细胞培养氨基酸氨基酸差异动态稳定同位素标记对胱氨酸溶胶糖基化对蛋白质稳定性的影响(Silac)*

  • 作者脚注
    ‖‖这些作者同样为工作贡献。
    Nathalie Nevo
    脚注
    ‖‖这些作者同样为工作贡献。
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    来自Inserm U1163,遗传性肾病实验室,Imagine Institute,巴黎,法国;

    巴黎Descartes-Sorbonne ParisCité大学,法国巴黎;
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  • 作者脚注
    ‖‖这些作者同样为工作贡献。
    Lucie Thomas.
    脚注
    ‖‖这些作者同样为工作贡献。
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    来自Inserm U1163,遗传性肾病实验室,Imagine Institute,巴黎,法国;

    巴黎Descartes-Sorbonne ParisCité大学,法国巴黎;
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  • Cerina Chhuon.
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    PlateformeProtéomique巴黎嵌入式颈部,PPN,3P5颈圈,SFR颈,US24,75014巴黎,法国;

    巴黎Descartes-Sorbonne ParisCité大学,法国巴黎;
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  • Zuzanna Andrzejewska.
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    来自Inserm U1163,遗传性肾病实验室,Imagine Institute,巴黎,法国;

    巴黎Descartes-Sorbonne ParisCité大学,法国巴黎;
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  • 乔安娜利克萨
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    CPN蛋白质组学设施 - 3P5,精神病学中心和神经科学,UMR Inserm 894,75014巴黎,法国;

    巴黎Descartes-Sorbonne ParisCité大学,法国巴黎;
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  • FrançoisGuillonneau.
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    PlayformeProtéomiqueParis Descartes Cochin,3P5-Cochin,法国巴黎75014;

    巴黎Descartes-Sorbonne ParisCité大学,法国巴黎;
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  • 安妮贝利克斯
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    来自Inserm U1163,遗传性肾病实验室,Imagine Institute,巴黎,法国;

    巴黎Descartes-Sorbonne ParisCité大学,法国巴黎;
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  • 亚历山大·埃德尔曼
    隶属关系
    PlateformeProtéomique巴黎嵌入式颈部,PPN,3P5颈圈,SFR颈,US24,75014巴黎,法国;

    Insm U1151,75015巴黎,法国;
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  • Corinne Antignac.
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    来自Inserm U1163,遗传性肾病实验室,Imagine Institute,巴黎,法国;

    巴黎Descartes-Sorbonne ParisCité大学,法国巴黎;

    援助Publique - HôpitauxDeAliS(AP-HP),雷纳斯医院遗传学系,法国巴黎
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  • Ida Chiara Guerra
    一致
    应该解决谁的通信:Hôpital脖子,网站Broussais 14 Rue Maria Helena Vieira Da Silva。 75993巴黎Cedex 14.电话:01 72 60 63 31;
    隶属关系
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    巴黎Descartes-Sorbonne ParisCité大学,法国巴黎;
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了催化剂研究基金会的补助金,并从投资未来计划(ANR-10-IAHU-01)。
    本文含有补充材料。
    ‖‖这些作者同样为工作贡献。
      半僵菌是一种稀有的常染色体隐性溶酶体储存障碍,其特征是胱氨酸的腹腔内积累。半胱易生症的致病基因是CTNS..,它们编码蛋白质半胱氨酸,溶酶体质子驱动的胱氨酸转运蛋白。已经报道了超过100个突变,导致不同的疾病严重程度,通常与残留半胱氨酸活性作为转运蛋白的相关性以及维持其蛋白质 - 蛋白质相互作用。在这项研究中,我们专注于ΔitLelp突变,唯一的突变报告称,有时会导致严重的形式,与其残留的运输活动不一致。 Δitlelp是一种缺失,消除了N66上的一种蛋白质的共识遗址'S七个糖基化位点。我们的假设是ΔitLelp突变体较低并且经历更快的降解。我们的动态稳定同位素标记由细胞培养(Silac)研究中的氨基酸清楚地表明,野生型半胱氨酸是非常稳定的,而Δitlelp迅速降低三倍。额外的溶酶体抑制实验证实ΔitLelp不稳定性,并显示出降解主要是溶酶体。我们观察到,在溶酶体中,ΔitLelp仍然能够与V-ATP酶复合物和MTOR途径的一些成员相互作用,类似于野生型蛋白质。感兴趣的是,我们的临节组和免疫荧光研究表明,ΔitILELP部分保留在内质网(ER)处。我们提出ΔitLelp突变使蛋白质被误用,ER保留和无法在GOLGI装置中加工,并且我们证明Δitelp在其剩余六个糖基化位点上的高甘露糖聚糖。我们发现,由于其未成熟的糖基化状态与低运输活性结合的糖基化状态的高趋势可能是在一些患者中观察到的表型。
      半僵菌(在MAN 219800的在线孟德利亚遗传)是一种稀有的常血型隐性溶酶体储存障碍,其特征是胱氨酸的腹腔内积聚,导致多器官功能受损(
      • gahl w.a.
      • Thoene J.G.
      • 施耐德J.A.
      )。基于发病年龄和症状的严重程度,已经描述了三种临床形式的半胱氨酸型:婴儿(严重),青少年和眼睑(温和)。
      半胱易生症的致病基因是 CTNS..,编码蛋白质半胱氨酸,一种溶酶体质子驱动的胱氨酸胱氨酸转运蛋白(
      • 镇M.
      • 让G.
      • cher
      • at Agent M.
      • 林业L.
      • 惠特更多S.A.
      • Callen D.F.
      • Gribouval O.
      • 培养器M.
      • 贝茨G.P.
      • Van't Hoff W.
      • 抗核酸C.
      编码整体膜蛋白的新基因在肾病性囊蛋白中突变。
      ,
      • cher
      • Kalatzis V.
      • Trugnan G.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸对溶酶体膜的靶向需要酪氨酸的信号和新型分选矩阵。
      ,
      • Kalatzis V.
      • cher
      • 抗核酸C.
      • 汽轮B.
      半胱易塞中缺陷的半胱氨酸蛋白质,是H(+)驱动的溶酶体胱氨酸转运蛋白。
      )。最近,我们已经表明,除了运输胱氨酸,通过与V-ATPase,Ragulator和Rags相互作用(
      • 和rzejewska z.
      • 内太福州。
      • 托马斯L.
      • Chhuon C.
      • Baileux A.
      • Chauvet V.
      • 托架P.J.
      • Chol M.
      • Guerrera i.c.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸是真空H + -ATPase-Ragulator-Rag复合物控制哺乳动物催乳素络合物1信号传导的组分。
      ),并且缺乏半胱氨酸蛋白导致MTOR信号传导途径的失调。
      半胱氨酸是367-氨基酸(AA)
      使用的缩写是:AA,氨基酸; endo h,内切糖苷酶h; ER,内质网; FDR,虚假发现率; LFQ,无标签量化; PDI,蛋白二硫化物异构酶; PNGase F,肽:N-糖苷酶F酶; RIA,相对同位素丰富; RSLC,快速分离液相色谱;硅酸盐,细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记; TM,跨膜; wt,野生型。
      1使用的缩写是:AA,氨基酸; endo h,内切糖苷酶h; ER,内质网; FDR,虚假发现率; LFQ,无标签量化; PDI,蛋白二硫化物异构酶; PNGase F,肽:N-糖苷酶F酶; RIA,相对同位素丰富; RSLC,快速分离液相色谱;硅酸盐,细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记; TM,跨膜; wt,野生型。
      蛋白质,具有41.7kDa的标称质量。它具有短细胞溶质10-AA C末端尾,七个跨膜(TM)结构域,延伸溶酶体膜和溶酶体内腔中的128-AA N-末端区域,轴承七个N-糖基化共有位点N-X-S / T(n36,n41,n51,n66,n84,n104,和n107,此后称为n1 to N7)(Fig. 1A)。成熟半胱氨酸的分子量(Mw)估计在〜56kDa。半胱氨酸含有两个溶酶体靶向基序:C末端尾部的典型酪氨酸基主题(GYDQL)和位于第五TM环路上的构象信号(
      • cher
      • Kalatzis V.
      • Trugnan G.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸对溶酶体膜的靶向需要酪氨酸的信号和新型分选矩阵。
      ,
      • 和rzejewska z.
      • névon。
      • 托马斯L.
      • Baileux A.
      • Chauvet V.
      • Benmerah A.
      • 抗核酸C.
      囊体靶向胱氨酸素需要AP-3。
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1WT半胱氨酸和δItilelp的蛋白质拓扑图和电泳谱。 A,半胱氨酸和(B)ΔitLelp被肽emass软件获得的理论胰蛋白酶(红色破折号)通过Q-辐射锻造(红色圈)。 C,表达Cystinosin-EGFP,ASN的NIH / 3T3细胞的裂解物66通过10%凝胶的SDS-PAGE分解ALA(单糖基化位点缺失的突变体)和ΔitILELP,然后通过用抗GFP抗体免疫印迹分析。
      在一组31个星星虫突变中进行的大多数早期功能研究表明,胱氨酸迁移活性与症状的严重程度之间的相关性(
      • Kalatzis V.
      • cher
      • 抗核酸C.
      • 汽轮B.
      半胱易塞中缺陷的半胱氨酸蛋白质,是H(+)驱动的溶酶体胱氨酸转运蛋白。
      )。大多数婴儿突变消除了胱氨酸运输,而较少的严重突变只会减少它(
      • Kalatzis V.
      • cher
      • 抗核酸C.
      • 汽轮B.
      半胱易塞中缺陷的半胱氨酸蛋白质,是H(+)驱动的溶酶体胱氨酸转运蛋白。
      )。受严重症状影响的患者在两位等位基因上患有严重的突变,而较温和的患者通常在两种等位基因上或与严重突变结合进行非静脉突变。
      但是,已经观察到一些差异,例如与我一起67-P.73del(Δitilelp),导致19%的残余运输活性,被认为是非静脉突变(
      • Kalatzis V.
      • cher
      • 抗核酸C.
      • 汽轮B.
      半胱易塞中缺陷的半胱氨酸蛋白质,是H(+)驱动的溶酶体胱氨酸转运蛋白。
      )。在两个等位基因上具有Δitilelp突变的个体具有幼年形式,而在一个等位基因上与57-kB缺失(最常见的严重突变)的Δitelp突变的那些可以发展婴儿形式(
      • 希尔斯。
      • levtchenko e。
      • 蒙诺斯L.A.
      • trijbels f.j.
      • van der put n.m.
      • Blom H.J.
      荷兰婴儿肾病性囊性症的分子基础。
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      • 内太福州。
      • cher
      • 汽轮B.
      • 抗核酸C.
      半胱素病的分子发病机制:CTNS突变对半胱氨酸血糖活性和亚细胞定位的影响。
      ,
      • Midgley J.P.
      • El-kares r.
      • Mathieu F.
      • 好人P.
      青少年发病性胱素病的自然历史。
      )。 ΔitLelp是与位66处的N-糖基化位点相邻的框架内缺失。预测Δitlelp突变(AA67-73的缺失),以防止NIT上N-糖基化NXS / T的识别共有序列(AA66-68)通过oligosaccaryltransferase。因此,Δitlelp导致在N末端腔区域中除去七个氨基酸,并在n上损失糖基化66,七个n-糖基化位点的第四个(
      • 马歇尔r.d.
      糖蛋白。
      )。迄今为止,Δitlelp是导致糖基化有缺陷的患者中检测到的唯一突变。
      已知溶酶体膜蛋白的糖基化免受蛋白水解保护(
      • kundra r.
      • Kornfeld S.
      天冬酰胺连接的低聚糖保护灯-1和灯泡-2免受细胞内蛋白水解。
      ),我们假设由ΔitLiLelp引起的错误糖基化可能影响蛋白质的稳定性。为了研究Δitlelp的稳定性,我们将其降解速率与野生型(WT)半胱氨酸进行比较。作为额外的对照,我们还研究了两个不冲糖基化位点的突变的降解(n288k和n323k)。蛋白质周转研究的典型方法是脉冲追踪与放射性氨基酸的脉冲序列标记。我们使用了基于质谱法的替代方法,称为细胞培养氨基酸(动态Silac)氨基酸的动态稳定同位素标记(
      • Doherty M.K.
      • 哈蒙德D.E.
      • Clague M.J.
      • Gaskell S.J.
      • Beynon R.J.
      人蛋白质组的营业额:动态氧化剂测定蛋白质细胞内稳定性。
      ,
      • Beynon R.J.
      蛋白质组的动态:蛋白质尺度上测量蛋白质成交量的策略。
      )。在这种代谢标记时期实验中,蛋白质的未标记和标记的肽的比例反映了在每个测量的时间点处的预先存在和新合成的蛋白质的比率。已经表明,从这些值,可以通过曲线绘图或数学公式成功地计算蛋白质的降解率(
      • SchwanhäusserB.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
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      • Doherty M.K.
      • 哈蒙德D.E.
      • Clague M.J.
      • Gaskell S.J.
      • Beynon R.J.
      人蛋白质组的营业额:动态氧化剂测定蛋白质细胞内稳定性。
      )。
      为了扩展我们对Δitlelp致病性涉及的细胞机制的知识,通过研究其糖基化,细胞定位和特定的蛋白质合作伙伴,在细胞中分析了其在细胞中的命运,与WT半胱氨酸相比。

      实验步骤

       抗体

      从以下来源获得抗体:来自烯唑生命科学(Lyon,France)的PDI和Calnexin的抗体,来自Roche的GFP抗体,来自GE Healthcare的抗小鼠IgG-HRP和Alexa Fluor 555 - 生命技术(Thermo Fisher Scientific,Courtaboeuf,法国)的647缀合的二抗。由J. Thomas 8月开发的灯-1(1d4b)单克隆抗体从发育研究杂交瘤银行获得,根据国家儿童卫生和人类发展研究所的主持,并由生物学系大学维护爱荷华州爱荷华州,爱荷华州,爱荷华州。

       细胞培养

      NIH / 3T3成纤维细胞系在补充有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中,100u / ml青霉素,0.1mg / ml链霉素和2米M L.-Glutamine(完整DMEM培养基)(来自Life Technologies)。
      对于动态氧化硅酸研究,稳定表达不同融合蛋白的NIH / 3T3细胞镀在4×106 每150mm细胞培养皿的细胞。除去完整的DMEM培养基后,将细胞用PBS迅速洗涤两次,然后与缺乏精氨酸和赖氨酸的DMEM培养基孵育,补充有175.2mg / L [13C6] l-Arginine,84 mg / L [13C6] l-Lysine,10%透析的FBS(来自Thermofer Simiter),100mg / L脯氨酸(Sigma-Aldrich),100u / ml青霉素,0.1mg / ml链霉素和2米M L.-Glutamine用于追逐0,6,18和24小时。在这些时间,在加工蛋白质组学周转分析之前处理细胞以进行免疫沉淀。
      为了计算细胞生长速率(D),将WT和突变细胞在1.3×10的10cm组织培养皿中铺板6 每150mm细胞培养皿的细胞培养24小时,在几个时间点(0,6,18和24小时)收集,然后使用Beckman Coulter Z2细胞计数器计数。通过装配细胞数量来计算细胞生长速率(D)(y)在不同的时间(x)通过Microsoft Excel中的指数增长曲线,使用公式: y = a * eDx,其中“a”是0小时的细胞数。

       产生稳定的细胞系

      为了产生稳定表达人蛋白质Cystinosin-EGFP的NIH / 3T3成纤维细胞系,构建PCTNS-EGFP(
      • cher
      • Kalatzis V.
      • Trugnan G.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸对溶酶体膜的靶向需要酪氨酸的信号和新型分选矩阵。
      )被亚克隆到Lentiviral prrl.sin.cppt.pgk / wpre载体中(
      • Zuffey R.
      • Donello J.E.
      • Trono D.
      • 希望T.J.
      Woodchuck肝炎病毒前术治疗元素增强了逆转录病毒载体输送的转基因的表达。
      )。胱氨酸蛋白突变体ΔitILELP,N288K,N323K(
      • 和rzejewska z.
      • 内太福州。
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      • Chhuon C.
      • Baileux A.
      • Chauvet V.
      • 托架P.J.
      • Chol M.
      • Guerrera i.c.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸是真空H + -ATPase-Ragulator-Rag复合物控制哺乳动物催乳素络合物1信号传导的组分。
      通过使用stratagenequikchange®站点诱变诱变试剂盒,通过改变prrl.sin.cppt.pgk / wpre-ctns-egfp构建体获得PRRL.Sin.cppt.pgk / WPRE-CTNS-EGFP构建体获得的N1N7(在丙氨酸中突变的七个推定的N-糖基化位点。根据制造商的建议。慢病毒在如前所述的HEK293T细胞中产生(
      • 和rzejewska z.
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      • Chhuon C.
      • Baileux A.
      • Chauvet V.
      • 托架P.J.
      • Chol M.
      • Guerrera i.c.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸是真空H + -ATPase-Ragulator-Rag复合物控制哺乳动物催乳素络合物1信号传导的组分。
      )。 NIH / 3T3细胞通过含有CTNS-EGFP的慢病毒颗粒或其突变形式在8μg/ mL含有8μg/ mL的含量的MOI下转导。

       EGFP融合构建体的产生和NIH / 3T3成纤维细胞的转染

      PCTNS-EGFP构建体及其突变形式ΔitiLelp已被描述(
      • cher
      • Kalatzis V.
      • Trugnan G.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸对溶酶体膜的靶向需要酪氨酸的信号和新型分选矩阵。
      )。对于突变N66A(在丙氨酸中突变的N66糖基化位点),PCTNS-EGFP构建体的修饰(
      • cher
      • Kalatzis V.
      • Trugnan G.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸对溶酶体膜的靶向需要酪氨酸的信号和新型分选矩阵。
      )根据制造商的建议使用Stratagene Quikchange站点定向诱变套件进行。根据制造商的协议,使用Lipofectamine®2000试剂(Invitrogen,Thermo Fisher Scientific,Courtaboeuf)用2μg不同构建体转染NiH / 3T3成纤维细胞。在转染后,细胞在蛋白质印迹后裂解48小时。

       CoimMunopectipitation和免疫印迹

      如前所述进行Cystinosin-EGFP上的CoimmunoMoMoPrecipitipitation和NiH / 3T3细胞中的突变体的蛋白质印迹实验(
      • 和rzejewska z.
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      • Guerrera i.c.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸是真空H + -ATPase-Ragulator-Rag复合物控制哺乳动物催乳素络合物1信号传导的组分。
      )。免疫沉淀的萼素用Bio-1D软件(Vilber Lourmat)表示为Calnexin和Cystinosin-EGFP的信号的比率。使用Kruskal-Wallis测试的统计分析(p <0.05)与HOC DUNN的测试进行了棱镜版5(GraphPad软件,La Jolla,CA)进行。统计显着性的阈值设定为 p <0.05。每个条表示平均值±s.e.来自四个独立实验。

       免疫荧光

      NIH / 3T3细胞在12孔组织培养皿中涂覆在玻璃盖玻片上,然后将24-38H H如前所述处理(
      • 和rzejewska z.
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      • Chhuon C.
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      半胱氨酸是真空H + -ATPase-Ragulator-Rag复合物控制哺乳动物催乳素络合物1信号传导的组分。
      )。对于分层分析,通过使用imagej 1.50软件将PDI或灯泡标记的区域分别划定PDI或灯光1标记的区域来定义网状和溶酶体隔室。测量囊氨酰蛋白-EGFP或其突变体的网状或溶酶体积累,以与PDI或灯1-标记区域分成的GFP融合蛋白的百分比表示的比例。使用HOC DUNN测试后kruskal-wallis测试的统计分析进行了棱镜版本5(GraphPad软件)。统计显着性的阈值设定为 p <0.05。分析了三种独立的生物重复,对于每个实验,进行每个细胞类型的五个细胞的分层化GFP / PDI或GFP / LAMP1。

       PNGase F和Endo H治疗方法

      除了在50°C下进行的建议,将细胞裂解物在37℃下,每μg总蛋白为100u,每μg总蛋白质,每μg总蛋白质处理。而不是100°C。通过蛋白质印迹分析所得细胞裂解物。

       药物治疗和FACS分析

      将稳定地表达WT Cystinosin-EGFP和ΔitLILP-EGFP的NIH / 3T3细胞与10μ孵育m Clasto-lactacystinβ-内酯(Calbiochem)或100 nm Bafilomycin A1(Sigma)在完整的DMEM培养基中为24小时(Merck Millipore,Alsace,France)。然后通过使用胰蛋白酶收获细胞,并以1500rpm离心2.5分钟。用PBS洗涤电池粒料一次,并用1%牛血清白蛋白重悬于500μLPBS中。通过使用CellQuest软件(BD Biosciences)的FacScalibur通过直接流式细胞仪进行分析EGFP表达。通过在向前/侧光散射上浇注死细胞和碎片,并每样品分析与EGFP阳性细胞相对应的10,000个事件。通过计算地质荧光强度(GFI)来确定单个NIH / 3T3细胞中EGFP的平均表达水平。相对于未处理细胞的GFI(用DMSO载体),将处理细胞的GFI归一化。使用HOC DUNN测试后kruskal-wallis测试的统计分析进行了棱镜版本5(GraphPad软件)。统计显着性的阈值设定为 p <0.05。每个条表示平均值±s.e.来自五个独立实验。

       营业额研究质谱(MS)分析

      对于营业额研究,通过SDS-PAGE在10%凝胶上解析免疫沉淀的蛋白质样品,并且切除对应于半胱氨酸的大蛋白质带。如前所述进行凝胶胰蛋白酶消化(
      • 和rzejewska z.
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      • 抗核酸C.
      半胱氨酸是真空H + -ATPase-Ragulator-Rag复合物控制哺乳动物催乳素络合物1信号传导的组分。
      )。对凝胶中消化样品的纳米LC-MS / MS分析是对偶极的3000次快速分离液相色谱(RSLC)系统进行的,耦合到Q-Active加上质谱仪(Thermo Sciencific,Waltham,MA)。将提取的肽重悬于0.1%(v / v)三氟乙酸和10%乙腈中,然后装载到μ-前柱上(适度的PEPMAP 100 C18,盒,300μmID×5mm,5μm,Dionex,Thermo Fishific, Courtaboeuf,法国),然后在分析50厘米纳米柱上分离(0.075 mm ID,适度的Pepmap 100,C18,2μm,Dionex)。色谱溶剂在水中(a)0.1%甲酸,(b)80%乙腈,甲酸0.08%。通过在38分钟内使用5%至40%B的梯度从柱中洗脱肽,然后通过数据依赖性MS / MS分析,使用前10个采集方法分析。简而言之,仪器设置如下:将分辨率设置为70,000,用于MS扫描,17,500,用于数据相关的MS / MS扫描以提高速度。 MS AGC目标设置为3.106 最大注射时间为200毫秒计数,而MS / MS AGC目标设置为1.105 最大喷射时间为120 ms。动态排除设置为30秒。
      使用蛋白质组发现者1.4.0.288软件(Thermo Scientific,San Jose,CA)进行处理原始文件,并使用吉祥物2.2对抗 亩肌肉 UNIPROT KB / SWISS-PLAT数据库V.5 / 7/2012(16,331个条目)与EGFP半胱氨酸WTS和突变体的序列集成。搜索参数包括固定修饰,用氨基甲酰基(C)和具有氧化(M)的可变修饰,标签:13C(6)(k),标签:13C(6)(r)和两个错过的裂缝。酶是胰蛋白酶,单异位肽质量耐受性为±2 ppm,片段质量耐受±0.05da。使用渗滤器进行鉴定验证,允许基于Q值的肽1-5%的肽进行靶FDR,并通过目标 - 诱饵方法确定。
      质谱蛋白质组学数据已经在全景公共场所存放(//panoramaweb.org/labkey/Guerrera.url)。与营业额研究相关的MS原始文件已通过骄傲在Proteomexchange联盟中存放(
      • VizcaínoJ.A.
      • Csordas A.
      • Del-Toro N.
      • 戴安斯J.A.
      • 怜悯J.
      • Lavidas I.
      • Mayer G.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • Ternent T.
      • 徐Q. -W.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      2016年更新自豪数据库及其相关工具。
      )与数据集标识符PXD005357的合作伙伴存储库。

       营业额数据分析

      可以在每个时间点的相对同位素丰度(RIA)来计算蛋白质的损失。 RIA表示残留预先存在的蛋白质的一部分(光肽的MS1面积:aL) 相对 预先存在的细胞中蛋白质的总量(aL)和新合成的(重肽的MS1面积:aH),在每个时间点。因此,RIA计算为:
      RIAL,t=AL,tAH,t+AL,t


      MS1区域aH 和 AL 用于使用天线素V2.6.0的肽SVSLTVPPVVK,EDGNILGHK,FEGDTLVNR和FSVSGEGDATYGK(可自由) //skyline.gs.washington.edu)。为了确保峰值归因中的准确性,使用来自相同样本的搜索文件构建专用的天际线库。由于存在在不同条件下部分氧化的甲硫氨酸存在而被排除肽YFPQAYMNFYYK。基于保留时间和质量误差进行彻底的手动检查和峰值拾取。 ria.L,T. 用于在每次点(0,6,18和24小时)的每种肽,用于WT半胱氨酸和每个突变体Δitilelp,n288k,n323k,和n1N7 (脱糖基化形式的半胱氨酸)(
      • Doherty M.K.
      • 哈蒙德D.E.
      • Clague M.J.
      • Gaskell S.J.
      • Beynon R.J.
      人蛋白质组的营业额:动态氧化剂测定蛋白质细胞内稳定性。
      ,
      • 普拉特准
      • 小J.
      • Riba-garcia I.
      • 罗伯逊D.H.L.
      • Gaskell S.J.
      • 奥利弗S.G.
      • Beynon R.J.
      蛋白质变型蛋白质周转动态,蛋白质组学中缺失的尺寸。
      )。蛋白质损失率, kloss.,计算拟合RIAL,T. 使用Excel和GraphPad V7的指数衰减曲线:
      y=eKlossx


      kloss. 另外在excel中数学计算,作为平均值 kloss. 每种肽的每个单时间点(
      • SchwanhäusserB.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      ,
      • 普拉特准
      • 小J.
      • Riba-garcia I.
      • 罗伯逊D.H.L.
      • Gaskell S.J.
      • 奥利弗S.G.
      • Beynon R.J.
      蛋白质变型蛋白质周转动态,蛋白质组学中缺失的尺寸。
      ),在每个独立的生物三份中:
      K失利=t×LN.(AHAL+1)t2


      退化率(克德格)计算为损失率之间的差异(kloss.)和细胞生长速度(D):
      Kde=KlossD


      分析至少三种独立的生物重复(四个用于WT Cystinosin-EGFP,三个用于ΔitILELP,n288k,n323k,和n1N7)。对于每个实验,在0,6,18和24小时测量三到四个肽(细节 补充表S1)。每个突变体始终与WT Cystinosin-EGFP平行运行。在每个样品的至少两个独立实验中测量细胞生长速率(D)(用于WT胱氨酸酶-EGFP的四个,每个用于Δitlelp,n323k,n288k,和n1N7)(细节 补充表S3)。使用K的使用单向ANOVA进行统计分析(GraphPad软件),使用K失利 通过曲线拟合和配方获得的值,从至少三个独立的实验和每次时间点三到四肽。统计显着性的阈值设定为 p <0.05。每个条表示平均值±S.D.

       临界科学研究的质谱分析

      对于副术分析,将CoimMunopectiplated蛋白质样品浓缩在10%SDS-PAGE凝胶的顶部并切除。如前所述进行凝胶胰蛋白酶消化(
      • 和rzejewska z.
      • 内太福州。
      • 托马斯L.
      • Chhuon C.
      • Baileux A.
      • Chauvet V.
      • 托架P.J.
      • Chol M.
      • Guerrera i.c.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸是真空H + -ATPase-Ragulator-Rag复合物控制哺乳动物催乳素络合物1信号传导的组分。
      )。通过LC-MS / MS分析如“质谱”(MS)分析用于营业额的分析,“除梯度长度除外,为120分钟而不是38分钟。质谱蛋白质组学数据和关于识别和量化的细节已经通过骄傲在Proteomexchange联盟中沉积(
      • VizcaínoJ.A.
      • Csordas A.
      • Del-Toro N.
      • 戴安斯J.A.
      • 怜悯J.
      • Lavidas I.
      • Mayer G.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • Ternent T.
      • 徐Q. -W.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      2016年更新自豪数据库及其相关工具。
      )与数据集标识符PXD004948的合作伙伴存储库。
      MS文件的杂物组数据分析由MaxQuant软件版本1.5.2.8处理,并使用Andromeda搜索引擎进行搜索 亩肌肉 UNIPROT KB / SWISS-PLAT数据库2016_01(20199条目),与WT Cystinosin-EGFP的Fasta序列集成。为了搜索父质量和片段离子,我们分别设定了4.5ppm和20 ppm的初始质量偏差。将最小肽长度设定为七个氨基酸,并且需要严格的胰蛋白酶切割特异性,允许两种错过的裂解位点。将氨基甲酰亚胺甲基化(Cys)设定为固定改性,而氧化(得到)和N-末端乙酰化被设定为可变修饰。使用默认参数允许匹配运行。 PSM和蛋白质鉴定的假发现率(FDR)设定为1%,由目标诱饵方法确定。分数在MaxQuant中计算,如前所述,留给默认参数(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )。从MaxQuant输出中除去反向和常见的污染物。根据使用无标记量化LFQ强度(以下)根据Maxquant标记算法量化蛋白质(
      • Cox J.
      • 嘿m.y.
      • Luber C.a.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      MAXLFQ通过延迟归一化和最大肽比例提取来精确蛋白质组宽的无标记量化。
      )。使用每种蛋白质至少两种肽获得蛋白质定量。对于途径分析,我们根据KEGG数据库注释了所有蛋白质,并选择分类为“内质网中蛋白质处理”的蛋白质。
      分析了三种生物学复制,用于WT Cystinosin-EGFP,ΔitLelp-EGFP和对照(没有GFP)。在所有蛋白质过滤出滤波后,进行WT星胱氨酸和ΔitILELP之间的统计分析鉴定了Perseus软件的阴性对照(1.5.5.3版,可自由地提供 www.perseus-framework.org.)(
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Sinitcyn P.
      • 卡尔森A.
      • 嘿m.y.
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      Perseus综合分析(Prote)OMICS数据的计算平台。
      )。对于统计比较,LFQ数据在log2中转换,通过创建随机数的高斯分布,施加填充缺失的数据点,而是相对于测量值的标准偏差,标准偏差为33%,以及三标准 - 模拟低信号值分布的平均值的平移。我们使用FDR = 0.05和S0 = 0.5执行了对数据的火山绘图分析。

       实验设计与统计理由

      对于Western印迹分析,我们进行了四个独立的实验。统计分析是用Hoc Dunn的测试后kruskal-wallis测试完成的(门槛 p <0.05)。对于分层化统计分析,我们进行了三种独立的生物重复。统计分析是用Kruskal-Wallis和Hoc Dunn的测试进行的(阈值 p <0.05)。对于药物治疗和FACS分析,我们进行了五次独立的生物重复。统计分析是用Kruskal-Wallis和Hoc Dunn的测试进行的(阈值 p < 0.05).
      对于MS营业额研究,我们至少表现出三种独立的生物重复(FOR为WT Cystinosin-EGFP,每次为ΔitLelp,Asn288Lys,Asn.323lys,和asn1asn.7)。对于每个实验,在0,6,18和24小时测量三到四个肽(细节 表S1)。每个突变体始终与WT Cystinosin-EGFP平行运行。在每个样品的至少两个独立实验中测量细胞生长速率(D)(用于WT胱氨酸酶-EGFP的四个,每个用于Δitlelp,n323k,n288k,和n1N7)(细节 补充表S3)。使用k使用棱镜版本7(GraphPad软件)进行使用单向ANOVA的统计分析失利 通过公式获得的值(阈值 p < 0.05) (details in 补充表S4A)。
      对于基于MS的族杂项研究,我们对WT Cystinosin-EGFP,ΔitLELP-EGFP和对照进行了三种独立的生物重复(没有GFP表达质粒的细胞)。 WT半胱氨酸和Δitlelp之间的统计分析用Perseus软件进行(1.5.0.31版)进行。对于统计比较,LFQ数据在log2中转换,通过创建随机数的高斯分布,避免填充缺失的数据点,其标准偏差相对于测量值的标准偏差,以及两到五个标准偏差越跨越模拟低信号值分布的平均值。我们基于的火山绘图分析 t 测试,应用FDR = 0.05和S0 = 1。

      结果

       通过MS检测EGFP标记的半胱氨酸氨酰肽

      为了分析WT和突变半胱氨酸蛋白的营业型,我们将3T3细胞与慢病毒构建体转导,以稳定地表达半胱氨酸素-EGFP融合蛋白及其突变形式。可以在WT半胱氨酸和ΔitLelp的示意图中找到 Fig. 1A1B。我们始终根据WT或突变形式识别特异性半胱氨酸蛋白肽288k和n323k(补充图。S1)。在所有分析的半胱氨酸形式中,我们可以鉴定肽AA23-33(SVSLTVPPVVK)。这些数据表明,在S22之后,在S22之后裂解半胱氨酸肽的信号肽,尽管先前的报道描述了不可用于不可脱模的信号肽(以前的报告),从SVSLTVPPVVK开始裂解新的N-末端序列(
      • cher
      • Kalatzis V.
      • Trugnan G.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸对溶酶体膜的靶向需要酪氨酸的信号和新型分选矩阵。
      ,
      • at Agent M.
      • 让G.
      • 林业L.
      • cher
      • Van't Hoff W.
      • 培养器M.
      • 抗核酸C.
      • 镇M.
      半胱易生素中表型的严重程度随CTNS基因的突变而变化:对胱氨酸模型的预测作用。
      )。我们的数据同意预测当前使用的算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)(补充图S2)。 Δitlelp-EGFP突变导致七个氨基酸的损失和一个N-糖基化位点(n66);因此,如果所有剩余的位点完全糖基化,则其预期的分子量将小于WT星胱氨酸的3kDa。然而,观察到的糖基化形式的分子量远低于预期,并且与七个氨基酸的简单缺失和一个聚糖的损失不一致(Fig. 1C)。再次,检测肽SVSLTVPVVK(Fig. 1B)对于ΔitLelp表示突变蛋白的N-末端结构域完好无损。
      进一步验证聚糖在第66位的影响(ASN66)在蛋白质电泳剖面上,我们取代了N-糖基化的位点n66 with alanine (N66一种)。 N66A与WT半胱氨酸相比,A分子量偏移与含有一种甘草的损失一致(Fig. 1C)。

       半胱氨酸和Δitilelp的半衰期

      为了研究N-糖基化是否会影响Δitlelp的稳定性,我们使用动态氧化硅酸接种测量蛋白质劣化。我们用[13C6] l-Arginine和[13C6] l-6,18和24小时的-6,18和24小时,以选择性地标记新合成的蛋白质。 WT胱氨酸素被用作主控制,而n288k和n323不影响糖基化的K作为另外的对照。人工突变体模拟七种糖基化的损失(n1N7)也调查了。
      在每个时间点,通过LC-MS / MS分析半胱氨酸苷及其突变体。对于每个样品,进行MS分析以确认胱氨酸酯或其突变体的存在,并验证在时间过程中掺入标记的氨基酸。为了计算给定蛋白质的周转率,我们在每个时间点(每个时间点的蛋白质)使用来自四个标记的和未标记的肽的前体离子信号(MS1区域)(在肽中示出了一个肽的示例 Fig. 2)。提取的MS1区域用于计算每个时间点的相对同位素丰度(RIAt)对于每个细胞类型和每个复制(补充表S1)。 ria.L 在时间0始终设置为1,因为细胞在该时间点含有100%的光氨基酸。 K.失利 通过拟合(RIA)获得的值我, t)在指数衰减曲线上(k失利 by formula) (
      • Doherty M.K.
      • 哈蒙德D.E.
      • Clague M.J.
      • Gaskell S.J.
      • Beynon R.J.
      人蛋白质组的营业额:动态氧化剂测定蛋白质细胞内稳定性。
      ,
      • Beynon R.J.
      蛋白质组的动态:蛋白质尺度上测量蛋白质成交量的策略。
      ,
      • 普拉特准
      • 小J.
      • Riba-garcia I.
      • 罗伯逊D.H.L.
      • Gaskell S.J.
      • 奥利弗S.G.
      • Beynon R.J.
      蛋白质变型蛋白质周转动态,蛋白质组学中缺失的尺寸。
      )或通过单时间点分析(k失利 by fitting) (
      • SchwanhäusserB.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      ,
      • 普拉特准
      • 小J.
      • Riba-garcia I.
      • 罗伯逊D.H.L.
      • Gaskell S.J.
      • 奥利弗S.G.
      • Beynon R.J.
      蛋白质变型蛋白质周转动态,蛋白质组学中缺失的尺寸。
      )(补充表S2)。 K.失利 用两种方法获得适合线性回归曲线(r2 = 0.985),建议k失利 通过在指数衰减曲线上或单时间点分析上彼此相邻而获得的值彼此非常相似( 补充图S3)。在每个时间点计算表达半胱氨酸的细胞及其突变体以确定细胞生长速率或稀释率(D)(补充表S3)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2肽Fsvsgegegdatygk在EGFP标记的半胱氨酸,ΔitLelp,N288K和N323K中的MS1区域。 峰值对应于在降解过程中预先存在的肽的MS1信号的提取离子色谱图(红色痕迹,轻标签)和新合成的肽(蓝色痕迹,重型标签)。 MS1区域被提取并使用天际线软件表示所有时间点。
      在三种不同独立的生物重复之间的指数衰减曲线上报告的测量的再现性似乎非常高(Fig. 3)(
      • 普拉特准
      • 小J.
      • Riba-garcia I.
      • 罗伯逊D.H.L.
      • Gaskell S.J.
      • 奥利弗S.G.
      • Beynon R.J.
      蛋白质变型蛋白质周转动态,蛋白质组学中缺失的尺寸。
      )。发现wt胱氨酸素非常稳定,K失利 = 0.0434±0.008,而Δitlelp比wt半胱氨酸速度快三倍,k失利 = 0.1291 ± 0.014 (Fig. 3, 补充表S2)。过表达半胱氨酸糖苷-EGFP和ΔitLELP-EGFP的细胞的划分率相似,表明ΔitILELP的损失率是因为降解增加(Fig. 3 直方图, 补充表S4)。 N288k和n323K与WT半胱氨酸相比,K显示出趋势,虽然没有显着,但朝着增加的降解。尖锐的是,用丙氨酸残留物替代七个天冬酰胺残留物(n1N7)模仿完全的脱糖基化,导致非常稳定的蛋白质,其周转与wt胱氨酸激素相似(Fig. 3)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3半胱氨酸和突变体的降解曲线。 RIA(相对同位素丰富, y 轴)每个时间点(x 轴)使用GraphPad软件绘制。曲线 黑色的 代表WT半胱氨酸的降解,而曲线 红色的 表示所指示的突变体的降解曲线。直方图代表损失率(k失利)对于每种蛋白质及其两个组分:降解速度(kde)细胞分割率(d)。

       半胱氨酸和δItilelp溶酶体降解

      为了确认ΔitiLelp的较高降解速率,用BafiLomycin A1(BAF A1),溶酶体和其他酸性室的活性抑制剂,将表达ΔitlELP-EGFP或胱氨基脲-EGFP的成纤维细胞进行24小时。然后通过流式细胞术测量EGFP荧光。在BAF A1处理时,与DMSO处理的细胞(载体)相比,WT半胱氨酸素和ΔitILELP的EGFP信号显着增加,表明两种蛋白质经历溶酶体降解。为了测试蛋白酶是否部分有助于ΔitiLelp的降解,用Clasto-Lactacystinβ-内酯(Cl)处理相同的成纤维细胞,特定的蛋白酶体抑制剂。在表达Cystinosin-EGFP或ΔitILELP-EGFP的成纤维细胞中,在CL处理24小时后,EGFP荧光强度不会改变,表明蛋白酶体降解对ΔitLELP的损失的损失没有显着贡献(Fig. 4)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4半胱氨酸溶酶体降解途径。 用蛋白酶体抑制剂Clasto-Lactacystin治疗稳定表达型Cystinosin-EGFP或ΔitiLELP-EGFP的NIH / 3T3细胞24小时(CL. ),用溶酶体抑制剂Bafiolomycin A1(BAF A1),或用DMSO作为载体控制。通过流式细胞术确定荧光强度。 EGFP融合蛋白水平的定量表示为荧光强度(*** p <0.0001与对照相比;每个 酒吧 表示平均值±s.e.五个实验)。示出了代表性的FACS配置文件。

       保持Δitilelp的restent

      为了探讨ΔitLelp突变是否会影响蛋白质 - 蛋白质相互作用,我们探讨了ΔitLelp的偶联与MS的WT半胱氨酸相比。我们将蛋白质与WT半胱氨酸或Δitlelp进行比较,然后鉴定为WT半胱氨酸和/或ΔitiLelp的潜在特异性交互剂的181个这样的蛋白质,因为它们未在阴性对照中鉴定(没有GFP)(补充表S5)。该MS分析的结果在很大程度上证实了我们以前发表过的WT胱氨酸酶产生的相互作用网络(
      • 和rzejewska z.
      • 内太福州。
      • 托马斯L.
      • Chhuon C.
      • Baileux A.
      • Chauvet V.
      • 托架P.J.
      • Chol M.
      • Guerrera i.c.
      • 抗核酸C.
      半胱氨酸是真空H + -ATPase-Ragulator-Rag复合物控制哺乳动物催乳素络合物1信号传导的组分。
      ),因为我们确定了八件真空型H的亚基+ - 酶(V-ATP酶)和rag gtpase c(Fig. 5,全蛋白质清单 补充表S5)。 ΔitLelp将与溶酶体中的wt星形素相同的蛋白质 - 蛋白质相互作用。然而,Δitlelp,但不是wt胱氨酸,特别是彼得蛋白沉淀的17个蛋白质直接涉及ER中的蛋白质加工(Fig. 5)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5用于WT胱氨酸蛋白酶和ΔitiLelp的蛋白质合作伙伴在溶酶体和网状室中。 通过抗GFP抗体免疫沉淀的蛋白质的火山曲线表达,并在Δitlelp-EGFP中鉴定质谱法 - 相对 Cystinosin-EGFP表达细胞。在 蓝色的,已知是半胱氨酸的溶酶体伴侣的蛋白质。在 红色的,由Kegg途径数据库分类的蛋白质作为“内质网中的蛋白质加工”。
      我们研究了通过免疫荧光稳定地过表达EGFP标记蛋白的细胞中WT半胱氨酸和其突变体的细胞分布。 WT Cystinosin-EGFP与晚期内体 - 溶酶体标记灯-1(83.62±1.73%)和蛋白质二硫化物异构酶(PDI),ER标记物(15.64±2.28%)的少量分致化,呈现主要的分层化。类似于wt cystinosin,n288k和n323K显示3T3细胞中主要的溶酶体定位。在引人注目的对比中,对应于ER定位的Δitelp的信号较高(48.26±2.57%),随着点状晚期内体 - 溶酶体定位模式的降低(47.66±2.01%)( Fig. 6A6B)。不采集适当配置的多岩蛋白蛋白在ER中累积,在那里他们被Calnexin识别(
      • Lamriben L.
      • 格雷厄姆J.B.
      • 亚当斯下班
      • Hebert D.n.
      基于N-Glycan的ER分子伴侣蛋白和蛋白质质量控​​制系统:Calnexin结合循环。
      )。为了分析半胱氨酸素和该伴侣之间的相互作用,用抗GFP抗体稳定地表达半胱氨酸氨酰-GFP或其突变形式的3T3细胞的裂解物,用抗GFP抗体免疫沉淀,并通过Western印迹检测到CoImMunoppippipated内源性钙蛋白。与本地化数据的预期相比,与WT半胱氨酸,n相比,Δitlelp与Calnexin的相互作用显着增加288k,或n323k(Fig. 6C6D)。突变体N.66A和N.1N7 似乎也在溶酶体上定位,没有任何呃保留(补充图S4)。这些数据在一起表明,由于蛋白质的错误折叠,ΔitLelp突变导致静脉中的半胱氨酸蛋白部分保留。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6Δitilelp的静脉保留。 A,NIH / 3T3细胞系稳定表达胱氨酸氨基锡 - EGFP,ΔitILelp,N288K和N323K是PDI或灯-1(共聚焦显微镜; 尺度条 =10μm)。这些图像代表三个生物学重复。 B,靶向半胱氨酸辛-EGFP(WT和突变体),量化为每组5个细胞内PDI或灯-1阳性的蛋白质的百分比。用ImageJ 1.50软件分析半胱氨酸素-EGFP和PDI或灯泡-1之间的分层化的百分比(**, p < 0.005; *** p <与WT半胱氨酸相比,0.0001)。 C,NIH / 3T3细胞系稳定表达Cystinosin-EGFP,Δitilelp,ASN288Lys和Asn.323用抗GFP抗体免疫沉淀的Lys,通过蛋白质印迹分析CoImMunopectippipated Calnexin。显示了来自四个独立实验的代表性印迹。 D,定量对囊氨酰信号(WT和突变体)归一化的Calnexin信号(*, p <0.05与wt胱氨酸相比;每个 酒吧 表示平均值±s.e.来自四个独立实验)。

       N-连接的Δitilelp的高甘露糖聚糖

      在ER中合成溶酶体跨膜蛋白,其中发生折叠和糖基化(高甘露糖型聚糖)的初始阶段。然后通过Trans-Golgi网络靶向溶酶体,获取进一步的修饰(复杂型N-聚糖)。为了验证WT半胱氨酸苷和Δitlelp的糖基化阶段,我们使用肽进行酶促脱糖基化:N-糖苷酶F酶(PNGase F),其除去所有 N - 链接的聚糖残留物。作为一个控制,我们使用了n1N7,组成型脱糖基化形式的半胱氨酸。与PNGase F孵育后,WT Cystinosin具有n的迁移曲线1N7,而n1N7 没有显示任何变化(Fig. 7A),显示WT胱氨酸的确是重大糖基化的。 ΔitILELP也通过PNGase F完全脱糖基,表明它还含有一定水平的糖基化。 N288k和n323K,用作阳性对照,显示出与WT半胱氨酸相同的电泳型材。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7半胱氨酸的脱糖基和其突变形式。 A,NIH / 3T3细胞系的裂解物稳定地表达Cystinosin-EGFP,N1N7(七个N-糖基化位点截变突变体),Δitilelp,n288k,和n323将K在37℃下用或没有PNGASE F温育1小时以除去N-聚糖。 B,将NIH / 3T3细胞系的裂解物稳定地表达半胱氨酸纤维素-GEFP和ΔitILELP,在37℃下与1小时温育,以裂解特异性未成熟的N-聚糖。所有裂解物通过10%凝胶的SDS-PAGE解决,并通过免疫印迹与抗GFP抗体进行分析。
      因此,我们测试了内甘油糖苷酶H酶(endoH)的作用,因为它特别是水解不适的N-聚糖(高甘露糖型)。与WT半胱氨酸素相比,ΔitLelp对Endo H消化敏感(Fig. 7B),表明Δitelelp在其可用的糖基化位点上携带高甘露糖。 WT半胱氨酸不受endo H消化的影响,证实WT形式含有复杂型聚糖,在GOLGI装置中成熟期间获得。

      讨论

      在这项研究中,我们研究了半胱氨酸蛋白酶缺失Δitlelp对蛋白质稳定性的影响。 Δitlelp突变破坏了囊蛋白对N66上的适当糖基化。在纯合状态下,ΔitLelp导致幼年半胱氨酸,与维持最小胱氨酸运输活性的能力相关 体外 (
      • Midgley J.P.
      • El-kares r.
      • Mathieu F.
      • 好人P.
      青少年发病性胱素病的自然历史。
      )。然而,当在第二等位基因上与57-KB缺失一起发现杂合子状态时,ΔitLelp突变可导致严重的婴儿表型(
      • 希尔斯。
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      半胱素病的分子发病机制:CTNS突变对半胱氨酸血糖活性和亚细胞定位的影响。
      )。这些令人惊讶的观察导致我们假设缺失七个氨基酸,以及缺乏糖基化66,干扰半胱氨酸稳定性。
      要调查Δitilelp转换,我们使用MS的动态氧化硅酸方法。但是,我们面临了两个主要挑战。首先,在非分割样品中,MS不易检测到半胱氨酸,例如总细胞裂解物或血液(NextProt.org在蛋白质组学研究中没有关于肽鉴定的记录)。这可能是因为细胞中的内源性半胱氨酸和其序列的特征非常低,其含有七个TM结构域和七个糖基化位点。据我们所知,在富含富硒溶酶体膜的一项研究中,用两种肽鉴定内源性半胱氨酸(
      • SchröderB.
      • Krocklage C.
      • 锅C.
      • Jägerr.
      • KöstersB.
      • Schäferh.
      • elsässerh.-p。
      • Hasilik A.
      积分和相关的溶酶体膜蛋白。
      )。此外,没有良好的抗体可用于从细胞裂解物中免疫内源性半胱氨酸,以富集内源性半胱氨酸。由于这些原因,我们开发了稳定表达EGFP标记的WT和突变的半胱氨酸的细胞模型。虽然这些标记的蛋白质在溶酶体中正确定位并且已经用于功能研究,但我们知道使用EGFP标记的半胱氨酸素是一个约束,我们不能确定内源性蛋白质遵循完全相同的行为。在这项研究中,我们检测到四个半胱氨酸苷(来自WT半胱氨酸和两种特异性突变体的两种)的肽,并提供了N-末端信号肽可以在s之前切割23.
      第二次挑战是动态氧化赛,虽然在研究稳定蛋白质的营业额时,可能会棘手。我们计算了k失利 从肽的MS1区域及其标记的对应物,使用曲线拟合或数学公式应用于每个时间点(在文献中以不同形式报告,但等同)(
      • SchwanhäusserB.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
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      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
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      • 普拉特准
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      蛋白质变型蛋白质周转动态,蛋白质组学中缺失的尺寸。
      )。我们的数据确认了k失利 当在计算中使用许多数据点时,通过曲线拟合和数学公式计算的值完美相关。然而,在细胞周期/寿命期间,在细胞周期/寿命期间实际上已经过度地破坏了稳定的蛋白质(降解速度:K.de),仅在细胞分裂时稀释。在这种情况下,损失率(k失利)蛋白质非常接近细胞分裂率(d)和kde = K失利-d值几乎达到零。验证D与所有研究的所有细胞系相似后,我们选择报告并比较K失利 wt胱氨酸和突变体。
      我们的动态硅酸数据显示WT半胱氨酸是一种非常稳定的蛋白质,ΔitLelp突变增加了蛋白质的降解增加了3倍,而n288k和n323K突变没有显着影响蛋白质的稳定性。我们清楚地表明,Δitlelp经历溶酶体降解,作为Bafiolomycin A1(BAFA1)的V-ATP酶抑制,但不是蛋白酶体抑制,导致通过增加的荧光信号观察到的细胞水平增加。 ΔitiLelp的溶酶体降解速率比WT蛋白的三倍大,进一步证实了该突变体的不稳定性。
      我们最近证明了半胱氨酸蛋白突变,除了来自溶酶体的胱氨酸的效率低下,诱导蛋白质网络的变化,这些蛋白质网络可能调节半胱氨酸在mTOR途径中的作用(
      • 和rzejewska z.
      • 内太福州。
      • 托马斯L.
      • Chhuon C.
      • Baileux A.
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      • 抗核酸C.
      半胱氨酸是真空H + -ATPase-Ragulator-Rag复合物控制哺乳动物催乳素络合物1信号传导的组分。
      )。因此,我们决定探讨ΔitLelp蛋白质网络。我们的杂项研究表明,类似于WT半胱氨酸,Δitlelp与V-ATP酶复合物和MTOR途径的一些蛋白质保持溶酶体膜的相互作用。溶酶体膜上的功能性Δitelp的存在与纯合ΔitliLELP突变患者产生少年而​​不是婴儿半胱氨酸症的事实对准。此外,ΔitLelp与er的15个蛋白相互作用,其中大部分都是涉及ER质量控制和处理的(例如 Calreteteticulin,OS9,Sel1L)(
      • Bernasconi R.
      • 加里克
      • Calanca V.
      • Nakajima T.
      • Molinari M.
      用于处理Erad-LS底物的HRD1,SEL1L和OS-9 / XTP3-B的严格要求。
      )。免疫荧光研究证实了这些发现,并显示了ΔitLelp在ER和溶酶体中的部分定位。
      ER中错误折叠的蛋白质的积累可以导致ER应激和细胞死亡。为了防止细胞损伤,非突出蛋白可以从ER出来进行蛋白酶体和/或溶酶体降解(
      • 蒋卫华
      • Messah C.
      • 林J.H.
      IS1引导蛋白酶体和错配的洛越蛋白的溶酶体降解。
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      • 琼斯下午
      • Eletto D.
      • Christianson J.C.
      • argon y.
      OS-9促进由高糖基化标记的非潮汐GRP94的营业额。
      )。为了更好地了解ER保留的原因,我们进一步探讨了Δitilelp的缺陷糖基化的程度,并证明它在所有六个剩余地点中携带未成熟的高甘露糖聚糖,这些剩余部位不直接受突变影响,这表明它被阻止到达它GOLGI网络进一步处理。这与SDS-PAGE观察到的Δitelp分子量相干。已经进行了几项研究以破译加工蛋白质的甘油代码,揭示了N-Glycans在引导蛋白质成熟方面的重要性(
      • Hebert D.n.
      • Lamriben L.
      • 幂e.t.
      • 凯莉J.W.
      N-连接聚糖对糖蛋白酶的内在和外在作用。
      )。聚糖组合物控制萼素结合循环,这对于识别ER中错折叠的蛋白是重要的(
      • 哈蒙德C.
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      N-连接的寡糖识别,葡萄糖修剪和Calnexin在糖蛋白折叠和质量控制中的作用。
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      N链寡糖如何影响内质网中的糖蛋白折叠。
      )。沿着这些线,我们在ΔitLelp和ER伴侣荠荠之间研究中所示的强相互作用表明该突变体被ER质量控制系统被认为是非蛋白质,并且部分保留在该隔室中。不携带任何糖基化的N1N7突变体被正确地从溶酶体正确指导,并且其稳定性不受影响。
      我们建议ΔitLelp最初保留在ER中,防止其在GOLGI中加工以获得成熟的糖基化,但它通过其两个靶向序列直接转运至溶酶体。进一步的研究将有必要完全理解ΔitLelp从溶酶体的偏移机制。一种可能的机制是可能被ER压力引起的ER宏自噬(
      • Høyer-hansen M.
      • jäätteläm。
      通过展开蛋白质反应和钙将内质网胁迫与自噬。
      )。然而,还描述了通过保留蛋白的ER逃逸的一些非常规细胞机制。非成实的CFTR可以靶向质膜,通过非传统掌握依赖途径跳过高尔基池(
      • gee h.y.
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      • kim k.h。
      • 李米。
      通过掌握依赖性非传统分泌途径拯救ΔF508-CFTR流通。
      )。另外,将被称为水肿的ER衍生的囊泡的形成是Erad调节所必需的,使得从ER和蛋白酶体和底糖蛋白酶蛋白酶的降解能够去除所选择的Erad调节剂。这些囊泡包含Edem1和Sel1L,但也可以携带其他ER蛋白质(
      • Bernasconi R.
      • Molinari M.
      Erad和Erad Tuning:从哺乳动物ER处处理货物和Erad调节器。
      )。
      我们得出结论,由于其未成熟的糖基化状态与低运输活性一起,ΔitLelp的高趋势可能是在一些患者中观察到这种突变的杂叠,以及57-kb缺失的表型。
      数据可通过Proteomexchange提供标识符PXD004948,PXD005357和全景公众//panoramaweb.org/labkey/Guerrera.url.

      致谢

      我们感谢R.J.Rof. BEYNON在营业额数据解释中有价值的建议; P. Codogno博士和A. Delaunay-Moisan博士为周到的讨论;和N.Gaudin,M. Garfa-traore和R. desvaux在Image Cell成像中,用于共聚焦显微镜的专家援助。

      补充材料

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