从组织病理学福尔马林固定和石蜡嵌入(FFPE)组织微粉中解锁癌糖糖;

  • Hannes Hinneburg.
    隶属关系
    来自Max Planck胶体和界面研究所,生物分子系统,14424波茨坦,德国;

    FreieUniversität柏林,化学,化学,化学研究所和生物化学研究所,14195柏林,德国;
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  • PetraKoraë.
    隶属关系
    克罗地亚萨格勒布萨格勒布大学分子生物学系科学系;
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  • Falko Schirmeister
    隶属关系
    来自Max Planck胶体和界面研究所,生物分子系统,14424波茨坦,德国;

    FreieUniversität柏林,化学,化学,化学研究所和生物化学研究所,14195柏林,德国;
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  • Slavko Gasparov.
    隶属关系
    病理学和细胞学研究所,大学医院Merkur,萨格勒布,克罗地亚;

    克罗地亚萨格勒布萨格勒布大学病理学,医学院萨格勒布
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  • Peter H. Seeberger.
    隶属关系
    来自Max Planck胶体和界面研究所,生物分子系统,14424波茨坦,德国;

    FreieUniversität柏林,化学,化学,化学研究所和生物化学研究所,14195柏林,德国;
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  • vlatkazoldoš
    隶属关系
    克罗地亚萨格勒布萨格勒布大学分子生物学系科学系;
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  • 作者脚注
    §§ 现代地址:Gliffith大学金色海岸校园,昆士兰州,4222,澳大利亚 [电子邮件 protected],电话:+ 61-7-5552 7026。
    Daniel Kolarich.
    一致
    应该解决对应的通信:Max Planck胶体和界面研究所,生物分子系统,德国14424波茨坦。电话:+ +49-30-838 59306;传真:+ 49-30-838 459306;
    脚注
    §§ 现代地址:Gliffith大学金色海岸校园,昆士兰州,4222,澳大利亚 [电子邮件 protected],电话:+ 61-7-5552 7026。
    隶属关系
    来自Max Planck胶体和界面研究所,生物分子系统,14424波茨坦,德国;
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了最大普朗克社会和欧盟(第七框架计划“糖蛋白质”项目,授予数字PCIG09-GA-2011-293847,IBD-BIOM项目,授予号码305479)。
    本文含有补充材料。
    §§ 现代地址:Gliffith大学金色海岸校园,昆士兰州,4222,澳大利亚 [电子邮件 protected],电话:+ 61-7-5552 7026。
      N- 和O-glycans是有吸引力的临床生物标志物,因为糖基化因疾病的反应而变化。定义的临床标本的有限可用性阻碍了大型患者队列的甘油 - 生物标志物鉴定和验证。福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)临床标本是临床病理学中样品保存的常见形式,但定性和定量N- 和O迄今为止,这种样本的良选尚未得到可行的。在这里,我们报告了一种同时的高敏感和聚糖的异构选择方法N- 和O - 组织病理学幻灯片的晶观。通过激光捕获微散射从FFPE组织切片分离的2000个细胞,使用多孔石墨化的碳纳米氧化镁/ MS是对深入的组织病理学 - 糖类的影响。N- 和O - 与新鲜组织相比,未染色和苏木精和嗜素染色的FFPE样品相似,庚烷曲线与eosin染色的曲线相似。该方法提供了从全球病理实验室存档的FFPE组织病理组织中解锁Glyco-Biomarker信息的关键。
      细胞表面和体液蛋白质广泛用特异性聚糖装饰(
      • Moremen K.W.
      • Tiemeyer M.
      • Nairn A.v.
      脊椎动物糖基化:多样性,合成和功能。
      )。糖蛋白和糖脂是血浆膜糖钙的一部分,是细胞间相互作用的第一界面(
      • 举行W.
      • Mariuzza R.A.
      细胞表面受体的顺式 ​​- 反式相互作用:生物学作用和结构基础。
      )。因此,Glycome和糖蛋白组是蜂窝通信的关键要素(
      • Croci D.O.
      • Cerliani J.P.
      • 达拉托 - 莫雷诺T.
      • Mendez-Huergo S.P.
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      糖基化依赖性凝集素受体相互作用在抗VEGF耐火性肿瘤中保留血管生成。
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      • Marth J.D.
      • 储存P.K.
      哺乳动物糖基化免疫。
      )。在许多疾病状态中,生物学过程改变以表达不同的聚糖和细胞表面上的糖蛋白(
      • 斯托尔斯。
      • 鞠t.
      • Cummings R.D.
      癌症中的蛋白质糖基化。
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      • Almeida A.
      • Kolarich D.
      个性化药物蛋白质糖基化的承诺。
      )。 Glyce的动态变化是年龄,生物体的生理状态(稳态或疾病)和各种其他环境或内在因素(
      • Kristic J.
      • 沃克诺维奇F.
      • Menni C.
      • Klaric L.
      • Keser T.
      • Beceheli I.
      • Pucic-Bakovic M.
      • Novokmet M.
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      • Thaqi K.
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      聚糖是一种新生和生物年龄的新型生物标志物。
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      • knezevic A.
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      • Redzic I.
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      • rudd下午
      • 赖特A.F.
      • 坎贝尔H.
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      老化,体重指数,血浆脂质谱和吸烟对人血浆N-聚糖的影响。
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      • knezevic A.
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      • Adamczyk B.
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      • 鲁丹一世。
      • Wuhrer M.
      • rudd下午
      • josic d.
      • Lauc G.
      IgG - 可变异性和IgG Glycome中IgG Glyce中IgG变异性的高通量分离和糖基化分析。
      )。随着聚糖整合环境和间接遗传因素并与复杂疾病密切相关,它们已被建立为癌症和慢性炎症等疾病的预测性和预后标志物(
      • Almeida A.
      • Kolarich D.
      个性化药物蛋白质糖基化的承诺。
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      • 粉丝m.m.
      • Esko J.D.
      癌症的甜味和酸酸:聚糖作为新型治疗靶标。
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      • Dube D.H.
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      治疗和诊断的癌症和炎症(MDASH)潜力的聚糖。
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      细胞表面蛋白糖基化在癌症中。
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      • miwa h.e.
      • 宋y.
      • alvarez r.
      • Cummings R.D.
      • 斯坦利P.
      细胞生长对照和肿瘤进展中的直接GLCNAc。
      )。
      大多数努力识别聚集在体液上的甘油生物标志物,因为易于访问性(
      • Almeida A.
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      个性化药物蛋白质糖基化的承诺。
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      • Adamczyk B.
      • Tharmalingam T.
      • rudd下午
      聚糖作为癌症生物标志物。
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      • Wuhrer M.
      临床蛋白质组学中的糖基化分析:用于甘油生物标志物的标题。
      )。为了更好地了解负责疾病发病和进展的分子事件,直接来自组织标本的特定糖基化签名的分析是至关重要的(
      • 这 odoratou E.
      • 坎贝尔H.
      • Ventham N.T.
      • Kolarich D.
      • Pucic-Bakovic M.
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      • Fernandes D.
      • 彭尔顿I.K.
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      糖基化在IBD中的作用。
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      糖蛋白分析鉴定癌症患者癌症特异性糖基化的候选生物标志物和血清内膜癌癌患者的血清。
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      • 钟T.
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      • Tsai C.H.
      • 常年。
      • 梁Y.
      • Tsui K.H.
      • 陈Y.T.
      微散射标本的比较组织蛋白质组学揭示了膀胱癌的新型候选生物标志物。
      )。然而,组织通常是妨碍特定标记的检测的不同细胞类型的高度异质混合物。由于道德和技术障碍,高质量的生物标志物研究的大量明确临床组织标本的集合是挑战性的。
      广泛应用的标准病理学程序是通过福尔马林固定保存组织样品,然后是随后的石蜡嵌入(FFPE)
      使用的缩写是:FFPE,福尔马林固定和石蜡嵌入;曲线下的AUC; BPC,碱峰色谱图; EIC,提取离子色谱图; H&E,苏木精和曙红; HCC,肝细胞癌; LC,液相色谱; LCM,激光捕获微量碎片; MS / MS,串联质谱; PGC,多孔石墨化碳; SPS,SMART参数设置; ICC,离子电荷控制。
      ,
      1使用的缩写是:FFPE,福尔马林固定和石蜡嵌入;曲线下的AUC; BPC,碱峰色谱图; EIC,提取离子色谱图; H&E,苏木精和曙红; HCC,肝细胞癌; LC,液相色谱; LCM,激光捕获微量碎片; MS / MS,串联质谱; PGC,多孔石墨化碳; SPS,SMART参数设置; ICC,离子电荷控制。
      随着 例如 苏木精和eosin(h&E) staining (
      • Fischer A.H.
      • 雅各逊K.A.
      • 玫瑰J.
      • Zeller R.
      组织和细胞部分的苏木精和曙红染色。
      )对于肿瘤诊断和长期保护。许多FFPE保存的组织标本可在世界各地的临床中心提供,并且通常与综合临床数据集相关联。可以在环境温度下处理FFPE组织,并且可以施加各种解剖方法,例如激光捕获微粉切段,以便通过其他组织和/或细胞最小化污染物。这使得它们对任何疾病相关的研究,生物标志物发现或回顾性研究使其成为一种高价值的来源,只要利益化合物定性和定量保存并且同样可以提取以进一步分析(
      • Magdeldin S.
      • Yamamoto T.
      朝向福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织的解密蛋白质。
      ,
      • ostasiewicz p.
      • Zielinska d.f.
      • wisniewski J.R.
      蛋白质组,磷脂蛋白酶和N-糖蛋白组在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中定量保存并通过高分辨率质谱分析。
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      • 德格朗蒙特A.
      • 沃森S.
      • 埃里斯黎各。
      • 罗登J.
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      • 德格朗蒙特A.
      • 汉密尔顿S.R.
      癌症靶向疗法的生物标志物评价的语用问题。
      )。
      蛋白质(
      • Magdeldin S.
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      朝向福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织的解密蛋白质。
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      蛋白质组,磷脂蛋白酶和N-糖蛋白组在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中定量保存并通过高分辨率质谱分析。
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      福尔马林固定的石蜡嵌入组织的埋藏宝脱染液,mRNA,miRNA和蛋白质分析的挖掘。
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      • 莱昂D.R.
      • Zaia J.
      组合组织组合蛋白质组学和糖录谱的工​​作流程。
      )或核酸(
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      福尔马林固定的石蜡嵌入组织的埋藏宝脱染液,mRNA,miRNA和蛋白质分析的挖掘。
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      从冷冻和福尔马林固定的组织切片微释放细胞微释放后提取DNA的定量。
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      • Seninginger K.
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      • 安德森M.G.
      鉴定使用福尔马林固定的石蜡嵌入组织样品在RNA表达分析中的使用方法。
      )现在经常从FFPE样本中恢复,即使它们可以在保护过程中被修改和/或降级。代谢物分析(
      • 凯莉A.D.
      • Breitkopf S.B.
      • 袁马。
      • 金匠J.
      • Spentzos D.
      • asara j.m.
      使用靶向LC / MS / MS从福尔马林固定,石蜡包埋的肿瘤组织中的代谢组分分析:在肉瘤中的应用。
      ),糖酰胺聚糖(
      • van wijk x.m。
      • Vallen M.J.
      • van de westerlo e.m.
      • Oosterhof A.
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      甲醛固定的石蜡包埋组织糖胺聚糖的提取与结构分析。
      ), 也 N - (
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      组合组织组合蛋白质组学和糖录谱的工​​作流程。
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      使用MALDI质谱法从福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片成像N-连接的聚糖。
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      人癌糖的分析鉴定了一种新型肿瘤相关的N-乙酰葡糖胺甘油抗原。
      ) 和 O-glycans(
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      从冷冻和石蜡嵌入的档案组织中释放寡糖。
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      人癌糖的分析鉴定了一种新型肿瘤相关的N-乙酰葡糖胺甘油抗原。
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      • Higashino K.
      • Sakairi N.
      • Shinohara Y.
      通过微波辅助β-消除吡唑酮类似物的定量O-糖。
      已经描述了。迄今为止,旨在综合临床组织的所有分析 N- 和O-Glycomics.(1)患有敏感性差(
      • DWEK M.V.
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      从冷冻和石蜡嵌入的档案组织中释放寡糖。
      ),(2)不能应用于两者 N- 和O-glycans(
      • Turiak. L.
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      • 孟尔。
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      福尔马林固定石蜡嵌入鼠肾脏对N-连接聚糖的MALDI成像质谱。
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      • Sakairi N.
      • Shinohara Y.
      通过微波辅助β-消除吡唑酮类似物的定量O-糖。
      ),(3)缺乏可靠的 O-glycan提取(
      • Satomaa T.
      • Heiskanen A.
      • Leonardsson I.
      • Angstrom J.
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      人癌糖的分析鉴定了一种新型肿瘤相关的N-乙酰葡糖胺甘油抗原。
      ),(4)患有病情的分化 N- 和O-glycans(
      • Toghi Eshghi S.
      • 杨科。
      • 王X.
      • 莎第P.
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      • 张H.
      使用MALDI质谱法从福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片成像N-连接的聚糖。
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      • 街道A.J.
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      • LeaThem A.J.
      从冷冻和石蜡嵌入的档案组织中释放寡糖。
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      • Heiskanen A.
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      • Angstrom J.
      • olonen a。
      • Blomqvist M.
      • Salovuori N.
      • Haglund C.
      • Teneberg S.
      • Natunen J.
      • Carpen O.
      • Saarinen J.
      人癌糖的分析鉴定了一种新型肿瘤相关的N-乙酰葡糖胺甘油抗原。
      )对完整的唾液酸化聚糖的可靠分析(
      • Toghi Eshghi S.
      • 杨科。
      • 王X.
      • 莎第P.
      • 李X.
      • 张H.
      使用MALDI质谱法从福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片成像N-连接的聚糖。
      ,
      • Gustafsson o.j.
      • Briggs M.T.
      • Condina M.R.
      • Winderbaum L.J.
      • Pelzing M.
      • McColl S.R.
      • everest-dass a.v.
      • 包装机N.H.
      • Hoffmann P.
      福尔马林固定石蜡嵌入鼠肾脏对N-连接聚糖的MALDI成像质谱。
      )。因此,对FFPE组织的敏感和选择性提取和深入分析的鲁棒方法 N- 和O-Glycans是必需的。
      在这里,我们提出了一种非常灵敏的方法来单独和顺序提取和分析结构保存 N- 和O - 从FFPE组织标本中分离的少数至1000个细胞的糖粉。激光捕获微量碎石(LCM)可确保接触细胞组或甚至单个细胞的自由拾取,以便于随后的操作。使用多孔石墨化碳(PGC)纳米级液相色谱(Nanolc)与在线ESI串联质谱(MS / MS)检测(MS / MS)检测,分析LCM分离的组织。
      • Jensen P.H.
      • Karlsson N.G.
      • Kolarich D.
      • 包装机N.H.
      结构分析 N- 和O从糖蛋白释放的糖粉。
      ,
      • Kolarich D.
      • 挡风剂M.
      • alagesan K.
      • altmann f.
      用多孔石墨化碳的LC-ESI MS / MS对释放的N-聚糖的异构体特异性分析。
      )。在单一实验中获得了关于岩藻糖和唾液酸键的深入聚糖结构信息,从最小量的临床材料提供最大的信息。该PGC纳米-ESI MS / MS基于基于FFPE组织样本的LCM-分离的细胞的糖类方法是开口新颖的途径,用于研究蛋白质糖基化在健康和疾病中的作用。

      实验步骤

      如果没有另外说明所有材料都以Sigma-Aldrich(圣路易斯,MO)的最高质量购买。肽 - N - 甘氨酸酶F(PNGase F)是从Roche Diagnostics GmbH(Mannheim,Germany)获得的。用Milli Q-8直接系统(Merck Kgaa,Darmstadt,Darmstadt,德国)净化后使用水。氯仿来自VWR International(Fontenay-Sous-Bois,法国)。人肝组织来自患有肝硬化或肝细胞癌的三个不同患者,根据米兰标准获得肝脏移植。这项研究由“伦理委员会的伦理委员会批准 Klinieka Bolnica Merkur.“对于报告糖类实验,遵循海市蜃楼指南(
      • 约克W.S.
      • Agravat S.
      • Aoki-Kinoshita K.F.
      • McBride R.
      • 坎贝尔M.P.
      • Costello C.E.
      • 戴尔A.
      • Feizi T.
      • 哈斯林三。
      • Karlsson N.
      • Khoo K.H.
      • Kolarich D.
      • 刘Y.
      • Novotny M.
      • 包装机N.H.
      • 保尔森J.C.
      • RAPP E.
      • Ranzinger R.
      • rudd下午
      • 史密斯D.F.
      • struwe w.b.
      • Tiemeyer M.
      • 井L.
      • Zaia J.
      • Kettner C.
      Mirage:糖类实验所需的最低信息。
      )。

       福尔马林固定和石蜡嵌入

      肝脏组织分为几个部分,并立即在-80℃下冷冻或用福尔马林(福尔马林溶液,中性缓冲,10%,Biognost,Zagreb,克罗地亚)固定在石蜡(石蜡,樱花,萨鲁塔,阿曼·埃·赖赫,荷兰)在常规程序之后。简而言之,组织经过10%福尔马林(24小时),70%乙醇(2×1小时),95%乙醇(2×1小时),绝对乙醇(2×1小时),二甲苯(2×1小时37 ℃)和液体石蜡(3×1H在60℃)。使用标准滑动手动切片(Microm,Dreiech,Germany)将石蜡组织块切成2-10μm厚的部分。将2-4μm厚的部分安装在玻璃载玻片上(显微镜载玻片,VITROGNOST)。 H&e根据常规协议进行染色(
      • Fischer A.H.
      • 雅各逊K.A.
      • 玫瑰J.
      • Zeller R.
      组织和细胞部分的苏木精和曙红染色。
      )。在用二甲苯的脱碱化后,通过降低系列乙醇再水化,洗涤载玻片,施加苏毒素。随后洗涤后,用升高的乙醇系列脱水并短暂地风干脱水后。初始制剂后3个月内使用标本。

       激光捕获微量碎裂

      在显微镜下分析激光捕获微小切割如下:安装在膜载玻片上(膜LiDE1.0笔,Carl Zeiss显微镜,Jena,Germany)的染色部分进行了分析,这是激光微碎石系统的一部分(棕榈蔡司Microbeam,Axiovert 200m 使用Palm RoboSoftware根据制造商的手册计算,标记和切割棕榈鞋面,Carl Zeiss显微镜)和所选细胞。
      使用制造商手册中描述的协议进行激光压力转移方法,并在500μl收集管的粘合帽中收集分离的组织部件(样品粘合剂500不透明(D)PCR管,Carl Zeiss显微镜)。

       来自FFPE组织的蛋白质提取/抗原检索 - 未安装样品集

      如前所述,完成蛋白质提取约50个未计算的FFPE组织切片(
      • ostasiewicz p.
      • Zielinska d.f.
      • wisniewski J.R.
      蛋白质组,磷脂蛋白酶和N-糖蛋白组在福尔马林固定的石蜡包埋的组织中定量保存并通过高分辨率质谱分析。
      )。简而言之,将2-10μm厚的FFPE部分转移到1.5ml样品管中,在二甲苯中在温和搅拌下在二甲苯中洗涤两次,然后用绝对乙醇洗涤5分钟,然后允许干燥。将脱碱化和洗涤的样品合并并在0.1的冰上均化 m Tris-HCl,pH 8.0; 0.1 m DTT缓冲区使用桌面Branson Sunifier B-12 Sonicator(Branson Sonic Power输出控制:1.5; 3×10-30秒)。将SDS加入到最终浓度的4%(w / v)中,并在温和搅拌下在99℃下在99℃下孵育样品,然后使其冷却至室温。随后,将样品以2,000rcf离心20分钟以除去非溶解材料。根据Wessel和Flügge使用的方法,从上清液中沉淀蛋白质(
      • Wessel D.
      • flugge u.i.
      洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质在稀释溶液中进行定量回收的方法。
      )。简而言之,将200μl上清液与800μL甲醇混合,然后加入200μL氯仿和600μL水并剧烈混合。将样品以14,000 rcf离心5分钟,小心地除去上部水相(间隔含有沉淀的蛋白质)。加入另外的600μL甲醇,混合液体,然后在14,000 rcf下离心10分钟。除去上清液,将最终沉淀溶于含6的溶液中 m 尿素和2 m 硫脲先前印迹在PVDF膜上(下面描述)或储存在-20℃以进一步使用。

       安装的样本集

      显微镜滑块携带H. &E染色和未染色的FFPE组织切片(2-4μm)用二甲苯(3×2分钟)洗涤,然后用绝对乙醇(3×2分钟)洗涤,用针/剃刀刀片刮掉,然后从载玻片转移到一个含有4%SDS的样品管在0.1中 m Tris-HCl,pH 8.0和0.1 m dtt。将悬浮液超声处理在冰上(见上文),然后如对未安装部分的描述进一步加工。

       激光捕获Microrodissed样品集

      含有未染色的管,已经脱碱化的洗涤液(〜100,000,〜10,000),以及H.&将彩色计数器倒置潜伏,以确保在解剖程序后捕获通常位于管盖子的微小样品,在0.1中以4%SDS为30分钟的30分钟 m Tris-HCl,pH 8.0,0.1 m dtt。随后将样品在99℃下在相同的缓冲液中孵育60分钟。然后如对于未安装部分所述进一步处理样品。
      第二组激光捕获含有约的微小组织。从肝细胞癌或周围的Nontumor组织的三种后续FFPE组织切片获得每种微量菌的2000个细胞。如上所述处理微散射样品。

       冷冻样品集

      如前所述进行冷冻组织的蛋白质提取(
      • 李阿。
      • Kolarich D.
      • Haynes P.A.
      • Jensen P.H.
      • 面包师M.S.
      • 包装机N.H.
      大鼠肝膜糖蛋白:通过相分配和糖蛋白捕获富集。
      )。简而言之,使用含有50μm的裂解缓冲液(pH7.4),使用IKA“T10基本”均化器(Staufen,德国)在冰上均质化肝组织块m TRIS-HCL,0.1 m sodium chloride, 1 mm 乙二胺四乙酸和蛋白酶抑制剂混合物(Promega,Mannheim,德国)并孵育20分钟。然后使用桌面布兰森超声机B-12 Sonicator(Branson Sonic Power输出控制:1.5; 3×10 -30),并在室温下以2000 rcf离心20分钟,将该溶液超声处理。将上清液直接被发现到PVDF膜上(见下文)或储存在-20℃。

       PVDF点印迹和 N- 和O-Glycan释放

      提取的蛋白质是点衬垫(冷冻/ FFPE组织)上0.2μm孔径PVDF膜(Millipore,Tullageen,爱尔兰)和 N- 和O如前所述依次释放糖蜜(
      • Jensen P.H.
      • Karlsson N.G.
      • Kolarich D.
      • 包装机N.H.
      结构分析 N- 和O从糖蛋白释放的糖粉。
      ,
      • Kolarich D.
      • 挡风剂M.
      • alagesan K.
      • altmann f.
      用多孔石墨化碳的LC-ESI MS / MS对释放的N-聚糖的异构体特异性分析。
      )。
      为了确保从FFPE组织切片中提取的蛋白质(1:2; 1:4; 1:8; 1:2)从FFPE组织切片提取的蛋白质(1:2; 1:8; 1:20; 1:32)从FFPE组织切片中提取的蛋白质(1:2; 1:8; 1:20; 1:32)的蛋白质(未安装部分仅制备并发现到膜上(未显示的数据)。与新鲜冷冻蛋白相比,表现出类似的直接蓝71染色强度的斑点被认为含有固定在PVDF膜上的可比例的蛋白质,并用于随后的聚糖释放。

       发布分析 N- 和O - 使用多孔石墨化碳液相色谱电喷雾电离质谱法的糖粉

      如前所述的最终离线碳脱盐步骤(
      • Jensen P.H.
      • Karlsson N.G.
      • Kolarich D.
      • 包装机N.H.
      结构分析 N- 和O从糖蛋白释放的糖粉。
      )将样品溶解在10μlmilliq - 水中,并注入3μl的每次LC-MS运行。 PGC Nanolc Setup如下:PGC预柱(Hypercarb5μm,30×0.32mm,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)和PGC分离柱(Hypercarb3μm,100×0.075 mm,Thermo Fisher Scientific)安装在最终的3000 UHPLC系统(Dionex,Gremering,Germany)。预先柱塞在缓冲A中平衡(10米 m 碳酸氢铵)和释放的聚糖在6μl/ min流速的先前阀门切换以6μl/ min流速将5分钟装入前料。分离塔的平衡条件为3%缓冲液B(10米的60%ACNm 碳酸氢铵)。将释放的聚糖加载到捕获栏中后,使用缓冲液B建立线性梯度,如下所示:降低 N在增加到49分钟的增加至40.3%缓冲b之前,在1分钟内使用线性梯度在1分钟内与3%缓冲b至15.8%分离。 O使用相同的设置分析庚烷,但在33分钟内施加线性梯度从2%至35%的缓冲液B。将流速设定为0.8μL/ min,并且柱保持在40℃的恒定温度下。 LC直接耦合到亚马逊速度ETD离子陷阱质谱仪,其配备有用于在负离子模式中在线检测聚糖的在线检测的亚马逊速度ETD离子陷阱质谱仪。 MS Spectra在Ultrascan模式中获得 m/z 380 - 1800的范围;智能参数设置(SPS)设置为 m/z 900;离子电荷控制(ICC)至40,000且最大。获取时间为200毫秒。
      使用碰撞诱导的解离MS / MS光谱通过通过 m / z. 在施加隔离宽度的三个最丰富的前体上的100 - 2,500范围 m / z. 3.使用增强的SmartFrag选项在32毫秒30-120%的增强型Smartfrag选项设定为碎片切断率为27%。 ICC设定为150,000。

       结构确定与相对聚糖量

      N- 和O通过手动筛选光谱和注释,包括异构结构阐明,基于PGC保留时间(
      • Jensen P.H.
      • Karlsson N.G.
      • Kolarich D.
      • 包装机N.H.
      结构分析 N- 和O从糖蛋白释放的糖粉。
      ,
      • Stavenhagen K.
      • Kolarich D.
      • Wuhrer M.
      采用石墨化碳液相色谱 - 质谱法的临床综合学。
      ,
      • PABST M.
      • altmann f.
      电吸收,溶剂,温度和离子极性对利用石墨碳的LC-ESI-MS对酸性寡糖的影响。
      ,
      • Palmisano G.
      • Larsen M.R.
      • 包装机N.H.
      • Thaysen-Andersen M.
      糖蛋白唾液酸糖蛋白的结构分析 - 第II:基于LC-MS的检测。
      ),负离子模式碎片行为(
      • 哈维D.J.
      碳水化合物的基质辅助激光解吸/电离质谱。
      ,
      • 哈维D.J.
      来自碳水化合物的负离子的破碎部分:第1部分。使用硝酸盐和其他阴离子加合物用于从N键入碳水化合物中生产负离子电喷雾光谱。
      ,
      • 哈维D.J.
      来自碳水化合物的负离子的破碎物:第2部分。高甘露糖N-连接聚糖的碎裂。
      ,
      • 哈维D.J.
      来自碳水化合物的负离子的破碎部分:第3部分。杂种和复合N-连接聚糖的碎裂。
      ,
      • 哈维D.J.
      • jaeken J.
      • 巴特勒姆
      • Armitage A.J.
      • rudd下午
      • DWEK R.A.
      来自N键碳水化合物的负离子的破碎物,第4部分。复合聚糖缺乏在6-天线上缺乏取代的碎裂。
      ,
      • 哈维D.J.
      • rudd下午
      来自N-连接的碳水化合物的负离子的破碎。第5部分:阴离子N-连接的聚糖。
      ,
      • 哈维D.J.
      • Edgeworth M.
      • 克里希纳B.A.
      • 奇晶粉
      • Allman S.A.
      • Crispin M.
      • 争夺J.H.
      来自N-连接的碳水化合物的负离子的破碎物:第6部分。含有核心中的N-乙酰葡糖胺的聚糖。
      ,
      • 哈维D.J.
      • 亚伯拉罕J.L.
      来自N键入碳水化合物的负离子的碎片和离子迁移性质:第7部分。减少聚乙烯。
      ,
      • 哈维D.J.
      • 罗伊尔L.
      • radcliffe c.m.
      • rudd下午
      • DWEK R.A.
      基质辅助激光解吸电离和负离子纳米普通质谱法对N-连接聚糖的结构和定量分析。
      ,
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      糖粉末端结构的串联质谱使得寡糖对寡糖上的决定因素的多级质谱鉴定能够。
      ,
      • Thomsson K.A.
      • 霍尔曼 - 拉斯森准噶
      • Angstrom J.
      • 约翰逊M.E.
      • xia l.
      • Hansson G.C.
      来自野生型,核心1-和核心3-转移酶 - 缺陷小鼠结肠的MUC2粘蛋白的详细O-糖型突出了与人体MUC2相比的差异。
      ,
      • Schulz B.L.
      • 包装机N.H.
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      用凝胶电泳分离的糖蛋白和粘蛋白的O型寡糖的小规模分析。
      ,
      • Schulz B.L.
      • Sloane A.J.
      • 罗宾逊L.J.
      • Prasad S.S.
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      • 包装机N.H.
      • Karlsson N.G.
      痰粘液的糖基化在囊性纤维化患者中改变。
      )和文学中已知的生物合成途径(
      • Trombetta E.S.
      N-聚糖的贡献及其在内质网对糖蛋白生物合成中的贡献。
      ,
      )。命名法基于varki 等等。 (
      • Varki A.
      • Cummings R.D.
      • Aebi M.
      • 包装机N.H.
      • Seeberger P.H.
      • Esko J.D.
      • 斯坦利P.
      • 哈特G.
      • Darvill A.
      • Kinoshita T.
      • Prestegard J.J.
      • Schnaar R.L.
      • 冻结H.H.
      • Marth J.D.
      • Bertozzi C.R.
      • Etzler M.E.
      • 弗兰克米
      • vliegenthart J.f.
      • Lutteke T.
      • 佩雷斯S.
      • 博尔顿E.
      • rudd p.
      • 保索J.
      • Kanehisa M.
      • Toukach P.
      • Aoki-Kinoshita K.F.
      • 戴尔A.
      • Narimatsu H.
      • 约克W.
      • Taniguchi N.
      • Kornfeld S.
      聚糖图形表示的符号命名。
      )。用于每个识别的糖粉结构的代表性MS / MS光谱(如果适用)可以从给定的信息生成(m/z,强度)在 补充材料。使用DataAnalysis 4.1(Bruker)的原始数据产生片段谱的质量清单,其绝对强度阈值为50(不使用阈值),S / N比为1和峰值宽度(FWHM(m/z)))0.1。除了手动注释之外,使用Glycomedb数据库或GlycoWorkBench 2.1使用Proteinscape 4.0(Bruker)分配Glycan产品离子光谱(
      • Ceroni A.
      • 玛雅K.
      • Geyer H.
      • Geyer R.
      • 戴尔A.
      • 哈斯林三。
      GlycoWorkBench:一种用于聚糖的计算机辅助注释的工具。
      )。对于ProteinsCape搜索,选择以下参数:Glycan类型: N-Glycan;分类: HOMO SAPIENS.;衍生化:und(未经辩护);还原端:减少;离子:H +最多3次费用;充电 - :1-3; MS耐受性:0.6 da; MS / MS耐受性:0.6 da;群众类型:单同质缺;碎片类型:CID A B C X Y Z,交叉环≤1,切割≤2。阈值设定得分:≥5%,碎片覆盖率:≥5%和强度覆盖率:≥5%。如果分数≥10,则接受Proteinscape Glycan作业。所有分配的光谱和识别的峰值都列于 补充材料.
      使用QuantAnalysis软件(版本2.1,Bruker),使用曲线(AUC)下的面积(AUC)下的面积测定单个聚糖结构的相对丰度(AUC)(提取的离子色谱图。检查所有AUC的集成限制,如果需要,请手动调整。样品中的所有检测和定量的聚糖结构的总和对应于100%,单独的相对量测定来自个体的AUC值。在必要时也与最高峰值有关的相对丰度。注意,在考虑本研究过程中的定量变化,将1%的相对丰度设定为可行的阈值,以考虑到定量变化。

       实验设计与统计理由

      我们开发了,优化和缩小了分析FFPE族族工作流程 N- 和O - 使用从被诊断患有肝细胞癌(HCC)的患者获得的肝标本并选择用于肝移植的肝脏样本。将一部分组织立即分离并在液氮中冷冻(在文本中称为 冷冻组织)而另一部分随后被保留(称为 FFPE组织)。从组织中提取后,将聚糖从蛋白质点释放到PVDF膜上。使用临床H.&E染色和未染色的组织切片,整个分析工作流程是开发和验证的,最小的样本要求评估和鉴定了由FFPE保存,染色或抗原检索诱导的潜在意外的伪影。该方案进一步优化了由LCMS选择的最小量的FFPE组织(1,000; 5,000个细胞)。然后将优化的方案与HCC组织的〜2,000肝细胞和周围的Nontumor组织一起使用(Fig. 1 )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1临床FFPE-组织工作流程的概述 N- 和O-Glycomics。 整个组织块,H之前或之后的滑动组织部分&E染色或微观分离的组织样本提供临床组织来源。抗原检索(Glyco)蛋白质固定在PVDF膜上 N- 和O用于多孔石墨化碳纳米-ESI MS / MS基甘料依次释放糖粉。
      统计分析的相对丰度 N- 和O来自不同起源的糖蜜( 例如 冷冻/ FFPE或肿瘤/无轨)基于线性模型。测试不同的样品源以在血晶分析中进行相同的适用性。研究了来自不同疾病状态的样品进行聚糖相对丰度的差异。相比样本的相对丰度的折叠变化及其各自的变化 p 绘制Volcano Plot的形状的值(见 补充材料)。如果在任何比较基团中未达到该阈值,则不绘制具有平均相对丰度的寡糖结构。这是为了清楚起见和潜在的问题,而不是精确定量非常小的峰面积。这 p 使用Benjamini和Hochberg的方法校正了多次测试的值(
      • Benjamini Y.
      • Hochberg Y.
      控制虚假发现率:多次测试的实用和强大的方法。
      )。与a相对甘草丰富的变化 p 值小于0.01被认为是统计学意义的。毫无监督的分层集群分析用于以热量的形式应用数据可视化。对数相对丰度值用于计算样品尺寸中的欧几里德距离矩阵和完全连杆聚类。另外,为了绘制每个聚糖结构的值,缩放为平均值和标准偏差一个(z分数标准化),除了 Fig. 4B 。 为了 Fig. 2A 分别为五个主要结构组中的每一个施加第二阶段的聚类阶段。统计计算和图形“R”的免费软件(
      • Pinheiro J.
      • 贝茨D.
      • 德布罗斯
      • Sarkar D.
      (2013)R开发核心团队NLME:线性和非线性混合效果模型。
      )被用作数据分析环境。代码可根据要求提供。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4N - 从肝细胞(1,000; 5,000和10,000个细胞)中测定的庚酰基&E染色的FFPE组织载玻片并通过多孔石墨化碳纳米蛋白-SIS / MS族进行分析。 A, N-Glycan基峰色谱图(BPC)从1,000获得;从h中分离5,000和10,000个细胞&E通过激光捕获微量碎片染色FFPE组织切片。所有BPC的强度被标准化为最强烈的样品(10,000个细胞)。专业 N - 在BPC中,已在其各自的保留时间中表明了甘油结构。星号表示时甘油污染信号。 B,在无监督的分层聚类之后获得的热图 N-Glycans从1000中检测到; 5000和10,000个细胞与从整个FFPE组织部分获得的细胞相比,并根据主要结构类别进行分类。检测到 N-glycan结构由结构ID号表示(有关详细信息,也可以参见 )在热图之上。根据不同的结构类(热图的底部)对热图进行分类,而底部的不同颜色盒提供有关个人的额外结构信息 N-glycans( 例如 NeuAc或岩藻糖连锁,存在分别的GlcNAc)。尽管具有较低的细胞数量较少的事实 N-glycans是可检测的(由白色盒子指示),没有发生细胞数相关聚类,表明整体轮廓与细胞数无关,并且微碎石本身不会改变聚糖型材。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2相对比 N- 和O-glycans从未计算的FFPE组织切片释放并匹配冷冻人类肝脏组织。 A,在未经监督的群集后获得的热图 N从两个样本来源的各种技术复制产生的糖蜜。检测到 N-glycan结构(十种最丰富的组合物是有色的,也可以参见 对于概述)由热图顶侧的结构ID号表示。结构编号指的是指中描述的各个ID 。以上数字的星号表示 p 获得的值范围在起始材料之间的统计相关差异(≤0.01(**)或≤0.05(*)之间。根据不同的结构类(热图底部的树木图)对热图进行分类,而底部的不同颜色盒提供有关个人的额外结构信息 N-glycans( 例如 NeuAc或岩藻糖连锁,存在分别的GlcNAc)。样品簇根据样品来源(冷冻和FFPE),因为主要是α2,3/α2,6连接的NeuAc残基的相对强度的差异。 B,结构被描绘为十个最丰富的 N-glycan组合物(红色标签)。结构19和25(紫色标签)是10 TH. 一个样本源中最丰富的组合物。 C,类别比较肝脏的比较 N - 从冷冻或FFPE原料获得的凝灰糖。误差条表示从5个技术复制确定的标准偏差。每个类别中的结构数量在酒吧上方表示。 D,对比较肝脏的 O - 从冷冻或FFPE原料获得的凝灰糖。结构编号指的是指中描述的各个ID .

      结果

      冷冻和肝脏FFPE临床组织用于提取 N- 和O-Glycans。为整个组织切片开发了分析FFPE族族工作流程,进一步优化用于最小的样品量,包括激光衍生的微散射,评价和通过鉴定的样品制备诱导的潜在意外的伪像。氯仿 - 甲醇沉淀(
      • Wessel D.
      • flugge u.i.
      洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质在稀释溶液中进行定量回收的方法。
      )在PVDF膜上以前的糖蛋白固定(
      • Jensen P.H.
      • Karlsson N.G.
      • Kolarich D.
      • 包装机N.H.
      结构分析 N- 和O从糖蛋白释放的糖粉。
      )被发现对随后的有益 N- 和O-Glycan释放以及PGC Nanolc-ESI MS / MS族。该步骤除去过量的SDS和其他污染物物质,从而显然降低了背景污染水平,更好的数据质量和清晰的灵敏度增加(未示出的数据)。综合的 N- 和O-glycome型材通常从厚度下的组织滑块和3μm的厚度和~15mm的表面积获得2.

       在保存和提取期间,易切割的纤维缺口保持完整

      一旦一个高度敏感 N- 和O-Glycomics的FFPE组织材料方案建立了与不同来源中获得的糖粉进行比较。这 N从代表性FFPE和冷冻组织标本获得的甘油基峰色谱图(BPC)出现了等同物(补充材料S1A)。在两个样本来源之间的十个最丰富的组合物中,九个是相同的(Fig. 2B)。唾液酸化,复合的双杉(〜66%)和岩氧化结构(〜40%)是最丰富的 N-glycans(Fig. 2C, 补充材料S1G)。总共74种不同 N在FFPE和冷冻组织中检测到糖膀甘油结构(衍生自40种组合物)(细节 补充材料S1B.)。 α2,6的分布:α2,3连接的NeuAc残基对复合物 N-Glycans大约是2:1。岩藻糖残留物主要附着在 N-glycan核心(35%),只有肝脏〜5% N-glycome表现出Lewis型岩藻糖基化(Fig. 2C, 补充材料S1G)。在两种FFPE和冷冻样品中以相似的量检测相同的甘糖表明,表明抗原检索所需的保存方法和样品制剂不会影响含唾液酸或岩藻糖残基的任何更容易切割的碎片缺口(补充材料S1B. )。
      肝脏 O-glycome由八种不同组成 O - 含有六种组成的糖苷(Fig. 2D, 补充材料S2A)。这些专用于核心1和核心2型,最多两种NeuAc残留物。总之,这些数据证实,FFPE保存过程和抗原检索没有引入可检测的任何定性变化 N- 和O-glycome。

       冷冻和FFPE标本之间存在微妙的定量Glycome差异

      Glyce的定量变化是在任何疾病相关的糖类研究中确定的主要参数。因此,我们测试了冻结和FFPE标本之间的定量Glyco是否相似。检测到 N-Glycans被分为全球结构类别(Fig. 2C)通过无监督的分层聚类分析评估的相对定量分布(Fig. 2A)。这些数据显示主要是水平 N与冷冻组织相比,携带α2,3连接的NeuAC和/或岩藻糖残基的糖醇溶糖(Fig. 2A, 2C)。特别是复杂的唾液酸核岩糖基化 N-glycans( 例如 IDS 30C,33D和35D)在FFPE组织样品中显示出较高的丰富,而α2,6NeuAc携带 N-glycans在冷冻组织中略微升高(Fig. 2A, 2C; 补充材料S1G,S1H)。未经监督的聚类分析还表明了一些白昔尼碱和复合中性类型的冷冻和FFPE组织之间的差异 N然而,-glycans仅对结构5B和25进行了进一步的统计相关差异(Fig. 2A, 2B, 也可以看看 补充图。S1)。这些数据强调,由于组织源已经导致未成年人的组织来源,避免了冷冻和FFPE衍生的起始材料之间的直接比较,尽管有统计相关的Glycome差异,这可能导致差异研究中的假阳性结果。尽管这些没有其他全球趋势,表明特定更容易可裂解或识别的破坏或识别,例如岩藻糖或唾液酸残基。此外,不能检测到非预期的化学修饰,进一步支持FFPE保守标本对Glyco-Biomarker研究的主要可用性。
      还发现了不同样本源之间的一些定量差异 O-glycome。单双唾液酸化芯2型结构1a(十六进制2 赫奈克 2NeuAC)和4B(十六进制2 赫奈克 2 NeuAc. 2)在FFPE样本中更加突出,而结构7的水平(HexhexNacneuac2)和6B(己hexnacneuac)在FFPE样品中较少。含有1%的相对丰度的其他结构未显示任何可检测的定量变化(Fig. 2D)。基于这些结果,我们得出结论,对于疾病签名评估,应避免冷冻和FFPE组织之间的直接比较,因为不同的起始材料明显模仿临床糖类研究中的统计相关签名。

       安装玻璃滑动和h&E染色组织标本为临床提供合适的来源 N- 和O-Glycomics.

      将FFPE组织切片安装到玻璃载玻片上和H.&e组织染色代表每个病理实验室中的标准程序。我们评估了接受这些程序的FFPE组织切片也适用于临床 N- 和O-Glycomics。在安装的FFPE中进行的PGC Nanolc-ESI MS / MS糖型保存的肝组织切片(两者)&E染色和未染色)导致77次检测 N-Glycan和9. O-glycan结构,与未计算的材料获得的结果一致(Fig. 3A3C, 补充材料S3A和S4a)。统计表明未处理和H之间的假素膜型结构的显着差异&E stained slides (Fig. 3B然而,随着这四个结构的量仅占相对强度的2%,次要个体组织截面差异也可能导致检测到的差异。基本上得到的类似结果 N- 和O-Glycans来自H.&E染色和未染色的组织切片表明染色方法不影响甘草完整性和抗原检索(Fig. 3A3C, 补充材料S3A,S3D和S4A,S4D)。这些数据还清楚地证明了糖类信息可以从用于病理检查的相同材料获得。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3肝脏的比较 N- 和O - 从未染色和苏木精和eosin获得的 - 庚(h&e)染色FFPE组织部分。 A,在未经监督的群集后获得的热图 N-glycans,根据 N-Glycan类别。相对的差异 N粒子的聚类分析在H之间的分析表明&E染色和未处理的FFPE部分小于方法论和单独的载玻片特异性差异,如图所示,没有获得清除样品源衍生的聚类。检测到 N-glycan结构由结构ID号表示(有关详细信息,也可以参见 )在热图之上。根据不同的结构类(热图的底部)对热图进行分类,而底部的不同颜色盒提供有关个人的额外结构信息 N-glycans( 例如 NeuAc或岩藻糖连锁,存在分别的GlcNAc)。 B,类别比较肝脏的比较 N - 从未染色的(蓝色)或h获得&E染色(红色)FFPE组织部分。误差条表示从4个技术复制确定的标准偏差。每个类别中的结构数量在酒吧上方表示。星号表示 p 在起始材料之间的统计相关差异(≤0.05(*))获得的值范围。 C,对比较肝脏的 O - 从未染色的(蓝色)或h获得&E染色(红色)FFPE组织部分。误差条表示从5个技术复制的分析确定的标准偏差。

       一千个细胞足以用于组成含量

      LCM提供了独特的可能性,可以选择性地隔离患有随后的糖类研究的感兴趣区域。然而,由于这种方法不可避免的产量只是少量组织,我们评估了仍然获得碱性聚糖简档所需的最小数量。从未染色和h中分离约1000,5000和10,000肝细胞&E染色FFPE用于聚糖剖面的组织切片(Fig. 4A, 4B)。为了保持与上述分析相当,只有仅1/3的样品实际上用于单个PGC纳米-ESI MS / MS分析,尽管是较少量的原料。
      我们成功获得了基础 N- 和O-Glycan配置文件低至1000个细胞(Fig. 4A, 4B, 补充材料S3K,S4G)。检测到的信号强度低于71中的25个 N-glycans符合我们严格的定量标准。基于MS / MS的识别分别在71种结构中的20个(分别为5000和10,000个细胞中的38和50分, 补充材料S3K.),基于在该项目期间获得的保留时间,前体质量和肝脏Glycome数据进行残留。四个中的四个 O-glycans也可以从1000个细胞原料中量化(补充材料S4G)。尽管糖粉型材从低至1000个细胞获得了低至1000个细胞,但该量被认为是可靠的定量临床糖类的不足。特别地,在从1000个细胞开始时不能可靠地定量较低的结构,使得非常困难可靠地检测细微的Glycome变化。使用更高的细胞数(≥2000)提供一般可靠的定量Glycome分析数据(Fig. 4A, 4B)。这些结果鼓励我们进一步追求LCM途径并验证微粉切除以使用肝细胞癌组织部分在原理研究证明中与糖类术语与组织病理学的可用性。

       肝细胞癌的空间洞察力 N- 和O - 使用激光捕获微量键

      将Glycome与显微镜可见的组织特征相关联提供了恰好确定疾病相关的聚糖特征的关键要求。然而,肿瘤组织微异质性代表了组织制剂中的主要障碍,因为含有无言语相关细胞的存在可以掩盖肿瘤特异性糖基化特征(
      • 德格朗蒙特A.
      • 沃森S.
      • 埃里斯黎各。
      • 罗登J.
      • Tabernero J.
      • 德格朗蒙特A.
      • 汉密尔顿S.R.
      癌症靶向疗法的生物标志物评价的语用问题。
      )。 LCM可以帮助克服这种障碍,因为它提供了具体地选择所感兴趣的组织区域,这些障碍也通过经典病理学诊断交叉验证。此外,该技术提供了从非常相同的患者获得对非肿瘤组织部件的机会降低单个糖基化异质性的因子。我们应用了这种技术,以进一步了解HCC的单个糖基化特征。
      N- 和O-glycan型材从LCM方法分离的〜2000个细胞确定(Fig. 5A)。 Nontumor组织的Glyce与上述不同肝脏样品所获得的组织相当(补充材料S10)。在孤立的HCC细胞中观察到显着的全局Glycome变化进行各种 N糖酰亚胺和核心岩藻糖基化型,但也用于杂种以及中性和α2,6唾液酸化 N-glycans(Fig. 5B5D)。虽然高甘露糖型聚糖作为组出现不妨碍,但是单个结构的水平(MAN8,MAN7和MAN6,IDS:8,7a,6b,分别)显着降低,而MAN5(ID:5B)表现出相反的趋势(Fig. 5C , 和 补充材料S5B.)。对于诸如十六进制的假皂碳结构,检测到最引人注目的变化2 赫奈克 2FUC(ID:2)和十六进制3 赫奈克 2FUC(ID:3)和Biantennary,双重α2,6唾液酸化结构(ID:30a, Fig. 5B, 5C )。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5N- 和O - 肝细胞癌(HCC)和非癌症肝组织(NC)的糖。 A,HCC的FFPE保存组织切片的代表性图像用于HCC细胞的空间分离,激光捕获微探针周围的非癌症组织。用于分析的各个区域如图所示标记。 B,概述 N-glycan结构表现出HCC和NC组织之间的最大表达水平的变化,包括它们的结构ID 。星号的数量表示 p 获得的值范围在起始材料之间的统计相关差异(≤0.01(**)或≤0.05(*)之间。 C,在无监督的分层聚类之后获得的热图 N-Glycans从HCC和NC肝组织的约2,000个细胞中检测到,并根据主要结构类别进行分类。检测到 N-glycan结构由结构ID号表示(有关详细信息,也可以参见 )在热图之上。根据不同的结构类(热图的底部)对热图进行分类,而底部的不同颜色盒提供有关个人的额外结构信息 N-glycans( 例如 NeuAc或岩藻糖连锁,存在分别的GlcNAc)。基于这一点 N-glycome,HCC和NC组织簇在不同的类别中。 Paucimannose型和α2,6Neuac携带 N-glycans显示这两个组织类型之间的最高变化。 D,HCC和NC的类别比较 N-glycomes。每个类别中的结构数量在酒吧上方表示。误差栏代表从3个技术复制确定的标准偏差。 E,HCC和NC的比较 O - 从相同的材料获得的糖 N获得了糖。 Sailll Lewis x表位在核心2型上 O-glycans显示HCC组织的显着增加,而核心1型 O-Glycan水平降低。
      O从非常相同的微小肿瘤组织标本获得的凝灰膜显示出携带Lewis X和SiaLyl Lewis x Glyco-epitop的更复杂的核心2结构,其转向较短的核心1型 O - 在非癌症周围细胞中的糖粉(Fig. 5E)。类似的核心2. O预先通过调节免疫反应(以下内容)的肿瘤类型中已经以许多肿瘤类型描述的肿瘤生存和转移(
      • Tsuboi S.
      使用O-聚糖的肿瘤防御系统。
      ,
      • 铃木Y.
      • Sutoh M.
      • 哈克萨达玛斯。
      • Yamamoto H.
      • Koie T.
      • Saitoh H.
      • Yamaya K.
      • Funyuu T.
      • Habuchi T.
      • 阿莱y.
      • 福田M.
      • 俄亥俄州C.
      • Tsuboi S.
      MUC1携带核心2 O-聚糖用作抗NK细胞攻击的分子屏蔽,促进膀胱肿瘤转移。
      )。作为肝脏 O-glycome与此相比明显不那么复杂 N-glycome,将来 O-Glycans在HCC组织分化的背景下可能呈现有用和更简单的替代品。

      讨论

      在原则上,聚糖已经从之前的FFPE组织部分分离出(
      • Gustafsson o.j.
      • Briggs M.T.
      • Condina M.R.
      • Winderbaum L.J.
      • Pelzing M.
      • McColl S.R.
      • everest-dass a.v.
      • 包装机N.H.
      • Hoffmann P.
      福尔马林固定石蜡嵌入鼠肾脏对N-连接聚糖的MALDI成像质谱。
      ,
      • DWEK M.V.
      • 布鲁克斯S.A.
      • 街道A.J.
      • 哈维D.J.
      • LeaThem A.J.
      从冷冻和石蜡嵌入的档案组织中释放寡糖。
      ,
      • Satomaa T.
      • Heiskanen A.
      • Leonardsson I.
      • Angstrom J.
      • olonen a。
      • Blomqvist M.
      • Salovuori N.
      • Haglund C.
      • Teneberg S.
      • Natunen J.
      • Carpen O.
      • Saarinen J.
      人癌糖的分析鉴定了一种新型肿瘤相关的N-乙酰葡糖胺甘油抗原。
      )。尽管我们早期的报告,但我们无法找到满意的答案对许多至关重要的问题。 (1)是在保存和抗原 - 检索程序期间定量和定性保存的所有甘油表位吗? (2)获得代表性Glycome所需的最低样品金额是多少? (3)糖果诚信和恢复仍然在h之后仍然给出&E staining?
      为了解决这些问题,我们开发并应用了新的PGC Nanolc-ESI MS / MS族族族族方法,用于定性和相对定量 N- 和O-Glycomics.临床FFPE组织段甚至富含LCM的组织标本。我们的结果表明未存在或h&E染色的FFPE组织部分代表临床糖类的良好来源。在我们分析的原则实验证明中 N- 和O来自肝脏肿瘤的糖粉,周围的无组织组织衍生自相同的组织截面和患者。使用激光捕获微散菌患者衍生的个体Glycome变化,结果为特定和单独的癌症组织族签名提供了更精确的视图,因为肿瘤和对照样品也来自空间接近的区域。这种方法允许对肝的深度表征 N- 和O - 来自单组织标本的凝聚,包括结构异构体的分化和相对定量(Fig. 6 )。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6使用多孔石墨化碳纳米LC-ESI MS / MS的结构识别示例。 A,基峰色谱图(BPC,红色迹线)代表 N-glycome从FFPE保存的肝组织获得。提取的离子色谱图(EIC,黑色迹线)示例 N-Glycan(Hex.5 赫奈克 4Neuacfuc,[M-2H]2− = 1038.9Da)存在于五种不同的结构异构体中。 B,五十六角的个体产品离子光谱5 赫奈克 4Neuacfuc异构体能够实现各种差异和相对定量 N-Glycan异构体。
      我们的结果清楚地强调,类似组织标本治疗对于甘蓝生物标志物研究势在必行。当与FFPE衍生的轮廓进行比较冷冻原料的Glycome时,虽然检测到显着差异。不可避免地,不同的起始条件需要不同的初始组织均质化和蛋白质提取程序。因此,大多数可能的特异性蛋白质损失和/或不溶于其中一种方法,随后导致缺乏特定的糖蛋白。与冷冻材料相比,FFPE部分也衍生自空间较窄的组织级分,因此差动的空间聚糖分布如先前通过MALDI成像实验(
      • Gustafsson o.j.
      • Briggs M.T.
      • Condina M.R.
      • Winderbaum L.J.
      • Pelzing M.
      • McColl S.R.
      • everest-dass a.v.
      • 包装机N.H.
      • Hoffmann P.
      福尔马林固定石蜡嵌入鼠肾脏对N-连接聚糖的MALDI成像质谱。
      ,
      • 权力T.W.
      • 霍尔特S.
      • Wuhrer M.
      • Mehta A.S.
      • 德雷克鲁克。
      马尔迪 - 成像质谱法的二维N-聚糖分布映射肝细胞癌组织。
      )也可能有助于观察到的定量变化。然而,在初始方法开发中,组合了几个较大的组织切片,使空间分布差异不太可能选择观察到的差异。
      Turiak. 等等。 还报告了数量和相对丰富的差异 N从冷冻和FFPE鼠肝组织中释放的糖粉(13 相对 14 compositions) (
      • Turiak. L.
      • 邵C.
      • 孟尔。
      • Khatri K.
      • Leymarie N.
      • 王Q.
      • Pantazopoulos H.
      • 莱昂D.R.
      • Zaia J.
      组合组织组合蛋白质组学和糖录谱的工​​作流程。
      )。在他们有趣的集成OMIC方法中,它们识别蛋白质和型糖胺聚糖和 N来自同一FFPE幻灯片的糖蜜。尽管如此,在他们的工作流程可靠的检测和定量释放 N-glycans需要六个顺序部分(10μm厚,~2 mm2 大小)要结合,而我们一直识别63 N-Glycans和7. O-Glycans来自5000个细胞。
      与最近的相比 N-Glycan Maldi-MAGAGAGAGAGE研究HCC,包括两名患者,仅为报告的33分之一 N-glycans与我们的结果重叠重叠(
      • 权力T.W.
      • 霍尔特S.
      • Wuhrer M.
      • Mehta A.S.
      • 德雷克鲁克。
      马尔迪 - 成像质谱法的二维N-聚糖分布映射肝细胞癌组织。
      )。虽然在我们的数据中保险箱 N-glycans特别表现出最大的差异(Fig. 5B5D),权力 等等。 (
      • 权力T.W.
      • 霍尔特S.
      • Wuhrer M.
      • Mehta A.S.
      • 德雷克鲁克。
      马尔迪 - 成像质谱法的二维N-聚糖分布映射肝细胞癌组织。
      )报告了高甘露糖类型和选定复合物的最大差异,无非 N-Glycans。因为 m/z 在他们的研究中使用的截止,假期皂炎 N-glycans挑选了他们的检测。然而,观察到的差异也可能反映各个患者的变异性。这种因素对这种临床糖类研究的不可避免的影响进一步支持了权力的事实 等等。 据报道,在早期的一些高甘露糖结构的矛盾结果,在16名患者中进行了类似的研究(
      • 权力T.W.
      • neely b.a.
      • 邵y
      • 唐H.
      • 特洛伊D.A.
      • Mehta A.S.
      • Haab B.B.
      • 德雷克鲁克。
      福尔马林固定石蜡嵌入临床组织块和组织微阵列中N-聚糖的马尔迪成像质谱分析。
      )。虽然HCC组织中的MAN8减少是由本工作中提出的数据支持的,并且由来自权力的两个独立报告支持 等等。 (
      • 权力T.W.
      • neely b.a.
      • 邵y
      • 唐H.
      • 特洛伊D.A.
      • Mehta A.S.
      • Haab B.B.
      • 德雷克鲁克。
      福尔马林固定石蜡嵌入临床组织块和组织微阵列中N-聚糖的马尔迪成像质谱分析。
      )和聂 等等。 (
      • 聂h.
      • 刘X.
      • 张Y.
      • 李T.
      • 詹C.
      • 霍W.
      • 他A.
      • 姚y。
      • jin y。
      • qu y.
      • 太阳X.L.
      • 李Y.
      肝细胞癌细胞表面的特异性N-聚糖和核 - α-1,6-岩石化三酰胺的异常增加通过N-乙酰葡糖氨基氨基氨基转移酶-IVA调节。
      ),来自权力和同事的后续研究报告了HCC组织中MAN8的增加(
      • 权力T.W.
      • 霍尔特S.
      • Wuhrer M.
      • Mehta A.S.
      • 德雷克鲁克。
      马尔迪 - 成像质谱法的二维N-聚糖分布映射肝细胞癌组织。
      )。该示例清楚地表明,未来的生物标志物的研究需要大型样品群和正交方法,以区分各个患者聚糖的异质性来自可能的方法伪影和真实癌症签名。鉴定聚糖签名是至关重要的,潜在的是支持组织病理学以及未来的个性化癌症诊断或治疗(
      • Almeida A.
      • Kolarich D.
      个性化药物蛋白质糖基化的承诺。
      )。
      这里呈现肝脏 O-Glyce展示了低结构多样性。迄今为止,肝脏组织上可以获得很少的数据 O-Glycome,我们的结果与函数算法联盟提供的数据同意,这些数据也报告了类似的低位 O - 甘油结构多样性人肝(见人类组织的聚糖结构数据库: www.functionalglycomics.org. )。
      这里呈现的方法通常适用于任何组织类型,并开启研究蛋白质的新机会 N- 和O - 直接从与MALDI成像技术正交的组织病理学检查的组织标本直接来自组织病理学检查的组织标本的糖基化。此外,我们的结果将FFPE组织的潜力解锁为未来临床甘氨酸生物标志物研究的有价值且易于访问的来源。

      致谢

      我们感谢Ursula Neu博士进行了富有成效的稿件讨论。

      补充材料

      参考

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