聚集,定期间隙的短语重复(CRISPR)/ Cas9偶联亲和纯化/质谱分析显示神经纤维蛋白在MTOR信号传导中的新作用*

  • 作者脚注
    §这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
    ,
    作者脚注
    ¶德克萨斯州癌症预防和研究所支持的计算癌症生物学培训计划团契的受援人员。
    徐立
    脚注
    §这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
    ¶德克萨斯州癌症预防和研究所支持的计算癌症生物学培训计划团契的受援人员。
    隶属关系
    来自德克萨斯州德克萨斯大学的实验放射肿瘤科,德克萨斯州休斯顿77030;
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  • 作者脚注
    §这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
    闵高
    脚注
    §这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
    隶属关系
    来自德克萨斯州德克萨斯大学的实验放射肿瘤科,德克萨斯州休斯顿77030;
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  • Jong Min Choi.
    隶属关系
    德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与细胞生物学系; 77030;
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  • Beom-jun Kim
    隶属关系
    德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与细胞生物学系; 77030;
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  • 毛田周
    隶属关系
    来自德克萨斯州德克萨斯大学的实验放射肿瘤科,德克萨斯州休斯顿77030;
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  • 甄辰
    隶属关系
    来自德克萨斯州德克萨斯大学的实验放射肿瘤科,德克萨斯州休斯顿77030;
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  • Antrix N. Jain.
    隶属关系
    德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与细胞生物学系; 77030;
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  • 宋云龙
    隶属关系
    德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与细胞生物学系; 77030;
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  • 京东元
    隶属关系
    纽约州哥伦比亚大学放射研究中心放射肿瘤科,纽约10032;
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  • 作者脚注
    §-乳腺癌研究基金会支持的美国癌症研究职业发展奖的美国癌症研究职业发展奖接受者。
    文奇王
    一致
    应该解决对应的通信。
    脚注
    §-乳腺癌研究基金会支持的美国癌症研究职业发展奖的美国癌症研究职业发展奖接受者。
    隶属关系
    加利福尼亚州欧文大学加利福尼亚大学发展与细胞生物学系92697
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  • 易王
    一致
    应该解决对应的通信。
    隶属关系
    德克萨斯州休斯顿贝勒医学院分子与细胞生物学系; 77030;
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  • 朱杰陈
    一致
    应该解决对应的通信。
    隶属关系
    来自德克萨斯州德克萨斯大学的实验放射肿瘤科,德克萨斯州休斯顿77030;
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了来自美国国防部的德克萨斯州和德斯逊大学安德森癌症中心的启动基金和希望学者研究奖,从美国国防部(对J. Chen)。提交人声明他们没有对本文内容的利益冲突。内容完全是作者的责任,不一定代表国家卫生研究院的官方意见。
    本文含有补充材料。
    1
    §这位作者的两位作者都贡献了这项工作。
    ¶德克萨斯州癌症预防和研究所支持的计算癌症生物学培训计划团契的受援人员。
    §-乳腺癌研究基金会支持的美国癌症研究职业发展奖的美国癌症研究职业发展奖接受者。
      神经纤维蛋白(NF1)是癌症患者通常突变的众所周知的肿瘤抑制剂。它与RAS物理相互作用,负面调节RAS GTP酶活性。尽管NF1在癌症中的重要性,但尚未建立高质量的内源性NF1蛋白单组。在这项研究中,我们合作 c迷惑, r自我 i肚带所写 s座子 p思文 r用抗抗内源蛋白的抗体,随后进行质谱分析,对肝脏纯化进行亲和力纯化,敏感,精确地检测蛋白质 - 蛋白蛋白质相互作用的亲和纯化具有亲和力纯化的基因敲除技术,以敏感,精确地检测未改变的NF1蛋白质 - 蛋白质相互作用 体内设置。使用该系统,我们分析了内源性NF1相关的蛋白质复合物,并确定了49个高置信度候选相互作用蛋白,包括Ras和其他功能相关的蛋白质。通过功能验证,我们发现NF1以LAMTOR1依赖性方式负调节雷帕霉素信号传导(MTOR)的机械靶标。此外,NF1缺陷细胞的细胞生长和存活率已经取决于MTOR途径的多动激活,并且这些细胞的致瘤性质已经取决于LAMTOR1。在一起,我们的研究结果可以为靶向NF1缺乏肿瘤的治疗方法提供新的洞察力。
      神经纤维瘤病类型是一种常染色体显性条件,其特征在于,多种神经纤维瘤,羊毛结节,脊柱侧凸,学习障碍,视觉障碍,精神障碍,多咖啡馆Au Lait斑点和癫痫发作。神经纤维瘤患者1型患者的平均预期寿命显着降低,恶性是最常见的死因(
      • 拉斯穆森S.A.
      • 弗里德曼·弗里德曼
      NF1基因和神经纤维瘤病1。
      )。这些恶性肿瘤是由突变引起的 NF1 基因位于17Q11.2染色体并编码神经纤维蛋白(NF1),
      使用的缩写是:NF1,神经纤维素; AP-MS,亲和纯化,然后质谱纯化; AP,亲和纯化; HCIP,高信心候选蛋白质; Lamtor1,晚期内体/溶酶体适配器,MAPK和MTOR活化器1; MTOR,雷帕霉素的机械靶标; PPI,蛋白质 - 蛋白质相互作用; PSM,肽光谱匹配; SFB,S Tag-Flag标签-SBP标签;硅酸,稳定同位素标记用细胞培养中的氨基酸; GRNA,引导RNA; S6K,S6激酶; IP,免疫沉淀; AMPK,AMP激酶。
      用于Ras蛋白的GTPase-activating酶(
      • 徐G.F.
      • O'Connell P.
      • Viskochil D.
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      • 邓恩D.
      • 史蒂文斯J.
      • 格斯特兰r.
      • 白r.
      神经纤维瘤病类型1基因编码与间隙有关的蛋白质。
      )。 NF1 是一种众所周知的肿瘤抑制剂,通常在许多类型的人类癌症中突变,例如恶性周围神经鞘瘤(
      • 巴士米
      • Demicco e.g.
      • 加西亚R.
      • Ahn L.
      • Merola P.R.
      • Cioffi A.
      • maki r.g.
      恶性周围神经鞘瘤。
      ),胶质母细胞瘤(
      • 癌症基因组阿特拉斯研究网络
      综合基因组特征定义人胶质母细胞瘤基因和核心途径。
      ),黑色素瘤(
      • Krauthammer M.
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      • SZNOL M.
      • 等等。
      Exome测序识别在阳光暴露的黑色素瘤中NF1和Rasopathy基因中的复发性突变。
      )卵巢癌(
      • 癌症基因组阿特拉斯研究网络
      卵巢癌的综合基因组分析。
      ),肺癌(
      • 丁L.
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      • 惠勒D.A.
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      • 等等。
      躯体突变影响肺腺癌的关键途径。
      )和乳腺癌(
      • 癌症基因组地图集网络
      人乳腺肿瘤的综合分子肖像。
      )。 NF1蛋白与RAS物理相互作用,加速RAS GTP酶水解(
      • 马丁G.A.
      • Viskochil D.
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      神经纤维瘤病类型1基因产物的差距相关结构域与RAS P21相互作用。
      ),而NF1缺陷细胞显示RAS-GTP的水平增加,这导致RAS信号的超动激活(
      • Basu T.N.
      • Gutmann D.H.
      • 弗莱彻J.A.
      • 格洛弗T.W.
      • 柯林斯F.S.
      • 向下J.
      1型神经纤维瘤病患者恶性肿瘤细胞中RAS蛋白的异常调节。
      )。然而,尽管癌症中NF1的重要性和高改变/突变率,但基于NF1的治疗方法在后面滞后。这主要是由于对NF1监管的理解有限及其除规范KRA之外的其他功能。靶向患者携带的RAS途径的几项临床试验 NF1 突变显示出在最佳的小响应(
      • yap y.s.
      • 麦克弗森J.R.
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      • 李阿。
      • Callen D.F.
      NF1基因重新判断 - 从替补席到床边。
      )。已经提出了靶向细胞增殖途径中多个节点的组合疗法,因为抑制单个节点可能导致补偿性负反馈途径的激活。然而,为了有效地靶向NF1相关的癌症,需要更好地了解NF1功能和法规。
      因为蛋白质 - 蛋白质相互作用意味着蛋白质之间的功能性联合,学习NF1与NF1的相互作用是如何促进NF1功能的贡献可能会大大增加我们对该蛋白质的理解。然而,NF1相互作用蛋白仍然很大程度上是未知的,因为NF1是非常大的蛋白质,具有2818个氨基酸和327kDa的估计分子量。在哺乳动物细胞中外源表达NF1全长蛋白在技术上挑战。此外,尽管NF1-RAS轴长期被称为在许多类型的癌症中RAS信号传导中最重要的调节器之一,但之前的所有NF1相互作用研究都未检测到NF1-RAS相互作用(
      • ratner n。
      • 米勒S.J.
      癌症中常见的rasopathy基因:神经纤维瘤病类型1肿瘤抑制剂。
      ),可能是因为这种酶底物相互作用的瞬态性质。高质量的NF1内源性互生互乱结果将透露有关NF1的职能和规定的其他细节,并应大大增加我们对生物学和参与疾病的理解。
      作为一种无偏见的方法,亲和纯化,然后质谱(AP-MS)提供巨大的优势,其具有在近乎生理条件下鉴定蛋白质 - 蛋白质相互作用(PPI)并鉴定蛋白质复合物而不是二元相互作用(
      • Aeberberold R.
      基于质谱的蛋白质组学。
      )。通过表演感兴趣的蛋白质(“诱饵”),其次是LC-MS / MS,可以识别与诱饵形成复合物的合作蛋白(“捕食”)(
      • Altelaar a.f.
      • 慕尼宫
      • Heck A.J.
      下一代蛋白质组学:朝着蛋白质组动力学的一体化视图。
      )。已采用AP-MS在不同信令事件中研究单个蛋白质,例如TGF-β和WNT信号传导途径(
      • KNUESEL M.
      • 万王。
      • 萧Z.
      • holinger E.
      • Lowe N.
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      • 刘X.
      使用通用哺乳动物串联亲和纯化表达系统鉴定新型蛋白质 - 蛋白质相互作用。
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      • 罗Q.
      • 别人偏袒
      • Kzhyshkowska J.
      • Angeletti R.H.
      通过质谱分析的内源性转化生长因子-β受体介导的SMAD信号络合物。
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      • 棕色K.A.
      • 火腿A.J.
      • 克拉克C.N.
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      • 法律B.K.
      • Chytil A.
      • 郑n
      • Pietenpol J.A.
      • 摩西H.L.
      鉴定新型Smad2和Smad3相关蛋白响应于TGF-β1。
      ,
      • Chaudhry S.S.
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      • 摩根A.
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      • Shuttleworth C.a.
      • kielty c.m.
      Fiblillin-1调节TGFβ1的生物利用度。
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      • Conrotto P.
      • Yakymovych I.
      • Yakymovych M.
      • SouchelnyTskyi S.
      转化生长因子-β型I受体(TβRI)的互动组:EPAC1抑制TGFβ信号传导。
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      • 昂热S.
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      • 郑恩。
      • maccoss m.j.
      • 月亮r.t.
      KLHL12-核蛋白-3泛素连接酶通过靶向贴花以降解来负调节WNT-β-Catenin途径。
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      • 主要的M.B.
      • 营地N.D.
      • Berndt J.D.
      • yi x.
      • Goldenberg S.J.
      • 隆堡C.
      • Biechele T.L.
      • Gingras A.c.
      • 郑恩。
      • maccoss m.j.
      • 昂热S.
      • 月亮r.t.
      Wilms肿瘤抑制剂WTx负调节Wnt /β-catenin信号传导。
      )。我们使用这种方法来研究DNA损伤信令途径。在单个DNA损伤响应蛋白的AP-MS结果的基础上已经开始了对DNA损伤响应途径调节的许多见解(
      • 霍米
      • 格兰特R.
      • Manke I.
      • Minn K.
      • yu x.
      • Yaffe M.B.
      • 陈杰。
      RNF8通过组蛋白泛络和检查点蛋白质组件转换DNA损伤信号。
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      • 刘涛。
      • GHOSAL G.
      • 元J.
      • 陈杰。
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      FAN1用Fanci-Fancd2作用,促进DNA Interstrand Cross-Link修复。
      ,
      • yu x.
      • 中国C.C.
      • MER G.
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      BRCT结构域是磷蛋白结合结构域。
      ,
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      • Minter-Dykhouse K.
      • 吴X.
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      MDC1与哺乳动物DNA损伤响应途径的活性CHP2偶联。
      ,
      • kim J.E.
      • 陈杰。
      • 娄Z.
      DBC1是SIRT1的负调节器。
      )。在哺乳动物细胞中,最常用的标记蛋白的过表达。然而,若干限制损害了AP-MS质量,包括扰乱蛋白质平衡和复杂组件的高假阳性率和过表达伪影(
      • 吉布森T.J.
      • Seiler M.
      • Veitia R.A.
      瞬态过度表达的特性。
      )。此外,诱饵蛋白的过度表达常常使系统饱和并阻碍PPI的动态变化响应于某些生物刺激(
      • 布劳恩P.
      • Cusick M.E.
      • vidal m.
      QuickStep和GS-Tap:蛋白质相互作用分析的新动作。
      )。
      理想情况下,使用识别内源蛋白的抗体的AP-MS比过表达系统更好,因为它们对系统产生最小的干扰,并且可以避免过表达伪影。然而,在AP-MS中使用抗对内源性蛋白质的抗体的主要缺点是它们通常拉下大量的非特异性交叉反应性结合蛋白,这是不可能通过生物信息学分析消除,并且对MS结果的质量有害(
      • Aeberberold R.
      基于质谱的蛋白质组学。
      )。
      为了在保持弱相互作用的同时有效消除污染物,并提出了一系列基于同位素标记的定量MS的方法(
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • ong s.e.
      • 尼尔森M.
      • 福斯特L.J.
      阐明应用于EGF信号传导的功能蛋白质 - 蛋白质相互作用的蛋白质组学策略。
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      • Sekedat M.D.
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      • 溃败M.P.
      • Chait B.T.
      I-DIRT,一种区分特异性和非特异性蛋白质相互作用的一般方法。
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      用定量蛋白质组学研究大分子复合物。
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      • Selbach M.
      通过定量免疫沉淀蛋白相互作用筛选与敲低(快速)。
      ,
      • Trinkle-Mulcahy L.
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      • 林Y.W.
      • 荨麻r.
      • Boisvert F.M.
      • Vandermoere F.
      • 莫里斯N.A.
      • Swift S.
      • Rothbauer U.
      • Leonhardt H.
      • Lamond A.
      使用定量质谱和珠蛋白质鉴定特异性蛋白质相互作用伙伴。
      )。所有这些都使用稳定的同位素标记用细胞培养物(Silac)中的氨基酸进行定量测量蛋白质的相对量。例如,Selbach和Mann(
      • Selbach M.
      通过定量免疫沉淀蛋白相互作用筛选与敲低(快速)。
      )开发了一个名为“快速”的方法(争取 immunoprecipitation. c混合 k击倒)夫妻RNA干扰和硅胶。作者使用从细胞中制备的提取物,其β-连环蛋白表达的90%下调,发现抗体抗体蛋白质(IE。 β-catenin)从较少的β-连环蛋白和四个相关蛋白质中拉下,而不是野生型细胞。通过氧化砂定量地捕获结合蛋白质的差异。我们认为,通过小干扰RNA或短发夹RNA不完全除去诱饵蛋白质的应用限制了该方法的应用。因为AP可以大大浓缩诱饵蛋白,所以甚至少量剩余的诱饵蛋白也可以富集到野生型细胞中的水平。因此,这种方法仍然带来了大量的 善意 控制AP-MS中的相互作用蛋白,因此可能产生相当大的假阴性。如果我们希望更敏感和准确地检测交互,更清洁的背景是必须的。
      首先在2012年作为人细胞培养物中的基因组工程/编辑工具(
      • jinek m.
      • Chylinski K.
      • Fonfara I.
      • Hauer M.
      • doudna j.a.
      • Charpentier E.
      一种可编程双RNA引导的DNA内切核酸酶,适应性细菌免疫。
      ),集群定期间隙短文重复(CRISPR)/ CAS9技术已成为在人细胞和动物中编辑DNA的快速和精确的方法(
      • Cong L.
      • ran f.a.
      • Cox D.
      • 林S.
      • 巴雷托·
      • Habib N.
      • HSU P.D.
      • 吴X.
      • 江W.
      • Marraffini L.A.
      • 张F.
      使用CRISPR / CAS系统进行多重基因组工程。
      ,
      • 马里P.
      • 杨L.
      • esvelt小时
      • AACH J.
      • Guell M.
      • dicarlo J.E.
      • 诺维尔J.E.
      • 教堂。
      通过CAS9进行RNA引导人类基因组工程。
      )。 CAS9核酸酶靶向由预测的导向RNA(GRNA)引入的强晶蛋白相邻的基序序列,并在相邻的基序序列的前下游切割3-4个核苷酸,这有时会导致帧突变和随后的靶基因的沉默。在此,我们将CRISPR / CAS9基因敲除技术与修饰的AP-MS协议组合,我们使用针对内源性蛋白质的抗体来敏感,并准确地检测内源性环境下的NF1蛋白质 - 蛋白质相互作用。

      实验步骤

       细胞培养,构建体,转染和病毒包装

      Hela和Hek293T细胞在Dulbecco的改性鹰培养基中培养,补充了10%胎牛血清和1%青霉素和链霉素。 MCF10A细胞在Dulbecco的改性Eagle的培养基/ F-12中培养,补充有5%马血清,10μg/ ml胰岛素,20μg/ ml表皮生长因子,0.5μg/ ml氢化胞蔻体,0.1μg/ ml霍乱毒素,1 %青霉素和链霉素。
      编码所指示的SFB标记基因的质粒是从人含量的v5.1文库中获得的,或从开放的生物系统中购买并重新组合成网关相容的目的载体,以确定C末端SFB标记的融合蛋白的表达。从果加中获得人密码子优化的Cas9构建体和靶GRNA表达构建体,并由乔治博士沉积(
      • 马里P.
      • 杨L.
      • esvelt小时
      • AACH J.
      • Guell M.
      • dicarlo J.E.
      • 诺维尔J.E.
      • 教堂。
      通过CAS9进行RNA引导人类基因组工程。
      )。通过定点诱变聚合酶链反应将NF1 GRNA序列引入表达构建体中。针对NF1的GRNA序列是5'-A形图GGACTGGTGGGA-3'和5'-GTTAGCAGTTATAATAGCC-3'。
      编码CAS9和GRNA的构建体使用聚乙烯与PCDNA3-EGFP与HEK293T细胞共转染,如前所述(
      • 李X.
      • 王W.
      • 王J.
      • Malovannaya A.
      • Xi Y.
      • 李W.
      • Guerra R.
      • 霍沃斯
      • 秦吉。
      • 陈杰。
      蛋白质组学分析显示不同的染色质相关和可溶性转录因子络合物。
      )。基于其GFP信号对细胞进行分类,并选择单克隆。通过蛋白质印迹和测序证实了敲除克隆。
      所有慢病毒上清液都是通过用辅助质粒pspax2和pmd2g的HEK293T细胞的瞬时转染而产生(由周松康博士提供)并以后收获48小时。上清液通过0.45μm过滤器并用于感染HEK293T和HELA细胞,加入8μg/ mL含氨基。

       Western Blotting,下拉和免疫沉淀测定

      通过用NetN缓冲液裂解细胞来制备全细胞裂解物(20米m Tris-HCl(pH 8.0),100米m NaCl, 1 mm EDTA和0.5%Nonidet P-40)在冰上进行30分钟,然后在2×Laemmli缓冲液中沸腾它们。裂解物经受SDS-PAGE,然后用针对各种蛋白质的抗体免疫印迹,包括NF1(ABCAM,AB17963)和KRAS(ABCAM,AB55391); β-管蛋白(Sigma-Aldrich,T8328)和标志M2(Sigma-Aldrich,F3165); LAMTOR1(小区信令8975),MTOR,RAPTOR,RICTOR和Gβ1(小区信令,9964),TSC1(小区信令6935),TSC2(小区信令3612),AMPKα1/ 2和AMPKβ1/ 2(小区信令9957),和磷酸p70s6激酶(Thr-389)(电池信号传导9205)。
      对于下拉,免疫沉淀和共免疫沉淀(CO-IP)测定,1×107 用NetN缓冲液在冰上裂解细胞30分钟。然后将裂解物与20μl的缀合的S-珠(对于SFB标记的下拉珠)温育2小时,或在4℃下与内源蛋白的抗体一起温育,然后加入20μl蛋白质A / G-琼脂糖,并在4℃下孵育2小时。用NetN缓冲液洗涤珠子三次,并在2×Laemmli缓冲液中煮沸。

       内源性NF1蛋白复合物的AP,MS分析和数据分析

      CRISPR / CAS9耦合AP-MS的简化工作流程可以在其中找到 补充材料.
      我们漂亮了1×108 Hela,HEK293T或MCF10A细胞与NETN缓冲液(20米m Tris-HCl(pH 8.0),100米m NaCl, 1 mm EDTA,0.5%NONIDET P-40,含有1μg/ mL的每种胃蛋白酶A和抑肽酶)30分钟。将粗裂解物以16,000×离心 g 15分钟。将上清液转移到新管中,并用NF1(AB1,ABCAM,AB17963; AB2,苯乙酯,A300-140A)或KRAS(ABCAM,AB55391)抗体在4℃下孵育,然后以100,000×离心离心 g 15分钟。再次将上清液转移至新管,并在4℃下用30μl蛋白质珠子孵育1小时。弃去上清液,用1ml冰冷的网管缓冲液洗涤珠子三次,用40μl2×laemmli缓冲液煮沸,并进行SDS-PAGE。切除含有整个样品的蛋白质条带,切成从上到下切成四片。然后对凝胶片进行凝胶胰蛋白酶消化并真空干燥。将样品在6μl高效液相色谱(HPLC)溶剂A(2.5%乙腈和0.1%甲酸)中重构,顶部两个带和底部两个带组合成两个样品。通过将5-μmC18球形二氧化硅珠填充成具有火焰拉伸尖端的熔融二氧化硅毛细管(100-μm内径×〜20 -cm长度)来产生纳米级反相HPLC毛细管。在柱状后,将每个样品加载到柱上。形成梯度,用浓度的溶剂B(97.5%乙腈和0.1%甲酸)洗脱肽。当肽洗脱时,将它们进行电喷雾电离,然后用75分钟的乙腈梯度进入LTQ-orbitrap Velos质谱仪(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)中。检测肽,分离和碎片,以产生特定碎片离子的串联质谱。以数据依赖性模式收集原始数据,其中通过抗碰撞诱导的解离,并通过LTQ-VELOS分析,通过抗碰撞诱导的解离扫描前体。调查扫描仅限于375-1300 m/z。通过在蛋白质组发现者1.4软件(Thermo Fisher Scientific)中使用吉祥物2.4程序(Matrix Science),通过将所获得的碎片模式与人参考蛋白数据库匹配来确定肽序列(和因此蛋白质标识)。酶特异性设定为半胰蛋白酶,两个错过的裂缝。修饰包括氧化(蛋氨酸,可变)和 13C-K(Silac,变量)。对于前体离子和0.5Da的片段离子,将质量耐受性设定为20ppm。根据从NCBI下载的数据库(2015-0610)的数据库,使用内部人为参考数据库(总计73,637条目)进行搜索。基于目标 - 诱饵方法,将光谱匹配过滤以在肽水平上含有小于1%的FDR。蛋白质推理在参考中审查的一般规则后评估。
      • nesvizhskii a.i.
      • Aeberberold R.
      霰弹枪蛋白质组学数据的解释:蛋白质推理问题。
      ,有必要时的手动注释。当肽匹配多种蛋白质时,它们仅被分配到最逻辑的蛋白质(定义原理)。然而,当比较来自WT和KO细胞的结果时,考虑了所有可能的蛋白质。为了产生HCIP,将所有数据应用于1%蛋白质FDR过滤器,并使用肽光谱匹配。在数据库中存在时,同样的原理用于同种型。对于MS1峰面积的无标签定量,我们使用来自定量蛋白质组发现者1.4的输出。为了获得可重复的蛋白质ID,我们使用了基于Perl的内部标签量化软件,它与两个重复/注射的峰值匹配。报告的蛋白质ID在吉祥物/ Pd中鉴定,其中至少两个肽光谱匹配(PSM)至少一个重复/注射;并且相应的峰可以在其他样本中匹配相同的样本 m/z 和类似的保留时间。对于SILAC数据量定量,搜索到的肽信息被导入地平线软件,然后导入原始数据。如前所述进行肽MS1峰面积定量(
      • 麦克莱恩B.
      • Tomazela d.m.
      • 舒尔曼N.
      • Chambers M.
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      天际线:用于创建和分析目标蛋白质组学实验的开源文档编辑器。
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      • Abbatiello S.E.
      • 席克宁B.
      • MANI D.R.
      • Zimmerman L.J.
      • 霍尔S.C.
      • 麦克莱恩B.
      • Albertolle M.
      • 艾伦S.
      • Burgess M.
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      • GOSH M.
      • Hedrick V.
      • 举行。
      • Inerowicz H.D.
      • 杰克逊A.
      • 等等。
      大规模的间接性研究开发,分析验证和应用高度复用,定量肽测定,以测量血浆中的癌症相关蛋白。
      )。必要时进行手动调整峰值选择。
      我们从Uniprot Consortium下载了蛋白质序列和注释(
      • Uniprot财团
      在通用蛋白质资源(Uniprot)处重组蛋白质空间。
      )。使用多实验查看器4.9.0软件生成热图。使用我们研究中识别的HCIP来产生途径注释和疾病相关性,由光谱计数加权。然后,我们使用由聪明的途径软件(Ingenuity Systems)提供的知识库来估计这些相关性的重要性,其中包含来自多种来源的发现和注释,包括基因本体数据库。我们使用了-log(p 个人功能的价值造成疾病注释网络。使用Cytoscape软件可视化HCIP疾病网络(
      • smoot m..
      • ono K.
      • Ruscheinski J.
      • 王P.L.
      • IDEKER T.
      Cytoscape 2.8:数据集成和网络可视化的新功能。
      )。

       实验设计与统计理由

      重复所有MS实验两次(生物重复)。每个实验都包含两个MS注射,并将原始文件合并并一起搜索。有16个无标签NF1 AP-MS,4个NF1 SILAC-AP-MS和2个倒数KRAS AP-MS实验。敲除细胞用作MS的阴性对照。所有其他实验都重复三次。没有从分析中排除样品。使用学生分析组之间的差异 t test and Pearson χ2 分析。一种 p value <除非另有说明,否则0.05被认为是统计学意义。计算时 p 基因本体学注释的值,使用了渔民的确切测试。

       软琼脂菌落形成测定

      Hela细胞(1×103(用0.2%琼脂加入到1.5ml生长培养基中,并在6孔板中分层在2ml 0.5%琼脂床上。每3天补充培养基14天。将所得菌落固定并用晶体染色。使用数量的软件(BIO-RAD)计算菌落数量。

      结果

       研究HeLa细胞中NF1内源蛋白复合物

      为了建立高质量的内源性NF1互乱组,我们使用了CRISPR / CAS9基因编辑系统,以产生敲除细胞作为阴性对照,然后使用修改的方案来实现AP-MS。简而言之,使用CRISPR / CAS9系统产生敲除细胞,如前所述(
      • Cong L.
      • ran f.a.
      • Cox D.
      • 林S.
      • 巴雷托·
      • Habib N.
      • HSU P.D.
      • 吴X.
      • 江W.
      • Marraffini L.A.
      • 张F.
      使用CRISPR / CAS系统进行多重基因组工程。
      )。内源性蛋白质复合物是从野生型和敲除细胞制备的提取物中纯化的亲和力,使用相同的抗体对内源性蛋白质分析,并通过MS进行分析,以便在工作流程中鉴定我们以前建立的蛋白质复合物(
      • Malovannaya A.
      • Lanz R.B.
      • Jung S.Y.
      • Bulynko Y.
      • Le N.T.
      • Chan D.W.
      • 丁C.
      • 施y.
      • yucer n。
      • KRENCIUTE G.
      • Kim B.J.
      • 李C.
      • 陈R.
      • 李W.
      • 王Y.
      • O'Malley B.W.
      • 秦吉。
      人内源性核心络合物分析。
      ,
      • Malovannaya A.
      • 李Y.
      • Bulynko Y.
      • Jung S.Y.
      • 王Y.
      • Lanz R.B.
      • O'Malley B.W.
      • 秦吉。
      内源蛋白复合物高通量鉴定的简化分析模式。
      )。从MS结果中鉴定的备食蛋白分为三组,如下:橙色, 善意 相互作用的蛋白质;绿色,与抗体结合但不给诱饵(交叉反应性结合蛋白)结合的蛋白质;紫色,通用毛细血管(例如,热冲击蛋白和其他非特异性结合蛋白(肌动蛋白,管蛋白和核糖体蛋白))经由AP-MS进行经常检测(Fig. 1A)。这 善意 相互作用的蛋白质仅存在于由野生型细胞制备的提取物的免疫沉淀物中,而另外两组蛋白质在野生型和敲除细胞提取物的免疫沉淀物中存在相当。通过比较野生型细胞和敲除控制细胞的结果,我们很容易区分 善意 从强大的背景噪声相互作用蛋白质(Fig. 1A)。我们称之为新方法“aFFINITY纯化/质谱 CRISPR / CAS9. u倾斜系统 m应用 EN.合成的蛋白质复合物(Acumen)。“可以在其中找到详细的逐步协议 补充材料.
      图缩略图GR1.
      Fig. 1敏锐探讨内源蛋白质复合物的综合图。 A,无标签的CRISPR / CAS9耦合AP-MS。步骤1,使用CRISPR / CAS9系统生成敲除单元。步骤2,野生型和敲除细胞的AP-MS。第3步,数据分析。从MS结果中鉴定的备食蛋白可以分为三组: 橙子, 善意 相互作用的蛋白质; 绿色,交叉反应性结合蛋白;和 紫色的,通用毛细血管和其他非特异性结合蛋白。 BC,示意图显示了CRISPR / CAS9耦合AP-MS和NF1的数据分析的主要步骤以及数据的每个部分的快照。
      NF1在几乎所有人体组织中普遍表达并进行肿瘤抑制函数,其中突变在许多类型的癌症中发现(
      • yap y.s.
      • 麦克弗森J.R.
      • ong c.k.
      • Rozen S.G.
      • B.T.
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      NF1基因重新判断 - 从替补席到床边。
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      • ratner n。
      • 米勒S.J.
      癌症中常见的rasopathy基因:神经纤维瘤病类型1肿瘤抑制剂。
      )。 NF1-KRAs相互作用的早期研究之一在Hela细胞中进行(
      • Basu T.N.
      • Gutmann D.H.
      • 弗莱彻J.A.
      • 格洛弗T.W.
      • 柯林斯F.S.
      • 向下J.
      1型神经纤维瘤病患者恶性肿瘤细胞中RAS蛋白的异常调节。
      )。通过在HeLa细胞中使用针对NF1蛋白的抗体来确定并确认NF1-KRAS通过免疫沉淀 - 西方分析的相互作用。我们的Hela细胞的整个蛋白质组分析数据证实了它表达了足量的NF1和KRAS蛋白,其可由MS检测到。因此,我们开始使用Hela细胞建立内源性NF1互蛋白。
      使用CRISPR / CAS9技术,我们生成了NF1敲除HeLa细胞。我们首先设计了针对不同外显子的GRNA NF1 基因,通过点定向诱变将它们设计成GRNA表达载体(
      • 马里P.
      • 杨L.
      • esvelt小时
      • AACH J.
      • Guell M.
      • dicarlo J.E.
      • 诺维尔J.E.
      • 教堂。
      通过CAS9进行RNA引导人类基因组工程。
      ),并将其与载体编码人密码子优化的CAS9共转染它们,并将绿色荧光蛋白增强到HeLa细胞中。在为绿色荧光蛋白分选后,我们将细胞播种成96孔板并通过蛋白质印迹筛选菌落(Fig. 1B)。通过测序以确认框架突变进一步验证敲除克隆(数8和12)。我们观察到两位等位基因在克隆NO中突变突变。 8,我们使用该克隆作为NF1敲除HeLa细胞,用于所有以下实验(Fig. 1B)。然后我们使用两种不同的抗体(AB1,ABCAM,AB17963; AB2,苯乙酯,A300-140A)进行AP,抵抗相同区域的内源性NF1(残留物2760-2818),并排在野生型(Hela-WT)中并排NF1敲除(Hela-NF1-KO)Hela细胞(Fig. 1C),使用改进的AP协议,该协议被设计成以最大容量捕获结合蛋白,而不试图限制背景污染( 补充材料)。我们希望这个过程可以保持MS仪器的最大容量的弱和瞬态相互作用,从而充分利用仪器。
      在用吉祥物搜索的线性陷阱Quadrupole-orbitrap VeloS质谱仪(Thermo Fisher Scienctific)上,使用无标记的霰弹枪方法对免疫沉淀的复合物进行MS。
      • Perkins D.N.
      • Pappin D.J.
      • 皱褶D.M.
      • Cottrell J.s.
      使用质谱数据搜索序列数据库来搜索基于概率的蛋白质识别。
      ),并定量PSM和峰面积(补充表1)。这种新方法从每个AP-MS实验中产生约2000个相互作用蛋白,其在两者复制中可再现,并且在一次复制中至少恢复2个PSM(Fig. 1C),这是前一步或串联AP-MS策略的两倍(
      • 李X.
      • 王W.
      • 王J.
      • Malovannaya A.
      • Xi Y.
      • 李W.
      • Guerra R.
      • 霍沃斯
      • 秦吉。
      • 陈杰。
      蛋白质组学分析显示不同的染色质相关和可溶性转录因子络合物。
      ,
      • Malovannaya A.
      • Lanz R.B.
      • Jung S.Y.
      • Bulynko Y.
      • Le N.T.
      • Chan D.W.
      • 丁C.
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      • KRENCIUTE G.
      • Kim B.J.
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      人内源性核心络合物分析。
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      一种蛋白质复合物特征和蛋白质组探索的通用蛋白质纯化方法。
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      哺乳动物河马途径的蛋白质相互作用网络揭示了激酶 - 磷酸酶相互作用的机制。
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      定义人脱硫酶相互作用景观。
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      • Dolinta K.G.
      • 陈杰。
      定义人河马途径的蛋白质 - 蛋白质相互作用网络。
      )。两种抗体从Hela-WT细胞中回收合理的NF1(AB1,161 PSM; AB2,287 PSM),但来自Hela-NF1-KO细胞的几乎没有NF1(AB1,1,1 PSM; AB2,0 PSM),表明该NF1蛋白质复合物在Hela-NF1-KO细胞中拉下的蛋白质复合物中完全缺失( Fig. 1C补充表1)。
      通过NF1抗体AB1和AB2分别仅在WT细胞中富集120和107个蛋白,使用四个归一化蛋白质折叠变化的截止值和 p <0.1,所有实验中的峰值对齐(Fig. 1C)。使用两种不同抗体鉴定的蛋白质列表显示出高度重叠;其他抗体也富集了86%的蛋白质,但许多人没有达到我们严格的截止阈值。该发现表明,可以使用这种方法成功消除特定抗体的交叉反应(Fig. 1C补充表2)。在这两个列表中出现的四十九个蛋白被认为是最自信的NF1核,包括KRAS,GTP酶调节鸟嘌呤核苷酸交换因子Rapgef2和Rapgef6;三重奏,rho gtpase-活化蛋白arhgap17;和其他GTPase - 相互作用的蛋白质,例如GNA13,Mprip,ERC1和PAK2(补充表2)。所有这些都很可能 善意 NF1结合伙伴因为他们调节GTP酶的能力。在任何先前的NF1 AP-MS研究中都没有鉴定出这些蛋白质(
      • ratner n。
      • 米勒S.J.
      癌症中常见的rasopathy基因:神经纤维瘤病类型1肿瘤抑制剂。
      )。
      这两种抗体都回收了相似的总蛋白质和PSM(Fig. 2A),表明AP-MS鉴定的大多数NF1相互作用蛋白是非特异性的。由两种不同抗体检测的NF1相关蛋白显示出高度相似性。整体相关性 R HelA-WT和HeLa-NF1-KO细胞的值分别估计为0.95和0.94,表明本研究中的优异数据再现性(Fig. 2B)。如预测所示,大多数HCIP在细胞质(49%)和血浆膜中局部地定位(23%)(Fig. 2C)。蛋白质还基于其在WT和KO细胞中的存在,如下分类为组: 善意 HCIPs (橙子),由一抗体检测的特异性相互作用蛋白(黄色的),交叉反应性结合蛋白(绿色)和通用毛细血管和其他非特异性结合蛋白(紫色的)(Fig. 2D)。使用ACUMEN方法具体识别的大量新型NF1 HCIPS参与了RAS / ERK信号,RHOA信号,以及与钙相关的法规,这是所有NF1已知功能(Fig. 2D)。我们的研究结果表明,新的分子机制基金会提出了这些法规。因为遗传遗传障碍中突变基因编码的蛋白质可能与已知造成类似疾病的蛋白质相互作用,表明PPI子网的存在(
      • Gandhi T.K.
      • 钟杰。
      • Mathivanan S.
      • Karthick L.
      • Chandrika K.N.
      • Mohan S.S.
      • Sharma S.
      • Pinkert S.
      • Nagaraju S.
      • Periasswamy B.
      • Mishra G.
      • Nandakumar K.
      • 沉B.
      • deshpande n。
      • Nayak R.
      • 等等。
      人蛋白蛋白蛋白酶分析与酵母,蠕虫和飞行交互数据集的比较。
      )我们进一步分析了疾病与NF1 HCIPS之间的相关性(补充表3.)并建立了NF1 HCIP癌症网络(补充图。S1)。实际上,许多牙龈涉及胶质母细胞瘤,星形细胞瘤和血液癌症,已知具有NF1突变(
      • 劳伦斯M.S.
      • Stojanov P.
      • mermel c.h.
      • 罗宾逊J.T.
      • Garraway L.A.
      • golub t.r.
      • Meyerson M.
      • 加布里埃尔S.B.
      • 着陆器E.S.
      • Getz G.
      21例肿瘤类型的癌症基因的发现与饱和度分析。
      )。我们的研究结果还提出了NF1和肝脏和生殖系统癌症之间的链接,这可能导致在这些类型的癌症中发现NF1的新功能(补充图。S1)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2NF1 AP-MS的概述导致Hela细胞。 A总结了每个实验中的总蛋白质和肽鉴定。 B,AP-MS之间的相关性使用两个NF1抗体之间的相关性。 xy 轴表示所示实验中鉴定的蛋白质的PSM。 C,总结了HCIPS的主要亚细胞本地化。 D,所指示的蛋白质的相对丰度的热图,代表了基于其特异性分类的四组:HCIPS(橙子);一种抗体检测的特异性相互作用蛋白质(黄色的);交叉反应性结合蛋白(绿色);和通用毛细血管和其他非特异性结合蛋白(紫色的)在不同的实验中。蛋白质也分为官能团。

       研究HEK293T细胞中NF1内源蛋白复合物,并比较两条细胞系中的NF1椎间膜

      为了建立NF1内源性蛋白质复合物并评估不同细胞系中的癌症性能,我们在HEK293T细胞中进行了CRISPR / AP-MS,其在相同的工作流程之后表达了相似水平的NF1但较低的KRA水平(Fig. 3A)。 GFP阳性克隆没有。通过测序进一步验证3以确认两位等位基因中的框架突变 NF1 基因。因此,我们将该克隆用作NF1敲除HEK293T细胞,用于所有后续实验(Fig. 3A)。在相同的Acumen工作流程之后,我们通过两种抗体确定了类似的NF1相互作用蛋白(补充表4.)。整体相关性 R HEK293T-WT和HEK293T-NF1-KO细胞的值分别估计为0.93和0.94,同样表明实验之间的高数据再现性(Fig. 3B)。整体相关性 R 两个野生型细胞中的值分别为0.83和0.86分别为0.83和0.86(Fig. 3C)。在两种细胞系中恢复58%的总蛋白质ID(Fig. 3D)。尽管在HEK293T细胞中未检测到NF1-RAS相互作用,但可能由于这些细胞中KRAS的表达较低,但仍有许多其他相互作用(Fig. 3E)。例如,HEK293T细胞中的KRA表达水平远低于HELA和MCF10A细胞(Fig. 3F)。我们通过在同一AP协议之后进行倒数AP-MS进一步证实了NF1-RAS相互作用,所述KRAS在表达更高水平的内源RAS(补充表5.)。在HEK293T细胞中识别时,在HeLa细胞中识别的大多数HCIP仍然存在统计学意义(Fig. 3E)。在HEK293T细胞中鉴定的HELA HCIP(总共73%)中,野生型和对照细胞之间的70%(总共51%)显着改变(Fig. 3G)。将结果与两种细胞系相结合,我们使用NF1作为诱饵恢复了大多数先前报告的PPI(Fig. 3H, 补充表6.)。更重要的是,我们发现,在先前研究中发现的超过一半(58%)的NF1“自信”相互作用蛋白质可能是误报,其中存在具有类似丰富的IP复合物中的IP复合物,其存在于WT和NF1-ko的IP络合物中细胞 (Fig. 3H, 补充表6.)。总的来说,这些结果表明,acumen方法会产生比以前的方法更少的误报,同时保留更多 善意 相互作用的蛋白质。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3NF1 AP-MS的概述导致HEK293T细胞和两种细胞系和文献之间的数据比较。 A,示意图显示了使用CRISPR / CAS9系统建立HEK293T-NF1-KO单元的主要步骤和数据的每个部分的快照。 B,AP-MS在HEK293T和HEK293T-NF1-KO细胞中使用两个NF1抗体之间的相关性。 xy 轴表示所示实验中鉴定的蛋白质的PSM。 C,AP-MS与HEK293T和HELA细胞之间的相关性,以及HEK293T-NF1-KO和HELA-NF1-KO细胞的结果。 xy 轴表示所示实验中鉴定的蛋白质的PSM。 D,Venn图总结了从293T和HeLa细胞获得的结果。 E,在HEK293T细胞中鉴定的NF1相互作用蛋白的牺牲品特异性图谱。点的大小表明WT和NF1-KO细胞之间的蛋白质丰度的比率。 Hela HCIPS中也存在的蛋白质标记为 橙子。 F,左侧面板,通过来自KRAS纯化的诱饵肽回收来评估不同细胞系中的KRA表达。这 y 轴表示KRAS蛋白的平均光谱计数。 右侧面板使用β-管蛋白作为内部对照,还通过蛋白质印迹评估NF1和KRA蛋白水平。 G,在HELA细胞中的NF1 HCIP之间与HEK293T细胞的结果重叠。与HEK293T-NF1-KO细胞相比,HELA HCIPS具有2倍的HEK293T细胞的富集细胞 p <0.1被认为是可能的自信。 H,文献重叠数据 are summarized.

       使用Silac-Acumen在HeLa细胞中探讨NF1内源蛋白复合物

      为了进一步验证使用无标记的定量AP-MS在HeLa细胞中获得的NF1互蛋白,我们使用[ 13C]赖氨酸标记的Hela和未标记的Hela-NF1-KO(WT(H)+ NF1-KO(L)细胞和[13C]赖氨酸标记的Hela-NF1-KO和未标记的Hela(Wt(L)+ NF1-KO(H))细胞(Fig. 4A)。通过在含有未标记的培养基中(光)或[的培养基)差异标记hela和hela-nf1-ko细胞。13C]赖氨酸标记的(重)氨基酸10代。使用相同的抗体对内源蛋白(ABCAM)进行亲和力纯化。将免疫沉淀物在1:1的比例下混合并通过MS分析,然后进行数据分析(Fig. 4A补充表7.)。通过比较含有20个随机选择的赖氨酸肽的沉重和光峰区域来评价标记效率13C]赖氨酸标记的Hela和Hela-NF1-KO细胞。两种细胞系的标记效率超过97%(Fig. 4B)。通过比较未标记的HeLa和Hela-NF1-KO细胞(光)和[中的含10种随机挑选的含NF1赖氨酸肽的峰面积)评价爆震效率。13C]赖氨酸标记的Hela和Hela-NF1-Ko细胞(重)。敲除效率在未标记和标记的Hela-NF1-KO细胞中超过98%(Fig. 4C)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4CRISPR / CAS9偶联硅酸铝型AP-MS在HELA细胞中内源性NF1复合物的研究。 A,Silac标记的CRISPR / CAS9耦合AP-MS。通过在含有未标记的培养基中(光)或[的培养基)差异标记WT和KO细胞。13C]赖氨酸标记(重)氨基酸。使用与内源蛋白相同的抗体进行AP。将免疫沉淀物在1:1的比例下混合并通过MS分析,然后进行数据分析。 B,通过比较含20种随机选择的赖氨酸肽中的重和光峰面积来评价标记效率[13C]赖氨酸标记的Hela和Hela-NF1-KO细胞。 C,通过比较未标记的HeLa和HeLa-NF1-KO细胞中的10个随机选择的含NF1赖氨酸肽的10个随机选择的NF1赖氨酸肽的峰面积来评价敲除效率) 和 [13C]赖氨酸标记的Hela和Hela-NF1-KO细胞(重的)。 D,Hela-Wt和NF1-KO细胞差异标记。制备提取物,用NF1抗体纯化亲和力,在1:1的比例下混合,并由MS分析。使用天际线软件定量和可视化NF1,KRA,CTTNBP2N1和HSPA5的肽。
      MS结果来自[13C]赖氨酸标记的HeLa细胞和未标记的Hela-NF1-KO细胞(WT(H)+ NF1-KO(L))和[13C]使用蛋白酶发现软件进行分析赖氨酸标记的Hela-NF1-KO和未标记的HeLa细胞(WT(L)+ NF1-KO(H)),从感兴趣的蛋白质中选择含赖氨酸肽的含赖氨酸的肽。所选肽被进口到天际线软件,并重新捕获原始数据以选择峰值。 NF1,KRAS,CTTNBP2N1和HSPA5的肽被定量和可视化(Fig. 4D)。虽然来自NF1,KRA和CTTNBP2NL的肽高度富集(>40倍以标记的形式(重)(wt(h)+ nf1-ko(l))实验和未标记的形式(光)(wt(l)+ nf1-ko(h))实验,hspa5肽在两种实验中显示出两种形式的相似性(< 2-fold) (Fig. 4D)。这些结果表明,可以容易地与背景污染物容易区分特异性结合蛋白。
      总之,这些数据确认我们的ACUMEN方法还在标记的定量AP-MS中有效地工作。致扫法可以与氧化硅或其他标记方法组合,例如相对和绝对量化的同位式标签(
      • 罗斯P.L.
      • 黄玉。
      • Marchese J.N.
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      多路复用蛋白质定量 酿酒酵母酿酒酵母 使用胺反应性的等离性标记试剂。
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      MS / MS使用6-Plex Isobaric标签的人脑脊液中蛋白质的相对定量。
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      • 哈蒙克
      串联质量标签:MS / MS的复合蛋白混合物比较分析的新量化策略。
      )为了更准确的定量。

       NF1与LAMTOR1形成稳定的复合物,并对MTOR信号通路进行负面调节

      为了通过通过acumen方法进行实验验证识别的HCIP列表,我们通过转染12个SFB标记的HCIP来进行互易调查结果,包括CDK9,TGFBI,LAMTOR1,GNA13,CTTNBP2NL,DAB2,HCFC1,PAK2,STRN3,TMOD4,GPA33和FMNL1进入HEK293T细胞并用S-珠子拉下。我们将空向量和FoxR2用作消极对照。所有12个HCIP都能够下拉内源性NF1(Fig. 5A),进一步验证了我们的纯化结果在生理条件下反映内源性PPI。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5NF1在MTOR信号传导途径中形成与LAMTOR1的内源蛋白质复合物。 A,验证NF1 HCIPS。用12个SFB标记的构建体转染HEK293T细胞,其使用空向量和SFB-FOXR2作为阴性对照。使用S-蛋白质珠子进行下拉实验,并用识别标志表位标签或内源NF1的抗体呈抗体。包括在IP中使用的相应细胞裂解物的5%作为输入控制。所有HCIP都能够拉下内源性NF1。 B,在HeLa,Hela-NF1-KO,HEK293T和HEK293T-NF1-KO细胞中的NF1 AP-MS中的LAMTOR1在峰面积和肽数中评估。 C,HEK293T细胞用SFB标记的LAMTOR1转染,用空向量作为阴性对照。使用S-蛋白质珠子进行下拉实验,并用识别旗子表位标签或内源NF1的抗体呈涂抗体。包括在IP中使用的相应细胞裂解物的5%作为输入控制。 D,使用由来自HeLa细胞制备的全细胞裂解物与IgG或抗拉米抗体进行具有NF1的内源性LAMTOR1的互核性CO-IP。包括在IP中使用的相应细胞裂解物的5%作为输入控制。 EF,使用IgG或抗MTOR,抗TSC1,抗TSC2,抗猛杆,抗标枪,抗Gβ1,抗AMPKα1/ 2或抗-MOP AMPKβ1/ 2抗体,使用由HeLa细胞制备的全细胞裂解物。包括在IP中使用的相应细胞裂解物的5%作为输入控制。
      NF1 HCIP的信号通路注释表明NF1 HCIPS富集在MTOR信号通路中。据报道,MTOR旨在体组成 Nf1 - 菲累累的主要细胞(
      • 约翰尼斯·下午
      • reczek e.e.
      • 詹姆斯米夫
      • BREMS H.
      • Legius E.
      • Cichowski K.
      NF1肿瘤抑制器致力于调节TSC2和MTOR。
      );然而,隐裂它仍然难以捉摸的分子机制。我们确定NF1是否通过其直接绑定到MTOR信令路径中的关键组件来调节MTOR激活。实际上,我们发现LAMTOR1是MTOR信号传导途径的重要组成部分,是NF1 HCIP;通过CO-IP测定确认其与NF1的结合(Fig. 5A补充表2)。其肽数和峰值区域均高度富集在Hela-WT和HEK293T-WT细胞中,但它们几乎不存在于HeLa-NF1-KO和HEK293T-NF1-KO细胞中,表明它具体绑定到nf1( Fig. 5B)。因此,我们通过外源和内源拉米λ1(Fig. 5, CD)。我们进一步使用NF1抗体进行了共同IP测定,并用靶向MTOR信号传导途径中的其他主要成分的抗体,包括MTOR,TSC1 / 2,猛禽,RICTOR,GβL,AMPKα和AMPKβ(Fig. 5, EF)。 NF1未与MTOR途径中的任何其他关键组分形成蛋白质复合物(Fig. 5, EF)。
      LAMTOR1定位在晚期底皮物和溶酶体的表面上,并为MTORC1和MAPK途径提供了一种用于支架复合物的基本锚,其包含LAMTOR1,LAMTOR2,LAMTOR3,LAMTOR4和LAMTOR5(
      • Hoshino D.
      • Tomari T.
      • 长野米
      • Koshikawa N.
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      与膜型1基质金属蛋白酶相关的新蛋白质结合P27(KIP1)并调节RHOA活化,肌动蛋白重塑和基质侵袭。
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      • Soma-nagae T.
      • 纳达斯。
      • Kitagawa M.
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      溶酶体信号锚P18 / LAMTOR1通过调节溶酶体介导的分解代谢过程来控制表皮发育。
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      • Takahashi Y.
      • 冈田M.
      P18 / LAMTOR1:MTORC1 / MAPK信号通路的晚期内体/溶酶体特异性锚蛋白。
      )。该“ragulator”复杂的rencuate ragulator gtpases和V-Atpase对溶酶体,其响应于氨基酸进一步激活MTORC1(
      • 纳达斯。
      • Takahashi Y.
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      P18 / LAMTOR1:MTORC1 / MAPK信号通路的晚期内体/溶酶体特异性锚蛋白。
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      Ragulator-Rag复合物靶向mtorc1至溶酶体表面,并且是氨基酸活化的必要条件。
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      • Sabatini D.M.
      Ragulator是一种用于rag gtpases的全球环境基地,其向MTORC1发出氨基酸水平。
      )。因为NF1具体地与LAMTOR1相互作用,但不与任何其他MTOR信令路径密钥组件相互作用,所以我们确定NF1是否通过LAMTOR1调节MTOR信号传导。使用良好表征的MTOR底物,S6激酶(S6K)THR-389磷酸化,我们评估了响应于HELA和HELA-NF1-KO细胞中的氨基酸的MTOR信号传导激活。实际上,我们发现在Hela-NF1-KO细胞中增强了S6K磷酸化,表明NF1禁止MTOR信号传导(Fig. 6A)。敲击喇嘛朗格降低了HELA和HEK293T细胞中的磷酸-S6K水平,表明NF1-KO电池中的MTOR信号传递超动取决于LAMTOR1(Fig. 6B)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6NF1以LAMTOR1依赖性方式调节MTOR信号传导。 A,Hela和Hela-NF1-KO细胞在无氨基酸培养基中培养24小时,并用10%FBS的新鲜氨基酸 - 无氨基酸培养基或常规培养基。如图所示,收集细胞裂解物并用抗体呈抗体。 B,Hela,Hela-NF1-KO,Hela-Shlamtor1,Heh-NF1-Ko-Shlamtor1,HEK293T,HEK293T-NF1-KO,HEK293T-Shlamtor1和HEK293T-NF1-KO-Shlllamtor1细胞在无氨基酸培养基中培养24小时并用10%FBS的常规培养基取代。收集细胞裂解物,使用抗体进行蛋白质印迹分析,如图所示。 C,将八种细胞系血清饥饿并用雷帕霉素处理在表明浓度上24小时,然后用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑鎓溴化物测定来评估细胞活力。 D,Hela,Hela-NF1-KO,Hela-Shlamtor1和Hela-NF1-KO-Shlamtor1细胞的软琼脂菌落形成测定。 E,工作模型显示NF1与LAMTOR1绑定并禁止MTOR1信令。
      为了确定NF1缺陷细胞的细胞生长和生存是否已依赖于MTOR途径的多动激活,我们用不同剂量的雷帕霉素治疗了这八种细胞系(Fig. 6C)。我们发现,与其亲本细胞系相比,雷帕霉素治疗后,抑制了HeLa-NF1-KO和HEK293T-NF1-KO细胞的增殖(HEK293T细胞,10 nm, p < 0.01; 100 nm 和 1 μm, p <0.001; Hela细胞:100 nm 和 1 μm, p < 0.01) (Fig. 6C)。 LAMTOR1击倒在两种细胞系(HEK293T细胞:10和100 N中抢救了这种效果m 和 1 μm, p <0.001; Hela细胞:100 nm, p < 0.01; 1 μm, p <0.05),表明NF1-KO诱导的MTOR信号传递超动激活是LAMTOR1依赖性的(Fig. 6C)。软琼脂菌落形成测定还证实兰科1对于NF1缺陷细胞的致瘤性质非常重要。 Hela-NF1-KO细胞形成比Hela细胞更明显更多的菌落(p <0.01),而Lamtor1的敲低几乎废除了这种效果(p < 0.01) (Fig. 6D)。总的来说,这些结果表明NF1与LAMTOR1形成蛋白质复合物,并以LAMTOR1依赖性方式抑制MTOR信号传导(Fig. 6E)。

      讨论

      对MS数据分析进行了相当大的努力进行识别 善意 相关蛋白质(
      • nesvizhskii a.i.
      • Vitek O.
      • Aeberberold R.
      串联质谱法产生的分析与验证蛋白质组学数据。
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      • Matthiesen R.
      • Azevedo L.
      • Amorim A.
      • Carvalho A.S.
      浅谈基于MS的蛋白质组学的常见数据分析策略。
      )。从深入功能分析的许多误报选择正确的相互作用是挑战性的。已经提出了许多算法来识别 善意 相互作用,同时消除假阳性结果(
      • Malovannaya A.
      • Lanz R.B.
      • Jung S.Y.
      • Bulynko Y.
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      人河马信号的相互作用蛋白质组:共激活剂YAP1的模块化控制。
      )。使用这些算法选择和有效地需要在AP-MS和大量工作中进行广泛的体验,以在任何给定的单元格中累积参考数据集(
      • Mellacheruvu D.
      • 赖特Z.
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      克拉佩:一种用于亲和纯化质谱数据的污染物库。
      )。我们在此开发的ACUMEN方法需要WT和KO细胞之间的简单比较和对比率的评估 p 价值,没有数学模型;我们希望这种技术能够缓解研究人员必须进行复杂的数据分析。
      一些蛋白质,如14-3-3个家庭成员(
      • MHAWECH P.
      14-3-3蛋白 - 更新。
      )和许多脱氢酶(
      • Komander D.
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      打破链条:脱硫酶的结构和功能。
      ),已知调节不同的细胞功能。然而,由于它们在AP-MS结果中的高丰度和频繁的外观,它们在使用基于大多数基于频率分析的数据分析工具时被识别为污染物。 acumen方法可以部分解决这个问题。例如,已知NF1由14-3-3蛋白(
      • 冯L.
      • yunoue s.
      • Tokuo H.
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      PKA磷酸化和14-3-3相互作用调节神经纤维瘤型I肿瘤抑制剂,神经纤维素的功能。
      )。在我们的研究中,从WT和KO细胞的IP复合物中鉴定了14-3-3蛋白。但是,它们是显着的(p <与HEK293T-NF1-KO细胞相比,0.01)来自HEK293T细胞(YWHAB,3.6倍; Ywhah,2倍)的IP复合物中富集。虽然此类富集在Hela标签结果中勉强统计​​学意义(YWHAB,1.6倍, p <0.05; Ywhah,1.7倍, p <0.2),在HeLa细胞中使用硅酸癌确认这些数据。这些结果表明,AP-MS结果的逐个病例分析将使您更容易选择对深入功能性研究的兴趣的正确蛋白质。请注意,在进行这些研究时,重要的是在进行中有一个非常明确的生物问题。
      有几种可用于将CAS9系统引入目标细胞的方法(
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      )。对于敏锐系统,理想的方法是使用瞬时转染,以引入含Cas9和SGRNA的质粒,因为我们在本研究中,一旦基因编辑完成,就不再需要表达CRISPR组件(
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      )。然而,使用慢病毒或逆转录病毒系统用于CRISPR / CAS9递送是有益的,难以转染的其他细胞系。使用慢病毒或逆转录病毒载体开发稳定的Cas9效应细胞系在引入SGRNAS之前,可以是在同一细胞系统中研究几种蛋白质时更容易的方式,因为它简化了更大规模研究的程序。在原代细胞中产生CRISPR / CAS9敲除细胞有挑战性。另一种方法是使用纯化的Cas9-SGRNA核糖核蛋白递送。已经建立了电穿孔方法以将Cas9-SGRNA复合物引入原代细胞和胚胎干细胞,并且这些可以诱导靶向基因突变和大染色体缺失,同时最小化偏离目标效果(
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      )。随着CRISPR / CAS9基因编辑技术的发展,希望将来将采用ACUMEN系统在所有细胞系甚至是动物模型中的研究。
      Acumen方法受到识别特定靶蛋白的特异性抗体的可用性的限制。虽然在选择抗体时交叉反应不再是敏锐的主要问题,但抗体富集诱饵蛋白的效力仍然是一个主要的考虑因素。虽然敏锐方法提供了与所用的个体抗体的非特异性关联的良好评估,但它可能不会绘制孤立的蛋白质复合物的完整图像,因为某些抗体可以与特定的蛋白质表面结合,从而防止它用其他蛋白质形成复合物。因此,使用识别出诱导诱饵蛋白的不同表位或表面的多于一抗体将有助于实现其相互作用的蛋白质的全面覆盖。新开发的CRISPR / CAS9敲入系统还提供了另一种解决方案(
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      工程 Caenorhabditis elegans. 基因组使用Cas9触发的同源重组。
      )。使用CAS9诱导的DNA双链断裂,可以通过同源重组修复,表位标签可以敲入诱饵蛋白的轨迹中,这将允许研究人员使用现有的抗表位抗体(例如 GFP,标志和HA)进行这些内源性AP-MS研究(
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      一种可扩展的基于基于基于基于基于基于基于基于基于基于基于基于蛋白复合物在人细胞中的覆谱素。
      )。虽然这种方法仍然会拉下非特异性丰富的蛋白质和特异性污染物,但是类似于使用表位标签的其他AP-MS方法,它提供了进行基因组内源性蛋白质复合筛选的更方便的方法,这不依赖于可用性抗内源性蛋白的抗体。
      与其他已在哺乳动物细胞的大规模研究中广泛使用的其他AP-MS方法不同,并导致许多公开的数据集,例如基于标志标签的AP-MS,Acumen是一种新方法,没有使用类似的可比结果以前基于AP-MS的PPI网络的方法。这使得难以通过将它们与基于知识的AP-MS数据库结果进行比较来评估各个acumen结果的数据质量。包括预先存在的PPI信息进入由Acumen建立的内源蛋白质网络将有所帮助,但也可能是风险的,因为许多以前的研究使用IgG下拉或空载体转染的细胞作为对照。经过多年的AP-MS数据分析,研究人员已经意识到这些是“不完美的控制”,产生许多假阳性结果,因为这些控制实验中的识别总数远低于实际实验中的识别总数(
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      通过亲和富集质谱(AE-MS)而不是亲和纯化质谱(AP-MS)的精确蛋白质复合物。
      )。
      在这项研究中,我们发现使用原始过滤方法鉴定的前一半以前报道的NF1特异性相互作用蛋白可能是误报( Fig. 3H补充表6.)。对这些结果的进一步分析表明,如上所述,这些假阳性识别主要由使用不完美控制的研究产生,而大多数先前的TAP-MS结果是可重复的,因为它们使用了严格的两步AP协议。然而,这些差异也可能是由于不同研究中使用的不同细胞系统或裂解缓冲液。在我们所用的两种细胞系中的至少一种中,未检测到先前报道的NF1相互作用蛋白的8%,并且28%的先前报道的蛋白质仅在一根细胞中通过了我们的特异性过滤标准(补充表6.)。这些结果表明,细胞系差异,尤其是蛋白质丰富差异,可能影响非特异性关联的水平以及细胞特异性蛋白质相互作用。类似地,不同的样品制备方案,例如使用不同的裂解缓冲液,也可能大大影响非特定协会的水平(
      • 格拉特T.
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      • 施密特A.
      不同样品制备方案的比较显示革兰氏阴性细菌和人细胞中的裂解缓冲液的提取偏差。
      )。因此,我们需要非常谨慎地纳入使用ACUMEN方法产生的新内源PPI网络中的信息。
      Carrpr / Cas9偶联AP-MS癌症方法集体提供了一种快速和技术上方便的方法,可以在任何给定的细胞类型中揭开任何给定蛋白质的内源蛋白质复合物。与先前的方法相比,这种方法可以识别弱 善意 互动,如NF1-KRAS协会,从显着的背景噪声。使用定量MS是有帮助的,但不再需要。不再需要获得具有很少交叉反应的高质量抗体,因为可以使用扫描方法容易地消除交叉反应。后MS后的数据分析已经显着简化,不再需要感兴趣的小区中的数据累积。建立基因组宽的CRISPR GRNA文库(
      • Koike-yusa H.
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      哺乳动物细胞与慢病毒CRISPR导向RNA文库的基因组宽隐性遗传筛选。
      ),可以采用这种方法对大规模的PPI研究,例如蛋白质组族研究或在重要的生物过程中涉及的信号传导途径(
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      定义人河马途径的蛋白质 - 蛋白质相互作用网络。
      )。
      使用Acumen系统,我们发现了一种新的NF1 - 相互作用蛋白,拉孔1,并将其与MTOR信号传导激活的相互作用连接(Fig. 5, Fig. 6)。 LAMTOR1已知溶胶体络合物的锚蛋白,其在溶酶体表面上,该裂解物络合物促进Ragulator GTP酶和其他GTP酶对溶酶体,可能是响应氨基酸(
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      )。因为NF1是一种GTP酶活性蛋白,所以加速RAS GTP酶水解并抑制其活化(
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      神经纤维瘤病类型1基因产物的差距相关结构域与RAS P21相互作用。
      ),它还可以通过类似机制调节兰科GTP酶或由LAMTOR1募集的其他GTP酶。识别MTOR信号传导中NF1的确切基板可能需要广泛的工作和精心设计的生物化学分析;然而,它可能最终建立两个重要的癌症相关的信号传导途径之间的机械关联,并表明NF1或MTOR相关肿瘤的新型治疗方法。
      GTP酶是一种大型水解酶的酶,可以通过它们的结合和水解GTP的能力调节信号级联。它们可以通过GTP酶活化蛋白如NF1灭活,将GTP酶从GTP结合的形式切换为GDP键。它们也可以通过鸟嘌呤核苷酸交换因子重新激活,其将GDP与GTP酶解离GDP。在我们的研究中,除了LAMTOR1之外,我们还鉴定了许多其他新型NF1相互作用的蛋白质,包括GTP酶调节鸟嘌呤核苷酸交换因子Rapgef2,Rapgef6和三重奏; rho gtpase-activating蛋白质arhgap17;和其他GTPase - 相互作用的蛋白质,例如GNA13,Mprip,ERC1和PAK2(补充表2)。这些蛋白质可能形成GTP酶调节络合物,其可以协调正积极和负面调节GTP酶活性。进一步调查这些相互作用和深入功能性研究可以提供更多的新颖见解进入不同信号级联的GTP酶的规定。

      数据可用性

      质谱蛋白质组学数据已经沉积在Proteomexchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过自豪的合作伙伴存储库(英国Hinxton)(
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      )使用数据集标识符PXD005107。项目名称,CRISPR / CAS中的AP-MS利用用于映射内源蛋白复合物交互网络的系统。项目加入号码,PXD005107;项目DOI,10.6019 / PXD005107。

      致谢

      我们感谢陈,王和秦立实验室为他们的咨询和技术援助,马克韦德和安德顿编辑稿件。德克萨斯州长安德森大学安德森癌症中心得到了国家卫生核心授予CA016672的支持。

      补充材料

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