D)。预测的中值蛋白质量为2 fmole,9 fmole和19 fmole(在QE,5600和VELOS数据中分别在QE,5600和VELOS数据中分别与假设的分数分别为QE,5600和VELOS数据平均分子量为60 kda(
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
      • Fröhlichf.
      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      ) (材料和方法)。

       使用无标记量化评估快速SEQ的可重复性

      然后,我们评估了使用Fast-SEQ工作流程进行大规模蛋白质组量化的可能性。用快速SEQ策略消化并加工HepG2细胞的全细胞提取物。我们从一个RP实验(MS重复)的相同分数或两个RP-LC实验(RP重复)的等效分数进行了两个平行的MS分析(Fig. 3A)。在这些数据集中,鉴定了8226个蛋白质,可以量化超过7000个蛋白质以进行可重复评估。日志之后2 - 转化,相关系数(r2在MS重复中,蛋白质丰度为0.94和0.93,并且RP重复超过0.80(Fig. 3B),暗示快速SEQ工作流程的良好重复性。 MS重复的中值变异系数(CV)为0.75%和0.82%,rp重复均为1.8%(图。 3.C3D)。这些数据表明,快速SEQ工作流程可用于无标记的蛋白质组定量。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3无标签量化的快速SEQ策略的重复性评估。 一种, 实验设计来估算快速SEQ策略的定量准确性, B,MS重复或RP重复鉴定的蛋白质IBAQ值的相关曲线。将IBAQ值计算并转换为基本-2对数。来自MS重复的蛋白质和RP策略中的蛋白质的变异系数可视化为框图(C)和密度图(D)。

       快速SEQ进行大规模蛋白质组量化的优化:快速SEQ - 快速量化的定量版本(快速Quan)

      在快速SEQ中,我们发现蛋白质/肽积累曲线在第一个次数中迅速达到其高原,表明可以使折衷能够进一步减少MS运行时间而不减少蛋白质组覆盖。更短的MS运行时间具有添加的好处,即MS仪器运行条件可能是常量的,这是无标签量化的先决条件。
      然后,我们评估了在MS运行时间的12小时内无标签定量的效率和准确性,以便在MS运行时间内的12小时内进行不同变化。我们同样分为Hela全细胞裂解物的胰蛋白酶摘要,然后添加了具有已知比率的10个同位素标记的定量级联蛋白(Qconcat)蛋白的胰蛋白酶肽(补充表S4)。我们在第一维LC中分离它们并为每次运行收集24个级分(RP1和RP2)。在12小时的矛盾时间内,我们经常运行24分数(24×1,方案1),汇集两个级分,12 ms用两个MS重复(12×2,方案2),并汇集三个分数8毫秒运行三毫秒重复(8×3,方案3)( Fig. 4A)。与一重复计划相比,在三重复方案中,蛋白质组鉴定减少了15%(表I.)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4大规模蛋白质量定量快速策略的发展。 A,两台重复RP-LC-MS实验的实验设计,具有相同的背景蛋白质组和差异尖刺标记的标准蛋白质Qconcat。 B,与差分比阈值相关的显着伪定量蛋白质曲线的数量。 X轴代表错误量化蛋白的数量(其否定。p 价值<0.01 = 1在1重复组中,没有。p 价值<0.01 = 4在2重复组中,没有。p 价值<0.01 在3重复组中= 9中的9),其在阈值定义的抑制区域中分布 y-axis(日志2 (比率) )。值箭头标有图表代表的对数差分阈值为1%的误报素率。 C,总量化蛋白质和假量化蛋白质(不。p 价值<0.01 = 9)根据蛋白质量化的最小肽数匹配的最小数量匹配的标准,在快速Quan(3重复)数据集中进行比较。图中标记的百分比值是数据集的虚假量化率。 D,由#1,#2和#3快速SEQ方案(FAST-QUAN)量化的实验QConcat比率与其理论上尖刺比一致。
      表I.三种快速SEQ定量调整中差异蛋白质测定的统计学评价。 * P值的数量低于0.01
      快速SEQ方案分数×重复总MS测量时间p 价值 filter*qconcat.理论差分QConcat检测到的差分QConcat.假负数鉴定的蛋白质理论差异蛋白质被渗出的差异蛋白质(假阳性数)假阳性率(%)
      1重复21(1/1)×112小时NUM≥1109100775806778.73
      2重复10(2/1)×212小时NUM≥110910071200121217.02
      NUM≥2109907120081411.43
      NUM≥310990712003905.48
      NUM≥410990712002683.76
      3重复7(3合1)×312小时NUM≥41091006529092414.15
      NUM≥510990652904426.77
      NUM≥610990652903034.64
      NUM≥710990652901912.93
      NUM≥810990652901482.27
      NUM≥910990652901171.79
      我们应用了重大测试的统计数据来计算 p 价值 of proteins identified in RP1 and RP2 from the three schemes to find the differentially expressed proteins (补充图S4a)(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )。可以在方案1中进行一个配对的比较,而四个和九个配对比较分别可以分别在方案2和3中进行。我们选择了 p 价值 <0.01作为分配差异表达蛋白的仪表。除了 p 价值评估,我们也可以使用数字 p 价值 <0.01作为差分蛋白质测定的次要参数。
      因为来自RP1和RP2的样品是相同的,所以从显着测试中鉴定为差异表达蛋白质的蛋白质可以被认为是假量化的差分蛋白(FQDP)。考虑到IBAQ比率的参数和数量,我们评估了虚假量化的速率和数量 p 价值 <0.01,可以从重复的数量确定。即使有9. p 价值 <0.01(3重复方案),发现了大量的假量化蛋白并以IBAQ比的函数绘制(Fig. 4B)。 1-(否)的FQDP的数量p 价值<0.01 = 1), 2- (NO.p 价值<0.01 = 4), and 3- (NO.p 价值<0.01 = 9)重复方案分别为770,275和117。考虑到蛋白质用1%FDR鉴定,假设全局蛋白质组中的FQDP的下限为1%是逻辑。针对所有已识别的蛋白质的误差量化率为3%,我们发现IBAQ Log2比率的最小置信度限制为2.13,3.14和7.01,(对应于5,10和50的比率,3,2和1重复实验(Fig. 4B)。假量化率可以由两部分组成:(1)定量的不准确性,(2)识别FDR。上述计算包括用1个肽鉴定的蛋白质。增加检测到的蛋白质定量肽数的阈值还原了可量化的蛋白质和FQDP,并且FQDPS的液滴率比定量蛋白质的速率更快,这可以通过增加量化精度和蛋白质识别FDR的减少来解释(Fig. 4C补充图。S4C)。检测到蛋白质定量检测到的2个肽显着降低了IBAQ Log2比的差异表达阈值,与0.22,1.66,3.17(对应于1.2,3.2和10的比例),在3,2和1-分别重复方案(补充图S4D)。
      然后我们测试了各种参数的相关性(IBAQ比率, p values<0.01,蛋白质鉴定中检测的肽数量和数量,具有假量化速率。对于3重复计划,放松的数量 p 价值 <0.01从9到5导致FQDP的增加,但在较高的IBAQ比率地区的增加速度是微不足道的(补充图S4B)。将最小数量的匹配肽的阈值增加到2-肽用于蛋白质量化可以显着损害由不放松引起的精度损失。p 价值< 0.01 (补充图S4E)。重要的是,在3重复方案中正确确定所有尖刺Qconcat蛋白的比率(Fig. 4D)。我们得出结论,3重复方案的虚假量化率可以保持低位,并将本方案命名为快速量化(快速 - Quan)方法。

       快速QUAN工作流程的应用:响应于MLN4924诱导的CRLS / SCF失活累积蛋白的筛选

      Cullin-Ring泛素连接酶(CRL)代表真核生物中最大的E3泛素连接酶家族。对其基质的发现,对揭示蛋白质组的调节至关重要,吸引了广泛的兴趣(
      • Emanuele M.J.
      • elia a.e.
      • 徐Q.
      • Thoma C.R.
      • Izhar L.
      • LENG Y.
      • 郭阿。
      • 陈y.n.
      • 赶紧J.
      • HSU P.W.
      • Yen H.C.
      • elldege s.j.
      模块化Cullin环连接酶基材的全局鉴定。
      ,
      • 廖H.
      • 刘X.J.
      • 空白J.L.
      • Bouck D.C.
      • 伯纳德H.
      • 加西亚K.
      • Lightcap E.S.
      MLN4924抑制NEDD8活化酶的细胞蛋白调节的定量蛋白质组学分析。
      )。 MLN4924是一种选择性抑制NEDD8活化酶(NAE)(NAE)的小分子(
      • Soucy T.A.
      • 史密斯P.G.
      • Milhollen M.A.
      • Berger A.J.
      • GAVIN J.M.
      • Adhikari S.
      • Brownell J.E.
      • Burke K.E.
      • Cardin D.P.
      • 克里德利S.
      • cullis c.a.
      • Doucette A.
      • Garnsey J.J.
      • 加州J.L.
      • Gershman R.E.
      • Lublinsky A.R.
      • 麦当劳A.
      • mizutani h.
      • Narayanan U.
      • olhava e.j.
      • Peluso S.
      • Rezaei M.
      • Sintchak M.D.
      • Talreja T.
      • 托马斯M.P.
      • Traore T.
      • Vyskocil S.
      • 宽敞的G.S.
      • yu J.
      • 张继夫
      • 迪克L.R.
      • Claiborne C.f.
      • rolfe m.
      • 鲍尔伦J.B.
      • Langston S.P.
      NEDD8活化酶的抑制剂作为治疗癌症的新方法。
      )。 MLN4924对NAE的抑制可防止Cullin蛋白与NEDD8的缀合,导致整个CRL的灭活。通过将MLN4924处理基团与人脐静脉内皮细胞Huvec中的载体组的蛋白质组图案进行比较,我们使用快速策略来推断CRL底物。在所有情况下,确定了6784个基因产品(在线追索注释的光谱信息: http://61.50.134.133/browseOneExperiment.jsp?experiment=HUVEC_DMSO_QE, http://61.50.134.133/browseOneExperiment.jsp?experiment=HUVEC_MLN_QE)。考虑到基于先前知识的已知的减去,我们为上调蛋白产生了两份候选名单:(1)敏感但不太准确的194候选名单(MLN4924 /载体的比例> 5, at least 6 p 价值 <0.01),大约有0.8%的假量化率(60 fqdps); (2)准确但不太敏感的99候选名单(MLN4924 /载体的比例> 5, at least 6 p 价值 <0.01,至少2个肽匹配),其具有大约0.3%的假量化率(25 FQDP)(补充表S5补充图。S4F)。
      我们使差异累积的蛋白质与聪明的途径分析(IPA, www.ingenity.com.)并且发现累积的蛋白质彼此相互作用并浓缩在细胞周期调节途径中(图。 5.A5B)。由于CRL / SCF系统在维持基因组完整性和细胞稳态中起主要作用,这对于肿瘤抑制和肿瘤发生是重要的(
      • Lipkowitz S.
      • Weissman上午
      善恶的环:肿瘤抑制和肿瘤内的十字路口的戒指手指泛素连接。
      ),发现许多Tumoorenesis相关的蛋白质响应于CRL / SCF灭活而显着积累,包括MT1x(
      • 彭B.
      • 顾y。
      • 熊Y.
      • 郑G.
      • 他Z.
      微阵列辅助途径分析识别MT1x&NFKappab作为口腔鳞状细胞癌中TCRP1相关抗顺性素抗性的介质。
      ),cdca2(
      • Uchida F.
      • uzawa k。
      • Kasamatsu A.
      • Takatori H.
      • Sakamoto Y.
      • Ogawara K.
      • Shiiba M.
      • Bukawa H.
      • 坦扎川H.
      人鳞状细胞癌中的CDCA2过度表达:与预防G1相阻滞和细胞凋亡的相关性。
      ),TPX2(
      • Aguirre-portolésC.
      • 鸟A.W.
      • Hyman A.
      • Canamero M.
      • Perez de Castro I.
      • malumbres m.
      TPX2控制主轴完整性,基因组稳定性和肿瘤发育。
      ),贪带(
      • 李德。
      • 魏先生
      • 彭诗
      • 黄C.
      • 唐H.
      • 贾诗。
      • 崔J.
      • Le X.
      • 黄S.
      • 谢克。
      失调的Foxm1-PRAUR信号在人结肠癌进展和转移中的关键作用。
      ),plek2(
      • 罗y.
      • 罗宾逊S.
      • 藤池J.
      • Siconolfi L.
      • Magidson J.
      • 爱德华兹C.K.
      • Wassmann K.
      • 风暴K.
      • Norris D.A.
      • BANKAITIS-DAVIS D.
      • 罗宾逊W.A.
      • 富士塔M.
      全血细胞的转录组分析鉴定了人黑素瘤的Plek2和C1Qb。
      ),SLC7A11(
      • Nabeyama A.
      • Kurita A.
      • asano k。
      • Miyake Y.
      • Yasuda T.
      • Miura I.
      • Nishitai G.
      • 阿拉克斯。
      • Shimizu S.
      • Wakana S.
      • Yoshida H.
      • 坦卡卡米
      XCT缺乏加速化学诱导的肿瘤发生。
      )和suv39h1(
      • 董C.
      • 吴y.
      • 王Y.
      • 王C.
      • 康T.
      • rychahou p.g.
      • Chi Y.I.
      • evers b.m.
      • 周B.P.
      与SUV39H1的相互作用对于蜗牛介导的乳腺癌的E-Cadherin抑制至关重要。
      ),暗示MLN4924在癌症治疗中抑制癌细胞的潜在机制。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5响应CRL / SCF系统灭活的代表性累积蛋白的熟食分析。 A,互动的网络,和(B)MLN4924诱导的累积蛋白的细胞途径焦点。

      讨论

      小姐性能的提高使得可以实现蛋白质组的深度覆盖(
      • Nagaraj N.
      • wisniewski J.R.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • Kircher M.
      • Kelso J.
      • PääboS.
      人癌细胞系的深层蛋白质组和转录组映射。
      )。目前的蛋白质组学策略倾向于在第二维HPLC / MS / MS中使用预分配和使用长梯度,以克服样本复杂性的问题(
      • Thakur S.S.
      • 盖尔特T.
      • Chatterjee B.
      • Bandilla P.
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      • Cox J.
      通过LC-MS / MS的深度和高敏感的蛋白质组覆盖,而无需预先分量。
      ),这是以牺牲MS运行时间为代价实现的,使得蛋白质组覆盖的典型实验需要数天和数周完成。许多科学家们的跑步长期以来,许多科学家们的成本令人挑战,并且在不同的运行期间保持仪器在恒定条件下保持仪器,以便可以比较结果。这种缺点阻碍了生物医学应用中蛋白质组深度测序的广泛散布。
      在这项研究中,我们寻求一种有效地平衡蛋白质组覆盖效率和深度的策略。以前的研究表明,2-D RP-RP系统在肽分离中的出色能力(
      • 酸林P.
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      pH /有机溶剂双层梯度反相HPLC。
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      具有高正常性的磷酸磷肽的多常态逆相液相色谱方法。
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      pH梯度反转相HPLC。
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      )。基于以前的知识,我们通过使用蛋白质组深度覆盖的双短路RP / RPLC-MS / MS方法(FAST-SEQ策略)选择了与当前蛋白质组学策略相反的方式( Fig. 1)。结果表明蛋白质组鉴定效率的增加。在所有三个测试的MS平台上平均超过2000种蛋白质识别,远远超过了文献中的任何报告的MS记录。可以在MS运行时间12小时内识别8000个GPS,这意味着可以在短时间内达到深度蛋白质组覆盖。
      我们将12小时模式的数据集组合在三种仪器中,并从Hela全细胞裂解物中获得超过8800个GPS(Fig. 2)。同时,鉴定蛋白质的序列覆盖率平均超过20%,表明该方法确实是蛋白质数计数的有效和深度蛋白质组策略。蛋白质丰度的可重复性评价进一步扩展了快速SEQ在不同生理/病理过程中全部蛋白质组定量的生物研究中的应用(Fig. 3)。
      快速SEQ方法具有几个有吸引力的特性。首先,该方法有效,因为它仅需要12小时的MS测量时间来在8000GPS的深度处映射人蛋白质组。这是一种足够深的蛋白质组覆盖,即大多数包括激酶,转录因子的调节蛋白(
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      质谱法在膜蛋白质组学中的应用。
      ),肿瘤抑制蛋白和牛蛋白被检测到,促进调节生物学的研究。其次,RP-RP方法消除了脱盐步骤,进一步简化了蛋白质组分析的工作流程。第三,最重要的是,快速SEQ方法与任何基于标签和无标签的绝对和相对量化兼容。
      我们将Fast-SEQ工作流程调整为允许蛋白质量化 - 快速Quan的版本。我们将两个相同的样本与快速的工作流程进行了两个相同的样本,这使我们能够系统地评估影响快速工作流程的灵敏度和准确性的不同参数(Fig. 4)。使用显着测试的统计数据,我们解开了基本的虚假定量差异蛋白(FQDP)的存在,并估计存在于无标记定量中的假量化率和参数的相关性。 FQDPS的速率由鉴定,AUC计算中的识别,不准确的速率(FDR)组成,以及HPLC和MS运行的再现性。我们的系统评估表明,可以获得合理数量的FQDPS(<20蛋白)使用以下参数时:3毫秒重复,IBAQ比率> 5, NO.p 价值< 0.01 = 9和至少两种肽以1%FDR检测到蛋白质鉴定。
      最后,我们采用了快速SEQ的定量版本:响应于MLN4924阻断的CRL / SCF系统的去激活,鉴定CRL / SCF调节蛋白,鉴别蛋白质组织筛选的定量版本。共鉴定并量化了6784个GPS。快速Quan工作流程的灵活性及其相关数据分析方法允许我们根据先前的知识考虑已知的减法,并为上调蛋白生成两个候选列表:(1)敏感但不太准确的194候选者列表,它可以包括60个fqdps和(2)准确但不太敏感的99-念珠式列表,其可能包括25个fqdps。我们认为,对于具有已知肯定对照的生物应用,有必要调整快速数据分析的参数集,以便包括肯定控件,但重要的是要记住所使用的参数集下的FQDP的数量用于分析。
      我们的测量产生了许多已知的CRL底物,包括CDC25A,CDKN1A,CDKN1B,DTL,NFE2L2,CCND,Jun,NUSAP1(
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      模块化Cullin环连接酶基材的全局鉴定。
      ),Cep110(
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      ),表明在大规模蛋白质组量化中快速Quan的敏感性。除了仅鉴定单肽的CDC25A,CCND1,FBXO5和NFE2L2,其他已知的基质与至少两种肽匹配。除了CRL的直接底物之外,还量化了与CRL / SCF系统相关的其他蛋白质的变化。 Sororin(也称为CDC5A)被鉴定为外语促进复合物(APC)的基材(
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      )。 EMI1(也称为FBXO5),CRL / SCF的另一个底物,抑制APC的活性。我们在MLN4924治疗中检测到EMI1和Sororin的积累。因此,候选列表包括CRL / SCF基质和它们调节的蛋白质。
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      FAST-SEQ和FAST-QUAN可以提供不同的蛋白质组学目的。 FAST-SEQ是一种高效的工具,可以推动深入蛋白质组学的信封,而FAST-QUAN是一种相对保守的策略,可确保量化的准确性,以略微降低的蛋白质组覆盖。凭借出色的效率和吞吐量,我们预计快速SEQ / FAST-QUAN工作流程将以积极的方式影响生物医学研究,并可能对群众提供MS。

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