大肠杆菌 蛋白质组微阵列鉴定了CLPYQ蛋白酶的基材*

  • Chih-Hsuan Tsai
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    隶属关系
    国立台湾大学农业化学系,第1号秒。 4,台北台北10617罗斯福路;
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  • Yu-Hsuan Ho
    脚注
    隶属关系
    国家中央大学系统生物学与生物信息学研究所,第300号,Jhongda Rd。台湾纪利32001;

    国家中央大学生物医学科学与工程系,300号,仲达路300号,台湾纪利32001
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  • Tzu-cheng
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    国家中央大学系统生物学与生物信息学研究所,第300号,Jhongda Rd。台湾纪利32001;

    国家中央大学生物医学科学与工程系,300号,仲达路300号,台湾纪利32001
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  • Whei-Fen吴
    一致
    应解决对应的通信:部门。作者:王莹,农业化学4,罗斯福路,台北,台湾106.电话.:+886-2-33664818;电子邮件: ;
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    国立台湾大学农业化学系,第1号秒。 4,台北台北10617罗斯福路;
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  • Chien-Sheng Chen
    一致
    国家中央大学生物医学研究所生物医学与生物信息学研究所,国家大学生物医学与工程,300号,Jhongda Rd。,纪利32001,台湾。 Tel.:Ply.886-3-4227151 Ext。 36103;传真:+ 886-3-4273822;电子邮件:。
    隶属关系
    国家中央大学系统生物学与生物信息学研究所,第300号,Jhongda Rd。台湾纪利32001;

    国家中央大学生物医学科学与工程系,300号,仲达路300号,台湾纪利32001
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了科学技术部的支持,台湾赠款NSC-101-2313-B-002-065-MY3,大多数103-2627-M-008-001,大多数104-2320-B-002-038和大多数104-2320-B-008-002-MY3,国家中央大学和Landsey医院的顶级大学项目的宗旨(NCU-LSH-103-A-001),国家中央大学和国泰综合医院加入研究计划(102NCU-CGH-02,102NCU-CGH-07,103CGH-NCU-A3)和国家卫生研究所职业发展授予补助金(NHRI-ex103-10233.C)。
    本文含有补充材料。
    ** 这些作者同等贡献这项工作。

      抽象的

      蛋白水解是调节所有王国中的细胞蛋白质的重要​​机制,并且ATP依赖性蛋白酶在该过程中发挥至关重要的作用。在大肠杆菌,CLPYQ是主要的ATP依赖性蛋白酶之一。除了在细胞中除去异常肽的功能外,CLPYQ如果需要,可以降解调节蛋白,因此让细胞适应各种环境条件。在大肠杆菌,Sula,RCSA,RPOH和TRAJ以及RNase R已被鉴定为CLPYQ的天然蛋白质基材。 CLPYQ包含CLPY和CLPQ。 ATPase CLPy负责蛋白质识别,展开和易位进入CLPQ的催化核心。在这项研究中,我们使用间接识别策略来筛选可能的碳酸碳目标大肠杆菌K12蛋白质组芯片。芯片测定结果表明,ybab强烈地与CLY结合。我们使用酵母双杂化测定来证实CLPY和YBAB蛋白之间的相互作用,并确定kd.通过石英晶体微稳定的CLPY和YBAB之间。此外,我们通过CLPYQ通过CLPYQ蛋白酶活动成功降解了YBAB体外体内降解测定。这些发现证明YBAB是CLPYQ蛋白酶的新衬底。这项工作也成功地证明,通过使用蛋白酶的识别元件可以通过间接蛋白质组芯片筛查测定成功地筛选其基质。
      蛋白酶负责通过分裂肽键来将长蛋白链中的蛋白质链中的蛋白质降解分成短片段(
      • Neurath H.
      • 沃尔斯k.a.
      蛋白水解酶在生物调节中的作用(综述)。
      )。蛋白酶存在于各种生物中。蛋白酶最重要的功能之一是降解错误折叠或无效的蛋白质。不折叠或无效的蛋白通常导致严重疾病,如阿尔茨海默病,牛海绵状脑病,心血管疾病,癌症,骨质疏松症,神经系统疾病和II型糖尿病(
      • 哈珀J.D.
      • Lansbury P.T.
      阿尔茨海默病和斯基斯的淀粉样液模型:淀粉样蛋白时间依赖性溶解性的机械真理及生理后果。
      ,
      • KAHN S.E.
      • 和rikopoulos s。
      • Verchere C.B.
      胰岛淀粉样蛋白:2型糖尿病的长期识别但低估的病理特征。
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      • 土耳其人B.
      靶向蛋白酶:成功,失败和未来的前景。
      )。此外,蛋白酶诱导的蛋白质调节在广泛的生物体中非常重要。细菌细胞中的蛋白酶诱导的蛋白质调节与细菌的抗生素抗性,环境弹性和感染性有关(
      • Gottesman S.
      蛋白酶及其目标 大肠杆菌.
      )。改变细菌的生长环境(例如 调整温度,渗透压,营养缺乏,紫外线照射,添加抗生素或其他化学品)可以诱导细菌细胞中的异常蛋白质合成和积累。在这种条件下,外部环境刺激可以激活细菌的响应系统,包括热冲击和SOS反应,这可以触发相应蛋白酶的生物合成,潜在的辅助细菌克服不利的生长条件(
      • 克里纳斯
      • Maurizi M.R.
      • Gottesman S.
      后期水平控制:折叠,重折叠和降解蛋白质。
      ,
      • Zwickl P.
      • Baumeister W.
      • 史蒂文A.
      DIS组装线:蛋白酶体和相关的ATP酶辅助蛋白酶。
      )。 ATP依赖性蛋白酶 大肠杆菌 为我们提供了一个很好的例子,以了解蛋白质降解在细胞生理中的重要性。这些能量(ATP或GTP) - 依赖性蛋白质的同源物也发现了在真核生物中,表明原核生物和真核生物之间的类似调节级联(
      • Gottesman S.
      蛋白酶及其目标 大肠杆菌.
      )。原核生,Lon,Ftsh,ClPAP / XP和CLPYQ有四种重要的ATP依赖蛋白酶患有四种重要的ATP依赖性蛋白酶(
      • Gottesman S.
      细菌调节电路中的蛋白水解。
      )。 LON蛋白酶是一种主要的细胞溶胶蛋白酶 大肠杆菌,这是一种负责蛋白质的脱模蛋白质降解的DNA热休克蛋白(
      • Parsell D.A.
      • Sauer R.T.
      通过展开蛋白质诱导热冲击响应 大肠杆菌:依赖蛋白质水平不是蛋白质的降解。
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      • GOFF S.A.
      • Goldberg A.L.
      生产异常蛋白质 大肠杆菌 刺激转录 lon和other heat shock genes.
      )。 Ftsh是一种膜结合的基本蛋白酶,其降低了热冲击转录因子Sigma 32(
      • Tomoyasu T.
      • 游戏玩家J.
      • Bukau B.
      • Kanemori M.
      • 森林。
      • 鲁特曼A.J.
      • Oppenheim A.B.
      • Yura T.
      • Yamanaka K.
      • Niki H.
      大肠杆菌 FtsH is a membrane-bound, ATP-dependent protease which degrades the heat-shock transcription factor sigma 32.
      )。 CLPAP / XP和CLPYQ属于CLP蛋白酶家族。这 CLP. 代表酪蛋白解蛋白酶,其可以降解酪蛋白 在弗里特里o(
      • Katayama-Fujimura Y.
      • Gottesman S.
      • Maurizi M.R.
      来自多组分,ATP依赖性蛋白酶 大肠杆菌.
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      • Gottesman S.
      • 罗氏e.
      • 周Y.
      • Sauer R.T.
      CLPXP和CLPAP蛋白酶通过SSRA标记系统添加羧基末端肽尾部来降解蛋白质。
      )。 ATP依赖性蛋白酶CLPYQ是一种蛋白酶络合物。翻译产品 CLPQ.+Y+ 操纵子是CLPQ(HSLV),肽酶负责蛋白水解,和CLPY(HSLU),具有展开活动的ATP酶(
      • Chuang S.E.
      • 伯兰佛州
      • Plunkett 3,G。
      • Daniels D.L.
      • blattern f.r.
      四种新型热冲击基因的序列分析 hslts / ibpab.HSLVU. 操纵子 大肠杆菌.
      )。 CLPYQ被建议作为替代蛋白酶,部分恢复LON蛋白酶的功能(
      • wu w.f.
      • 周Y.
      • Gottesman S.
      多余的 体内 蛋白水解活动 大肠杆菌 LON和CLPYQ(HSLUV)蛋白酶。
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      • Kuo M.S.
      • 陈K.P.
      • wu w.f.
      CLPYQ(HSLUV)蛋白酶对RCSA的调节 大肠杆菌.
      )。 Bochtler. 等等。 (
      • Bochtler M.
      • Hartmann C.
      • 宋H.K.
      • Bourenkov G.P.
      • Bartunik H.D.
      • Huber R.
      HSLU和ATP依赖性蛋白酶Hslu-HSLV的结构。
      )报道了CLPYQ的蛋白质晶体结构,由CLPY和CLPQ Hexamers组成(CLPY6和ClpQ6)。两个CLPQ六辐射的中心和两端各自连接到CLPY六聚体,从而形成CLPYQ复合物(
      • 凯斯尔M.
      • wu w.f.
      • Gottesman S.
      • Kocsis E.
      • 史蒂文A.C.
      • Maurizi M.R.
      六倍的CLPQ旋转对称性, 大肠杆菌 20S蛋白组的同源物,及其ATP依赖活化剂,CLY。
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      • Missiakas D.
      • Schwager F.
      • Betton J.M.
      • Georgopoulos C.
      • raina s.
      涉及错误折叠蛋白总体蛋白分解的HSIV HSIU(CLPQ CLPY)蛋白的鉴定与表征 大肠杆菌.
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      • Rohrwild M.
      • coux o.
      • 黄鹤。
      • Moerschell r.p.
      • yoo s.j.
      • SEOL J.H.
      • Chung C.H.
      • Goldberg A.L.
      HSLV-HSLU:一种新的ATP依赖性蛋白酶综合体 大肠杆菌 与真核蛋白酶有关。
      )。之前的学习 (
      • Bochtler M.
      • Hartmann C.
      • 宋H.K.
      • Bourenkov G.P.
      • Bartunik H.D.
      • Huber R.
      HSLU和ATP依赖性蛋白酶Hslu-HSLV的结构。
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      • Rohrwild M.
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      • SEOL J.H.
      • Chung C.H.
      • Goldberg A.L.
      HSLV-HSLU:一种新的ATP依赖性蛋白酶综合体 大肠杆菌 与真核蛋白酶有关。
      )已经验证了CLPY在诸如ATP,ADP和不氢化ATP类似物的核苷酸的存在下仅形成环形络合物(例如 AMP-PNP或ATP-γ-S)。相比之下,CLPQ可以自发地形成六元环。因此,完整的ClPyQ复合物的合成必须涉及包括ATP的核苷酸(
      • Rohrwild M.
      • Pfeifer G.
      • 桑塔瑞斯U.
      • Muller S.A.
      • 黄鹤。
      • Engel A.
      • Baumeister W.
      • Goldberg A.L.
      ATP依赖性HSLVU蛋白酶 大肠杆菌 是一种类似于蛋白酶体的四环结构。
      )。以前的研究(
      • Bochtler M.
      • Hartmann C.
      • 宋H.K.
      • Bourenkov G.P.
      • Bartunik H.D.
      • Huber R.
      HSLU和ATP依赖性蛋白酶Hslu-HSLV的结构。
      )将CLPY的结构分成三个域:N-末端域(N结构域,SER2-LYS109,ILE244-LEU332),中间结构域(I域,MET110-ALA243)和C末端域(C域,GLN333- Leu443)。 N结构域包含ATP结合位点。 I域比较远离CLPQ比N域相对较远,并且包含用于识别和束缚基板的双环结构。 C域涉及在CLPY和CLPQ复合物中聚合原子(
      • Lien H.Y.
      • 害羞的R.S.
      • 彭S.S.
      • 吴y.l.
      • 翁y.t.
      • 陈H.H.
      • SU P.C.
      • ng w.f.
      • 陈Y.C.
      • chang p.y.
      • wu w.f.
      表征 大肠杆菌 CLPY(HSLU)谱(HSLU)谱系识别位点使用酵母双混合系统。
      ,
      • 李y.y.
      • chang c.f.
      • kuo c.l.
      • 陈米。
      • yu c.h.
      • 林P.I.
      • wu w.f.
      亚基低聚和基材识别 大肠杆菌 CLPYQ(HSLUV)蛋白酶涉及 体内 酵母双杂交系统中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      ,
      • 宋H.K.
      • Hartmann C.
      • Ramachandran R.
      • Bochtler M.
      • Behrendt R.
      • 莫里达尔L.
      • Huber R.
      HSLU的突变研究及其与HSLV的对接模式。
      )。以前关于CLPY如何识别基质的研究表明g90Y91V92G93 位于CLPY中心孔的孔主题(孔1位点)是展开和运输基材的保守和必不可少的(
      • 苏达尔斯。
      • 贝克T.A.
      • Sauer R.T.
      AAA的I领域+ Hsluv蛋白酶坐标谱系结合,ATP水解和蛋白质降解。
      ,
      • 公园E.
      • rho y.m.
      • koh o.j.
      • ahn s.w.
      • Seong I.S.
      • 歌J.J.
      • Bang O.
      • SEOL J.H.
      • 王J.
      • Eom S.H.
      • Chung C.H.
      HSLU ATP酶Gyvg孔基序在HSLV肽酶降解中蛋白质展开和易位的作用。
      ,
      • Hsieh F.C.
      • 陈C.T.
      • 翁y.t.
      • 彭S.S.
      • 陈Y.C.
      • 黄L.Y.
      • 胡H.T.
      • 吴y.l.
      • 林N.C.
      • wu w.f.
      CLY(HSLU)突变体在加工下降的逐步活性 大肠杆菌 CLPYQ(HSLUV)蛋白酶基材。
      )。
      目前,与其他ATP依赖性蛋白酶相比,已经鉴定了几种底物用于CLPYQ蛋白酶(
      • 苏达尔斯。
      • 贝克T.A.
      • Sauer R.T.
      AAA的I领域+ Hsluv蛋白酶坐标谱系结合,ATP水解和蛋白质降解。
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      • 公园E.
      • rho y.m.
      • koh o.j.
      • ahn s.w.
      • Seong I.S.
      • 歌J.J.
      • Bang O.
      • SEOL J.H.
      • 王J.
      • Eom S.H.
      • Chung C.H.
      HSLU ATP酶Gyvg孔基序在HSLV肽酶降解中蛋白质展开和易位的作用。
      ,
      • Hsieh F.C.
      • 陈C.T.
      • 翁y.t.
      • 彭S.S.
      • 陈Y.C.
      • 黄L.Y.
      • 胡H.T.
      • 吴y.l.
      • 林N.C.
      • wu w.f.
      CLY(HSLU)突变体在加工下降的逐步活性 大肠杆菌 CLPYQ(HSLUV)蛋白酶基材。
      )。因为蛋白酶的基材可以反映其在细菌细胞中的作用,所以鉴定潜在的酶底物是蛋白酶研究中必需的。使用基材 - 酶相互作用作为用于筛选大批的酶底物的指示剂在最近的ATP依赖性蛋白酶基材上的研究中已经成为一种普遍的方法(
      • Westphal K.
      • Langklotz S.
      • Thomanek N.
      • Narberhaus F.
      捕获方法揭示了基本蛋白酶FTSH的新型基板和生理功能 大肠杆菌.
      ,

      Flynn,J.M.,Neher,S. B.,Kim,Y.-I.,Sauer,R.和Baker,T.A。,CLPXP蛋白酶细胞底物的蛋白质组学发现,揭示了五类的CLPX识别信号。摩尔。小区11,671-683,

      )。因为CLPY负责基板识别,所以在本研究中,我们使用了 大肠杆菌 蛋白质组微阵列以鉴定CLPY识别蛋白,结果表明,CLPY表现出与YBAB的强烈相互作用。我们还使用了酵母双混合测定系统来验证CLPY和YBAB之间的相互作用。另外,石英晶微观(QCM)
      使用的缩写是:QCM,石英晶体微稳定。
      1使用的缩写是:QCM,石英晶体微稳定。
      用来测量 kd. YBAB-CLPY交互的值。这 体外体内 进行降解试验以确认YABB的降解CLPYQ。这些结果提出了Yabb是ATP依赖性蛋白酶CLPYQ的新靶标。

      实验步骤

       大肠杆菌K12蛋白质组芯片的制备

      对于对细菌蛋白质组的研究,我们建造了 大肠杆菌 K12蛋白质组微阵列(
      • 陈C.S.
      • Korobkova E.
      • 陈H.
      • 朱茹
      • 剑X.
      • Tao S.C.
      • 朱H.
      蛋白质组芯片方法揭示了新的DNA损伤识别活动 大肠杆菌.
      )。简而言之, 大肠杆菌 K12 ASKA library (
      • Kitagawa M.
      • 一只老鼠。
      • Arifuzzaman M.
      • Ioka-nakamichi T.
      • inamoto E.
      • Toyonaga H.
      • 森林。
      完整的ORF克隆 大肠杆菌 aska图书馆(一套完整的 大肠杆菌 K-12 ORF存档):生物研究的独特资源。
      )首先用含有30μg/ ml氯霉素的2×luria肉汤(LB)培养基,在37℃下过夜。然后,过夜培养物用2×1b稀释到OD595 值0.1。当od.595 值达到〜0.8,异丙基β-d - 硫代酰乳糖苷加入到培养物中,并在37℃下孵育〜2小时。通过离心收获培养物,在纯化之前将颗粒储存在-80℃。
      为了纯化蛋白质,将冷冻细胞颗粒在冰上中解冻并重新悬浮在由50米组成的裂解缓冲液中m NaH24,300米m NaCl, 30 mm 咪唑,塞利林,1mg / ml溶菌酶,50个单位/ ml苯并酶,蛋白酶抑制剂混合物,1米m 苯基甲磺酰氟(Sigma-Aldrich,St.Louis,MA)和Ni-NTA超流树脂(Qiagen,Hilden,德国)在4℃下。在4℃下在板式振荡器上孵育2.5小时后,将混合物转移到96孔过滤板(Nunc)中。然后用洗涤缓冲液I洗涤板(50米m NaH2宝4,300米m NaCl,20%甘油,20米m 咪唑和0.1%吐温20)和洗涤缓冲液II(50米m NaH24,150米m NaCl,30%甘油,30米m 咪唑,0.1%Tween 20,pH8,Sigma-Aldrich)。最后,用洗脱缓冲液洗脱蛋白质(50米m NaH24,150米m NaCl,30%甘油,300米m 咪唑,0.1%吐温20,pH 7.5)。制备纯化蛋白质后,将它们通过ChipWriter Pro(Bio-rad,Hercules,Ca)在醛载玻片上在醛载玻片上印刷,在冷室内用48个引脚。然后在使用前将芯片储存在-80℃。

       大肠杆菌K12蛋白质组芯片测定

      为了减少非特异性结合,芯片被1%牛血清白蛋白封闭。 0.5μ.m ClpY (
      • Hsieh F.C.
      • 陈C.T.
      • 翁y.t.
      • 彭S.S.
      • 陈Y.C.
      • 黄L.Y.
      • 胡H.T.
      • 吴y.l.
      • 林N.C.
      • wu w.f.
      CLY(HSLU)突变体在加工下降的逐步活性 大肠杆菌 CLPYQ(HSLUV)蛋白酶基材。
      )或CLY(ΔI+ GLY)(
      • Lien H.Y.
      • 害羞的R.S.
      • 彭S.S.
      • 吴y.l.
      • 翁y.t.
      • 陈H.H.
      • SU P.C.
      • ng w.f.
      • 陈Y.C.
      • chang p.y.
      • wu w.f.
      表征 大肠杆菌 CLPY(HSLU)谱(HSLU)谱系识别位点使用酵母双混合系统。
      ,
      • Hsieh F.C.
      • 陈C.T.
      • 翁y.t.
      • 彭S.S.
      • 陈Y.C.
      • 黄L.Y.
      • 胡H.T.
      • 吴y.l.
      • 林N.C.
      • wu w.f.
      CLY(HSLU)突变体在加工下降的逐步活性 大肠杆菌 CLPYQ(HSLUV)蛋白酶基材。
      )在TBS-T(Tris缓冲盐水中含有0.05%吐温20)含有5米m ATP和1%牛血清白蛋白用于探测杂交室中的碎片,在室温下摇动1小时。温育后,用TBS-T洗涤芯片,并与抗CLPY抗体孵育(
      • Lien H.Y.
      • 害羞的R.S.
      • 彭S.S.
      • 吴y.l.
      • 翁y.t.
      • 陈H.H.
      • SU P.C.
      • ng w.f.
      • 陈Y.C.
      • chang p.y.
      • wu w.f.
      表征 大肠杆菌 CLPY(HSLU)谱(HSLU)谱系识别位点使用酵母双混合系统。
      )另外1小时。用TBS-T洗涤后,Dylights 649(Thermo Scientific,Waltham,MA)标记为山羊抗兔抗体(Abcam,Cambridge,England),用于在室温下探测30分钟的碎片。最后,用TBS-T和蒸馏水进行几次碎片。在最后洗涤后,通过在201×中离心干燥芯片 g和then scanned with a microarray scanner (Axon GenePix 4000B).

       芯片测定的生物信息学分析

      为了处理芯片测定结果的图像,Genepix Pro 6.0用于对齐每个蛋白质点并将所有图像导出到文本文件。用于数据预处理,Procat(
      • 朱克。
      • Gerstein M.
      • 斯奈德米
      ProCAT:蛋白质微阵列的数据分析方法。
      )被应用于标准化信号并点击选择。基于本地截止选择正击中,该截止值被定义为每个斑点的信号上方的三标准偏差。

       酵母双杂化,体外和体内测定的Ybab和Cly蛋白表达质粒的构建

      列入了用于表达质粒结构的YBAB基因扩增,限制性位点和HIS标签融合的引物 补充表S1。选择PGILDA和PB42AD(CLONTECH®,山景,加利福尼亚州)载体质粒构建PB42AD-ybab.和pGilda-ybab. 用于后续酵母两种杂交测定。 YBAB表达质粒(PB42AD-ybab. or pGilda-ybab.)使用限制性酶构建 埃森我和 XHO.我在两个引物中的网站和来自Mg1665的染色体DNA的模板;随后,这是 ybab. 使用聚合酶链反应(PCR)扩增基因片段,然后用相同的限制酶加入Pb42AD或Pgilda载体。接下来,将在PB42AD和PGILDA质粒中构建的靶基因转化到XL-1蓝中 大肠杆菌 然后用菌株和具有氨苄青霉素的选择培养基用于筛选包含的转化细菌菌落 ybab. 基因。这 基因表达质粒pb42ad-和pGilda- 已经被李建了 等等。 (
      • 李y.y.
      • chang c.f.
      • kuo c.l.
      • 陈米。
      • yu c.h.
      • 林P.I.
      • wu w.f.
      亚基低聚和基材识别 大肠杆菌 CLPYQ(HSLUV)蛋白酶涉及 体内 酵母双杂交系统中的蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      )。
      限制性酶 埃森我和 III用于从PB42AD中切解基因 - ybab. 然后将基因连接到pmal-c2x(Neb®)和pth18kr-中连接到pthMBP. vectors (
      • chang c.y.
      • 胡H.-t.
      • Tsai C.-h.
      • wu w.-f.
      CLPYQ(HSLUV)蛋白酶的RCSA降解 大肠杆菌.
      )使用相同的限制性酶制备,构建PMAL-C2x-ybab.,和pth18kr-MBP-YBAB.。 PET21A-(6X. 他的 tag)-和pET21a-CLPQ-(6x 他的-TAG),用于蛋白质纯化他(6x)-CLPY和CLPQ-HIS(6x)的表达载体由HSIEH构建 et,al. (
      • Hsieh F.C.
      • 陈C.T.
      • 翁y.t.
      • 彭S.S.
      • 陈Y.C.
      • 黄L.Y.
      • 胡H.T.
      • 吴y.l.
      • 林N.C.
      • wu w.f.
      CLY(HSLU)突变体在加工下降的逐步活性 大肠杆菌 CLPYQ(HSLUV)蛋白酶基材。
      )。载体被转化为 大肠杆菌和then screened using a growth medium containing ampicillin (pTH18kr-MBP. 被卡那霉素筛查)。将储存具有不同质粒的那些菌株直至后续验证测定所需的菌株。

       酵母双杂交测定

      两个质粒套,pgilda-ybab.和pB42AD- or pGilda-和pB42AD-ybab.,与Ey48酵母菌菌株共转化为进行酵母双杂化测定。通过观察是否验证两种质粒表达的蛋白质之间的相互作用 Lacz. 转化菌株中的报告基因被活化。通过首先在30℃下在5-ml SD / URA培养基中培养12-14小时,通过首先将酵母培养至egy48酵母菌株直至OD600 达到0.4-0.6。然后离心酵母细胞并用无菌水和100米洗涤m 乙酸锂(LiOM)并重悬于240μl50%(V / v)聚乙二醇(PEG)中。混合36μl1 m LiOAc,25μl鲑鱼精子DNA(在使用前,将该试剂在100℃下煮沸并置于冰浴中10分钟),具有50μl的每种质粒并加入到酵母细胞悬浮液中。将混合物剧烈摇动1分钟,在30℃下孵育30分钟,然后在42℃水浴中进行热冲击处理20-25分钟。热冲击后,将溶液以14,000rpm离心5秒,除去上清液。将酵母细胞悬浮在100μl无菌水中,然后在含有选择性生长培养基的生长平板上涂抹(S.D./- / -HIS/-TRP)。在30℃温育2-3天后,将转化的酵母菌菌落在30℃下转移至新的S.D.-URA / -HIS / -TRP生长板1-2天孵育以激活细胞。活性细胞在80mg / L X-GAL(GAL / RAF / -URA / -HIS / -TRP)生长平板上涂布并在30℃下温育2天以观察细胞生长。

       测量K.d 在MBP-YBAB和CLPY之间

      QCM(Affinix QNμ)用于测量 kd. Ybab-Cly蛋白质相互作用的值,其在转化中表达 大肠杆菌 cells through pMal-ybab.和pET21a (6x 他的 tag)- (
      • Hsieh F.C.
      • 陈C.T.
      • 翁y.t.
      • 彭S.S.
      • 陈Y.C.
      • 黄L.Y.
      • 胡H.T.
      • 吴y.l.
      • 林N.C.
      • wu w.f.
      CLY(HSLU)突变体在加工下降的逐步活性 大肠杆菌 CLPYQ(HSLUV)蛋白酶基材。
      )。使用淀粉糖树脂(新英格兰Biolabs,Neb,Ipswich,Ma)和镍树脂(Talon Resid,Takara,Kusatsu,Shiga,Japan)纯化MBP-Ybab和His-Cly。在开始时,将QCM的传感器电池用500μL十二烷基硫酸钠(SDS,1%)溶液清洗,然后用压缩的氮气干燥。随后,将传感器单元合并为300米m HEPES缓冲液含30米m MgCl2, 3 mm DTT, and 3 mm EDTA和8μLMBP-Ybab(1mg / ml)固定在电极上。在传感器的频率降低并保持稳定之后,再次加入5μlMBP-Ybab以确认频率保持稳定,表明已经在传感器单元上​​饱和的MBP-Ybab。然后加入2μL牛血清白蛋白(BSA)溶液以减少非特异性结合。用450μLHEPES缓冲液洗涤传感器电池两次,以除去未结合的MBP-YBAB和BSA。在添加下一个样品之前,传感器电池填充有450μl的HEPES缓冲液并支架3分钟以稳定频率。最后,将1,3,5,8和10μl样品分别加载到传感器电池中以测量频率的降低。 Aqua分析软件(Initium Co.,Chigasaki,Kanagawa,日本)被雇用来计算 kd. values.

       MBP-YBAB体外降解试验

      两μ.m ClpY, 2 μm ClpQ, and 1 μm 将MBP-YBAB与15μl4x降解溶液混合以产生60μl反应溶液。将反应溶液在37℃下温育。孵育开始后,将每20μl反应溶液分别在0和4小时中收集。向每种反应溶液中加入等体积的2×SDS蛋白样品缓冲溶液并通过涡旋混合。将混合物在100℃下煮沸5分钟以使蛋白质和无活性蛋白酶活性变性。通过SDS-PAGE分析含有CLPY,CLPQ和MBP-YABB的混合物,然后用Coomassie蓝色R-250染色。 Digigel®扫描仪扫描图像。通过用抗MBP抗体蛋白质印迹还检测MBP-Yabb蛋白的降解。将蛋白质印迹膜暴露于放射缩影膜(经典蓝色,Midsci)。信号强度用于通过使用图像J软件计算ybab蛋白质劣化。手段和标准偏差是从三个独立的分析中取出的,并且学生的计算差异 t test (p < 0.05).

       MPB-YBAB在体内降解测定中

      pth18kr-MBP-YBAB. 质粒转化为 大肠杆菌 SG22623(+ CLPYQ)和AC3112(-CLPYQ)菌株。将转化的细菌细胞在LB肉汤中培养直至OD600 达到0.3-0.4和1米m isopropyl β-d然后加入-1-硫代酰基吡喃糖苷(IPTG)以诱导蛋白表达30分钟。随后,加入北霉素(以最终浓度,100μg/ ml)终止蛋白质表达。接下来,OD600 培养基的值以0和240分钟记录。还在这些时间点收获细菌细胞。将收获的细胞重新悬浮并离心在灭菌水中以除去生长培养基溶液。将相等体积的2×SDS蛋白样品缓冲液加入到样品中,并在100℃下煮沸5分钟。通过用抗MBP抗体蛋白质印迹检测MBP-Yabb蛋白的降解。将蛋白质印迹膜暴露于放射缩影膜(经典蓝色,MIDSCI),并且使用图像J软件使用图像信号强度来计算YBAB蛋白质劣化。手段和标准偏差是从三个独立的分析中取出的,并且学生的计算差异 t test (p < 0.05).

      结果

       大肠杆菌蛋白质组芯片测定和生物信息学分析

      我们雇用了高吞吐量 大肠杆菌 蛋白质组微阵列系统地识别CLPY的识别蛋白。这 大肠杆菌 蛋白质组微阵列由〜4300个非冗余蛋白组成,如先前报道的醛涂层玻璃载玻片上印刷(
      • 陈C.S.
      • Korobkova E.
      • 陈H.
      • 朱茹
      • 剑X.
      • Tao S.C.
      • 朱H.
      蛋白质组芯片方法揭示了新的DNA损伤识别活动 大肠杆菌.
      )。在这项研究中, 大肠杆菌 用CLPY和CLY(ΔI+ 7gly)蛋白探测蛋白质组芯片。 CLPY(ΔI+ 7gly)是来自CLPY的I结构域缺失突变蛋白,但保持该构型,这使得其底物的结合能力(
      • Lien H.Y.
      • 害羞的R.S.
      • 彭S.S.
      • 吴y.l.
      • 翁y.t.
      • 陈H.H.
      • SU P.C.
      • ng w.f.
      • 陈Y.C.
      • chang p.y.
      • wu w.f.
      表征 大肠杆菌 CLPY(HSLU)谱(HSLU)谱系识别位点使用酵母双混合系统。
      ,
      • Sousa M.C.
      • 驯服C.B.
      • Tsuruta H.
      • 威尔银行S.M.
      • reddy五。
      • mckay d.b.
      HSLUV蛋白酶伴侣复合物的晶体和溶液结构。
      )。在这项研究中,我们使用CLPY(ΔI+ 7GLY)作为识别特定CLY识别蛋白的控制。然后使用兔抗康氏菌检测抗体来识别芯片上的CLY(Fig. 1A)。最后,Dylights™649标记的抗兔抗体用于检测抗康培并在芯片上显示荧光信号。洗涤步骤后,扫描并分析芯片。显示了CLPY和CLPY之间的代表性芯片图像比较(ΔI+ 7GLY) Fig. 1B。 CLPY和CLPY(ΔI+ 7GLY)芯片图像在特定蛋白质之间表明了不同的结合亲和力。代表性蛋白质YFBV,rhLB和YBAB分别显示出比CLY(ΔI+ 7GLY)的更强的信号(Fig. 1B)。这表明CLPY以特定的目标识别 大肠杆菌 筹码。在进行芯片分析之后,将信号输出为文本文件,用于信号归一化和正面打击选择。每个信号都与procat标准化(
      • 朱克。
      • Gerstein M.
      • 斯奈德米
      ProCAT:蛋白质微阵列的数据分析方法。
      )。信号的分布适用于正态分布,基于局部截止选择正峰值,其被定义为每个斑点的信号上方的三标准偏差。在初始选择之后,我们选择可能的候选人只绑定到CLPY,但不是CLY(ΔI+ 7GLY)。眼球后,我们删除了3个次数,因为对照和实验之间没有明显差异。因此,鉴定并概述了6种蛋白质 表I..
      图缩略图GR1.
      Fig. 1使用A的CLY识别蛋白鉴定的示意图 大肠杆菌 proteome chip. 一种, 康复蛋白质被探测到 大肠杆菌 碎片上的蛋白质并由抗菌抗体检测。用Dylights™649标记抗兔抗体。 B,代表性的图像 大肠杆菌 用CLPY探测蛋白质组芯片并控制CLY(ΔI+ 7GLY)。芯片上的YFBV,rhLB和Ybab的代表性蛋白分别从CLY的样品图像和控制CLY(ΔI+ 7GLY)的样品释放出来。
      表I.选择六种蛋白质相互作用的蛋白质 大肠杆菌 K12 proteome chips
      加入号码蛋白质名称注解信号强度
      eg11100.ybab.DNA结合蛋白667.1±34.3.
      eg14106YFBV.TER Macrodomain绝缘蛋白218.4±31.5.
      eg10817rbsd.d - 吡喃酶140.6±20.5.
      eg13443Cobb.蛋白质赖氨酸脱乙酰酶,趋化性调节剂114.8±44.6.
      eg10844rhlb.ATP依赖性RNA Helicase100.8±71.0.
      eg13114YGBT.多功能内切核酸酶CAS1,CRISPR适应蛋白82.7±7.7

       酵母双杂化测定分析

      因为Ybab信号远高于其他5个蛋白质,所以我们专注于Ybab进一步验证和研究。首先,我们使用了酵母双混合系统来验证YBAB和CLPY之间的互动。酵母双杂化测定系统参与将靶蛋白基因链段转化为PB42AD和PGILDA质粒,其可以分别表达靶有源结构域(Ad)和结合结构域(Bd)融合蛋白。我们克隆了 ybab. 进入pgilda质粒,与Pb42ad-共同转化 - 进入EYGE48酵母细胞。要考虑AD或BD融合对目标蛋白质的影响, ybab. 将基因克隆到Pb42AD质粒中,并与pgilda一起克隆 进入EYGE48酵母细胞。具有和不具有克隆基因的PGILDA / PB42AD质粒被COT转化成酵母细胞。同时,我们验证了靶蛋白是否与B42肽(PB42AD的产物)或Lexa(PGILDA产物)相互作用。没有克隆基因的PGILDA和PB42AD质粒的COTRANSFATION产生阴性对照组。为了进行X-gal试验,使用报告质粒p8op-进行酵母双杂化测定分析Lacz. 由Eyge48酵母细胞携带。 X-Gal测试结果显示出明显的Ybab-Cly反应(Fig. 2)。表达的CLPY和YBAB之间的相互作用导致β-半乳糖苷酶表达并进一步降解X-gal化合物,形成深蓝色细菌菌落。相比之下,对照组是无色的。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2酵母双杂交检测中CLPY和YBAB之间的相互作用。 仅载体的PB42AD和PGILDA被称为阴性对照。通过添加紫红色和半乳糖,通过将酵母菌菌状物传导含有最小培养基的酵母菌落来测试CLPY和YBAB蛋白之间的相互作用。转动殖民地的蓝色表示相互作用。

       测量K.d 在MBP-YBAB和CLPY之间

      通过固定在传感器电极上的MBP-YBAB施加QCM,然后加载各种体积的CLPY蛋白以测量传感器电池频率的变化。平均值 kd. 三份测定为1.37×10−9 ± 3.12 × 10−10 m. Fig. 3 显示了CLPY剂量响应曲线的代表性图像之一。这 kd. 小于 kd. (3 × 10−9 m)Azim报道的CLPY和MBP-SULA之间 等等。 (
      • Azim M.K.
      • 流孔W.
      • 宋H.K.
      • Ramachandran R.
      • Bochtler M.
      • Goettig P.
      HSLV蛋白酶Hslu伴侣亲和力的表征。
      )。因此,CLPY和MBP-YBAB之间的相互作用比CLPY和MBP-SULA之间的相互作用强。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3确定 kd. QCM测定的CLPY和YBAB之间。 测定法通过Affinix Qnμ进行并一式三份进行。选择代表性的数字用于显示曲线配件和 kd. calculation.

       MBP-YBAB体外降解试验

      在确认MBP-YBAB和CLPY蛋白之间的相互作用后,我们纯化了CLPY,CLPQ和YBAB蛋白以研究CLPYQ蛋白酶是否可以降解YBAB。他的标签用于通过镍柱净化CLPY和CLPQ。 6倍的CLPY标签位于N终端,而CLPQ则位于C终端。 MBP融合给YBAB以净化MBP-YBAB本身。因此,纯化产物的分子量升高了〜40kDa。具有Coomassie染色的SDS-PAGE向CLPY,CLPQ和YBAB显示了清晰的单频带(Fig. 4A)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4体外 MBP-YBAB的降解测定。 通过抗MBP抗体在37℃下通过CLPYQ降解MBP-YBAB的降解并通过图像J.分析。 A,Coomassie蓝色染色纯化的MBP-YBAB,CLPY和CLPQ。 B,ybab的SDS-Page通过CLPYQ降级。 (C)通过抗MBP Western印迹确定的CLPYQ降解。手段和标准偏差(误差酒吧)采用三个独立分析。这 星号 表明学生的显着差异 t test (p < 0.05).
      体外 通过添加2μ来配置劣化测试m ClpY, 2 μm ClpQ, 1 μm MBP-YbaB, and 5 mm ATP到HEPES降解缓冲液。将所得溶液在37℃下反应4小时,并在反应后在0和4小时收集样品。 SDS-PAGE用于观察蛋白质含量。仅使用含有MBP-Ybab和ATP的反应溶液作为对照,以确定蛋白质是否可以在4小时内自降解。测试结果显示,含有CLPYQ的实验组与没有蛋白酶的控制相比表现出更高的降解速率(Fig. 4B)。蛋白质印迹结果还显示了4小时后ybab的降解(Fig. 4C)。这表明YBAB不仅绑定到CLPY,而且是CLPYQ的基板。

       MBP-YBAB在体内降解测试中

      除了探索 体外 该研究的ClpyQ的降解效果也适用 lon 大肠杆菌 菌株(SG22623)和 lon CLPQ. 大肠杆菌 菌株(AC3112)。 SG22623由野生型构成,爆炸 lon 基因。 AC3112通过进一步敲出了SG22623构建的 CLPQ. gene (
      • chang c.y.
      • 胡H.-t.
      • Tsai C.-h.
      • wu w.-f.
      CLPYQ(HSLUV)蛋白酶的RCSA降解 大肠杆菌.
      )。这2 ko菌株将有助于我们调查 体内 ybab的降解。 大肠杆菌 有两个主要的ATP依赖性蛋白酶,这是LON和CLP蛋白酶。 LON负责许多细菌中异常或不稳定的调节蛋白的降解。此外,LON蛋白酶与CLPYQ蛋白酶共享相同的底物。它表明CLPYQ蛋白酶的底物可以通过LON蛋白酶降解 大肠杆菌 患有ClpyQ无效的突变(
      • Tsilibaris V.
      • Maenhaut-Michel G.
      • van Melderen L.
      LON ATP依赖性蛋白酶的生物学作用。
      )。因此,菌株SG22623和AC3112都被认为是ATP依赖性蛋白酶缺陷菌株,而没有LON蛋白酶,这两个菌株之间的蛋白质组学谱的差异将通过在SG22623中的CLPYQ蛋白酶的表达来源于(
      • chang c.y.
      • 胡H.-t.
      • Tsai C.-h.
      • wu w.-f.
      CLPYQ(HSLUV)蛋白酶的RCSA降解 大肠杆菌.
      )。样本 ybab. 被克隆到pth18kr-MBP. 质粒然后转化为SG22623和AC3112菌株。施用IPTG以表达MBP-YBAB融合蛋白30分钟,然后使用北霉素终止细菌细胞中蛋白质的生物合成。因此,细菌细胞中蛋白质的量不再增加。如果ybab蛋白质水平在Sg22623中减少了超过AC3112中的,这将证实Ybab蛋白通过CLPYQ降解 体内。使用抗MBP抗体的Western印迹测量蛋白质水平。定量分析结果基于细菌生长OD标准化600 values.
      Fig. 5,蛋白酶缺陷菌株AC3112显示出4小时后没有显着降解MBP-YBAB。对比,蛋白质印迹显示CLPYQ Coxcression菌株SG22623后4小时后显着降低MBP-YBAB信号。 体内。这表明YBAB通过CLPYQ蛋白水解活性降解,结果与YBAB是CLPYQ的基材一致 体外.
      图缩略图GR5.
      Fig. 5体内 MBP-YBAB的降解测定。 抗MBP抗体测定SG22623和AC3112中MBP-YBAB的降解。条形图是通过Image J.手段和标准偏差的降解率的量化(误差酒吧)采用三个独立分析。这 星号 表明学生的显着差异 t test (p < 0.05).

      讨论

      这是使用蛋白质微阵列的全局筛选蛋白酶基材的第一研究。因为蛋白质芯片上的蛋白质基质将通过蛋白酶探针降解,所以通过直接使用常规蛋白质组微阵列测定来鉴定蛋白酶衬底是非常具有挑战性的。在这项研究中,我们选择一个间接策略来首先识别蛋白酶结合蛋白。我们仅使用CLPY,这是CLPYQ蛋白酶的识别单元,用于筛选CLPY结合蛋白质 大肠杆菌 蛋白质组微阵列。在鉴定CLPY认可的蛋白质后,我们通过验证蛋白酶活性 体外体内 降解测定。通过使用这种间接策略,我们确定YBAB是CLPYQ的基板。
      什么时候 大肠杆菌 患有热量,误用蛋白质将积聚。因此,诱导热休克蛋白(
      • 罗森r.
      • Biran D.
      • Gur E.
      • BECHER D.
      • Hecker M.
      • ron e.z.
      蛋白质聚集在 大肠杆菌:蛋白酶的作用。
      )。然而;在正常的生理状态下,热休克蛋白的过表达对细胞有毒。一些抗生素,如嘌呤霉素,诱导的热休克调节蛋白表达。 Missiaka. 等等。 (
      • Missiakas D.
      • Schwager F.
      • Betton J.M.
      • Georgopoulos C.
      • raina s.
      涉及错误折叠蛋白总体蛋白分解的HSIV HSIU(CLPQ CLPY)蛋白的鉴定与表征 大肠杆菌.
      )发现CLPYQ能够抑制嘌呤霉素诱导的组成型热冲击调节。他们报告了ClpyQ可以降解异常的“嘌呤霉素多肽”。因此,它是帮助细胞降低异常热休克反应的毒性效果。 SOS反应蛋白SULA(
      • 贝E.
      • Lutkenhaus J.
      分析 FTSZ. 赋予细胞分裂抑制剂SULA(SFIA)抗性的突变。
      )是ClpyQ的已知基材(
      • wu w.f.
      • 周Y.
      • Gottesman S.
      多余的 体内 蛋白水解活动 大肠杆菌 LON和CLPYQ(HSLUV)蛋白酶。
      )。当SOS反应激活时,SULA抑制细胞分裂(
      • 贝E.
      • Lutkenhaus J.
      分析 FTSZ. 赋予细胞分裂抑制剂SULA(SFIA)抗性的突变。
      )。 ClpyQ的另一个目标是RCSA,RPOH,TRAJ和RNASER(
      • wu w.f.
      • 周Y.
      • Gottesman S.
      多余的 体内 蛋白水解活动 大肠杆菌 LON和CLPYQ(HSLUV)蛋白酶。
      ,
      • Kuo M.S.
      • 陈K.P.
      • wu w.f.
      CLPYQ(HSLUV)蛋白酶对RCSA的调节 大肠杆菌.
      ,
      • 刘宏,即
      • 洛克T.
      • 埃里森M.J.
      • raivio t.l.
      • 弗罗斯特L.S.
      CPX调节件的激活使F质粒转移活化剂Traj通过HSLVU蛋白酶稳定下来 大肠杆菌.
      ,
      • Kanemori M.
      • Nishihara K.
      • yanagi h.
      • Yura T.
      HSLVU和其他ATP依赖蛋白酶在控制中的协同作用 体内 Sigma32的营业额和异常蛋白质 大肠杆菌.
      ,
      • 梁W.
      • Deutscher M.P.
      转移信使RNA-SMPB蛋白通过促进Hsluv和Lon蛋白酶的结合来调节Ribonuclease R营业额。
      )。 RPOH是热休克转录因子(
      • Kuo M.S.
      • 陈K.P.
      • wu w.f.
      CLPYQ(HSLUV)蛋白酶对RCSA的调节 大肠杆菌.
      )。 RCSA是胶囊合成激活蛋白,也是LON的基材(
      • Gottesman S.
      • Trisler P.
      • Torres-Cabassa A.
      调节荚膜多糖合成 大肠杆菌 K-12:三种调节基因的表征。
      )。 Traj负责F质粒缀合物激活(
      • 刘宏,即
      • 洛克T.
      • 埃里森M.J.
      • raivio t.l.
      • 弗罗斯特L.S.
      CPX调节件的激活使F质粒转移活化剂Traj通过HSLVU蛋白酶稳定下来 大肠杆菌.
      )。 Rnaser是一种重要的放电酶,负责结构化RNA的降解 大肠杆菌 (
      • 梁W.
      • Deutscher M.P.
      转移信使RNA-SMPB蛋白通过促进Hsluv和Lon蛋白酶的结合来调节Ribonuclease R营业额。
      )。这些研究结果表明CLPYQ参与重要的细胞生理功能。在这项研究中,我们展示YBAB是CLPYQ的新颖目标。 Ybab是一种DNA结合蛋白,其具有可能的组蛋白样活性,所述细菌细胞中通过形成核细胞填充原核生物的遗传物质(
      • Jutras B.L.
      • 鲍曼A.
      • 褐色c.a.
      • 亚当斯C.A.
      • Verma A.
      • Chenail上午
      • 史蒂文森B.
      EBFC(YBAB)是一种新型的细菌核相关蛋白和Lyme疾病中基因表达的全球调节因子。
      ,
      • 狄龙S.C.
      • Dorman C.J.
      细菌核相关蛋白,核结构和基因表达。
      )。但是,Ybab的实际功能仍然不清楚(
      • Jutras B.L.
      • 鲍曼A.
      • 褐色c.a.
      • 亚当斯C.A.
      • Verma A.
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      EBFC(YBAB)是一种新型的细菌核相关蛋白和Lyme疾病中基因表达的全球调节因子。
      )。因为Ybab是一种组蛋白样蛋白质,所以它可以通过调节核结构来介导基因沉默和抗抑变活动(
      • 狄龙S.C.
      • Dorman C.J.
      细菌核相关蛋白,核结构和基因表达。
      )。这表明CLPYQ蛋白酶参与了YBAB的法规函数和其他基因调节级联。此外,YBAB与许多病原体份子股票,例如 嗜血杆菌流感, 大肠杆菌, 霍乱霍乱, Pseudomonas普蒂达, Rickettia Rickettsiae., 淋球菌, bdellovibrio细菌莫罗乌斯, 产气荚膜梭菌, 枯草芽孢杆菌, 肠球菌粪便器, 肺炎链球菌肺炎料, 结核分枝杆菌, Bacteroides capillosus., 和 Borrelia Burgdorferi. (
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      DNA结合 嗜血杆菌流感大肠杆菌 YBAB,一种广泛分布的细菌蛋白家族的成员。
      )。他们的宿主包括人类,植物和动物。这表明通过CLPYQ消化的ybab函数调节是细菌中的一个非常重要的机制。

      补充材料

      作者简介

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