细菌纤维素将培养的内皮细胞的转录组和蛋白质组移动到天然分化*

      保留原代细胞的本机表型体外是一个复杂的挑战。最近,水凝胶基细胞基质已经进化为常规细胞培养技术的替代品。我们开发了一种基于细菌纤维素的凝胶状生物材料,被称为氧化林,其模仿细胞微环境,似乎保持培养和原代细胞的天然表型。当施用于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)时,它允许连续培养细胞单层超过一年而不会降解或去除湿。为了详细探讨氧化林蛋白对内皮细胞表型的影响,我们应用定量转录组和蛋白质组学,并将天然Huvec的分子构成与胶原涂层氧化茄蛋白和胶原涂层细胞培养塑料(聚苯乙烯)进行了比较。
      统计分析12,475转录物和7831个蛋白展开含有比较的转录瘤和蛋白质蛋白酶的大规模定量差异。K - 梅尔斯聚类随后是网络分析表明,Huvec在塑料上调转录物和蛋白质控制增殖,细胞周期和蛋白质生物合成。相反,Xellulin的Huvec维持,By和大,基因的表达水平支持其天然生物功能和信号传导网络,例如整联蛋白,受体酪氨酸激酶MAP / ERK和PI3K信号传导途径,同时降低增殖相关蛋白的表达。此外,CD34-在细胞培养期间通常损失的内皮细胞分化标志物 - 在氧化林林的2周内重新表达,但不在塑料上重新表达。 Xellulin的Huvec与塑料上的uvec表现出显着更强的功能性反应性比Huvec在塑料上的功能敏感性。
      在一起,这是天然和传播Huvec的最全面的转录组和蛋白质组学研究之一,强调了细胞微环境的形态来调节细胞分化的重要性,并首次证明Xellulin作为多功能的潜力工具促进A.体内 - 在原发性和繁殖细胞培养中的表型。
      原发细胞培养 体外 是建立良好的模型系统,以分析定义的实验条件下的不同细胞反应,以研究疾病机制并鉴定推定的治疗选择。然而,原发性细胞培养仍然受到生物学以及实验约束的影响。常规细胞的培养物几乎总是与刺激增殖和细胞活性的培养条件相关。结果,在重复在培养物中繁殖时,表型可能是不稳定的并且促进原代细胞的消化剂(
      • Reischl J.
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      影响体外原发性牛输卵管上皮细胞增殖和去除率的因素。
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      哺乳动物心肌细胞的消化膜和增殖。
      )。此外,还通过机械性能调节细胞分化 体内 microenvironment (
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      基质刚度在调节细胞行为中的作用。
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      动脉僵硬,血管疾病和心血管事件的风险。
      ),刚性和疏水性塑料表面上的常规细胞培养物可以引起表型改变(
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      • 周H.
      不同刚度衬底上的人脐静脉内皮细胞实时PCR可靠参考基因的验证。
      ),最终促进差异 体内体外 生物学模型。出现了多种技术,以更好地模仿细胞微细环境的机械和调节性能,包括原发细胞的两维培养,包括天然,合成和半合成细胞外基质,合成或生物水凝胶(
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      合成生物材料作为组织工程中的形态发生的指导细胞外微环境。
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      细胞外基质的合成模拟:足够复杂的复杂程度如何?
      )。而且,使用支架和基质开发了各种方法,以促进细胞附着并产生生物造成组织 体外 (
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      从组织工程到泌尿外科再生医学 - 潜在和陷阱。
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      人类软骨细胞在工程多孔细菌纤维素支架中的行为。
      ),是细菌纤维素(BC)
      使用的缩写是:BC,细菌纤维素; Bh,Benjamini-Hochberg; DAPI,4',6-二氨基-2-苯基吲哚; FCS,胎牛血清; FDR,虚假发现率; GSEA,基因设定富集分析; Huvec,人脐静脉内皮细胞; LC-MS / MS,液相色谱串联质谱; MACE,CDNA的大规模分析结束; PCA,原理成分分析; ROS,反应性氧气物种; TMT,串联质量标签; TPM,百万标记。
      1使用的缩写是:BC,细菌纤维素; Bh,Benjamini-Hochberg; DAPI,4',6-二氨基-2-苯基吲哚; FCS,胎牛血清; FDR,虚假发现率; GSEA,基因设定富集分析; Huvec,人脐静脉内皮细胞; LC-MS / MS,液相色谱串联质谱; MACE,CDNA的大规模分析结束; PCA,原理成分分析; ROS,反应性氧气物种; TMT,串联质量标签; TPM,百万标记。
      。这种潜水糖,由线性组成 d由β(1-4)糖苷键链接并合成的葡萄糖分子 葡聚糖杆菌木龙,是纯粹的,具有机械强度,孔隙率,生物相容性和非晶胞生物降解性 体内 (
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      细菌纤维素及其复合材料在生物医学中的应用。
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      • 汗科
      • Kim Y.
      • 公园J.K.
      无细胞系统产生的生物纤维素的结构和物理机械表征。
      )。
      为了评估细胞培养中BC的潜力,我们开发了一种基于BC的水文生物材料,作为细胞培养载体,称为氧化林蛋白,并在Xellulin的细胞培养物中获得各种细胞类型。鉴于内皮细胞对(肿瘤相关的)血管生成,凝血,炎症和内皮内的其他过程的生理和药理研究的意义(
      • Bevilacqua M.P.
      • 清醒J.S.
      • Majeau G.R.
      • Cotran R.S.
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      白细胞介素1(IL-1)诱导人血管内皮细胞中促凝血活性的生物合成和细胞表面表达。
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      • Klingberg H.
      • 阁楼S.
      • 奇德德L.B.
      • Moller P.
      流动,剪切应力和粘附分子靶向人内皮细胞金纳米粒子摄取的影响。
      ),我们因此研究了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)对氧化铝的分化,以示例性展示该BC用于细胞培养目的的通用性。
      在这里,我们证明,在胶原涂覆的氧化林蛋白上培养的繁殖Huvec的转录组和蛋白质组学表型保留了天然表型的重要特征,包括减少增殖相关蛋白的表达,以及整联蛋白和受体酪氨酸激酶信号传导,地图/ ERK和PI3K的持续表达信号传导途径和麋鹿,MEF和NFAT转录因子。我们的研究还揭示了胶原涂覆的氧化林蛋白诱导内皮分化标志物CD34的重新表达,并且可以刺激静脉葡萄状单层以获得氧化林蛋白的活化表型。这些结果表明了BC一般的潜力,特别是Xellulin,作为促进促进的通用细胞培养基 体内 - 在原发性和繁殖细胞培养中的表型。

      实验步骤

       细菌纤维素的氧化林蛋白的制备

      氧化林是基于BC的天然聚合物。这种潜水糖由来自菌株的真实培养物合成 葡聚糖杆菌木龙 (Leibniz-Institut Dsmz - Deutsche Sammlung Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,Braunschweig,德国,DSM 2325)。 Xellulin根据Hofinger的修饰过程中的扁平床生物反应器中生产 等等。 (
      • Hofinger M.
      • Bertholdt G.
      • Weuster-Botz D.
      膜生物反应器中均匀分层纤维素颗粒的微生物生产。
      )。收获的Xellulin片材在0.2中清洁 m Naoh(Carl Roth,Karlsruhe,德国),然后在蒸馏水中洗涤。从薄的氧化刀板上切出光盘并安装在框架上。这些所谓的Xell盘适合于6孔和24孔细胞培养板格式,以及6孔格式的Xell盘被用作本研究中对Huvec的细胞培养支持。使用扫描电子显微镜(S.E.)检查Xellulin,如先前由Schulte所述描述 等等。 (
      • 舒德J.
      • Friedrich A.
      • Hollweck T.
      • Königf.
      • EBLENKAMP M.
      • Beiras-Fernandez A.
      • Fano C.
      • Hagl C.
      • AKRA B.
      血管组织工程的一种新型播种和调节生物反应器。
      )。

       人脐静脉内皮细胞的分离与培养

      用来自六个帕拉斯的书面知情同意和以下道德准则进行与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的调查。出生后收集脐带,并在2-8°C下储存。 Huvec在出生后一到四小时内分离出预热的分散溶液(3.6-3.8 U / ml; Thermo Fisher Scientific,Darmstadt,Darmstadt,Darmstadt,Darmstadt)。获得的Huvec在细胞培养烧瓶中繁殖。 Huvec通道1以3.8×10的密度接种4 cells/cm2 在Xell-Discs(Xellutec GmbH,Neuried,Germany)已被涂有0.5mlCellovations®大鼠尾部(I型)胶原蛋白溶液(750μg/ ml在0.1%乙酸中; Pelobiotech GmbH,Martinsried,德国)。 Huvec在完整的内皮细胞生长培养基(Promocell,Heidelberg,德国)培养,补充有1%胎牛血清(FBS; Thermo Fisher Scientific)。 3周和6周后,Huvec用胶原酶型IV(500 U / ml; Thermo Fisher Scientific)分离。对于标准细胞培养,HUVEC通道1播种,密度为2.2×104 cells/cm2 在6孔细胞培养板(技术塑料制品AG,Trasadingen,瑞士)涂有1mlCellovations®大鼠尾部(I型)胶原溶液。将Huvec用完整的内皮细胞生长培养基加入,所述内皮细胞生长培养基共补充,总共1%或5%FBS。在细胞播种后2天收获汇合单层(细节 补充材料)。
      原生Huvec从六个脐带逐渐分离,然后传播(第0段)。在标准塑料细胞培养物中培养十个样品Huvec通道1和12个样品Huvec通道1。给出了实验设计的概述 补充表S1.
      此外,分别在氧化铝上培养一年和两个月的Huvec,在塑料软件上繁殖,然后在如上所述的氧化铝上重新种子。

       Huvec Monolayers的划痕测定

      为了评估肌肉蛋白的静脉蛋白的生理潜力,用100μL移液管尖端的划痕培养的Huvec单层培养胶原蛋白培养。作为对照,培养在胶原涂层培养板上的Huvec单层也被划伤。监测细胞行为2天。

       人脐带样品的组织学和免疫组织学

      将组织样品固定并嵌入低温恒温器,或使用标准方法进行链烷烃切片。将石蜡切片被脱碱化,再水化,然后根据标准方案用氮杂染色组织学上染色(补充材料)。将冷冻冻干与阻塞/渗透溶液一起温育。之后,施加针对血小板/内皮细胞粘附分子PECAM-1(CD31)和ZO-1)的一抗抗血小板/内皮细胞粘附分子PECAM-1(CD31)。通过与山羊抗小鼠IgG alexa Fluor 546孵育来检测抗体,以及山羊抗兔IgG Alexa Fluor 633二次抗体,然后与Sytox Green核酸染色孵育(补充材料)。

       Xellulin的Huvec免疫细胞化学

      用Huvec单层的氧化林蛋白固定,然后分别为CD31,von Willebrand因子(VWF)或CD 34分别染色,具有抗原特异性初级抗体(补充材料)。通过随后与Alexa Fluor 594山羊抗小鼠IgG抗体,抗兔IgG-FITC抗体或Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG抗体一起孵育结合的抗体。核用DAPI染色。为了表征Xellulin上播种的Huvec的表型,将来自相同起源的Huvec通道1另外地接种成脂素8孔μ载玻片(Ibidi,Martinsried,德国)。腔室滑动培养物固定并染色Von Willebrand因子(VWF)和CD31(补充材料)。
      为了比较与CD31和ZO-1免疫染色的脐静脉切片(见上文),固定在氧化林蛋白上的HUVEC,然后用阻塞/透氧溶液孵育。随后,将针对CD31和ZO-1的一抗涂覆在鸡尾酒中。通过山羊抗兔Cy3检测结合的抗体,或山羊抗小鼠Cy5二次抗体,然后与营工术核酸染色(补充材料)。

       显微镜

      用相对造影和荧光显微镜(Axio Observer.Z1,Carl Zeiss)进行CD31,VWF和CD34染色的塑料和氧化铝上的塑料和氧化林肽的图像。使用顺序的共用激光扫描显微镜(LSM 510 Meta,Carl Zeiss,Jena,Germany)使用顺序地利用顺序地获得人脐蛋白染色的人脐带上染色的Xellulin染色的Xellulin染色的Xellulin染色,ZO-1,CD34,VWF,Ve-Cadherin和血管翅流动素。扫描和适当的过滤器集(补充材料)。图像出口和图形面板使用Adobe Photoshop(San Jose,CA)组装。

       转录组和蛋白质组分析的实验设计与统计学理由

      实验设计总结在 Fig. 1A补充表S1。分析来自六个脐带的28个Huvec样品,对应于来自六种不同供体的天然Huvec,分别在Xellulin培养的2×5繁殖的Huvec(通道1),分别为3和6周,2×6繁殖Huvec(第1段)分别用1和5%FCS栽培于塑料上。我们使用MACE技术将所有28个样本的转录om,相当于每个条件的至少5个生物学重复。我们将对应于将供体匹配的生物三倍体的12个样品的蛋白质蛋白质体分析为Xellullin的繁殖Huvec 3和6周,并使用基于TMT10Plex的量化方法在1和5%FCS上繁殖Huvec。由于样品量有限,我们在蛋白质组研究中没有包括原生Huvec。此外,我们分析了使用无标记的强度的强度基于蛋白质组学方法的Xellullin和塑料培养物(用于TMT10PLEX量化的相同样品的池的蛋白质蛋白质蛋白质。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1本土和培养HUVEC的综合分子表征。 A, 实验设计。 B,表达基因的转录物和蛋白质水平的数量。 C,28个样品的转录谱的原理分析(PCA)。 D,分别分布10个叶绿素和12个塑料样品的双向皮尔逊相关系数分别, 相对 六个本机样本。这 p 价值已经用双面计算 t 试验假设差异不平衡。 E,匹配转录组和蛋白质组数据集的共识PCA。简而言之,共识PCA表示PCA的概括,这允许将多个OMIC水平叠加到同一空间中。这里,箭头底座代表转录组,箭头头蛋白质组。箭头越短,转录物和蛋白质谱之间的相似性越高。

       RNA制备

      对于来自天然Huvec的RNA分离,脐静脉用DPBS(1x)W / O Ca洗涤 &然后用5至7ml Rnaprotect Cell试剂(Qiagen,Hilden,德国,76526)孵育2分钟。将液体转移到离心管中。用DPBS(1×)W / O CA的另一个洗涤步骤之后&通过与预热(37℃)Gibcotm分离酶(3.6-3.8u / ml)孵育1小时,通过孵育来分离镁锰。将所有液体收集在一个离心管中。将细胞沉淀(5分钟,5000× g)弃去了上清液。
      为了从Huvec通道1中提取RNA,用DPBS(1x)W / O Ca洗涤细胞&用600μLRNAProtectCell试剂孵育2分钟。用细胞刮刀分离细胞并转移到离心管中。对于细胞产率的最大化,分别用额外的mL DPBS(1×)W / O Ca洗涤氧化林蛋白和塑料表面上的残留Huvec&将Mg和液体转移到先前使用的离心管中。沉淀脱离的细胞。
      根据制造商的协议,使用RNEasy Mini Kit(Qiagen,74104)分离并纯化RNA。将洗脱液储存在-20℃直至进一步加工。

       RNA量化和完整性

      用基线-Toons™DNA酶(Epicenter,Madison,Wi;由Biozym Scientific GmbH,Hessisch Oldendorf,Germany提供)制成所有RNA样品的DNase I,以确保样品完全没有DNA。随后使用RNA清洁纯化RNA样品&Conceptatortm-5套件(Zymo Research Europe,Freiburg德国)。用qubit1 2.0荧光计和qubit1RNA HS测定套件(Life Technologies GmbH,Darmstadt,德国)测量总RNA浓度。 RNA质量估计在德国Perkinelmer Rodgau的Labchip GX稀释系列中(软件版4.2.1745.0)。使用RNA完整性数(rin)估计所有样品的RNA质量(rin)(
      • 施罗德A.
      • 穆勒O.
      • 储料器S.
      • Salowsky R.
      • Leiber M.
      • Gassmann M.
      • Lightfoot S.
      • Menzel W.
      • Granzow M.
      • ragg t.
      rin:将完整性值分配给RNA测量的RNA完整性编号。
      )获得6.4和10之间的rin分数。

       转录组测序和定量

      使用CDNA末端(MACE)技术的大规模分析对HUVEC样品的转录组合,结合Truequant方法,消除并校正PCR引入的副本,从而能够更准确的转录组量化(
      • Zajac B.K.
      • Amendt J.
      • 恐怖r.
      • verhoff m.a.
      • Zehner R.
      使用MACE(CDNA末端大规模分析CDNA末端的CALLIPHORA VICINA(DIPTERA:CALLIPHORIDAE)蛹的DE Novo转录组分析和高敏感的数字基因表达分析。
      )。
      从每个RNA样品中,在cDNA 3'末端附近构建坐标cDNA文库的术靶向序列。 MACE如上所述由Genxpro GmbH进行(
      • Kahl G.
      • 莫里纳C.
      • 转子B.
      • jünglingr.
      • 弗兰克A.
      • Krezdorn N.
      • Hoffmeier K.
      • 冬季P.
      降低植物应激转录om的表示测序。
      ,
      • Zawada A.M.
      • Rogacev K.S.
      • Muller S.
      • 转子B.
      • 冬季P.
      • Fliser D.
      • 海伊尼克
      CDNA末端的大规模分析(坐标)和miRNA表达分析识别慢性肾病中的疗法途径。
      )。简而言之,在随机碎片与定向超声(Bioruptor,Diagode,Belgium)之后,通过链霉抗生物素蛋白涂覆的磁珠将多腺苷酸化的mRNA逆转录,并将所得cDNA固定用链霉抗生物素蛋白涂覆的磁珠。剩下的碎片被丢弃。 50-600 BP长碎片在从5'-末端开始的聚尾巴尾(单读)使用Illumina下一步SEQ500平台(Illumina Inc.,San Diego,CA),产生75bp长读数。 Illumina的控制软件用于测序和实时分析,然后是illumina对基础呼叫和解复用的序列和变异程序的共识评估。为了防止illumina测序的PCR偏置量化,应用了所描述的真正方法。

       E-Selectin mRNA表达测定

      通过2的Huvec在胶原蛋白I涂层塑料或氧化铝盘上播种。在〜2天后,细胞达到汇合,用5ng / ml人重组TNFα(HRTNFA,生物摩尔#50435,批次#2214-1)刺激3小时。随后,将细胞用冰冷的HBSS W / Ca洗涤一次2+/ Mg2 +并在300μlrlt-裂解缓冲液/ 1%β-巯基乙醇(qiagen)中裂解并在液氮中冷冻。根据制造商的说明(RNeasy Minikit,Qiagen Cat。No.:74106)根据制造商(Rneasy Minikit)分离。对于cDNA合成,根据制造商的协议(OMNIScript RT Kit,Qiagen,Cat。No.:205113)使用100ng RNA。使用以下引物和条件使用2.5μLcDNA进行PCR反应:HRPL32:前进5'GTTCATCCGCACCAGTCAG3',反向5'ACGTGCACATGAGCTGCCTAC3',5分95°C,循环:30 s,95°C,60°C,45 S,72°C,1分钟,24个循环,72°C 5分钟,369bp,He-Selectin:前进5'ttcgcctgtcctgaaggatg3',反向5'tcagttgaaggccgtccttg3',5分95°C,循环:30 s,95° C,55℃,45秒,72℃,1分钟,33个循环,72℃5分钟,474bp。将PCR产物分离在1%琼脂糖凝胶上,并使用GEL DOC XR +系统记录和数量一软件,版本4.6.9(BIO-RAD)。使用image J软件(1.49a)量化灰色强度。

       用于定量蛋白质组分析的样品制备和异差标记

      使用含有8的裂解缓冲液裂解Huvec m urea, 40 mm Tris / HCl(pH7.6),1×EDTA无蛋白酶抑制剂混合物(完全迷你,罗氏)。使用Bradford方法(Coomassie蛋白质测定试剂盒,Thermo Scientific)测定蛋白质浓度。减少蛋白质并用10米烷基化m Tris(2-羧乙基)磷(TCEP)在37℃下1小时,然后25米m 氯乙酰胺在室温下45分钟。用40米稀释蛋白质混合物m TRIS / HCl到最终尿素浓度为1.6 m。通过添加测序级胰蛋白酶(Promega,Mannheim,德国; 1:100酶/基板比)来消化50μg的蛋白质等分试剂,并在37℃下在37℃下孵育样品4小时。在37℃下加入另外1:100种胰蛋白酶用于过夜消化。将样品用甲酸酸化至pH 2,随后如上所述使用C18依赖性的C18颗粒浓缩并浓缩(
      • Rappsilber J.
      • Ishihama Y.
      使用缘物的蛋白质组学的微纯化,富集,分馏和储存的微纯化,富集,分馏和储存的方案。
      )。
      为了比较和规范化串联质量标签(TMT)报告器在不同TMT10-PLEX LC-MS / MS实验之间的强度,表示所有样品的汇集摘要的相同样本被用作公共参考。对于共同的参考池,合并每个样品的15μg肽消化。
      肽等分试样干燥 真空,以40μl50米重组m 碳酸三乙酯在室温下孵育15分钟。将TMT10-PLEX试剂(Thermo Fisher Scientific,Drieich)溶解在42μl无水乙腈中,每样品加入10μlTMT。在室温下温育1小时后,通过将羟胺加入终浓度为0.2%(v / v)的终浓度淬灭标记反应。
      将标记的肽以相等的量混合,用甲酸酸化,并根据制造商的说明使用C18 Seppak盒脱盐(C18墨盒,Sep-Pak Vac,1 CC,50毫克,Waters Corp.,Eschborn,德国)。将洗脱液干燥并储存在-80℃。如前所述,使用亲水性强阴离子交换色谱(Hsax)进一步分离样品以24个级分(
      • Ruprecht B.
      • koch h.
      • 塞尔山
      • Mundt M.
      • Kuster B.
      • Lemeer S.
      使用铁固定化金属离子亲和色谱(Fe-IMAC)柱的综合性和可重复磷酸富集。
      ),使用C18酸盐脱盐并浓缩肽。

       用于全局蛋白酶组合物分析的无标记定量蛋白质组分析的样品制备

      分别合并六个氧化林蛋白和六个塑料样品的肽等分试样(另见 补充表S1),使用C18依缘脱落和浓缩,并如上所述以雄鹿分级(
      • 陈W.
      • 王S.
      • Adhikari S.
      • 邓诗
      • 王L.
      • 陈L.
      • 柯米
      • 杨P.
      • 田R.
      基于Spintip的简单和集成的基于Spintip的技术应用于深度蛋白质组分析。
      )在25米中使用ACN的逐步梯度m 合并级分1和5和2和6之前的铵甲状腺型(流动,5%,10%,15%,17.5%,50%)。

       液相色谱串联质谱(LC-MS / MS)

      纳米射线LC-MS / MS / MS分析肽样品在偶极3000 rslcnano系统(Thermo Scientific,Dreieich,Germany)上进行了Q-Exactive HF质谱仪(Thermo Scientific,Bremen,Germany)。将肽递送至捕集柱(100μm内径×2cm,用5μl/ min的5μl/ min的5μmC18树脂(Reprosil Gold,Maisch,德国),在100%溶剂中以5μl/ min的流速填充10分钟A(0.1%FA在HPLC级水中)。装载和洗涤后,将肽转移到分析柱(75μm×40cm C18柱; Rerosil Gold,3μm,Maisch博士,德国)并使用线性分离110分钟的梯度在300nl / min的流速下从4%至32%溶剂B(0.1%Fa,0.1%Fa,5%二甲基磺氧化亚砜),5%(v / v)DMSO用于溶剂A和B.促进纳米电子涂布响应(
      • Hahne H.
      • Pachl F.
      • Ruprecht B.
      • 迈尔S.K.
      • Klaeger S.
      • 掌舵D.
      • 塞尔山
      • 威尔m。
      • Lemeer S.
      • Kuster B.
      DMSO增强了电喷雾响应,促进蛋白质组学实验的敏感性。
      )。
      使用2.2-kV电喷雾电压和275℃的毛细管温度电离肽。质谱仪以数据相关的采集模式操作,自动在MS和MS2之间切换。全扫描MS Spectra(m/z 360-1300)在75,000时在壁球上获得(m/z 200)具有自动增益控制(AGC)目标值3E6的分辨率。 MS光谱在飞行中使用信号重新校准 m/z 401.92339作为锁定质量(
      • Hahne H.
      • Pachl F.
      • Ruprecht B.
      • 迈尔S.K.
      • Klaeger S.
      • 掌舵D.
      • 塞尔山
      • 威尔m。
      • Lemeer S.
      • Kuster B.
      DMSO增强了电喷雾响应,促进蛋白质组学实验的敏感性。
      )。使用更高的能量碰撞诱导的解离(HCD)产生35个前体的片段质量(MS2)光谱,其具有33%的标准化碰撞能量为33%。固定的第一个质量设定为120 m/z 对于片段质量光谱和片段离子,在斜拉瓣质量分析仪中读出35,000的分辨率 m/z 200,其对应于TMT10-Plex报告离子~50,000的分辨率。将隔离窗口设置为1.3 TH和2E5的MS2 AGC目标值(
      • R开发核心团队
      使用(
      • Werner T.
      • 甜蜜曼G.
      • savitski m.f.
      • Mathieson T.
      • Bantscheff M.
      • Savitski m.m.
      中子的离子聚结编码TMT 10-Plex报告离子。
      )。动态排除测序的前体离子20秒。

       蛋白质识别和量化

      原始MS数据由MaxQuant(1.5.1.0)处理,用于峰值检测和量化(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )。使用Andromeda搜索引擎搜索MS / MS Spectra以防止人体Ensembl数据库的当前版本(版本GRCH 38; 99,436条目)(辅助群组)(辅助普通污染物)(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )随着以下搜索参数:TMT10PLEX,全胰蛋白特异性,最多两个错过的裂解位点,半胱氨酸残基的氨基甲酰基化设置为固定改性,以及N-末端蛋白乙酰化和甲硫氨酸氧化为可变修饰。在MaxQuant(首次搜索:20ppm前体耐受)内重新校准质谱,随后以6 ppm的质量耐受重新搜索。片段离子质量耐受设定为20ppm。将搜索结果过滤到蛋白质的最大假发现速率(FDR),对于蛋白质,1%肽光谱匹配,并且需要至少7个氨基酸的最小肽长度。每种蛋白质组总结TMT10PLEX报告器离子强度。仅使用具有至少75%的前体强度级分(PIF)的串联质谱用于蛋白质量化。
      对于无标记的蛋白质组定量,IBAQ值是从MAXQUANT获得的,并用作蛋白质丰度的代理(
      • Schwanhausser B.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      )。

       数据分析

      在R统计计算环境(3.2.1版)中执行数据分析(
      • R开发核心团队
      )和TIGR Multipperiment Viewer(版本4.9)(
      • Howe E.A.
      • Sinha R.
      • Schlauch D.
      • Quackenbush J.
      RNA-SEQ分析在MEV中。
      )。
      通过线性回归方法标准化每个筒子和TMT10PLEX批量的转录物和蛋白质表达。使用基因表达的简单基因和批量明智归一化​​(准备稿件)消除了坐标数据集中的小批量效应。简而言之,我们假设每种基因的平均表达在不同批次之间是恒定的,并且通过将每个基因表达值乘以分批和基因特异性恒定来调整每个基因的表达并相应地进行批量。在规范化之后,只有具有总和表达值的基因>保留了所有样品的50,以进一步分析以消除非常低表达的转录物。两种TMT10plex实验之间的蛋白质强度通过每个TMT10plex实验中包含的常见参考对齐。
      使用R函数“PRComp”进行原理分量分析(PCA)。为此,数据是Z分数转化的,并除去具有缺失值的蛋白质。将前两种原理成分(PC)与各种实验因素(样品型,供体,%FCS和培养时间)进行比较,以确定最有影响力的实验因素。使用ANOVA统计测试鉴定了天然Huvec,Huvec在Xellullin和Huvec之间的转录物,在塑料中鉴定了7165种差异表达了与本杰里尼-Hochberg纠正的差异表达的转录物 p value <0.05。差异表达的转录物进一步Z分数转换,聚集成六个不同的簇,使用K-Means聚类(公制:Pearson相关)(
      • Soukas A.
      • 科恩P.
      • Socci N.D.
      • 弗里德曼·弗里德曼
      白色脂肪组织中基因表达的瘦素特异性模式。
      ),随后手动愈合。使用字符串的功能蛋白质相互作用和关联富集单簇(
      • Szklarczyk D.
      • Franceschini A.
      • 蜡厂
      • Forslund K.
      • Heller D.
      • Huerta-Cepas J.
      • Simonovic M.
      • 罗斯A.
      • Santos A.
      • Tsafou K.P.
      • Kuhn M.
      • Bork P.
      • Jensen L.J.
      • von mering c.
      字符串v10:蛋白质 - 蛋白质相互作用网络,整合在生命之树上。
      )使用Cytoskape(3.2.1版)(3.2.1)(3.2.1)(
      • 苏G.
      • Kuchinsky A.
      • 莫里斯J.H.
      • 国家D.J.
      • 孟F.
      辉煌:生物网络的社区结构分析。
      )。通过David检索在这些子网络中包含的转录物的功能和路径信息(
      • 黄达W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      生物信息学富集工具:大型基因清单综合功能分析的路径。
      )。
      使用双面鉴定了用双面鉴定在氧化林蛋白上培养3或6周的Huvec的差异表达转录物,以及差异表达的转录物和成对比较的蛋白质 t 测试假设等同差异。这 p 对Benjamin-Hochberg的价值进行多重测试校正程序和转录物/蛋白质,具有校正 p 认为低于0.05的值差异表达。
      使用共识PCA方法进行mRNA和蛋白质数据的整合分析,这代表了PCA的概括到多个表场景(
      • 孟康
      • 掌舵D.
      • Frejno M.
      • Kuster B.
      MOCLUSTERS:跨多个OMICS数据集识别联合模式。
      )。它识别代表数据集之间最合理的结构的共识PC。与PC类似,共识PC可以传递给聚类算法,以识别两个数据集的关节图案。在该分析中,采用了使用欧几里德距离和病房连接的分层聚类来聚集前两种共识的PC。
      使用每转录物和基团的中值表达和使用ProteoMaps工具使用池样的样品的IBAQ值的蛋白质组数据从转录组数据中产生蛋白质斑斑块。使用Proteomaps工具(
      • Liebermeister W.
      • EOR E.
      • Flamholz A.
      • Davidi D.
      • 伯恩哈特J.
      • Milo R.
      蛋白质投资蜂窝功能的视觉叙述。
      )。仅使用转录物/蛋白质,其可以从Enembl基因标识符和基因名称映射到Uniprot登录号。

      结果

       胶原涂层Xellulin的Huvec和其他细胞类型的培养物

      作为对二维细胞培养的新型支持,我们开发了一种基于BC的水文生物材料,名为Xellulin。氧化林素由BC和99%(W / W)水组成,在干燥柜中在30℃下干燥后的重量损失证明。扫描电子显微镜显示纤维素纳米纤维的非晶网络,表明具有大表面的弹性,亲水载体:体积比(补充图S1A)。
      我们观察到Huvec(见下文)以及平滑肌细胞,成纤维细胞,间充质干细胞和肝细胞(补充图S1B 可以在胶原涂层的Xellulin上培养I-IV,长达几周而不会分裂。肝细胞在Xellulin上形成了典型的簇,而其他细胞类型导致细胞单层。
      在开始分子分析实验之前,我们证实了从六个脐带中分离的Huvec表型和纯度。研究内皮细胞标记物CD31(也称为PECAM-1)和VWF的所有细胞染色阳性补充图S2)。在播种后2天形成常规胶原涂层塑料塑料的HUVEC。相比之下,在播种后观察到Xellulin上的Huvec单层,直到两到4天。塑料和氧化林蛋白的细胞显示出鹅卵石状形态。达到汇合后,Xellulin的Huvec揭示了较小的细胞尺寸(补充图S3)。细胞单层用标准培养基每周喂两次。值得注意的是,我们观察到在Xellulin上培养的Huvec可以容易地在培养上保持一年,而不会减少CD31和von Willebrand因子(VWF)的标记蛋白的明显表达模式,并且在接触抑制后重新引发增殖的能力(补充图S4)。

       对比较转录组和蛋白质和塑料天然,新鲜分离的Huvec和Huvec的蛋白质组学分析

      氧化林蛋白允许连续培养静态Huvec单层超过一年,没有降解迹象或去除湿。更好地了解Xellulin上的Huvec是否可以作为 体外 模型 体内 内皮细胞生物学,并揭示了天然和原生和潜在的分子差异 体外 微环境,我们开始分析原生和繁殖Huvec在氧化铝和塑料中的转录组和蛋白质组学表型。
      分析了来自六个脐带的28个Huvec样品,对应于6天内的Huvec,2×5繁殖的Huvec(通道1)分别培养3周和6周,培养2×6繁殖的Huvec(通道1)塑料分别为1和5%FCS。我们将所有28个样品和蛋白质蛋白质的转录组分解了12个样品的蛋白质,对应于Xellulin的繁殖Huvec的生物三倍体3和6周,并用1和5%FCS在塑料上繁殖Huvec(Fig. 1A, 补充表S1)。由于样品量有限,我们在蛋白质组研究中没有包括原生Huvec。
      使用最近描述的cDNA末端(立柱)测序技术,数字基因表达方法测序50至200bp的转录物的3'或5'cDNA的CDNA表达方法进行定量转录组分析(
      • Zajac B.K.
      • Amendt J.
      • 恐怖r.
      • verhoff m.a.
      • Zehner R.
      使用MACE(CDNA末端大规模分析CDNA末端的CALLIPHORA VICINA(DIPTERA:CALLIPHORIDAE)蛹的DE Novo转录组分析和高敏感的数字基因表达分析。
      )。 3'Mace方法导致每批37,090至41,210个量化转录物。经过严格过滤低丰度转录物(补充图S5A),这种方法导致在本研究中分析的12,475个基因(补充表S2)。
      使用基于串联质量标签(TMT)的等异质量策略进行12个样品子集的定量蛋白质组分析(
      • Bantscheff M.
      • Lemeer S.
      • Savitski m.m.
      • Kuster B.
      蛋白质组学中的定量质谱:2007年至今的批判性评论更新。
      )并导致鉴定7831蛋白(蛋白质FDR<0.01),其中7417个蛋白质对应于7257基因(补充表S3和S4)。
      基因的比较揭示了在mRNA水平上专门鉴定的6333个基因,并专门在蛋白质水平上发现1115个基因(Fig. 1B)。在蛋白质水平上未鉴定的大多数转录物具有低丰度。在未经转录物水平上鉴定的蛋白质中是许多重要的细胞外蛋白和血管生成的主要调节因子,如血管发成素-2(血小平蛋白-1的拮抗剂),血管发成素样2和血管发成素样4,以及凝血因子和血管舒张蛋白(如ACE,DDAH2和ECE),表明蛋白质组学有助于在转录物水平上无法访问的信息 反之亦然.
      基于原理成分分析(PCA)基于转录物表达谱的所有28个样品对所有28个样品的无监督分析显示了与三个主要实验组相对应的三种不同的簇(Fig. 1A1D)。到目前为止,实验方差的最大比例由原理成分(PC)1(62%)捕获,其分离来自Huvec培养物的原生,并通过PC2(17%)的程度更小,其将Xellullin样品从另一个分离团体(补充图S5B)。值得注意的是,Xellulin簇在主导PC1轴上的天然HUVEC簇更接近,表明更类似的转录组表型。其他实验因素如供体,培养时间,氧化铝,胎牛血清(FCS)或样品批量的浓度小于相关性或无关紧要(见 补充图S5C 和 below).
      为了确认PCA结果,我们对所有Xellulin进行了相关分析(n = 10) and plastic (n = 12)转录组样品对所有原生Huvec样本(n = 6)。 Pearson相关系数显着更高(p <2.2E-16)与塑料样品相比,氧化林样品(中位数0.84)(0.79)(Fig. 1D),支持上述观察。
      为了评估六个塑料样品和六种氧化林样品的转录组和蛋白质组曲线是多么的转录组和蛋白质组曲线,我们遵循共有PCA方法,这是多个OMIC水平的PCA的推广,并允许转录组和蛋白质组谱的投影到同一平面上。如图所示 Fig. 1E,转录组和蛋白质组(箭头底座和箭头头)塑料和氧化叶蛋白样品簇聚集在一起,而两个样品基团沿PC1清楚地分离,表明转录组和蛋白质组代表相同的生物变异,并且之间的生物学差异两个样品基团比蛋白酶组和转录组之间的变化大得多。
      总之,这些数据表明,Xellulin和塑料上的天然Huvec和繁殖Huvec在Xellulin和Xellulin的天然Huvec和Huvec之间具有显着性的转录组和蛋白质组学表型。

       系统分析显着调节的转录组

      为了进一步分析潜在的基因表达差异,我们使用ANOVA测试(阈值FDR = 0.05)鉴定了三组之间的显着调节的转录物,得到7165种差异表达的转录物(57%的所有量化转录物, Fig. 2A),表明天然和繁殖Huvec之间基因表达和细胞生理学的大规模重新耦合。 K-mears的所有差异表达的转录物的聚类揭示了六个(非常)的不同表达谱的簇,各自与Xellulin和塑料的Huvec上的不同功能,细胞成分和途径相关联(Fig. 2B, 补充表S5)。虽然大多数基因在氧化林蛋白(5,804个基因对应于簇1,2,4和5)之间的天然Huvec和Huvec通道1之间表现出和大的相似性表达水平,但是在氧化铝上仅在Huvec上推动了一个基因的一个簇(群集3)和一个群体通常在传播的Huvec(群集6)中下调的基因。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2差异表达转录物的聚类和网络分析。 A,分布本杰里尼 - Hochberg(BH)纠正 p 价值观。 B,手动策划k-means差异表达转录物的簇(bh校正 p values < 0.05). CD,蛋白质相互作用和k-means簇1和4的相关蛋白质的高度连接的子网,分别从绳子获得(过滤以获得最高置信度,组合得分>0.9)并使用辉光社区聚类算法进一步聚集。
      所有K-means集群都进一步富含蛋白质相互作用和使用字符串的关联,并使用辉光群落聚类算法进行额外的子网聚类(Fig. 2C, 2D补充图S6)。
      在塑料材料(2832或40%,簇1和2)上的Huvec中高度表达的非常大的基因比较与增殖紧密相关。子网络被描绘 Fig. 2C和 补充图S6。这些簇包括细胞周期和有丝分裂调节剂,例如极光激酶,细胞周期蛋白和细胞周期蛋白依赖性激酶,以及检查点激酶1和2以及增殖所需的数百个其他基因(翻译,RNA加工/剪接,DNA复制,能量和建筑物块供应,蛋白质运输)。重要的是,这两种簇还包含与ROS解毒,DNA损伤修复(包括P53)和展开的蛋白质反应相关的数百个基因,所有这些都具有触发细胞衰老的可能性(
      • d'adda di fagagna f.
      生活在休息时间:细胞衰老作为DNA损伤反应。
      ),因此,表型改变。
      簇3包含在Xellulin的Huvec中高度表达的547个基因。许多这些基因(>150)是分泌的和糖蛋白以及溶酶体和内体蛋白质,包括胶原蛋白型IV,层粘连蛋白和Fibrillin。这些蛋白质代表基底薄膜的基本组分,其将内皮细胞与结缔组织分离。
      簇4和5包括表示蜂窝函数的2945个基因(41%),其在常规塑料软件上下调或完全损失,并且至少部分地保存在氧化林中。最重要的是,这些保存的功能涉及信令和转录因子网络。为了更好地理解和可视化信令和转录因子网络的潜在差异,我们基于集群4重建这些网络。 Fig. 3 举例说明这种重建并表明重要受体和信号通信网络的基因表达在塑料上下调,但不是对氧化林蛋白的支持,并且最终也表达了内皮细胞生物学的许多关键转录因子,例如ELK3和4,FOXO1和4, MEF2和EF2C和各种NFATS。然而,值得注意的是,转录物的下调并不一定意味着蛋白质不存在( 例如 FOXO1表达在蛋白质水平上保持不变)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3基于在Xellulin上保持高表达的转录物的重建信号网络(K-Means集群4; )。检测和量化的转录物以粗体,其他转录物和灰色信号分子描绘。蛋白质水平的表达变化在括号中描绘(α,Ⅳ,在氧化铝中显着上调或下调 相对 塑料; 〜,不重要;无迹象:未识别或量化蛋白质水平)。
      集群6由与ECM组织相关的789个基因组成,响应伤口,细胞粘附和细胞识别。这些基因在氧化铝和塑料HUVEC中下调,一些实例与内皮细胞功能紧密相关,例如BMP结合内皮调节剂蛋白(BMP),血小板内皮聚集受体1(PEAR1)和内皮激酶TIE2( Tek)。
      这些结果表明,Xellulin保留了天然Huvec的许多重要功能和信号传导机制,但同时表现出值得注意的差异,例如增加分泌的分泌和糖蛋白基因的表达以及广泛的天然HUVEC基因的表达减少。

       系统分析显着调节的蛋白质组

      对氧化铝和塑料材料栽培的Huvec的定量蛋白质组学数据的统计分析支持转录组水平的观察,同样揭示了蛋白质组水平的巨大差异(Fig. 4A)。在1771个差异调节的蛋白质中,1016在塑料样品中上调,并且绝大多数(85%)这些蛋白质涉及核糖体生物发生,蛋白质生物合成和细胞周期(Fig. 4B)。相比之下,755蛋白在Xellulin培养的Huvec源自不同的生物学功能和细胞室(Fig. 4C)包括大量的溶酶体蛋白和许多蛋白质蛋白质,参与蛋白质分泌,聚糖,糖脂和糖蛋白生物合成,细胞外基质和细胞粘附。其中,我们确定了表征本地内皮细胞的蛋白质,并在血管生成激活(纤连蛋白1,MMP2,神经键1和2,PDGFB,EphB2和许多下游信号分子),凝血(VWF,凝血酶/凝血因子中,支持这些细胞的不同功能性质。 II和凝血因子V,IX,X,XIII和凝血酶受体)和炎症(许多信号蛋白,包括AKT3,IKBKB,鞘氨酸激酶1,磷脂酶C,Rel,KRA)(补充表S4; 补充图S7)。繁殖Huvec的蛋白质组学表型表明,培养的细胞在氧化林蛋白上培养静止,分化表型的关键特征,包括降低的增殖相关蛋白表达。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4塑料与氧化铝栽培Huvec差异表达的蛋白质分析。 A,火山剧情 p 价值观。差异表达的蛋白质以红色描绘(t 测试,BH校正 p value < 0.05). BC,蛋白质相互作用和蛋白质相关蛋白质在塑料中高度表达的子网(B)和氧化林样品(C)。

       在氧化铝培养3周和6周后的转录组和蛋白质组

      观察到在塑料和氧化铝上培养的天然和繁殖的Huvec之间的巨大差异,我们进一步分析了Huvec在氧化肝素上的培养时间是否影响了它们的转录组和蛋白质组曲线,因此它们的表型。 Xellulin培养3个和6周的Huvec转录组的PCA并未显示根据培养时间的清晰分离样品( 补充图S8A)。此外,没有明显调节的转录物或蛋白质(t 测试,本杰里尼 - 霍奇伯格纠正 p value <0.05) (补充表S3和S4)。尽管如此,在分析全球的转录组数据时,但趋势较弱(非校正 p value <0.05; 补充图。S8B),它似乎有关相关过程(补充图S8C)在Xellulin 3周后增加,而指向静止的静态和分化表型的蛋白质在长期培养上上调(补充图S8D)。这些蛋白质中是许多负调节剂的增殖(如FGF13,Nog,Cyclin依赖性激酶抑制剂1a和pPARγ和KLF4),受体,信号蛋白和趋化因子,可以协调免疫系统的反应(例如TLR4,Irak4,Peli1, IL8,CX3Cl和CXCL3)以及自噬相关蛋白质(例如ATG5,MAP1LC3B和MAP1LC3B2)。

       转录组和蛋白质组水平绝对丰富差异的比较

      可能争辩说,与氧化林林天然Huvec和Huvec细胞相比,传统塑料上细胞的信号能力显着降低,因为细胞转录和平移能力的大部分分配给(丰富)增殖相关蛋白的合成,例如在簇1和2中包含的那些。为了进一步研究该假设,我们将转录组和蛋白质组组合物分析为使用Proteomaps(以下不同细胞函数所述的转录和平移能力的代理)(
      • Liebermeister W.
      • EOR E.
      • Flamholz A.
      • Davidi D.
      • 伯恩哈特J.
      • Milo R.
      蛋白质投资蜂窝功能的视觉叙述。
      )(补充图S9)。蛋白质组组合物由合并的氧化林蛋白和塑料样品获得(n 每组= 6;也可以看看 补充表S1)通过无标签LC-MS / MS分析并使用IBAQ方法量化(
      • Schwanhausser B.
      • 巴士D.
      • 李恩
      • Dittmar G.
      • Schuchhardt J.
      • 狼J.
      • 陈W.
      • Selbach M.
      哺乳动物基因表达控制的全局量化。
      )。
      它变得明显 - 主要是转录水平 - 扩散相关的过程和功能(IE。 代表DNA维持,转录,翻译和蛋白质折叠,分选和降解和“代谢”的KEGG类别“遗传信息处理”)在塑料材料上的细胞比在天然HUVEC和氧化林蛋白样品中产生的细胞相当丰富。相反,与天然细胞的生物学功能有关的转录物(“环境信息处理”和“有机体系统”)在支持上述假设的塑料样品中具有很大的压力。转录物水平的显着差异在蛋白质水平上镜像,但程度更小(这主要反映了最丰富的蛋白质在类似水平上表达的事实)。只有“有机体系统”类别(-29%)显示出丰富的强烈降低,其由两个经常使用的内皮细胞谱系标记蛋白,VWF(下调)和细胞表面糖蛋白MCAM(CD146; 3.3-折叠下调)。

       评估Xellulin培养Huvec的内皮分化

      Sialomucin CD34是分化和静态内皮细胞的重要标志物。为了验证Xellulin的HUVEC的本地特征,通过免疫染色2天,从传统的胶原涂层的塑料载体传递后的一次和3周,通过免疫染色2天来监测CD34表达。 1周后,Xellulin Huvec和常规塑料Huvec的CD34表达低。然而,3周后,几乎所有Huvec在氧化铝上都是CD34阳性,而CD34表达在塑料培养板上的HUVEC中未上调(Fig. 5A)。 CD34的再表表达与转录组和蛋白质组学数据中的表达水平一致(Fig. 5B)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5Xellulin的Huvec分化。 CD34培养时期不同点Huvec的表达。 A,Huvec在胶原涂层的6孔培养板(上排)和胶原涂层Xellulin(下排)上培养3周。 2天后,7天和3周HUVEC被染成CD34(绿色)。另外染色3周的培养物用于表达CD31(红色)。用DAPI(蓝色)进行核备体。秤条:50μm。 B,来自28例转录组织和12种蛋白质组学样品的CD34的平均转录物和蛋白质表达。统计测试:ANOVA(转录组织)和 t 测试(蛋白质组学)。 p 纠正价值观和Benjamini-Hochberg p 显示值。误差栏:±1标准偏差,N.I. =未调查。
      为了进一步评估对氧化铝培养的Huvec是否可以获得激活和迁移的表型,进行划痕测定(Fig. 6A)。在Xell圆盘或塑料表面上生长的Huvec单层产生的人工伤口在胶原涂层塑料和胶原涂层的氧化林蛋白的两和4天内在两次和4天内进行相当封闭。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6功能性细胞测定。 A,划伤Huvec单层。人造表面伤口由Huvec覆盖,塑料板(上排)和氧化叶蛋白(下排)均具有相同的速率。秤条:400μm。 B,对TNFα刺激的响应性。 Huvec在塑料板上生长或涂有大鼠胶原I的氧化丁蛋白盘。汇合细胞单层用HRTNFα(5ng / ml)刺激3小时,并加工E-Selectin表达的PCR分析(*p < 0.05 相对 plastic control, **p < 0.01 相对 Xellulin control, ##p < 0.01 相对 塑料hrtnfα, n = 3,N.D. =不可检测)。所有数据显示为平均值±S.D.
      此外,比较了对Xellullin或塑料生长的Huvec的功能反应性与原型促炎刺激。相应的实验方法的结果表明,TNFα依赖性e-Selectin mRNA表达在Xellulin的Huvec中显着发音(Fig. 6B)。
      我们还观察到在Xellulin培养的少量Huvec单层中的自发管形成,表明Xellulin的Huvec能够利用它们的血管生成潜力。管位于Huvec单层下方。在免疫细胞化学和免疫组织学分析中(补充图S10-S12)我们将内皮特异性蛋白质的表达与Xellulin的内皮细胞进行了比较,脐带内皮细胞,塑料Huvec和Xellulin的Huvec。这表明,除了PECAM-1(CD31)和ZO-1之外,该管形成内皮细胞对于血管发成素-2,CD34和Ve-Cadherin显然是阳性的。

      讨论

      我们对HUVEC的转录组和蛋白质组学分析表明,胶原涂层BC或常规胶原涂层聚苯乙烯材料上的天然和繁殖HUVEC的表型差异涉及57%的转录组和24%的蛋白质组的显着变化。
      我们研究了天然的转录组,并将HUVEC传播至12,475转录物的深度,并且将HUVEC繁殖至7831蛋白的蛋白质组,这代表到目前为止产生的深度内皮蛋白质中最深入的内皮蛋白质组。定量转录组和蛋白质组学方法的全面性使我们能够在BC和塑料材料上对天然和繁殖Huvec之间的众多表型和生理差异脱光。
      通过和大,我们的结果与最近公布的培养内皮细胞的转录组和蛋白质组研究符合和延伸,其细胞外基质的组成显示细胞外基质的性质和汇合水平对其生理学产生重要影响(
      • 髌骨F.
      • Neilson L.J.
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      )。在这种情况下,分析与信号传导,细胞周期和内皮标记相关的关键转录物和蛋白质数据表明,胶原涂覆的氧化茄蛋白但不是常规的胶原涂层塑料促进稳定的静止成熟的内皮细胞状态。例如,这反映了Ve-Cadherin在蛋白质水平上显着上调Ve-Cadherin(与塑料相比)的显着上调,而yap1,增殖相关基因的转录共激活剂,始终下调Xellulin和塑料的转录水平,共同有助于静态状态。 体内,由粘附和紧密交界处组成的细胞 - 细胞触点在维持成熟内皮细胞单层的静脉中起重要作用。血管内皮钙粘蛋白(Ve-Cadherin或CD144,由基因编码 CDH5)内皮细胞的主要粘附结蛋白,并通过与生长因子受体(例如VEGFR2和TGFBR)的相互作用稳定脉管系统,从而激活Pro-静态信号传导机构。最近发现,内皮细胞的接触抑制由河马 - 是相关蛋白(YAP)信号传导(
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      )通过PI3K-AKT轴。
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      进一步证据表明,氧化林实际上促进了成熟内皮的发展,因为它通常是占主导物的 体内 可以从内皮分化标志物的分析中推断出来。例如,转录组和蛋白质组数据均显示出较高水平的内皮标记物PECAM-1(CD31)和VWF在Xellulin培养的HUVEC中,表明其静态状态。实际上,在大多数类型的血管内皮中可以检测到VWF表达 体内 (
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      通过调节其Von Willebrand因子含量,培养内皮细胞调节血小板粘附到细胞外基质。
      )。此外,VWF的缺乏与内皮细胞的血管生成活化有关(
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      人肿瘤血管生成和血管成熟的异质性:对抗血管生成肿瘤疗法的影响。
      ),这些观察结果在Xellulin保持静止内皮细胞表型的产能下划线。
      相比之下,Huvec在胶原蛋白涂层塑料表演消费者和内皮 - 间充质转换(Endmt)的迹象。内皮细胞的终止特征在于内皮标记物的损失(如Ve-Cadherin,PECAM-1,VWF或CD34对转录物和/或蛋白质水平观察),细胞 - 细胞接触的丧失(例如整联蛋白, Fig. 3),获取侵入性和迁移性质(如vimentin转录物表达的增加, 补充表S5)和中间充质标记物(如转晶体)的增益,平滑肌分化标志物(也称为SM22-α)(
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      CD34基因在血管内皮细胞中的表达。
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      三维球培养模型中的血管成熟:与平滑肌细胞直接接触调节内皮细胞静态并废除VEGF响应性。
      )。事实上,允许培养的内皮细胞获得静止似乎是增强和微妙的先决条件 体内 - 与特定刺激的反应,例如血管生成的决定簇(
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      最近,杨 等等。 (
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      透过神经素-1和红色链形信号的信号素-3C信号以抑制病理血管生成。
      )利用在氧化林蛋白上培养的Huvec来研究Semaphorin-3C局部递送抑制新生儿小鼠的视网膜血管生成的机制。 Semaphorin-3C给药强烈抑制新的血管芽的形成,并扰乱了塑料的Huvec单层形成,但不影响完全发育的血管网络 体内 或在Xellulin开发的静态Huvec单层。这些发现表明氧化林支持静态成熟的发展 体内 - 状内皮细胞表型。然而,在氧化铝上培养的HUVEC可以切换它们的表型,以激活并迁移,如划痕测定所证明的那样。
      我们期望对Huvec,平滑肌细胞,成纤维细胞,间充质干细胞和肝细胞进行的观察结果(补充图S1B)对于许多其他(初级)细胞类型以及常用的不朽细胞系(例如HeLa,K562或HEK 293)也保持真实,使Xellulin成为有前途的细胞生物学工具。建立基于氧化林蛋白的细胞培养物是简单的,但可能需要微小的修饰来确定诸如使用替代酶的细胞培养方案(例如 胶原酶代替胰蛋白酶)以在水溶性染料的情况下分离细胞或轻微适应染色程序,这可能导致染色背景增加。氧化林还为药理学和毒理学研究提供了新的机会 体外,作为串行和重复测试的平台,最终作为基于动物的研究方法可行的替代品。
      我们的研究表明,将现代转录组和蛋白质组学技术应用于建立和小说 体外 模型是一种强大的方法,以表征内皮和其他细胞类型中的分子表型差异和功能关联,并更好地理解细胞微脑的机械和调节性能的影响。我们的结果提供了在常规塑料支持以及Xellullin上培养的综合基线转录组和蛋白质组,培养的植物和繁殖的Huvec,其近期转录组,蛋白质组和磷脂蛋白酶(
      • 髌骨F.
      • Neilson L.J.
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      )。本研究可以为新兴细胞培养技术的进一步激发和应用构成进一步令人兴奋的洞察力和应用的基础 体内 - 类似的表型,从而弥合之间的差距 体外体内 biological research.

      数据可用性

      通过ArrayExpress数据库可获得转录组测序和定量结果(MACE数据);加入号码E-MTAB-4747)。本研究中生成的原始质谱数据和MaxQuant分析文件可通过ProteomeXchange获得(登录号:PXD003975)。

      致谢

      我们感谢Mathias Wilhelm,Jana Zecha和Karl Kramer的批判性评论和洞察力讨论。

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