健康新生儿,儿童和成人中的血浆蛋白的定量年龄特异性变异性*

  • Stefan Bjelosevic.
    隶属关系
    从梅尔丁儿童研究所,墨尔本,VIC 3052,澳大利亚血液学研究实验室;

    墨尔本墨尔本大学,澳大利亚维克3010年,墨尔本大学儿节省;
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  • Dana Pascovici.
    隶属关系
    澳大利亚蛋白质组分析设施,麦格理大学,悉尼,南威尔州2113,澳大利亚
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  • 慧平
    隶属关系
    从梅尔丁儿童研究所,墨尔本,VIC 3052,澳大利亚血液学研究实验室;

    墨尔本墨尔本大学,澳大利亚维克3010年,墨尔本大学儿节省;
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  • Vasiliki Karlaftis.
    隶属关系
    从梅尔丁儿童研究所,墨尔本,VIC 3052,澳大利亚血液学研究实验室;
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  • 蒂里Zaw.
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    澳大利亚蛋白质组分析设施,麦格理大学,悉尼,南威尔州2113,澳大利亚
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  • 小民歌
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    澳大利亚蛋白质组分析设施,麦格理大学,悉尼,南威尔州2113,澳大利亚
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  • Mark P. Molloy.
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    澳大利亚蛋白质组分析设施,麦格理大学,悉尼,南威尔州2113,澳大利亚
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  • 保罗蒙格勒
    隶属关系
    从梅尔丁儿童研究所,墨尔本,VIC 3052,澳大利亚血液学研究实验室;

    墨尔本墨尔本大学,澳大利亚维克3010年,墨尔本大学儿节省;
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  • Vera Ignjatovic.
    一致
    应解决对应的通信:血液学研究实验室,默多克儿童研究院,墨尔本大学儿科系,电话.:+61 3 9936 6520;传真:+61 3 9348 1391;
    隶属关系
    从梅尔丁儿童研究所,墨尔本,VIC 3052,澳大利亚血液学研究实验室;

    墨尔本墨尔本大学,澳大利亚维克3010年,墨尔本大学儿节省;
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  • 作者脚注
    *本研究得到维多利亚州政府的业务基础设施支持计划的支持。本研究得到了BioPlatforms Australia Ltd的支持,并通过访问澳大利亚政府国家合作研究基础设施计划的澳大利亚蛋白质组分析设施促进。
    本文含有补充材料。
      人血浆是含有可溶性蛋白质,糖,激素,电解质和溶解气体的复杂生物流体。随着等离子体与各种体系相互作用,蛋白质表达的变化或特定蛋白质的存在或不存在在临床中定期使用作为分子生物标志物工具。存在细节病理背景下的蛋白质组学变化的大体内文献,然而已经对年龄特异性,健康受试者的血浆蛋白质组的定量进行了很少的研究,特别是在儿科中。在这项研究中,我们利用SWATH-MS来鉴定和量化健康新生儿血浆中的蛋白质,1 - 5岁以下儿童和成年人。我们鉴定了100多种蛋白质,在这些年龄组中显示出显着的差异表达水平,并且我们分析了跨年龄谱的蛋白质表达的变化。新生儿的血浆蛋白质组学谱与年龄较大的儿童和成人毫不含糊。通过针对大型人类光谱库提取SWATH数据,我们增加了蛋白质鉴定超过6倍(940蛋白),并确认了使用ELISA的几种浓度。该研究的结果地图蛋白质和途径表达的变化通常涉及疾病,因此具有显着的临床意义。
      人血浆是一种复杂但理想的生物系统,其含有来自各种细胞型的蛋白质。由于这种等离子体是临床环境中最好的报道系统之一,因为它与身体大部分部位沟通并反映了整个生物体状态的变化。与血清不同,血清脱毛凝血蛋白,其不仅在凝结中起作用而且在炎症等过程中,人血浆含有血液中发现的所有可溶性蛋白质。因此,人血浆是用于生物标志物发现的常用样品。
      利用人血浆的蛋白质组学研究迄今为止,主要涉及特定的疾病环境,以检测最高数量的蛋白质或某些药物对血浆蛋白表达的变化的影响。此外,大多数此类研究都集中在成年人身上,研究数量有限,因此有限了解婴儿和儿童血浆蛋白质组。儿童的血浆蛋白质组学研究侧重于检查心肺旁路手术期间发生的蛋白质表达的变化(
      • 平静的m.e.
      • 弗里曼下午
      • 迈尔斯J.L.
      • 中间F.
      • 生理学生。
      • 凌乱A.
      • vraana K.E.
      血浆蛋白质组学:病理学和儿科心脏手术的非侵入性窗口。
      ),以及几种疾病状态,包括:血液疾病(
      • Michiels J.J.
      • 布伦曼Z.
      • Gadisseur A.
      • van der Planken M.
      • 施罗扬省W.
      • Van de Velde A.
      • 范·vlieth。
      寄生术2A,2B,2C,2D,2E,2M,2N和2U(未分配)von Wilebrand疾病的分类和表征。
      ), 镰状细胞性贫血症 (
      • Kakhniashvili D.G.
      • Giko N.B.
      • Bulla Jr.,L.A.
      • 古德曼S.R.
      镰状细胞疾病的蛋白质组学:2D-Dige和串联质谱法通过2D-DIGEDTE膜蛋白的分析。
      ), 白血病 (
      • yocum a.k.
      • 母布线
      • 菲利克斯C.A.
      基于蛋白质组学的策略,用于鉴定白血病的生物标志物和具有T(4; 11)易位的白血病药物靶标。
      )和囊性纤维化(
      • Roxo-Rosa M.
      • 达福斯塔G.
      • Luider T.M.
      来自囊性纤维化患者的鼻细胞和非狭窄纤维化控制的蛋白质组学分析:寻找囊性纤维化肺病的新型生物标志物。
      )。迄今为止,只有一项研究专注于通过检查年龄发生的血浆蛋白表达的变化,从新生儿到成年人(
      • Ignjatovic V.
      • 赖C.
      • 夏天r.
      • Mathesius U.
      • Tawfilis S.
      • Perugini M.A.
      • 蒙格尔P.
      血浆蛋白的年龄相关差异:血浆蛋白质如何从新生儿转变为成人。
      )。该研究利用凝胶电泳(2D-Dige)方法的二维差异,并通过鉴定高达100个蛋白斑点的表达的显着年龄的特异性变化,描述了人血浆蛋白质的老化概念。
      人类蛋白质组织(HUPO)
      使用的缩写是:ELISA,酶联免疫吸附测定; 2D-DIGE,二维差异凝胶电泳; HUPO,人类蛋白质组织; PEDIOME,儿科蛋白质组学; DIA,数据独立采集; TOFMS,飞行时间质谱; ANOVA,方差分析; GPLD1,GPI特异性磷脂酶D; PELTN,PERIOSTIN; A2M,α-2-癌胶蛋白; HRG,组氨酸富含糖蛋白; IDA,信息依赖性采集; PCA,主成分分析; HBG1,血红蛋白亚单位伽马1; HBG2,血红蛋白亚单位γ-2; CO1A1,胶原醛α-1(i)链; IGHA1,IGα-1链C区域; IGA2,IGα-2链C区域; HBF,胎儿血红蛋白; HGA,成人血红蛋白; Tcerc1,转录伸长率调节器1; ECHA,三官能酶亚基α; LC-MS,液相色谱质谱。
      1使用的缩写是:ELISA,酶联免疫吸附测定; 2D-DIGE,二维差异凝胶电泳; HUPO,人类蛋白质组织; PEDIOME,儿科蛋白质组学; DIA,数据独立采集; TOFMS,飞行时间质谱; ANOVA,方差分析; GPLD1,GPI特异性磷脂酶D; PELTN,PERIOSTIN; A2M,α-2-癌胶蛋白; HRG,组氨酸富含糖蛋白; IDA,信息依赖性采集; PCA,主成分分析; HBG1,血红蛋白亚单位伽马1; HBG2,血红蛋白亚单位γ-2; CO1A1,胶原醛α-1(i)链; IGHA1,IGα-1链C区域; IGA2,IGα-2链C区域; HBF,胎儿血红蛋白; HGA,成人血红蛋白; Tcerc1,转录伸长率调节器1; ECHA,三官能酶亚基α; LC-MS,液相色谱质谱。
      等离子体蛋白质组项目(PPP)通过将其确定为他们的科学目标和研究优先事项之一,认识到分析和理解年龄相关差异的重要性(
      )。此外,最近成立的儿科蛋白质组学(PEDIOME)倡议的主要目的是HUPO的一部分,是推进蛋白质组学技术的使用,通过在各种组织中表征小儿蛋白质的特征来解决儿科医学的主要问题和生物样品。
      2012年,已知为SWATH-MS的新蛋白质组学方法(
      • Gillet L.C.
      • Navarro P.
      • 塔特S.
      • 罗斯特H.
      • selevsek n。
      • 重新勒
      • Bonner R.
      • Aeberberold R.
      由数据独立获取产生的MS / MS光谱的有针对性的数据提取:一致和准确的蛋白质组分析的新概念。
      )。这种高吞吐量,数据独立采集(DIA)方法允许在大型样品组上自信地识别和定量Query肽,其动态范围为4个数量级,并且如此适合于对人血浆的研究。 SWATH-MS的特定优势是重新挖掘先前获取的数据集的能力。作为一种新兴技术,迄今为止只有少数研究已经利用了人类血浆的调查的SWATH-MS(
      • 刘Y.
      • Huttenhain R.
      • 苏里诺瓦S.
      • Gillet L.C.
      • mouritsen J.
      • 布鲁纳尔R.
      • Navarro P.
      • Aeberberold R.
      Swath-Ms.对人血浆中N-连接糖蛋白的定量测量。
      ,
      • 刘Y.
      • Buil A.
      • 柯林斯B.C.
      • Gillet L.C.
      • BLUM L.C.
      • 郑;
      • Vitek O.
      • mouritsen J.
      • 加法扬G.
      • 卫星T.D.
      • Dermitzakis e.t.
      • Aeberberold R.
      342例血浆蛋白在人双胞胎腺中的定量变异性。
      )。第一项研究调查了SWATH-MS进行量化的性能和适用性 N - 在人血浆中链接糖蛋白,并提出这种组合方法适用于生物标志物发现和验证(
      • 刘Y.
      • Huttenhain R.
      • 苏里诺瓦S.
      • Gillet L.C.
      • mouritsen J.
      • 布鲁纳尔R.
      • Navarro P.
      • Aeberberold R.
      Swath-Ms.对人血浆中N-连接糖蛋白的定量测量。
      )。第二项研究利用SWATH-MS来量化单卵和致电双胞胎血浆蛋白质组中的变异性,展示了双胞胎之间的蛋白质丰富的大变异性(
      • 刘Y.
      • Buil A.
      • 柯林斯B.C.
      • Gillet L.C.
      • BLUM L.C.
      • 郑;
      • Vitek O.
      • mouritsen J.
      • 加法扬G.
      • 卫星T.D.
      • Dermitzakis e.t.
      • Aeberberold R.
      342例血浆蛋白在人双胞胎腺中的定量变异性。
      )。
      在新生儿和儿科等离子体样本中使用SWATH-MS技术以确定变异性和随后与成年等离子体的比较仍然是一个令人兴奋的研究机会,并且迄今为止没有探索。因此,本研究旨在利用SWATH-MS来定量健康新生儿,儿童和成人中血浆蛋白的年龄特异性变异性。

      实验步骤

       参与者招聘,样品收集和存储

      根据已建立的方案收集和处理本研究中使用的血液样品(
      • Ignjatovic V.
      • 赖C.
      • 夏天r.
      • Mathesius U.
      • Tawfilis S.
      • Perugini M.A.
      • 蒙格尔P.
      血浆蛋白的年龄相关差异:血浆蛋白质如何从新生儿转变为成人。
      ,
      • 蒙格尔P.
      • Barnes C.
      • Ignjatovic V.
      • Furmedge J.
      • 纽瓦尔F.
      • 陈A.
      • 德罗莎L.
      • 汉密尔顿S.
      • ragg p.
      • 罗宾逊S.
      • Auldist A.
      • 缸C.
      • 罗伊N.
      • 罗兰斯州S.
      发育性肿瘤:对临床肝脏实验室的影响。
      ,
      • Ignjatovic V.
      • Straka E.
      • 夏天r.
      • 蒙格尔P.
      肝素与血浆蛋白结合的年龄特异性差异。
      ,
      • Ignjatovic V.
      • 夏天r.
      • 纽瓦尔F.
      • 蒙格尔P.
      对低分子量肝素的体外反应不是依赖于儿童的年龄。
      ,
      • C.
      • van der Straaten T.
      • karlaftis五。
      • 蒙格尔P.
      • Ignjatovic V.
      发育肿胀:止血蛋白的年龄特异性差异。
      ,
      • C.
      • Kubitza D.
      • 蒙格尔P.
      • Ignjatovic V.
      体外 Rivaroxaban在新生儿中的抗凝血作用。
      )。新生儿样品(72小时内)从家庭分娩单位或墨尔本皇家妇女医院的家庭分娩单位或产后病房中收集来自健康术语新生儿。资格标准包括:妊娠>37周,阴道分娩,出生体重>2500gm,Apgar5min≥7,没有系统异常。儿科样本是从出席医院进行小型选修日外科医院的健康儿童获得的儿科样本(例如 舌苔释放和割礼释放和割礼释放和割礼释放和包皮环切术没有重大疾病的重要家族史,特别是已知与老龄化的过程有关的疾病(例如 糖尿病和心血管疾病)。儿科队列排除了服用口服避孕药和吸烟者的青少年。成年样品是从20至45岁之间的健康志愿者获得,他没有服用任何药物(包括口服避孕药),并不是吸烟者,而且同样,没有过去的病史。通过简要访谈儿童和成人志愿者自己的父母来评估家庭历史。在S-MONOVette®管(SARSTEDT,澳大利亚)中收集血液样品,每9体积血液含有1体积的柠檬酸盐,并以3000rpm,10分钟离心,10分钟°C,等离子体储存在-80°C,直到测试。
      本研究经皇家儿童医院道德在人类研究委员会批准,参考号20031年;和皇家女性医院人类研究伦理委员会(#02/08)。书面知情同意书是从儿童父母和成人参与者自己获得的。

       血浆样品制备

      将25μl人血浆样品在475μl50米中稀释m 碳酸氢铵(Sigma,St.LOUIS,MO)溶液。用5米降低样品m 在65℃下的二硫代噻唑(Bio-rad,Hercules,Ca)30分钟,然后用10米烷基化m 碘乙酰胺(Sigma)在室温下在黑暗中30分钟。在37℃下用序列级猪胰蛋白酶(20μg,promega)消化了一五分之一的还原和烷基化样品(121μl)过夜。在所有质谱分析之前,将消化的样品在0.1%甲酸中稀释(×10.5)。

       信息依赖性采集质谱

      用于IDA和SWATH-MS分析,采用5600个三重型质谱仪(SCIEX,FRAMINGHAM,MA)与EKSIGENT Ultra-Nanolc-1d系统(ECSIGENT Technologies,Dublin,CA)采用。对于IDA数据,汇集了来自每组的10μl消化的样品,制作四个群组(新生儿,<注射了每组1年,1-5岁,成人)和5μL。
      将肽加载到反相肽C18胶囊(Bruker,Billerica,MA)上,用于预浓缩,加载缓冲液(0.1%(v / v)甲酸,2%(v / v)乙腈)进行5分钟。以每分钟10μl的流速。脱盐后,用内部填充分析柱(150μm×10cm,固体核心卤素C18,160埃,2.7μm(Bruker)在线切换肽疏水阀。使用缓冲液B(99.9%(v / v)乙腈,0.1%(v)甲酸)梯度从柱子中洗脱并与柱分离,从2%开始,10分钟增加到10%,然后达到35% 78分钟以每分钟500nl的流速。肽洗脱后,用95%缓冲液B冲洗柱15分钟,然后用98%缓冲液A(0.1%(v / v)甲酸)在下一次注射之前再平衡15分钟。空白在样品之间运行。在IDA模式下,获得了TOFMS调查扫描 m/z 350-1500,累积时间为0.25秒,具有十个最强烈的前体离子(2+–5+;算>150)在调查扫描中,连续分离出后续产品离子扫描。动态排除与20岁的窗口一起使用。产物离子光谱在质量范围内累积50毫秒 m/z 100-1500滚动碰撞能量。

       IDA数据分析

      使用Paragon算法使用蛋白质单嘴(V4.2,SCIEX)进行IDA数据的蛋白质鉴定。搜索参数如下:样本类型:识别; cys烷基化:碘乙酰胺;消化:胰蛋白酶;仪器:Tripletof 5600;特殊因素:无; ID专注:生物修改;错过 - 乳沟:二。这 HOMO SAPIENS. 搜索数据库是从UNIPROT获得的(20,265条参赛作品,2015年1月)。逆转诱饵数据库搜索策略与蛋白质单滴一起使用,计算出的蛋白质FDR等于0.68%。

       SWATH图书馆建设

      来自4个样本组的IDA搜索结果的蛋白单靶文件被导入PeakView(v2.1)(sciex)并用作局部肽测定库。该文库含有从未耗尽的血浆样品鉴定的151个蛋白质。使用SwathxTend脚本构建延长的肽测定库(
      • 吴j.x.
      • 歌曲X.
      • Pascovici D.
      • Zaw T.
      • 护理
      • Krisp C.
      • Molloy M.P.
      使用延长肽MS / MS测定文库的SWATH质谱性能。
      ),将局部肽测定文库合并为10,000名蛋白质人(
      • Rosenberger G.
      • Koh C.C.
      • 郭t.
      • rost h.l.
      • Kouvonen P.
      • 柯林斯B.C.
      • 赫苏尔米
      • 刘Y.
      • 克隆e.
      • vichakevski A.
      • Faini M.
      • Schubert O.T.
      • 法里岛P.
      • EBHARDT H.A.
      • Matondo M.
      • 林H.
      • 糟糕的S.L.
      • 坎贝尔D.S.
      • 德意曲e.w.
      • 莫里茨R.L.
      • 塔特S.
      • Aeberberold R.
      通过SWATH-MS量化10,000个人蛋白的测定储存库。
      )从Swathatlas下载的光谱库。

       Swath-Ms.

      对于SWATH-MS实验,将5μL每种消化样品注入样品顺序,每次注射有两种技术复制;一式一倍于串联末端的一次和两次样本运行一次,以检查潜在的仪器漂移,详见补充信息。如上所述使用相同的LC条件,利用基于前一个IDA数据中的前体M / Z频率确定的M / Z窗口尺寸。 SWATH可变窗口采集,带有一组60个重叠窗口(窗口重叠的1 AMU),覆盖M / Z 399.5 - 1249.5的质量范围。在SWATH模式下,获得了TOFMS调查扫描(m/z 然后,依次进行MS / MS分析的650-1500,0.05秒,然后依次进行60个预定义的M / Z范围。产物离子光谱在质量范围内累积50毫秒 m/z 350-1500滚动碰撞能量优化为低于M / Z窗口+ 10%,具有3.7秒的总占空比。

       SWATH数据分析

      使用PeakView(v.2.1)提取条子峰。排除共享和改性肽。峰提取参数设定为以下:每种蛋白质100个肽,每种肽6过渡离子,肽置信阈值99%,FDR提取阈值1%,XIC(提取离子色谱图)保留时间窗口10分钟和质量耐受75ppm。萃取的过渡离子峰面积,肽峰面积和蛋白质峰面积在Excel中出口进一步统计分析。

       实验设计与统计理由

      为四个年龄群组中的每一个的10个独立的生物样品获得定量MS数据。在SWATH采集中获得每个生物样品的两种技术复制。将肽离子峰面积平均用于复制技术注射,然后进一步缩放,使得每个样品的离子强度之和等于最大总离子强度。为每种肽和蛋白质求和归一化离子强度。使用分层聚类(欧几里德距离和完整的链接)聚集整个蛋白质水平数据,并使用主成分分析可视化以检查全局趋势。使用BOLKPLOTS和密度图(补充信息:数据质量)在视觉上检查数据分布。
      进行两种方法以确定差异表达:对数转化的归一化蛋白峰面积的差异分析,以及对样品对的成对比较。对于方差分析,认为如果ANOVA,则认为蛋白质被视为差异表达 p 值小于0.05,最大蛋白质折叠变化超过1.5。我们评估了调整ANOVA p 使用Benjamini和Hochberg的FDR标准进行多次测试的值,但不调整的组合 p 利用折叠变化阈值的值,因为它在这种情况下表示更严格的要求。
      对于成对比较,首先通过两个样本的学生比较来自所有选定的条件对的样本 t 对数转化的蛋白质区域进行试验,其次是通过组合每个蛋白质的单个肽水平比。报告阈值需要学生 t 测试 p 值小于0.05并折叠变化超过1.5。
      对于ELISA测试,我们使用了用于SWATH分析的相同40个独立的生物样本,以及每个年龄组的10个额外的个体。两个样本的学生 t 应用测试以检测组之间的显着差异。

       途径分析

      使用具有NeoNates的丰富与成人的丰富率作为特色观察,以及使用默认设置,在生物数据的背景下检查差异表达的蛋白质。标记和描述了前五种最富集的途径,功能和疾病以及前三个网络。

       酶联免疫吸附试验(ELISA)验证

      根据制造商的规格,我们利用以下ELISA试剂盒:GPI特异性磷脂酶D(GPLD1); (CSB-EL009721U,Cusabio,武汉,中国),Periostin(Postn)(CSB-E16444H,Cusabio,武汉,中国),α-2-宏醛蛋白(A2M)(AB108888,ABCAM,剑桥,英国),组氨酸富含糖蛋白(HRG)(CSB-E13159H,Cusabio,武汉,中国)。

      结果

       样本特征

      Swath-MS分析由以下每种年龄组的10个单独样品进行:新生儿(5F / 5M,出生后72小时内),<1岁(3F / 7M,中位数7.7个月,6个月至11个月),1-5岁(5F / 5M,中位数3.12岁,1.59至4.39岁)和成人(5F / 5M,中位数)年龄31.40岁,范围为22.02至44.97岁)。

       Swath-Ms.

      我们使用来自样品群和IDA的非料等血浆样品,以建立含有146个蛋白质的局部肽测定文库。得到40个单独样品的SWATH获取,然后与局部测定文库匹配以定量肽区域(补充表S1)。

       对成年人的新生儿的年龄频谱的总体差异

      使用146蛋白的SWATH定量的40个等离子体样品的分层聚类显示出对应于实验性年龄组的良好分离的簇。有趣的是,这种分析清楚地表明,新生儿的血浆蛋白水平与三个剩余的年龄群体中的血浆蛋白质水平与成人和一到五年彼此聚集(Fig. 1)。这些趋势通过主成分分析证实,显示了基于年龄的清晰隔离,与所有其他年龄组相比单独进行新生儿聚类。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1A,使用本地测定库的146蛋白质鉴定的无监督分层分析。 使用欧几里德距离获得的相对表达模式。绿色 - 表达减少的蛋白质;红色 - 蛋白质增加了表达增加。 B,主要成分分析数据来自 A。显示了PC1和PC2的前10个最高负载。 C,使用延长的测定库的940蛋白的无监督分层聚类。
      鉴于样品与未经监督分析(聚类和PCA)的强烈分离,毫不奇怪地发现基于对方差(ANOVA)的分析来差异表达的大百分比百分比。发现总共有107个蛋白质有Anova p 价值 <0.05和最大折叠变化(最高平均值与最低平均值的比率)至少为1.5(表I.)。与使用Benjamini和Hochberg调整的121个蛋白质相比,这是一种更严格的方法 p 值小于0.05(数据未显示)。对于载脂蛋白-M而言,观察到1.51的最小折叠变化,对于血红蛋白亚基γ-2的变化高达300倍,在新生糖酸盐中显着升高。具体地,存在86(80%)蛋白质,最大折叠变化在1.5和5之间; 11(10%)蛋白质,最大折叠变化5-10倍; 6(6%)蛋白质,最大倍数在10-至50倍和4(4%)蛋白之间的变化,最大倍数变化>50-fold.
      表I.Anova分析显示,跨年龄谱的蛋白质表达的变化(给成年人的新生儿)。结果表达为蛋白质表达的平均变化
      Uniprot加入蛋白质意思是新生儿吝啬的-<1 y.o.平均值-1-5 Y.O.吝啬的-adult折叠变化ANOVA调整了 p value蛋白质名称
      O95445apom_human.1.53E + 06.2.20E + 06.1.89E + 061.45E + 06.1.513.21E-03.载脂蛋白M.
      P01008ant3_human.6.58E + 06.9.94E + 069.63E + 067.91E + 06.1.511.73E-08.抗凝血酶-III
      P08603cfah_human.1.25e + 071.46E + 071.88E + 071.48E + 07.1.511.26E-05.补体因子H.
      P02675FIBB_HUMAN.1.61E + 081.06E + 08.1.39E + 081.24E + 081.512.86E-05.纤维蛋白肽B.
      P05156cfai_human.3.05E + 05.3.33E + 05.4.66E + 053.54E + 051.531.09E-05.补充因子I.
      P02671FIBA_HUMAN.1.43E + 089.35E + 071.30E + 081.22E + 081.548.05E-07.纤维蛋白原α链条
      P05543thbg_human.9.95E + 059.78E + 051.05E + 06.6.80e + 05.1.551.39E-02.甲状腺素结合球蛋白
      P0C0L5CO4B_HUMAN.8.41E + 056.76E + 051.05E + 06.8.66E + 051.554.51E-02.补体C4-Bα链
      P02679菲布_human.1.23E + 087.93E + 07.1.10E + 081.00E + 081.567.00E-07.纤维蛋白原伽马链
      P04004vtnc_human.8.32E + 06.1.07E + 071.30E + 07.1.09e + 071.575.54E-04.Vitronectin v10亚基
      P06331HV209_human.9.09E + 051.44E + 061.32E + 06.9.62E + 05.1.591.19E-03.IG重链V-II区ARH-77
      P18136kv313_human.1.21E + 078.66E + 061.20E + 071.37E + 07.1.598.99E-04.Ig Kappa链V-III区HIC
      P08697A2AP_HUMAN.4.26E + 065.03E + 06.4.64E + 06.3.13e + 06.1.608.34E-04.α-2-抗蛋白
      O75636fcn3_human.3.01e + 05.4.17E + 05.4.11e + 052.57E + 051.625.03E-04.Ficolin-3.
      P05090Apod_human.2.93E + 06.2.67E + 062.84E + 06.4.35E + 061.631.37E-03.载脂蛋白D.
      P05452tetn_human.2.67E + 053.39E + 054.35E + 052.89E + 051.638.46E-06.四菌菌素
      P01031Co5_human.3.57E + 06.2.17E + 06.2.88E + 06.2.78E + 06.1.641.70E-06.补体C5 beta链
      P36955Pedf_human.1.08E + 06.8.38E + 051.31E + 06.1.38E + 06.1.665.48E-03.颜料上皮衍生因子
      P00734thrb_human.8.60e + 061.32E + 071.43E + 071.15E + 071.666.11e-05.活化肽片段1
      P04433kv309_human.3.27E + 06.2.18E + 06.3.51E + 06.3.68E + 06.1.691.97E-03.IG Kappa链V-III区VG
      P02652apoa2_human.1.13e + 071.92E + 07.1.55E + 07.1.81E + 07.1.693.72E-09.proapolipoprotein a-ii
      P01042kng1_human.4.99E + 06.8.05E + 068.44E + 06.7.33E + 061.691.96E-06.T-Kinin.
      P22792cpn2_human.7.20E + 058.92E + 051.24E + 06.7.56E + 051.732.11e-06.羧肽酶N亚基2
      P06727apoa4_human.1.05E + 07.1.83E + 07.1.44E + 07.1.09e + 071.743.53E-03.载脂蛋白A-IV
      Q14624ITIH4_human.1.26E + 071.64E + 07.2.20E + 07.1.77E + 071.741.99E-07.35 KDA间α-胰蛋白酶抑制剂重链H4
      P02751Finc_human.1.63E + 07.2.27E + 072.84E + 072.32E + 07.1.741.32E-05.anactellin.
      P04208lv106_human.1.82E + 06.1.04E + 06.1.67E + 06.1.70E + 06.1.743.82E-04.Ig Lambda Chain V-I Region Wah
      P00747plmn_human.7.07E + 06.1.04E + 07.1.24E + 071.16E + 071.751.20E-07.血浆重链A,短型
      P10643Co7_human.1.02E + 06.8.59E + 059.18E + 05.5.74E + 05.1.781.61E-05.补充组件C7
      P13671CO6_human.8.29e + 051.11e + 06.1.49E + 06.8.71E + 051.804.73E-07.补充组件C6.
      P00751cfab_human.1.10E + 071.37E + 07.2.00E + 07.1.46E + 071.811.38E-06.补体因子b bb片段
      P10909clus_human.7.90E + 061.15E + 071.45E + 07.1.29E + 07.1.834.09E-11.Clusterin Alpha链条
      P01611kv119_human.5.58E + 053.00E + 05.3.13e + 054.90E + 051.852.49E-05.IG Kappa Chain V-I地区WES
      P05155IC1_human.1.12E + 071.84E + 072.13E + 071.33E + 071.886.91E-08.血浆蛋白酶C1抑制剂
      P04207kv308_human.1.20E + 06.8.12e + 051.54E + 06.1.10E + 061.905.77E-02IG Kappa链V-III区CLL
      P01602kv110_human.2.52E + 06.1.32E + 06.1.62E + 06.2.14E + 06.1.901.66E-03.IG Kappa Chain V-I Region HK102
      P06319lv605_human.1.25E + 051.83E + 05.1.49E + 05.8.97E + 042.045.61E-02.IG Lambda链V-VI区EB4
      P0C0L4co4a_human.1.63E + 06.1.18E + 06.2.45E + 06.2.12E + 06.2.072.67E-04.C4a过敏毒素
      P01609kv117_human.4.10E + 06.1.94E + 06.2.40E + 06.3.31E + 06.2.102.11e-06.IG Kappa链V-I区域SCW
      P04217A1BG_HUMAN.8.36E + 061.52E + 07.1.77E + 071.38E + 07.2.127.59E-08.α-1B-糖蛋白
      P02753Ret4_human.1.69E + 06.1.87E + 06.1.30E + 06.2.79E + 06.2.157.16E-03.血浆视黄醇结合蛋白(1-176)
      Q96PD5PGRP2_HUMAN.1.33E + 06.2.75E + 06.2.88E + 06.1.60E + 06.2.161.89E-09.N-乙酰杂摩托 - l - alanine酰胺酶
      P03952klkb1_human.8.74E + 051.68E + 06.1.90E + 06.1.55E + 06.2.173.99E-08.血浆Kallikrein轻链
      P01880Ighd_human.2.08E + 05.2.02E + 05.2.58E + 05.4.43E + 052.184.77E-02.IG Delta Chain C地区
      P01019Angt_human.1.79E + 079.18E + 068.12E + 069.37E + 062.201.36E-04.血管紧张素-2
      P07358CO8B_HUMAN.4.22E + 05.7.55E + 059.47E + 05.8.63E + 052.241.68E-10.补体组分C8β链
      P51884lum_human.1.20E + 06.1.54E + 06.1.44E + 066.87E + 052.251.04E-06.Lumican.
      P02763A1AG1_human.3.04E + 073.54E + 076.88E + 073.79E + 07.2.252.42E-05.α-1-酸糖蛋白1
      P06314kv404_human.1.97E + 06.1.26E + 06.1.56E + 06.2.84E + 06.2.262.65E-07.IG Kappa链V-IV区B17
      P00450ceru_human.1.99E + 073.79E + 07.4.62E + 07.3.25E + 072.314.66E-06.刺激子
      P33151cadh5_human.7.02E + 04.4.50E + 045.37E + 042.95E + 04.2.379.62E-07.Cadherin-5.
      P02750A2GL_HUMAN.9.15E + 05.1.18E + 06.2.19E + 061.19E + 062.391.15E-05.富含含氨的α-2-糖蛋白
      P01857Ighg1_human.1.99E + 088.27e + 071.38E + 081.43E + 082.402.71E-08.IG Gamma-1链C地区
      P06309kv205_human.6.33E + 063.19E + 06.5.93E + 06.7.74E + 06.2.427.59E-08.Ig Kappa Chain V-II Region GM607
      P02748co9_human.1.19E + 061.73E + 062.96E + 062.67E + 062.486.00E-07.补体组件C9A
      P19652A1AG2_HUMAN.3.82E + 06.9.53E + 069.21E + 068.34E + 06.2.496.60E-09.α-1-酸糖蛋白2
      P07225PROS_HUMAN.2.42E + 055.61E + 05.6.05E + 05.5.72E + 052.503.85E-14.维生素K依赖蛋白质s
      P01023a2mg_human.3.89E + 084.58E + 084.29E + 081.76E + 082.591.53E-14.Alpha-2-macroglobulin
      P01860Ighg3_human.5.40E + 072.08E + 07.4.30E + 074.30E + 072.593.33E-10.Ig Gamma-3链C地区
      Q96IY4cbpb2_human.9.14E + 041.77E + 05.2.37E + 051.72E + 05.2.593.98E-10.羧肽酶B2
      P07357CO8A_HUMAN.3.90E + 041.02E + 05.9.24E + 048.66E + 042.624.38E-05.补体组分C8α链
      P05546Hep2_human.1.95E + 06.4.89E + 065.14E + 063.92E + 06.2.633.45E-12.肝素Cofactor 2.
      P18428lbp_human.8.15e + 053.08e + 05.4.34E + 054.81e + 052.641.25E-05.脂多糖结合蛋白
      Q06033ITIH3_HUMAN.1.41E + 06.8.36E + 051.06E + 06.5.33E + 052.641.79E-06.α-胰蛋白酶抑制剂重链H3
      P02649apoe_human.1.43E + 076.68E + 06.8.18e + 06.5.32E + 06.2.691.24E-08.载脂蛋白E.
      P27169Pon1_human.1.91E + 06.4.67E + 065.15E + 064.73E + 062.694.77E-10血清律杀氧酶/芳香剂酶1
      P07360CO8G_HUMAN.2.91E + 055.49E + 057.87E + 05.6.43E + 052.702.87E-09.补体组分C8伽玛链
      P35858als_human.3.42E + 05.6.82E + 057.48E + 059.25E + 052.702.45E-07.胰岛素样生长因子结合蛋白复合酸不稳定亚基
      P02743Samp_human.4.59E + 05.3.68E + 05.6.63E + 05.1.03E + 06.2.811.73E-06.血清淀粉样蛋白P-组分
      P02790Hemo_human.2.99E + 077.40e + 078.43E + 076.99E + 07.2.821.19E-15血红蛋白
      P02775cxcl7_human.5.48E + 051.88E + 05.2.10E + 05.4.15E + 052.912.85E-05.血小板碱性蛋白质
      P00739HPTR_HUMAN.1.64E + 053.87E + 054.34E + 054.95E + 053.015.68E-05.哈达福林相关蛋白质
      P07996tsp1_human.3.69E + 041.21E + 041.58E + 04.1.86E + 04.3.033.02E-03.血小板波动素-1
      P0CG06lac3_human.8.26e + 042.68E + 046.46E + 047.97E + 043.081.88E-10.IG Lambda-3 Chain C区
      B9A064Igll5_human.9.10E + 06.3.56E + 06.9.82E + 061.11e + 073.124.57E-10.免疫球蛋白Lambda样多肽5
      P01834IGKC_HUMAN.2.04E + 086.88E + 071.43E + 082.41E + 083.493.13-13.IG Kappa Chain C地区
      P0DJI8Saa1_human.3.50E + 05.9.70e + 041.36E + 052.87E + 053.601.90E-02.血清淀粉样蛋白A(2-104)
      P80748lv302_human.3.91E + 06.1.04E + 06.2.22E + 06.4.05e + 06.3.907.50E-12Ig Lambda链V-III区LOI
      P60709Actb_human.7.96E + 05.5.29E + 051.37E + 062.29E + 064.341.19E-07.肌动蛋白,细胞质1,N-末端加工
      P06889lv405_human.1.63E + 055.00E + 05.3.63E + 051.15E + 05.4.347.32E-08.IG Lambda链V-IV区摩尔
      P04430kv122_human.3.85E + 05.8.68E + 041.99E + 05.3.58E + 054.446.73E-04.Ig Kappa链V-I地区禁令
      P04003c4bpa_human.2.60E + 06.8.24E + 06.1.17E + 07.8.11e + 064.481.32E-11C4b结合蛋白α链
      P04278shbg_human.5.77E + 042.62E + 052.39E + 058.93E + 044.557.64E-07.性激素结合球蛋白
      Q13790apof_human.6.85E + 04.2.39E + 052.73E + 053.20e + 054.673.98E-10.载脂蛋白F.
      P68871hbb_human.4.94E + 06.3.57E + 06.4.91E + 06.1.02E + 06.4.835.25E-04.血红蛋白亚单位β
      P01859Ighg2_human.1.01e + 073.12E + 06.4.78E + 061.52E + 07.4.865.25E-15Ig Gamma-2链C地区
      P04196hrg_human.1.93E + 066.49E + 069.87E + 066.88E + 065.092.89E-11.富含组氨酸的糖蛋白
      Q9Y490tln1_human.2.81E + 032.46E + 035.14E + 031.31E + 045.345.50E-07.塔林1
      P06311kv311_human.3.83E + 041.12E + 042.80e + 047.75E + 046.904.60E-05.IG Kappa链V-III区IARC / BL41
      P01772hv311_human.3.50E + 05.5.31E + 042.05E + 05.3.74E + 05.7.044.57E-10.IG重链V-III区KOL
      P01861Ighg4_human.4.65E + 06.8.49E + 052.26E + 06.6.18E + 067.271.91E-06.IG Gamma-4 Chain C地区
      P02771Feta_human.3.35E + 06.4.84E + 054.28E + 054.90E + 057.831.44E-10α-胎儿
      O43866cd5l_human.1.60E + 051.04E + 06.1.23E + 06.1.30E + 06.8.103.51E-11.CD5抗原样
      P02452co1a1_human.1.40E + 051.06E + 05.6.81E + 041.66E + 04.8.425.90E-16胶原醛alpha-1(i)链
      P01780HV319_human.1.17E + 051.72E + 04.1.07E + 05.1.49E + 05.8.687.83E-09.IG重链V-III区Jon
      P01871Ighm_human.1.49E + 06.9.65E + 06.1.19E + 071.36E + 07.9.142.09E-12IGU Chain C地区
      P04438HV208_human.7.01E + 05.7.02E + 04.3.18E + 05.2.36E + 059.982.14E-02.IG重链V-II区斯梅
      P00738HPT_HUMAN.1.00E + 07.6.96E + 071.09e + 085.99E + 07.10.834.72E-06.Haptoglobin alpha链条
      P04220mucb_human.1.55E + 05.1.24E + 06.1.20E + 06.1.81E + 06.11.673.13-13.Ig亩重链疾病蛋白质
      P01591IGJ_HUMAN.1.34E + 05.7.78E + 051.11e + 06.1.76E + 06.13.115.39E-15.免疫球蛋白J链
      P69905HBA_HUMAN.1.66E + 07.2.67E + 063.33E + 06.8.51e + 0519.553.99E-08.血红蛋白亚基α
      P07951tpm2_human.3.35E + 041.47E + 04.1.08E + 05.3.22E + 0521.831.20E-07.Tropomyosin Beta链条
      P01877Igha2_human.7.27E + 041.64E + 054.55E + 052.03E + 06.27.982.69E-15IGα-2链C地区
      A0M8Q6lac7_human.5.29E + 049.09E + 04.2.07E + 062.93E + 06.55.338.49E-06.IG Lambda-7链C地区
      P01876Igha1_human.6.11e + 055.10E + 06.1.24E + 073.58E + 0758.591.39E-20.IGα-1链C地区
      P69891HBG1_human.1.90E + 06.1.88E + 04.2.85E + 042.03E + 04.101.251.96E-13.血红蛋白亚单位伽玛-1
      P69892HBG2_human.4.87E + 06.2.49E + 04.1.87E + 041.48E + 04.328.589.58E-22.血红蛋白亚单位伽玛-2
      这些107蛋白的得到的分层聚类确认了与总体数据的无监督聚类观察到的类似模式(Fig. 2A)。这些蛋白质可以分为6个特定的表达簇(Fig. 2B)。介绍了每个集群中包含的蛋白质清单 补充表S2。这些最有趣的是簇2和4,分别具有25和30个蛋白质,显示出增加的表达增加;和簇1和5,分别具有14和9个蛋白,显示出随着年龄的增加而降低的表达。这些簇中包含的蛋白质代表了补体和凝血级联的Kegg途径,具有最显着的基因本体作用:急性炎症反应,蛋白激活级联,体液免疫应答的补体激活和调节。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2A,来自使用ANOVA鉴定的局部测定文库的107差异表达蛋白的热敷。 使用基于相关的距离和完全连杆获得聚类模式。蓝色 - 表达下降的蛋白质;红色 - 蛋白质增加了表达增加。 B使用ANOVA鉴定的差异表达蛋白质的分层聚类获得的簇和蛋白质丰度趋势。 x-axis代表四岁(1,新生儿; 2,<1岁; 3,1-5岁; 4,成人)。 y-axis表示每个相关蛋白质(灰色)表达的对数归一化区域,其总体平均值作为包含标准偏差(2SD)条的彩色线。三簇中的分离是基于切割树枝图,在0.1的距离下并着色所得的样品聚类。

       聪明的途径分析

      107型差异表达蛋白的富集途径(基于ANOVA) Fig. 3。尽管显示14个途径由差异表达的蛋白质表示,但是呈显着性的前5个途径是:急性相位响应信号传导(18.1%重叠); LXR / RXR激活(19.5%重叠); FXR / RXR激活(17.4%重叠);补体系统(34.2%重叠)和凝血系统(34.3%重叠)。 Fig. 4 显示前3名所识别的网络作为血液系统的开发和功能,机能函数,发育障碍(Fig. 4A);神经疾病,脂质代谢,分子运输(Fig. 4B)体液免疫反应,炎症性疾病,免疫疾病(Fig. 4C)。列出了疾病和障碍,以及所确定的生理系统的发展和函数具有重要意义 表二.
      图缩略图GR3.
      Fig. 3基于ANOVA分析的107个差异表达蛋白的最高富集途径,排名越来越多的渔夫精确测试 p 价值(Ingenuity Pathway分析,默认背景比较)。 绿色 - 新生儿表达下降的蛋白质;红色 - 蛋白质增加了新生儿的表达;白色 - 没有重叠与数据集;橙色 - 日志(p 价值),Fisher精确测试,右尾。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4最重要的网络识别使用熟智能途径分析。 A,血液系统开发和功能,机能函数,发育障碍; B,神经疾病,脂质代谢,分子运输; C,体液免疫应答,炎症反应,免疫疾病。 红色表示与成人相比的新生儿的上调,绿色表示新生儿的下调。白色表示不在数据集中的分子。形状的传奇如下:双圈,复杂/群体;梯形,运输车;金刚石,酶;水平金刚石,肽酶;圈子,其他。
      表二基于108差异表达蛋白对默认背景的疾病和疾病疾病和开发和开发和功能的慈善能力分析
      p value#分子
      疾病和疾病
      炎症反应1.01E-04-5.02E-2358
      代谢疾病1.20E-04-4.73E-2246
      免疫疾病9.85E-05-6.15E-2139
      神经疾病1.23E-04-3.86E-1946
      心理障碍2.73E-08-3.86E-193
      细胞到细胞信令和交互1.49E-04-1.38E-2052
      细胞运动1.39E-04-3.29E-1841
      细胞死亡和生存1.15E-04-5.86E-1249
      细胞发育6.94E-05-2.94E-1127
      脂质代谢1.49E-04-1.55E-1036
      生理系统开发与功能
      体液免疫应答8.95E-05-5.02E-2320
      血液系统开发与功能1.04E-04-8.00E-2051
      免疫细胞贩运1.04E-04-3.28E-1943
      有机函数7.21E-05-4.35E-1722
      组织形态学9.53E-05-6.84E-134

       使用基于大型存储库的频谱库扩展脚本

      由于我们评估了许多高度丰富的蛋白质的存在,因此通过对含有更多的频谱的大型人机储存库的光谱库来检测更多蛋白质是否可以检测更多蛋白质,因此难以通过MS产生广泛的蛋白质血浆的广泛蛋白质曲线超过10,000人蛋白质(
      • Rosenberger G.
      • Koh C.C.
      • 郭t.
      • rost h.l.
      • Kouvonen P.
      • 柯林斯B.C.
      • 赫苏尔米
      • 刘Y.
      • 克隆e.
      • vichakevski A.
      • Faini M.
      • Schubert O.T.
      • 法里岛P.
      • EBHARDT H.A.
      • Matondo M.
      • 林H.
      • 糟糕的S.L.
      • 坎贝尔D.S.
      • 德意曲e.w.
      • 莫里茨R.L.
      • 塔特S.
      • Aeberberold R.
      通过SWATH-MS量化10,000个人蛋白的测定储存库。
      )。我们使用Swathxtend软件将此库与本地库合并,确保可靠的保留时间对齐进行用于提取SWATH获取的数据。利用这种方法使用NondePleted,非分割血浆我们从940蛋白提取定量信息(提取FDR 1%,需要两种或更多种需要)(补充表S3, Fig. 1C)与局部生成的IDA基谱库相比,增加大于6倍。我们选择了两种蛋白质骨膜(Postn)和GPI特异性磷脂酶1(GPLD1),其在扩展文库中的多种肽上具有高质量的肽光谱匹配。据报道这些蛋白质被分泌,但通常在血浆蛋白质组学分析中报道,因此我们使用ELISA确认其存在和浓度。显示了五种蛋白质表达式的表达式表达式最大的表达式的表达模式 Fig. 5. 这些都是: 血红蛋白亚单位γ-1(HBG1);血红蛋白亚单位γ-2(HBG2);胶原醛alpha-1i链(CO1A1); IGα-1链C区域(IGHA1)和IGα-2链C区域(IGHA2)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5选择的五种蛋白质的年龄特异性表达模式进行讨论。 五种蛋白质的表达模式具有最大的表达年龄的变化。 A,血红蛋白亚单位γ-1(HBG1); B,血红蛋白亚单位γ-2(HBG2); C,胶原醛alpha-1i链(CO1A1); D,IGα-1链C区域(IGHA1)和 E,IGα-2链C区域(IGHA2)。

       ELISA验证

      ELISA证实了每个年龄组的血浆样品中PERIOSTIN和GPLD1的表达。 gpld1表达(Fig. 6A)在成年人中最伟大的成年人,随着年龄的增长(成人40μg/ ml,18μg/ ml新生儿)。 Periostin显示出逆趋势,但表达得多(在新生酸盐中0.6μg/ ml,成人中0.01μg/ ml)。它被显着下调(Fig. 6B)与新生儿相比,所有年龄段,并且与...相比,在成年人中显着下调<1和1-5年年龄组。这与SWATH数据同意并表明扩展人类图书馆是更深层等离子体分析的有用策略。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6ELISA对差异表达蛋白质的验证。 A,GPI特异性磷脂酶1(GPLD1), B,periostin(postn), C,α-2-丙蛋白(A2M), D,组氨酸富含糖蛋白(HRG)。 E例如,用于比较,使用扩展库(GPLD1和Postn)和本地库(A2M和HRG)从SWATH数据检测的各个丰度模式的音箱。所有误差条都是标准偏差(SD)。 *表示显着≤0.05; **表示显着≤0.01。
      我们还经过验证了另外两种蛋白质的表达,发现我们的调查结果与SWATH数据α-2-丙蛋白(A2M)有明显下调(Fig. 6C)在所有年龄段中(<与新生儿相比,1年,1-5岁和成人)。与成年人相比,1-5岁的小组被发现明显上调。组氨酸富含糖蛋白(HRG)(Fig. 6D与新生儿相比,在1-5岁组中显示出上调,但下调<1 year and Adults.

       使用延长的血浆库对蛋白质表达的成对比较

      还进行了比较年龄组之间的成对比较。在局部和扩展文库中差异表达的蛋白质被列为:与之相比的新生儿< 1 year olds (补充表S4),下调26和25个蛋白质,在局部和扩展文库中调节17和23个蛋白质;新生儿与1-5岁(补充表S5),下调35和38个蛋白,在局部和扩展文库中调节8和11个蛋白质;新生儿与成年人相比(补充表S6),下调25和24个蛋白质,在局部和扩展文库中调节9和18个蛋白质;<1岁的孩子与1 - 5岁(补充表S7),下调15和16个蛋白质,在局部和扩展文库中调节0和2个蛋白质;<1岁与成年人相比(补充表S8),下调15和20个蛋白,在局部和扩展文库中调节9和12个蛋白质; 1 - 5岁与成年人相比(补充表S9),用8和7个蛋白质下调,11和15个蛋白质在局部和扩展文库中调节。

      讨论

      虽然以前的研究评估了儿科和成人群体中血浆蛋白质组的老化(
      • Ignjatovic V.
      • 赖C.
      • 夏天r.
      • Mathesius U.
      • Tawfilis S.
      • Perugini M.A.
      • 蒙格尔P.
      血浆蛋白的年龄相关差异:血浆蛋白质如何从新生儿转变为成人。
      ),这是第一次利用SWATH-MS技术来计算和分析成人和儿科年龄特异性背景下差异蛋白表达的变异性的研究。该方法的额外优点是能够利用巧妙的途径分析来阐明富集的生物化学途径和疾病过程中涉及的途径。实际上,对多个年龄组蛋白质表达变异的Anova分析表明,蛋白质涉及造血发育和功能,免疫系统和物理生长的显着变化作为血浆蛋白质组。
      我们确定了107种蛋白质,这些蛋白质在审查的四个年龄组中变得丰富。 Anova分析所识别的最重要的发挥作用在造血发育和免疫功能中起作用。血红蛋白亚单位γ-2(HBG2)是由其编码的蛋白质 HBG2 基因,并且已被证明在造血系统的发展中发挥着重要作用(
      • HIGGS D.R.
      • 维克斯M.A.
      • Wilkie A.O.
      • 凡富汉。
      • Jarman A.P.
      • Weatherald D.J.
      对人α-珠蛋白基因簇的分子遗传学综述。
      )。在开发的胎儿中, HBG1HBG2 两种γ链蛋白的代码,与相应的α链一起,构成胎儿血红蛋白(HBF)。在出生时,HBF经历成熟成人血红蛋白(HBA)的替代品,在前6个月的过程中持续的过程中(
      • Pereira C.
      • Relvas L.
      • Bento C.
      • 休眠A.
      • Ribeiro M.L.
      • Manco L.
      影响胎儿血红蛋白水平的多态变异:β-地中海贫血携带者的关联研究以及葡萄牙血症的正常性。
      )。如图所示 表I.,随着HBA取代HBF,HBG2的平均表达水平随着年龄而显着降低。以类似的方式,胶原醛α-1I链(CO1A1),一种形成I型胶原蛋白α-1I链的一部分的蛋白质也经历了NeoNates对成人的表达减少。由于I型胶原蛋白在骨骼,肌腱和真皮中发现丰富(
      • 曼V.
      • 拉尔斯顿S.H.
      骨密度和骨质疏松骨折相关的Col1A1 SP1多态性的Meta分析。
      ),对此的可能解释是,由于生长的结果,生命早期的CO1A1表达尖峰,然后在成年期到维护功能下调。相比之下,IGα-1链C区域(IGHA1),一种在IGA抗体形成中发挥作用的蛋白质(
      • Takahashi K.
      • raska m.
      • Stuchlova Horynova M.
      • 霍尔S.D.
      • Poulsen K.
      • 克里安米
      • Hiki Y.
      • Yuzawa Y.
      • 摩尔多瓦Z.
      • 朱利安B.A.
      • renfrow m.b.
      • 诺瓦克J.
      IGA1 O-聚糖的酶促唾液酸化:对IgA肾病研究的影响。
      )在我们的分析中显示出表现出更高的表达作为蛋白质组,在新生儿至1-5岁年龄组中观察到最大的表达变化。这表明免疫系统的快速发展发生在新生儿到儿童早期期,并在青少年和成年期继续成熟。
      利用SWATH-MS的优点是能够通过使用明显更大的测定库进行匹配来重新挖掘数据。在这里,我们利用来自超过10,000种蛋白质的含有光谱的广泛的人类测定文库,并从未浸入和非分割血浆的SWATH数据重新提取质量匹配肽。这使得检测到的肽增加大于6倍,使得能够更彻底的肽量定量,其代表达到非普通的人血浆中的SWATH定量蛋白的最大定量设定。 ELISA验证两种借用分泌的蛋白质,PERIOSTIN和GPLD-1证实了它们在血浆中的SWATH测量水平。刘 等等。 (
      • 刘Y.
      • Buil A.
      • 柯林斯B.C.
      • Gillet L.C.
      • BLUM L.C.
      • 郑;
      • Vitek O.
      • mouritsen J.
      • 加法扬G.
      • 卫星T.D.
      • Dermitzakis e.t.
      • Aeberberold R.
      342例血浆蛋白在人双胞胎腺中的定量变异性。
      )使用对人血浆的SWATH分析,并报道了342蛋白在232个血浆样品中定量,从双胞胎上纵向收集。它们检测到GPLD-1,但不具有肝素和这些342蛋白的注释亚细胞定位。包括核蛋白质(例如 转录伸长率调节剂1(Tcerg1),异质核核糖核糖蛋白,线粒体蛋白质(例如 GRP75,三官能酶亚基α(ECHA),腺苷酸激酶2)和高尔基蛋白(例如 Golgi膜蛋白GP73),其中在循环中具有非吸收功能作用。通过这些观察结果,有很好的理由利用大规模的蛋白质宽的文库方法,因为我们这里所示的情况下,随着LC-MS而没有样品免疫普雷,可以随机增加血浆蛋白质组覆盖的深度。有趣的是,在小鼠血浆中使相关方法能够定量超过1500个蛋白质,其中许多是细胞来源(
      • Malmströme.
      • KilsgårdO.
      • 哈利斯。
      • 击败E.
      • 赫瓦尔德H.
      • malmströml。
      • MalmströmJ.
      使用定量靶向蛋白质组学的革兰氏阳性脓血体血浆中蛋白组织来源的大规模推断。
      )。当然,次要方法应该试图验证在血浆中观察到的细胞蛋白的检测。在利用这种异构性质的大规模文库时,不能排除1型错误,并且一种策略是通过要求多种肽的证据来增加严格性,在这种情况下至少2个蛋白质。
      我们使用途径知识来鉴定最丰富的途径,以及功能和疾病。急性期响应信号传导涉及急性非特异性免疫应答,构成了最富集的规范途径。鉴于以前的证据表明IVEA1表达随着年龄的主体增加,这进一步指示免疫发育是一种动态和不断发展的系统。此外,鉴定IL-6作为顶部上游调节剂(参与炎症反应的细胞因子,以及急性期反应的介体(
      • Heinrich P.C.
      • Castell J.v.
      • 安德斯T.
      白细胞介素-6和急性期反应。
      )),炎症反应和体液免疫反应分别作为最富集的疾病,进一步支持这种争论。
      实际上,血浆蛋白年龄特异性可变性的定量对诊所具有明确和相关的应用。虽然疾病特异性背景下的蛋白质组学表达的变化已经很好地表征了本文的文献和先前提到的,但鉴定了表达变化 年龄特定的 背景是一个潜在的临床用途工具。例如,血型病理如β-秋季复苏和其他相关条件通常具有延长的伽马链HBG2生产,较早(
      • Neishabury M.
      • Zamani S.
      • Azarkeivan A.
      • 阿比尼尼斯。
      • Darvish H.
      • Zamani F.
      • Najmabadi H.
      XMN1-HBG2对炎症表型的改性效果与其在β球蛋白基因座控制区域中的链接元素相关,包括5'HS4的回文位点。
      )。因此,患者血浆的蛋白质组学分析,参考年龄特异性蛋白质参考范围,可以帮助临床医生在诊断阶段,或有助于阐明相关病理的严重程度。
      在这项研究中,我们已经表明,血浆蛋白质组经历了系统年龄的显着变化。除了在造血发育等系统中具有各种功能作用的蛋白质之外,还鉴定了与默认背景相比,鉴定了最高度富集的途径,上游调节因子,疾病环境和功能。应在进一步阐明蛋白质表达中的年龄特异性变异性的情况下,以来,将来应向未来的研究表明,重要的是,其与疾病过程的联系。

      数据可用性

      质谱蛋白质组学数据已经通过PRIDE [1]伙伴存储库沉积到ProteomexChange联盟,与数据集标识符PXD005661。
      审稿人帐户详细信息:用户名: [电子邮件 protected],密码:Auk6amra。

      致谢

      我们感谢皇家儿童医院的麻醉和外科部门的成员,以促进样品收集。

      补充材料

      作者简介

      参考

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