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无关的蛋白质测序(蘸)可以全长 德诺维 蛋白质和抗体序列测定*

      传统的“bottom-up”蛋白质组学方法使用蛋白水解消化,LC-MS / MS和数据库搜索阐明肽身份及其亲本蛋白。不能识别来自数据库中不存在的蛋白质序列,即使存在于数据库中,即使对于样品中最丰富的蛋白质,也很少实现完整的序列覆盖。因此,未知蛋白质如抗体或元素组分的序列仍然是一个具有挑战性的问题。迄今为止,在高吞吐量中,没有可用的全长蛋白质测序的方法,与参考数据库无关。在这里,我们呈现了无关的蛋白质测序,一种明确,快速,数据库无关,全长蛋白质测序的方法。该方法是蛋白质,LC-MS / MS分析,肽的非酶促,半随机切割的新组合,肽德诺维使用命名的算法测序,提取肽标签及其组装成共有序列“肽标签汇编器。”作为概念证明,将该方法应用于三种已知蛋白质的样品,其代表三种尺寸的类别和先前未测序的临床相关的单克隆抗体。不包括亮氨酸/异亮氨酸和谷氨酸/脱胺化谷氨酰胺模糊,端到端全长德诺维为所有基准蛋白​​和抗体轻链的精度为99-100%的精度达到测序。测序抗体重链的准确性,包括整个可变区,也为100%,但在恒定区序列中存在23-残基间隙。
      基于质谱的蛋白质组学实验的主要目标通常是蛋白质鉴定。为了实现这一目标,目前的方法利用蛋白质样品的蛋白水解消解,然后是LC-MS / MS和数据库搜索鉴定肽,从而母体蛋白质(
      • 张Y.
      • fonslow b.r.
      • 山B.
      • BAEK M.C.
      • yates 3rd,J.R.
      霰弹枪/自下而上蛋白质组学的蛋白质分析。
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      • yates j.r.
      • ruse c.i.
      • Nakorchevsky A.
      蛋白质组学通过质谱:方法,进展和应用。
      )。虽然在分析良好表征的生物体时非常强大,但是当分析不具备特征的样品时,该方法具有几个显着的缺点。首先,它严格依赖于含有测量肽的正确序列的蛋白质数据库。无法识别未知的蛋白质序列。其次,它依赖于鉴定蛋白水解肽,通常是胰蛋白酶。胰蛋白酶用于几种原因,包括其高效率和特异性。然而,由于胰蛋白酶仅在赖氨酸和精氨酸残留物后切割蛋白质,因此典型蛋白质的胰蛋白酶消化导致一些太短,过长,过于疏水的一些肽,或含有一系列残留物,其残留物是不良或碎片的残留物。结果,即使对于样品中最丰富的蛋白质,蛋白质的序列覆盖率( IE。 由测量肽覆盖的整个氨基酸序列的百分比几乎从未100%,并且可能是鉴定的肽之间没有重叠的区域。有时针对特定应用进行其他蛋白酶的酶消化,但它们也可能导致不适合通过LC-MS / MS鉴定的肽。
      蛋白质组学分析的另一种策略是肽 德诺维 测序,其中肽序列直接从MS / MS谱推断,而不参考数据库(
      • allmer J.
      算法的算法 德诺维 串联质谱肽测序。
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      • Seidler J.
      • Zinn N.
      • Boehm M.E.
      • Lehmann W.D.
      德诺维 用MS / MS测序肽。
      )。这是通过识别与特定氨基酸完全对应的MS / MS谱之间的峰之间的质量差异来完成。这种方法的优点在于鉴定肽不需要数据库。然而,肽的固有化学性质和仪器的低效率可能导致空隙 德诺维 测序,导致仅部分或不完美的肽序列。因此,获得自信和准确的肽序列 德诺维 在高吞吐量中非常具有挑战性。此外,即使肽被正确测序 德诺维,对其亲本蛋白的推断再次,严格依赖于使用BLAST在数据库中与已知蛋白质匹配的肽
      使用的缩写是:Blast,基本的局部对准工具; PTA,肽标签汇编器;倾斜,无关的蛋白质测序; PTM,翻译后修改; IAA,碘乙酰胺; IAC,碘乙酸盐; Maah,微波辅助酸水解; MSP,Meta-SPS。
      1使用的缩写是:Blast,基本的局部对准工具; PTA,肽标签汇编器;倾斜,无关的蛋白质测序; PTM,翻译后修改; IAA,碘乙酰胺; IAC,碘乙酸盐; Maah,微波辅助酸水解; MSP,Meta-SPS。
      例如,搜索。对于未知的蛋白质,使用电流自下而上的方法,其全氨基酸序列的重建非常具有挑战性。
      没有先验知识的蛋白质序列的测定是分析表征差的蛋白质样本的重要和速率限制步骤,例如衍生自未曲线的生物,环境样品和微生物组。其他重要病例是可变区序列未知的抗体和T细胞受体。为了推断出感兴趣的未知单克隆抗体的氨基酸序列,通常产生来自源杂交瘤的cDNA,测序和翻译。然而,杂交瘤细胞并不总是可用的,或者用于扩增cDNA的引物可能与目标抗体DNA序列不匹配。在这种情况下,必须通过蛋白质组学技术直接测定蛋白质的氨基酸序列。
      迄今为止,只有一些报告的方法试图执行端到端 德诺维 LC-MS / MS的蛋白质测序,其中ALP和META-SPS(MSP)是最近的(
      • Guthals A.
      • 克劳瑟K.R.
      • Bandeira N.
      霰弹枪蛋白质测序与meta-contig组件。
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      • Bandeira N.
      • 克劳瑟K.R.
      • PEVZNER P.A.
      霰弹枪蛋白测序:从改性蛋白质的混合物中组装肽串联质谱。
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      • Guthals A.
      • 克劳瑟K.R.
      • 弗兰克上午
      • Bandeira N.
      测序级 德诺维 分析来自重叠肽的MS / MS三态(CID / HCD / ETD)。
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      • tran n.h.
      • Rahman M.Z.
      • Xin L.
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      完整的单克隆抗体序列组装。
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      • Vyatkina K.
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      • DEKKER L.J.
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      德诺维 肽从自上而下串联质谱中测序。
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      • Bandeira N.
      • PHAM V.
      • Pevzner P.
      • Arnott D.
      • LILL J.R.
      自动化 德诺维 单克隆抗体的蛋白质测序。
      )。所有这样的自下而上的方法都依赖于多种蛋白酶酶消化以产生重叠肽,然后是 德诺维 肽测序和组装。其中一些方法使用搜索结果对参考蛋白质数据库以改善组装过程。如果分析的蛋白质或其密切的同源物在该数据库中没有表示,因此需要仅使用 德诺维 用于组装的测序肽,这些方法预计具有较差的性能。例如,在不使用数据库搜索的结果对内部生成的抗体数据库,阿尔卑斯山(
      • tran n.h.
      • Rahman M.Z.
      • Xin L.
      • 山B.
      • 李米
      完整的单克隆抗体序列组装。
      )导致其分析的抗体的所有光和重链组装成分。即使使用数据库搜索结果,分析的两条重链中的一种也导致阿尔卑斯山的碎片化组装,特别是在重链的可变区(
      • tran n.h.
      • Rahman M.Z.
      • Xin L.
      • 山B.
      • 李米
      完整的单克隆抗体序列组装。
      )。碎片化组件是对确定未知蛋白质的全长序列的有害性,因为在没有先验知识的蛋白质序列的情况下,不可能确定所有contig中的哪个(组装的氨基酸序列拉伸,覆盖多肽的一部分链条)应用于大会。使用 德诺维 仅限数据,MSPS组装的最长CONDIG是194年氨基酸长(使用具有三种不同碎裂方法的多种蛋白水解消化的分析)(
      • Guthals A.
      • 克劳瑟K.R.
      • 弗兰克上午
      • Bandeira N.
      测序级 德诺维 分析来自重叠肽的MS / MS三态(CID / HCD / ETD)。
      ),据报道,没有蛋白质通过MSPS在单个Contig中完全组装(从N到C末端)(
      • Guthals A.
      • 克劳瑟K.R.
      • Bandeira N.
      霰弹枪蛋白质测序与meta-contig组件。
      )。 因此, 德诺维 典型全长蛋白的测序仍然利用当前技术具有挑战性。
      在这里,我们为全长提出了概念验证 德诺维 我们命名为无关的蛋白质测序(倾斜)的蛋白质测序方法。该方法基于通过非酶促,微波辅助酸水解(MAAH),通过固相萃取,LC-MS从水解产物中富集LC-MS / MS-Amerable肽的半含有蛋白质的切割。通过固相萃取,LC-MS / MS分析, 德诺维 所得肽的肽测序,来自肽标签的肽标签 德诺维 肽序列,以及他们的组装成共识折叠(Fig. 1)。在样品处理的几分钟内,然后是标准蛋白质组学分析,全长 德诺维 可以获得蛋白质序列。
      图缩略图GR1.
      图。1。 蘸酱的描述。 通过悬浮液在3中经受Maah的蛋白质 m HCL和微波炉4分钟。通过固相萃取从水解产物中富集LC-MS / MS易用肽并进行标准NLC-MS / MS。经受产生的光谱 德诺维 使用峰值软件进行排序。 PTA使用峰的输出以提取和将肽标签提取和组装成共识折叠。

      实验步骤

      对三个独立的重复进行三种蛋白质进行浸渍分析。这些包括牛血清白蛋白(BSA),Fetuin-A和Myoglobin作为基准。另外,AR37是先前未测序的单克隆抗体,也将作为测试用例浸渍。

       样品制备

      除非另有说明,否则所有化学品和蛋白质购自Sigma-Aldrich。对于Maah,每BSA的10μg干蛋白粉末(Uniprot加入No.P02769,Sigma-Aldrich目录号。A2153),Fetuin A(Uniprot加入号码P12763,Sigma-Aldrich目录号。F2379),或马肌电站( Uniprot登录号。P68082,Sigma-Aldrich目录No.M1882)溶解在200μL的8个中 m 尿素,0.1 m Tris-HCl,pH 7.9。将Dithiothreitol(DTT)加入到5米的最终浓度m 并在37℃下孵育50分钟。以10米的最终浓度加入碘乙酰胺(IAA)m 并在黑暗中孵育30分钟。使用AMICON 3-KDA MWCO过滤器(Millipore UFC500396)通过添加300μLH来将缓冲液交换为水2o以14,000×离心 g 直到剩余体积约为40μL,重复该过程。收集剩余的体积并用预缝隙盖(Waters,目录号186000307C)转移到玻璃瓶子。将HCl加入到3的最终浓度 m;将小瓶放入烧杯中并在最高设置的标准家用微波(LG Intellyave 1,200 Watts)中微波炉(每1分钟再加补充冰)。然后对水解产物进行固相萃取(Oasis HLB,水,目录No.186001828BA),用80%乙腈洗脱肽。使用真空离心机(Eppendorf浓缩器加)干燥肽样品并重悬于3%乙腈,0.1%甲酸中的纳米-SMS / MS分析。将1.2μg重悬的水解蛋白加载到色谱柱上。如前所述孤立AR37(
      • Carvalho S.
      • Lindten M.
      • Lauriola M.
      • Shirazi N.
      • sinha s.
      • 阿卜杜勒 - 海A.
      • Levanon K.
      • Korach J.
      • Barshack I.
      • 科恩y.
      • ONN A.
      • 磨坊G.
      • yarden y.
      对amphegegulin的抗体,患者液体中丰富的生长因子,抑制卵巢肿瘤。
      )。如上所述进行AR37的样品处理,除了用碘乙酸酯(IAC)(Sigma-Aldrich目录No.I4386)而不是IAA(与IAA烷基化相同的浓度和条件)进行烷基化。
      对于胰蛋白酶消化,蛋白质溶解在8中 m 尿素,0.1 m 如上所述,Tris-HCl,pH7.9,减少和烷基化。将样品稀释至2 m urea with 50 mm 碳酸氢铵。然后用胰蛋白酶(Promega;麦迪逊,Wi)在37℃(50:1蛋白质量/胰蛋白酶)中消化蛋白质,然后用​​胰蛋白酶(50:1蛋白质量/胰蛋白酶)进行消化,然后进行第二次胰蛋白酶消化4小时。通过加入三氟乙酸(1%)停止消化物。在消化后,如上所述,脱盐,干燥并重悬于肽并重新悬浮。

       液相色谱法

      ULC / MS级溶剂用于所有色谱步骤。每种样品加载一次(没有技术复制),使用较少的纳米超高效液相色谱法(纳米型;水分)。流动阶段如下:a,h2O + 0.1%甲酸; B,乙腈+ 0.1%甲酸。使用反相对称C18捕获柱(180μm内径,20mm长,5μm粒度;水)在线进行样品的脱盐。然后使用HSS T3纳米塔(75μm内径,250mm长度,1.8μm粒度;水)分离肽,在0.35μL/ min。对于BSA,Fetuin-A和Ar37,使用以下梯度在3小时内从柱中从柱中洗脱肽:4-30%B在140分钟,30-90%B在25分钟内保持,保持在95% 5分钟,然后返回初始条件。对于肌球蛋白,使用以下梯度在2小时内从柱中从柱中从柱中洗脱最小蛋白质:4-30%B在105分钟内,在15分钟内30-90%B,保持在95%5分钟,然后返回初始条件。

       质谱

      纳米UPLC通过纳米ESI发射器(10μm尖端;新物镜; Woburn,MA)连接到四极氧橡胶型射频仪(Q辐射加上,Thermo Fisher Scientific)(Proxeon) 。
      使用TOP20方法在数据相关的采集(DDA)模式下获取数据。 MS1分辨率设定为70,000(400 m/z),20 ms的最大喷射时间,扫描范围为300-1650 m/ z, 和3E6的AGC目标。 MS2分辨率设置为70,000,最大注入时间为120 ms,隔离窗口1.7 m/z和1E6的AGC目标。标准化的碰撞能量设定为30。

       数据分析

      使用峰值7.0软件(BioInformatics Inc,Waterloo,Ontario,Canada)进行分析原始数据使用 德诺维 模块用于点倾斜或使用数据库搜索模块进行分解效率的评估。对于BSA,Fetuin-A和肌蛋白,分析参数包括无酶特异性,无固定的修饰和可变修饰,如下:甲硫氨酸氧化,半胱氨酸氨基甲酰化,半胱氨酸羧甲基化和精氨酸瓜氨酸。对于Ar37(用IAC烷基化), 德诺维 参数包括无酶特异性,固定修饰半胱氨酸羧甲基化,以及如下的可变修饰:甲硫氨酸氧化,精氨酸瓜氨酸和谷氨酰胺与焦蛋白转化。父质量误差容差为10.0 ppm。片段质量误差耐受性为0.02 da。每种肽的最大变量ptm为5.未过滤 德诺维 序列肽(最小“平均局部置信度评分”= 0)被导出为“.csv”文件,并使用默认参数用作PTA的输入:K-MER大小= 7,K-MEL MIN重叠= 5,Unite重叠大小= 5,团结最小延伸= 7,合并最小质量= 0.7。
      对于AR37验证,搜索胰蛋白酶摘要,并将包含蘸倍数和光序列的数据库,以及123个常见的实验室污染物。搜索使用峰值算法的数据库搜索模块进行,参数指定非特异性消化,固定改性半胱氨酸羧甲基化,以及甲硫氨酸氧化,天冬酰胺/谷氨酰胺脱氨酸和N-末端天冬酰胺/谷氨酰胺的可变改性。基于逆转序列诱饵数据库搜索,在肽水平下以1%FDR过滤数据。
      PTA可执行文件和示例数据被提供为a 补充文件。质谱蛋白质组学数据通过骄傲沉积在Proteomexchange联盟中(
      • VizcaínoJ.A.
      • Csordas A.
      • Del-Toro N.
      • 戴安斯J.A.
      • 怜悯J.
      • Lavidas I.
      • Mayer G.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • Ternent T.
      • 徐Q.W.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      2016年更新自豪数据库及其相关工具。
      )与DataSet标识符PXD003804的合作伙伴存储库。 PTA工具可作为Windows可执行文件(补充材料)代码可通过 //bitbucket.org/incpm/dips.

      结果

       一代重叠肽

      DIPS基于重叠的组装 德诺维 将肽标记称为蛋白质的最终共有序列。为此目的,一个改进的Maah协议(首先在参考文章中描述。
      • 钟H.
      • 张Y.
      • 温Z.
      • Li L.
      受控蛋白水解后多肽梯子的质量分析蛋白质测序。
      )被开发为一种简单,经济效益和快速的方法,可在半无规肽键处切割蛋白质,从而产生序列重叠的肽,其覆盖全蛋白质序列。
      由于沿多肽链的不同肽键的物理和化学性质,因此通过浸渍产生肽标签的过程不是完全随机的。为了增强随机化,基于从经过NANOLC-MS / MS的BSA水解产物和标准数据库搜索作为基准测试的BSA水解产物鉴定的最高数量的唯一肽进行了优化了该过程的每个步骤。优化参数包括水解时间(补充图。S1),固相提取洗脱(补充图S2)和肽碎片的标准化碰撞能量(NCE)(补充图S3 )。

       De Novo肽标签确定和共识序列组件

      在Maah处理后,对所得水解产物进行纳米-Sm / ms和 德诺维 使用商业峰值7.0软件进行肽测序。我们开发了一种指定肽标签汇编器(PTA)的算法,用于从峰值中提取自信的肽标签 德诺维 基于De Bruijn图形方法,产出及其组装进入共识Contigs。在这里,我们将“肽标签”称为高置信部分 德诺维 测序肽。 Fig. 2 包含PTA逻辑和操作方法的详细描述。从单个种子序列开始,该算法将生长的Contig的末端延伸到下一个位置的最有可能的残留物(在发生和置信区段),如峰值所示 德诺维 输出。在使用所有独特的肽标签作为种子的初始CentIG组件之后,PTA执行若干细化步骤,包括将类似的ContiG的合并成共识序列,如果在它们之间存在足够的重叠,则这些合并的Condigs将这些合并的Contig在它们之间存在足够的重叠,则它们将这些合并的Condigs集成到更长的Contig中。 PTA输出几个文件总结分析的分析结果,包括HTML报告(补充图S4 )。
      图缩略图GR2.
      图2。 PTA算法设计和理由。 PTA的输入是未过滤的峰值 德诺维 肽测序输出。我们将K-MER定义为具有K氨基酸的肽。 PTA有四个阶段: 阶段1, 预处理,旨在维持最大数量的肽标签,同时去除低自信的序列分配。理由,噪声过滤减少了不正确标记的组装。 第2阶段, CONTIG延伸,尚未组装的每个K-MER用作使用所有原始K-MERS组装最长的CONTIG的种子。基本原理,偶尔正确的K-MER肽不会具有最高的出现次数,除非用作种子,否则不会用于组装。 第3阶段, CONTIG合并,CONTIGS对齐并合并以产生最长的序列。基本原理,Contig组装的过早终止(PTA阶段2)是由于延伸不正确的残留物。重叠终止点的正确序列可以在另一个COLDIG中找到通过正确的k-mer或沿相反方向延伸(正确序列的组装不会终止于该点,因为有正确的K-MERS进一步扩大)。 第4阶段, 序列细化,评估化学残留物是否转化(GLN到Glu或ASN到ASP)发生在给定位置或是否在组装过程中纳入错误。所有肽均在组装序列上对齐,并进行每个位置评估。理由,在特定位置剩余未转化的残留物在Maah之前揭示了它们的身份。此外,通过酶消化产生的肽标签可以另外通过PTA用于解决化学转化含糊不清。
      先前已经据报道了某些游离氨基酸在酸水解期间被修饰(
      • Fountoulakis M.
      • lahm h.w.
      蛋白质水解和氨基酸组成。
      ,
      • inglis a.s.
      • Nicholls P.W.
      • roxburgh c.m.
      肽键的水解和氨基酸改性氢酸。
      )。通过检查部分正确的MS / MS光谱 德诺维 已知肽的作用,我们发现,除了未报告的修改之外,还发现这些修饰中的一些修改也来自Maah,除了未报告的修改( 表I. ),并在数据分析中考虑它们。
      表I. 通过微波辅助酸水解样品制备所产生的氨基酸改性
      Maah改性残留物修改大规模转移等同的质量残留物
      asn. 脱染 +0.98402 asp.
      GLN. 脱染 +0.98402 glu.
      arg 柑橘系 +0.98402
      Cys. 羧甲基化
      a 当IAA用作烷基化剂时,大多数半胱氨酸是羧甲基化的,其余的是氨基甲酰化。当使用IAC时,只发生半胱氨酸羧甲基化,因此可以被认为是固定改性 德诺维 sequencing.
      +58.00548
      a 当IAA用作烷基化剂时,大多数半胱氨酸是羧甲基化的,其余的是氨基甲酰化。当使用IAC时,只发生半胱氨酸羧甲基化,因此可以被认为是固定改性 德诺维 sequencing.
      谷氨酰胺和天冬酰胺分别脱氨酸分别为谷氨酸和天冬氨酸,在MAAH期间非常常见。在某些情况下,原始Gln或Asn残基的很少或没有证据仍然在水解产物中用于特定的残留位置,特别是对于沿蛋白质序列的覆盖差的区域。在这种情况下,在组装期间在这些特定位置期间选择Glu或Asp残基。在决定没有关于残留物的身份的决定( 例如 潜在的序列变体,垂侧的Gln / glu,Deamidated Asn / Asp),介绍PTA HTML报告的顶部面板和它们的覆盖范围(“具有潜在歧义/变体”的序列)。 补充图S4)。最终序列决定在报告的中间人面板上(“最终共识序列”, 补充图S4),其中所选残留物在其中进行颜色编码,以便在分配方面的置信度。不同胞亮氨酸和异亮氨酸不能在MS / MS光谱中区分,因此在所有相关位置的PTA报告的LEU被认为是“黎鲁或ILE”。最后,PTA沿着共识序列报告每个位置的序列覆盖率( IE。 覆盖此位置的肽标签数)(“覆盖图”,底板, 补充图S4 )。

       基准倾斜

      对于基准倾斜,将其应用于含有BSA(583氨基酸)的样品,一式三份的牛氨基蛋白(153个氨基酸)或牛Fetuin-A(342个氨基酸)。选择这些蛋白质的大小和结构的多样性。每个实验的单个得到的contig匹配相应的已知蛋白质序列,精度为99-100%,覆盖100%的序列(在加工N-末端甲硫氨酸后,在相关的N-末端甲硫氨酸加工后)(Fig. 3)。唯一的排序错误是两个残留物交换的结果( 例如 “ASP-Pro”而不是“Pro-ASP”)或ILE:Leu,Deamidated Gln:Glu和Deamidated Asn:ASP模拟的结果,所有这些都被PTA识别为潜在的歧义。我们表明,将肽标签从基准蛋白质的胰蛋白酶消化的额外单一分析中掺入PTA,正确解决了大多数歧义(补充图S5 )。
      图缩略图GR3.
      图3。 基准蛋白的汲取结果。 Equine myoglobin (A ),BSA( B),牛蕨 - a(C)以三份酸盐进行浸渍。 PTA输出序列与每种蛋白质的已知序列对齐。对准不匹配,这是异甲硅/ leu,脱甜的gln / glu( 绿色 )或致弯曲的ASN / ASP( 黄色的 )含糊不限于准确性计算中的排序错误。突出了两个残留的交换 蓝色的 .

       抗体AR37的序列测定

      在oonco-免疫学中产生新兴的治疗策略是利用抗体来使用免疫疗法来控制肿瘤生长或消除癌症。我们试图展示蘸治疗抗体研究的效用。 Amphiregulin是表皮生长因子(EGF)家族的成员,并已被抑制单克隆抗体靶向(
      • Carvalho S.
      • Lindten M.
      • Lauriola M.
      • Shirazi N.
      • sinha s.
      • 阿卜杜勒 - 海A.
      • Levanon K.
      • Korach J.
      • Barshack I.
      • 科恩y.
      • ONN A.
      • 磨坊G.
      • yarden y.
      对amphegegulin的抗体,患者液体中丰富的生长因子,抑制卵巢肿瘤。
      ,
      • Lindten M.
      • Carvalho S.
      • 斯塔尔A.
      • 本队列N.
      • PRADEEP C.R.
      • Köstlerw.j.
      • Rabinkov A.
      • 拉维斯
      • Bacus S.S.
      • yarden y.
      包含EGFR和ERBB-4的重组诱饵抑制肿瘤生长和转移。
      ,
      • 法拉罗D.A.
      • Gaborit N.
      • Maron R.
      • Cohen-Dvashi H.
      • Porat Z.
      • Pareja F.
      • 拉维斯
      • Lindten M.
      • 本队列N.
      • Sela M.
      • yarden y.
      通过抗体与EGFR组合抑制三阴性乳腺癌模型。
      )。其中一种Ar37,选自Ampheregulin敲除小鼠,并显示出延迟人肿瘤细胞的生长 体外 体内 (数据未显示)。选择作为浸渍的测试用例,因为当使用在侧翼的节省区域的标准底漆混合物时,CDNA扩增和测序未能产生产品。
      对于更深的覆盖范围和改进潜在的模糊的分辨率,来自单个MAAH制剂的两个实验的肽标签(一个LC-MS / MS实验,然后是另一个包含自信的排除列表 德诺维 来自第一个实验的测序肽)和一种试验中的一个实验均包括在分析中。试图改善 德诺维 遍布二硫键的肽的测序(
      • Samgina T.Y.
      • vorontsov e.a.
      • 戈尔科夫v.a.
      • Artemenko K.A.
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      • 汉瓦蒂B.
      • Schmitt-Kopplin P.
      • Zubarev R.A.
      • lebedev a.t.
      新型半胱氨酸标签,用于对非胞外非胰蛋白酶二硫化物肽测序的标签:ESI-MS对碎裂效率的研究。
      )预期在样品制备期间用作抗体测序中至关重要的抗体测序至关重要,而不是IAA。通过IAC的半胱氨酸烷基化结果在羧甲基化(+ 58.00548AD)中,因此还具有在分辨含糊不清的亚氨基化碱化的碱化的增加的益处,这是异甘油甘氨酸和氨基甲酰基(+ 57.02146Da)的结果。在我们的手中,IAA在典型的自下而上的工作流程中肽鉴定方面比IAC烷基化更好,但是对于二硫化蛋白的浸渍,应考虑与IAC的烷基化。 N-末端谷氨酰胺的环化至焦醛酸盐是重组单克隆抗体的常见修饰(
      • 刘H.
      • Ponniah G.
      • 张zh。
      • Nowak C.
      • 内尔A.
      • gonzalez-lopez n。
      • Patel R.
      • 郑G.
      • Kita A.Z.
      • 和 rien b.
      体内体外 重组和人IgG抗体的修饰。
      因此,被包括为峰的可变修改 德诺维 肽测序分析。适用时,PTA还报告了在相关位置处的吡葡萄酒,谷氨酰胺和谷氨酸的出现次数。 DIPS分析导致三个折叠。由于假设样品中的蛋白质的先验知识,因此通过使它们进行爆炸搜索来执行三个折叠的初始表征。
      Contig1长达215个残留物。 BLAST搜索显示CONTIG1至G0YP42小鼠抗人类Langerin2G3Λ型轻链的接近完美的身份(补充图S6)。在预测信号肽的切割后,Contig1的第一个残留物对准第一G0YP42残基。 G0YP42的恒定区域与CONTIG1完美地匹配(具有一个脱码-Q / E模糊性),并且可变区域仅不同五个位置。有趣的是,CONTIG1的第1位的大多数谷氨酰胺残留物被修饰为焦蛋白。
      Contig2是363个残留物,并且与鼠IgG重链I6L985对齐,具有几个差异的可变区,其中大多数位于预测的超可变区(CDR 1-3)(补充图S7)。 Contig2的第一个残留物对准预测信号肽后的I6L985的第一残基对准。 Contig2还涵盖了大多数鼠IgG恒定区域,但相邻残余物的弱证据导致本网站上的组件过早终止。如轻链的情况,浸渍显示,将一部分N末端谷氨酸残基的谷氨酸残基进行修饰至焦蛋白(补充图S7)。 CONTIG3覆盖其余的重链恒定区域,除了CONTIGS之间不良的23个残留物(补充图S7 )。

       蘸蘸确定的AR37序列

      抗体序列的初始验证包括使用峰值算法的数据库搜索模块通过DIPS确定的序列搜索的胰蛋白酶消化和数据库。数据库搜索分别为光和重链的96或99%的序列覆盖率,具有支撑每个胰蛋白肽的多种光谱。两个可变区都有100%序列覆盖率(补充图S6和S7)。唯一的不受支持的序列富含胰蛋白酶裂解位点,因此预计会产生太短暂的胰蛋白酶肽,无法识别。
      接下来,基于通过浸渍到具有已知DNA序列的抗体链确定的氨基酸序列的近似同源性,侧翼了重链和轻链的可变区的引物是定制的并且用于通过PCR从cDNA中扩增可变区AR37杂交瘤。确定了整个重链可变区的确信cDNA序列,而轻链可变区的DNA测序质量在沿序列的几个位置次开。尽管如此,所有自信cDNA序列的翻译证实,通过浸渍测定的抗体氨基酸序列是100%精确的(Fig. 4 )。
      图缩略图GR4.
      图4。 AR37的DIPS结果。 使用单一Maah制剂的两个纳米UPLC-MS / MS实验和胰蛋白酶消化的一个实验进行AR37。得到的组装成的CONDIG1和2与重的重量(B)和轻链(A)可变区,其基于与确定序列同源的蛋白质的基因进行PCR扩增和测序。

       比较PTA,ALP和MSPS

      两种先前发表的蛋白质方法 德诺维 测序,MSP和ALPS,基于蛋白水解消化和DE BRUIJN图组装。我们比较了这些方法的PTA组装性能,与肽的产生或肽的方式无关 德诺维 通过将PTA施加到来自阿尔卑斯山和MSP的公布数据,并通过将阿尔卑斯申请到我们的BSA和AR37抗体数据来获得序列。尽管努力,但我们无法使用MSPS分析我们的Maah衍生水解产物数据。
      用于比较的关键参数 德诺维 蛋白质排序方法如下:测序精度,总序列覆盖率,以及覆盖蛋白质全长的折叠数。后者对于测序真正未知的蛋白质或未知的序列区域,例如抗体中的可变区是至关重要的。该方法产生的单独碎片的葡萄片越多,对于给定的蛋白质产生的方法越具挑战性,所述全蛋白质序列的测定变得更具挑战性。
      PTA专门设计和优化,用于组装肽标签 德诺维 测序Maah加工蛋白质。由于肽键随机水解,这些数据以小的覆盖率和高重叠的较小覆盖率,以及在肽的背景下的某些残基的Maah衍生的化学修饰。因此,MAAH数据可能与酶消化数据不同,这导致较低的序列覆盖,这导致较少的肽覆盖每个残留物,因为消化不是随机的并且发生在特定的残基。肽之间的重叠可能大量增量(取决于分析的蛋白质序列和所用的蛋白酶),并且不预期由蛋白水解产生的显着的化学修饰。因此,除了BRUIJN图组件外,PTA还执行多个预处理步骤( 例如 用天冬氨酸和所有谷氨酰胺用谷氨酸替换所有糯酰胺,同时跟踪改变的肽标签)和CONTIG细化步骤( 例如 合并并根据其相似性和重叠结束结束折叠,以适应MAAH数据的这些特征(Fig. 2 )。

       PTA与阿尔卑斯州,水解酸盐

      最初,我们使用BSA和AR37抗体的水解数据进行比较PTA和AlP。尽管输入数据相同,但PTA使用一个COLDIG达到BSA的完全覆盖,而Alps需要六个(Fig. 5A)。对于抗体轻质和重链,PTA报告了覆盖了两条链的三个葡萄片,而阿尔卑斯醛仍未达到可比覆盖率,即使在包括20个葡萄片之后,也没有如此 Fig. 5B。此外,阿尔卑斯苜蓿产生的葡萄片覆盖着轻链的CDR3,这是抗体最可变的区域,并且是其表征的关键。此外,正如预期的那样,阿尔卑斯苜蓿不能识别Maah衍生的天冬酰胺和谷氨酰胺的脱胺,并分别报道了大部分这些作为天冬氨酸或谷氨酸。这强调了Maah和PTA的卓越性能 德诺维 蛋白质的测序。
      图缩略图GR5.
      图5。 PTA和ALPS装配性能对MAAH数据的比较。 BSA (A)和AR37(B经受Maah和胰蛋白酶消化的抗体,然后是LC-MS / MS,肽 德诺维 测序,PTA和阿尔卑斯山脉分析。从每种算法的输出所取的顶部成像的数量符合真正蛋白质序列的累积序列覆盖。

       PTA与阿尔卑斯州和MSP,酶消化

      接下来,我们开始比较三种算法在酶消化分析中。 TRAN的表III 等等。 (
      • tran n.h.
      • Rahman M.Z.
      • Xin L.
      • 山B.
      • 李米
      完整的单克隆抗体序列组装。
      )提出了阿尔卑斯山和MSP之间的比较,其中通过造影从纸张中的6蛋白混合物中获取的数据 等等。 (
      • Guthals A.
      • 克劳瑟K.R.
      • 弗兰克上午
      • Bandeira N.
      测序级 德诺维 分析来自重叠肽的MS / MS三态(CID / HCD / ETD)。
      )通过阿尔卑斯山分析。 表二 是那个表的适应。 PTA的输入是AlPS'De Bruijn组装器使用的肽(PSM-DDS)的相同列表。当应用于该蛋白水解消化数据时,省略了PTA对Maah数据进行了优化的预处理和细化步骤( IE。 谷氨酸和天冬酰胺未被替换,结果指的是PTA的“COLIGS.CSV”输出文件,见 Fig. 2 )。
      表二使用蛋白水解摘要数据作为输入组装MSPS,ALP和PTA之间的性能比较
      从相同的输入数据开始,PTA与ALPS相当或略好更好,并且在几乎每个参数中都比MSPS更好(表二)尽管PTA未针对酶消化而优化,而是针对Maah衍生数据。

      讨论

      dips是第一种促进快速的方法, 德诺维 蛋白质的全长测序。我们证明可以通过几乎完美的准确度实现可变尺寸的全长蛋白质序列,而不使用参考数据库,参考爆炸同源物或分析蛋白质的先验知识。另一个出版的方法试图达到相同的目标,MSP和ALPS(
      • Guthals A.
      • 克劳瑟K.R.
      • Bandeira N.
      霰弹枪蛋白质测序与meta-contig组件。
      ,
      • Bandeira N.
      • 克劳瑟K.R.
      • PEVZNER P.A.
      霰弹枪蛋白测序:从改性蛋白质的混合物中组装肽串联质谱。
      ,
      • Guthals A.
      • 克劳瑟K.R.
      • 弗兰克上午
      • Bandeira N.
      测序级 德诺维 分析来自重叠肽的MS / MS三态(CID / HCD / ETD)。
      ,
      • tran n.h.
      • Rahman M.Z.
      • Xin L.
      • 山B.
      • 李米
      完整的单克隆抗体序列组装。
      ),要求用多种蛋白酶消化并分开每种消化的分析。为了最佳性能,阿尔卑斯醛需要含有分析蛋白质的同源序列的数据库,MSP需要不同的采集模式。这些程序是劳动密集型,昂贵,资源要求的,并且仍然导致分析的蛋白质的碎片组装和部分序列覆盖。
      倾斜中的关键特征之一是Maah的应用,这不限于裂解特定残留物,从而有利于酶促消化,其能够在任何序列的任何位置产生多重重叠肽的能力。另外,在MAAH蛋白期间,假设由于高温和低pH而完全变性,从而消除了在典型的消化条件下在蛋白质的三维结构中不可溶剂可溶剂的肽键切割的偏差。肽的输出 德诺维 在所发现的Maah相关化学修饰的情况下,产生的水解产物的测序分析,为DE Bruijn图组件提供了大大改进的数据集与由于高覆盖和肽重叠而导致的酶消化。 PTA专为此类型的数据而设计和培训。虽然MSP和ALPS也使用DE BRUIJN图形方法,但PTA使用几个额外的预处理和改进步骤来提高组装的CONTIGS的长度和精度(Fig. 2 )。
      例如,由于MAAH期间ASN和GLN脱次的高频率,在组装之前,所有ASN和GLN的所有情况都分别由ASP和GLU代替,同时注意到改变的肽标签。 Maah之前的原始残留物的测定仅在Contig组装,合并和联合之后的最终细化步骤中进行,其中肽标签(包括改变的)被映射回组装到组装的CONTIG,以及改进的/未改性的残余比评估。此时,如果存在的实质证据存在,则在最终的HTML报告中也会评估和报告其他序列变体。
      PTA是唯一解决蛋白质组装的衍生修改和其他序列变体的唯一算法,它提供了用于评估组装序列的工具。
      由于MAAH的随机蛋白质切割,序列紧密接近的多种肽标签用作组装的种子,并导致相同或相似的COLIGS。 PTA对所有类似的Contigs进行CONTIG合并细化步骤,进入最可能的共识序列。然后执行单一的重叠共识Contig的额外细化步骤。虽然未优化酶消解作为输入,但我们试图将PTA的性能与阿尔卑斯山和MSP进行比较。为此目的,我们将PTA施用于用于ALP和MSPS基准测试的6蛋白混合物的已发表的蛋白水解消化数据。或者,我们使用阿尔卑斯山分析了我们的BSA和AR37数据集。对于蛋白水解化摘要数据,在最长组装的CONTIG的长度,精度和序列覆盖的长度方面,PTA与ALPS相当于ALPS和MSP。然而,对于Maah数据,PTA优于阿尔卑斯山。使用 德诺维 仅限测序肽(无需额外的数据库搜索结果),ALPS导致BSA和AR37的碎片化组装,与PTA的近乎完美的组装相比,具有多个较短的和非重叠的Contig。虽然PTA在所有相关位置正确地确定了Maah衍生的Gln和Asn Deamidation事件,但少数例外,Alps错误地报告的Glu和Asp在大多数这些位置。
      我们证明了含有单个蛋白质的样品的准确测序(或用于AR37抗体的两种多肽链,重和光的混合物)。然而,复杂性较高的样品可能导致较差的序列覆盖范围和因此分散的组装。这 补充表S1 列出增加覆盖范围的可能方法,从而改善组装。额外的 德诺维 从部分正交分析程序获得的肽标签(使用不同蛋白酶的蛋白水解,正常相LC-MS / MS,不同的碎片技术,不同 德诺维 算法等)还可以在特定覆盖的蛋白质位置增加覆盖并允许组装复杂样品。就像其他人一样 德诺维 方法,使用参考数据库或爆炸同源物(如果可用)可以有助于组装碎片浸渍序列Contigs。

       翻译后修改

      DIPS的目标是解决蛋白质的主要序列。最初,DIPS数据分析以肽开始 德诺维 使用参数测序,包括仅氧化氧化和Cys氨基甲酰化/羧甲基化作为可变修饰,同时忽略所有其他修改。为了确定PTM存在和位置,可以使用允许感兴趣的PTM作为可变修改的参数的数据库对包含DIPS确定的序列的数据库的标准数据库搜索相同的原始数据。事实上,Maah肽粘合裂解的随机性可以解析MS / MS不稳定修饰的精确位置,其中存在多个潜在的修改位点( 例如 确定哪种残基在含有磷酸化序列的蛋白质中磷酸化“ XXXX. 英石 XXXX. “通过鉴定Maah-生成的肽” XXXX. sp“但不是”tp XXXX. “)。先前据报道了Maah和数据库搜索的使用,以便磷酸化本地化(
      • 王恩。
      • Li L.
      使用家用微波炉的蛋白质的可再现微波辅助酸水解及其与LC-ESI MS / MS的组合用于映射蛋白序列和修饰。
      ,
      • 苹果电脑。
      • 曲J.
      • Meisner J.
      • 赵X.
      • 李X.
      • 吴Z.
      • 朱H.
      • yu z.
      • Li L.
      • 郭y.
      • 宋J.
      • 王P.G.
      方便和精确的映射策略 N - 使用微波辅助酸水解和特征离子识别的糖基化位点。
      ) 和 N-Glycosylation,并且理论上可以遵循类似的程序,以定位不是Maah稳定的所有其他PTM(或导致由于Maah引起的可预测的修改产品)。
      如果未在肽中未指定修饰,则不会测序修饰的残余物 德诺维 测序参数,这可能导致在倾角期间对Contig组装的不利影响。然而,即使经常修饰蛋白质的特定位置的残留物,在数百万分子的相同蛋白质的群体中,也可以导致肽标签可用于组装蛋白质的肽标签。因此,除非修饰特定位置几乎所有氨基酸拷贝,否则导致覆盖未改性残余物的肽标签,仍然可以测序蛋白质的全长。如果怀疑特异性修饰以在给定样品中占据某些残留物,则与单克隆抗体中的n末端焦蛋白,肽的参数时,肽的参数是如此。 德诺维 可以针对该特定样本定制测序,并且可以定义不同的可变修改。
      在这项工作中,我们表明DIPS检测到AR37抗体的轻质和重链中的N-末端谷氨酰胺或谷氨酸常转换为焦蛋白(补充图S6和S7)。通过浸渍检测改性和未改性的N-末端谷氨酰胺或谷氨酸残基的能力可以为制造环境中测序的单克隆抗体提供质量控制。

       信号肽,切割位点和终端的测定

      蛋白质末端的特征可以对蛋白质功能,稳定性和定位产生重大影响。即使存在基因注释和预测的蛋白质产物,也可能由于各种因素而容易推断成熟蛋白质的末端,包括蛋白质截短,降解,蛋白水解,转录/翻译的替代引发或通过使用分泌物信号肽。 Maah然后是数据库搜索以前用于Termini表征(
      • 陈L.
      • 王恩。
      • 太阳D.
      • Li L.
      蛋白质的微波辅助酸水解结合肽分馏和质谱分析表征蛋白末端序列。
      )。在这里,我们表明,浸渍能够精确且可重复地确定所有分析的蛋白质的N和C Termini,因为蘸料的第一和最后一个残留物确实是各种成熟蛋白的N-和C末端残基。唯一的例外是AR37重链组装中预终止的结果( IE。 CONTIG2的最后残留物不是AR37重链的C末端残余物,并且CONTIG3的第一个残余物不是第一个N-末端残基)。然而,因为这种终止发生在抗体的恒定区域中,所以手动检查很容易解决这个问题。此外,在最终改进步骤之前,可以在顶部组装的Contig中找到大部分剩余的“缺失”序列的证据。
      BSA和Fetuin-A以及AR37的光和重链是所有分泌的蛋白质,具有切割的信号肽。在蛋白质成熟期间裂解的信号肽后,BSA还具有6-残基长的肽(
      • Waldmann T.
      • rosenoer V.
      • 奥拉茨米
      • Rothschild M.
      )。标牌肌蛋白是细胞内蛋白质,其N-末端甲硫氨酸在蛋白质合成后加工(
      • 杰恩W.
      • 病房L.D.
      • 里德G.E.
      • 莫里茨R.L.
      • SIMPSON R.J.
      蛋白质的内部氨基酸序列 原位 聚丙烯酰胺凝胶中的氰基溴化物裂解。
      )。通过确定精确的开始残留物,浸渍有效地鉴定了各种成熟蛋白的切割位点。
      总之,DIPS表示突破性的数据库无关,全长蛋白质测序方法。我们预计浸渍将在诸如抗体或T细胞受体的未知序列的测序中的蛋白质中的仪器。此外,由于其能够通过精确度确定蛋白质终端,因此DIPS表示解决具有挑战性的问题,例如信号肽或底物切割位点的挑战性问题。

      数据可用性

      PTA可执行文件和示例数据作为补充文件提供。质谱蛋白质组学数据通过骄傲(12)伴侣储存库(//www.ebi.ac.uk/pride/archive/)使用DataSet标识符PXD003804。 PTA工具可作为Windows可执行文件(补充信息),并且代码可通过 //bitbucket.org/incpm/dips.

      致谢

      我们感谢Tel Aviv大学Itai Benhar教授,在方法开发期间讨论富有成效的讨论。我们还感谢Weizmann科学研究所Rami Jaschek博士,为PTA的早期发展提供帮助。

      补充材料

      参考

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