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西部MS,一种多路复用的绝对彩易福彩定量方法是Western Blotting *的实际替代品

  • Mukesh Kumar.
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    从Max Planck分子细胞生物学和遗传学研究所,Pfotenhauerstr。 108,01307德国德累斯顿;
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  • Shai R. Joseph.
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    从Max Planck分子细胞生物学和遗传学研究所,Pfotenhauerstr。 108,01307德国德累斯顿;
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  • Martina Augsburg.
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    医疗系统生物学,UCC,医学系Carl Gustav Carus,Tu Dresden,01307德国德累斯顿;
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  • Aliona Bogdanova.
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    从Max Planck分子细胞生物学和遗传学研究所,Pfotenhauerstr。 108,01307德国德累斯顿;
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  • 作者脚注
    ‡‡ 现代地址:1030维也纳,奥地利分子病理学IMP研究所。遗忘:M.K.,M.和A.。设计了这项研究。 M.K.,A.B.和D.D.设计和生产的彩易福彩嵌合体。 M.K.进行了MS西部基准测试和验证实验和量化的斑马鱼组蛋白。 S.R.J.和n.l.v.用斑马鱼胚胎进行实验。 M.A.和F.B.在HeLa细胞中进行了KD实验。 M.K.并作为。撰写了由所有合唱团共同修订的草案。
    David Drechsel.
    脚注
    ‡‡ 现代地址:1030维也纳,奥地利分子病理学IMP研究所。
    ‡‡ 作者捐款:M.K.,M.G.和A.。设计了这项研究。 M.K.,A.B.和D.D.设计和生产的彩易福彩嵌合体。 M.K.进行了MS西部基准测试和验证实验和量化的斑马鱼组蛋白。 S.R.J.和n.l.v.用斑马鱼胚胎进行实验。 M.A.和F.B.在HeLa细胞中进行了KD实验。 M.K.并作为。撰写了由所有合唱团共同修订的草案。
    隶属关系
    从Max Planck分子细胞生物学和遗传学研究所,Pfotenhauerstr。 108,01307德国德累斯顿;
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  • Nadine L.Pastenhouw.
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    从Max Planck分子细胞生物学和遗传学研究所,Pfotenhauerstr。 108,01307德国德累斯顿;
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  • 弗兰克布赫霍尔斯
    隶属关系
    从Max Planck分子细胞生物学和遗传学研究所,Pfotenhauerstr。 108,01307德国德累斯顿;

    医疗系统生物学,UCC,医学系Carl Gustav Carus,Tu Dresden,01307德国德累斯顿;

    德国癌症研究中心(DKFZ),海德堡和德国癌症联盟(DKTK)合作伙伴网站Dresden,德国德累斯顿01307;

    国家肿瘤疾病中心(NCT),大学医院Carl Gustav Carus,Tu Dresden,01307德国德累斯顿
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  • 作者脚注
    ** 现在的地址:德国德累斯顿01307德累斯顿的分子和细胞生物工程中心。
    Marc Gentel.
    脚注
    ** 现在的地址:德国德累斯顿01307德累斯顿的分子和细胞生物工程中心。
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    从Max Planck分子细胞生物学和遗传学研究所,Pfotenhauerstr。 108,01307德国德累斯顿;
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  • 和 rej shevchenko.
    一致
    应如何解决对应的通信:MPI的分子细胞生物学和遗传学,Pfotenhauerstrasse 108,01307德累斯顿,德国。电话:49-351-210-2615;传真:49-351-210-2000;
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    从Max Planck分子细胞生物学和遗传学研究所,Pfotenhauerstr。 108,01307德国德累斯顿;
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  • 作者脚注
    *在MPG核心资金支持AS和NLV实验室的工作。由于实验室得到了KFO249和TRR83(Project A17)的支持,来自德意志Forschungsgemeinschaft; NLV实验室由人类前沿科学计划职业发展奖(CDA00060 / 2012)。在FB实验室的工作得到了德国联邦和州政府(机构战略,措施'支持最好的Zuk 64')的卓越倡议。 MK和SRJ是博士学位学生奖学金的收件人。
    本文含有补充材料。
    ** 现在的地址:德国德累斯顿01307德累斯顿的分子和细胞生物工程中心。
    ‡‡ 现代地址:1030维也纳,奥地利分子病理学IMP研究所。遗忘:M.K.,M.和A.。设计了这项研究。 M.K.,A.B.和D.D.设计和生产的彩易福彩嵌合体。 M.K.进行了MS西部基准测试和验证实验和量化的斑马鱼组蛋白。 S.R.J.和n.l.v.用斑马鱼胚胎进行实验。 M.A.和F.B.在HeLa细胞中进行了KD实验。 M.K.并作为。撰写了由所有合唱团共同修订的草案。
      彩易福彩的绝对量化阐明了多粒蛋白组装和网络的分子组成,调节和动力学。在这里,我们报告了MS Western的方法,该方法是准确地确定在整个细胞或组织裂解物中的分酵母水平的数十种使用的骨灰丰度,没有代谢或化学标记,而不使用特异性抗体。西方女士依赖于GELC-MS / MS并量化彩易福彩凝胶具有同位素标记的Qconcat蛋白嵌合体的多角形,由串联彩易福彩肽组成。它不需要嵌合体纯化,并将所有彩易福彩肽的摩尔丰度与单一参考蛋白相关。在比较实验中,MS Western优于免疫荧光免疫荧光免疫荧光彩易福彩印迹,彩易福彩检测特异性,线性动态范围和彩易福彩量化的敏感性。验证西方女士体内实验,我们在早期胚胎发生的十个阶段期间量化了斑马鱼核心组粒H2A,H2B,H3和H4的摩尔含量。准确量化(CV<10%)证实了预期的组蛋白等摩尔化学计量,揭示了它们总丰富的意外趋势。
      尽管有知名的技术限制和众多应用陷阱,Western Blotting(WB)
      使用的缩写是:WB,Western印迹; Fa,甲酸; BSA,牛血清白蛋白;猫,过症酶; GP,糖原磷酸化酶; Adh,酒精脱氢酶; eno,enolase; Tuba,α-管蛋白; ubi,泛素。
      1使用的缩写是:WB,Western印迹; Fa,甲酸; BSA,牛血清白蛋白;猫,过症酶; GP,糖原磷酸化酶; Adh,酒精脱氢酶; eno,enolase; Tuba,α-管蛋白; ubi,泛素。
      仍然是分析生物化学中最广泛使用的工具之一(在(
      • gorr t.a.
      • Vogel J.
      Western Blotting重新审视:批评的技术问题的关键预言。
      ,
      • Gassmann M.
      • Grenacher B.
      • rohde b.
      • Vogel J.
      量化彩易福彩印迹:密度测定的缺陷。
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      • 贝克M.
      再现性危机:将其归咎于抗体。
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      • Janes K.A.
      定量免疫印迹关键因素分析。
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      • 波尔多J.
      • 威尔士A.
      • agarwal s.
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      • Anagnostou V.
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      抗体验证。
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      • Uhlen M.
      • Bandrowski A.
      • 卡车。
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      • Lundberg E.
      • RIMM D.L.
      • Rodriguez H.
      • Hiltke T.
      • 斯奈德米
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      验证抗体的提案。
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      • Minoda A.
      • 克ugmans。
      • 韭葱。
      • Kolasinska-Zwierz P.
      • Alekseyenko A.A.
      • 张马
      • Day D.S.
      • 加德尔S.
      • Gorchakov A.A.
      • kharchenko p.v.
      • 宽轩
      • Latorre I.
      • Linder-Basso D.
      • 鲁y.
      • ngo问:
      • 佩里M.
      • Rechtsteiner A.
      • 谜语N.C.
      • Schwartz Y.B.
      • Shanower G.A.
      • Vielle A.
      • Ahringer J.
      • 埃尔金斯科。
      • Kuroda M.I.
      • Pirrotta V.
      • ren
      • 斯多尔
      • 公园P.J.
      • 卡普伦G.H.
      • 霍金斯R.D.
      • 谎言J.D.
      组蛋白改性抗体质量评估。
      )))。 WB方便地提供直接从粗细胞或组织提取物的半定量估计彩易福彩丰度。 WB的定量能力,特别是通过使用荧光标签和用于识别的彩易福彩带的丰度的光学读数的高级系统(
      • 伊顿S.L.
      • Hurdado M.L.
      • oldknow K.J.
      • Graham L.C.
      • Marchant T.W.
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      • Farquharson C.
      • Wishart T.M.
      现代定量荧光Western Blotting指南,故障排除策略。
      )。然而,这并未减轻具有抗体对靶蛋白的高和特异性亲和力的关键要求(
      • Gilda J.E.
      • Ghosh R.
      • Cheah J.X.
      • 西三。
      • BODINE S.C.
      • 戈麦斯A.V.
      Western Blotting与未经证实的抗体有不准确:需要彩易福彩印迹最小报告标准(WBMR)。
      )。
      在过去的二十几年内,各种基于质谱的基于质谱的靶向绝对彩易福彩定量方法,依赖于同位素标记的肽/彩易福彩标准( 例如 AQUA (
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • STEMMAN O.
      • Kirschner M.W.
      • Gygi S.P.
      通过串联MS从细胞裂解物中绝对定量彩易福彩和磷蛋白。
      ),PSAQ(
      • 布伦V.
      • Dupuis A.
      • Adrait A.
      • Marcellin M.
      • 托马斯D.
      • 法庭M.
      • Vandenesch F.
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      同位素标记的彩易福彩标准:朝向绝对的定量彩易福彩组学。
      ),Flexiquant(
      • Singh S.
      • Springer M.
      • 斯丁J.
      • Kirschner M.W.
      • 斯丁H.
      Flexiquant:一种用于绝对定量彩易福彩的新型工具,以及潜在改性肽的同时鉴定和定量。
      ),PERST(
      • 塞勒河M.
      • Straube W.L.
      • Lundberg E.
      • Uhlen M.
      彩易福彩表位签名标签(PERTT)文库允许基于氧化硅酸的绝对量化和细胞系中彩易福彩拷贝数的多重测定。
      )或qconcat(
      • Beynon R.J.
      • Doherty M.K.
      • 普拉特准
      • Gaskell S.J.
      替代拟肽人工QCAT蛋白的彩易福彩组学中的多路复用绝对量化。
      ,
      • 普拉特准
      • SIMPSON D.M.
      • Doherty M.K.
      • 河流J.
      • Gaskell S.J.
      • Beynon R.J.
      QConcat基因编码的级联签名肽的多路复用绝对量化彩易福彩组学。
      ));使用化学或代谢标记的相对彩易福彩组定量( 例如 ICAT (
      • Gygi S.P.
      • rist b.
      • 格柏S.A.
      • Turecek F.
      • 凝胶M.H.
      • Aeberberold R.
      使用同位素编码亲和标记的复合蛋白混合物的定量分析。
      ),tmt(
      • 汤普森A.
      • Schafer J.
      • Kuhn K.
      • Kienle S.
      • Schwarz J.
      • 施密特G.
      • Neumann T.
      • 约翰斯通r.
      • 穆罕默德A.K.
      • 哈蒙克
      串联质量标签:MS / MS的复合蛋白混合物比较分析的新量化策略。
      ),ITRAQ(
      • 罗斯P.L.
      • 黄玉。
      • Marchese J.N.
      • 威廉姆斯B.
      • 帕克克。
      • 哈桑斯。
      • Khainovski N.
      • Pillai S.
      • 丹尼尔斯S.
      • Purkayastha S.
      • Juhasz P.
      • 马丁斯。
      • Bartlet-Jones M.
      • 雅各布森A.
      • Pappin D.J.
      使用胺 - 反应性的异常标记试剂在酿酒酵母中的多重彩易福彩定量。
      ,
      • 威斯特S.
      • Reidegeld K.A.
      • Meyer H.E.
      • Warscheid B.
      伊特拉克彩易福彩标记:彩易福彩组研究中定量质谱的新工具。
      ),Silac(
      • ong s.e.
      • Blagoev B.
      • Kratchmarova I.
      • 克里斯滕森D.B.
      • 斯丁H.
      • Pandey A.
      细胞培养物中氨基酸的稳定同位素标记,硅胶,作为表达彩易福彩组学的简单且准确的方法。
      ),超级硅胶(
      • 盖尔特T.
      • Cox J.
      • ostasiewicz p.
      • wisniewski J.R.
      用于人肿瘤组织的定量彩易福彩组学的超级硅酸混合物。
      )),以及无标记的彩易福彩组定量(
      • Chelius D.
      • Bondarenko P.V.
      液相色谱法和质谱法测量彩易福彩中彩易福彩的分析。
      ,
      • Bondarenko P.V.
      • Chelius D.
      • shaler t.a.
      通过酶消化鉴定和相对定量彩易福彩混合物,然后用毛细管反相液相色谱 - 串联质谱法。
      ,
      • Ishihama Y.
      • 奥达Y.
      • Tabata T.
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      • nagasu t.
      • Rappsilber J.
      指数改性彩易福彩丰度指数(EMPAA),用于通过每种彩易福彩的测序肽数估计彩易福彩组学中的绝对彩易福彩量。
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      • 高B.B.
      • 斯图尔特L.
      • Feener E.P.
      1D-PAGE LC / MS / MS彩易福彩组的无标记定量分析:在血管紧张素II上的应用刺激平滑肌细胞沉淀。
      ,
      • wisniewski J.R.
      • 嘿m.y.
      • Cox J.
      用于彩易福彩拷贝数和浓度估计的“彩易福彩组学标尺”,没有尖峰标准。
      ) 已经开发了。作为WB的SDS提取的膜蛋白Arnott的替代方案 等等。 开发了通过LC-MS / MS之前的亲和层析富集的预选对标记肽的SRM定量的方法(
      • Arnott D.
      • Kishiyama A.
      • luis e.a.
      • ludlum s.g.
      • 玛斯特J.C.
      • 心理J.T.
      无需抗体的膜蛋白的选择性检测 - 彩易福彩印迹的质谱形式。
      )。但是,这些和其他发展没有取代WB en masse.虽然已经提出了该领域将从常规使用彩易福彩的常规使用彩易福彩的常规使用常规使用彩易福彩(
      彩易福彩组学可以退休西方印迹吗?
      )。
      由于抗杆敏感性,彩易福彩识别置信度,定量准确度,分析吞吐量(审查(
      • Aeberberold R.
      彩易福彩组结构和功能的质谱探索。
      )),最后但并非最不重要的是,高端质谱彩易福彩组学的可用性对整个分子和细胞生物学领域产生了重大影响。然而,通常被认为是监测全球彩易福彩型扰动的工具,这对于假设驱动的研究具有过于繁琐,并且对包括在许多生物条件中需要定量的彩易福彩的有限选择的彩易福彩选择的彩易福彩的研究过于繁琐和不灵活。高成本和彩易福彩全组织组织或整个模型生物的技术障碍,具有稳定同位素;繁琐的清洁蛋白提取物制备;合成肽标准的不一致质量;膜和改性彩易福彩的偏置量化是靶向彩易福彩组学应用中的常见瓶颈。
      在这里,我们报告了我们称为MS Western的方法,该方法提供来自未标记的细胞和组织裂解物的数十种使用的彩易福彩的多路复用绝对(以摩尔人)抗体定量,所述组织裂解物结合了常规WB的样品制备型具有特异性,准确性和LC-MS / MS的敏感性。

      实验步骤

       化学品和试剂

      所有试剂都是分析级或更好的质量。 LC-MS等级溶剂购自Fisher Scientific(Waltham,MA);来自默克(德国达姆施塔特,德国)的甲酸(FA),来自Roche的完全超蛋白酶抑制剂(德国Mannheim);胰蛋白酶金,质谱等级,来自Promega(麦迪逊,Wi);新英格兰Biolabs的限制酶和缓冲液(Ipswich,MA); Novagen(Gibbstown,NJ)的苯并酶;其他常见的化学品和缓冲液来自Sigma-Aldrich(德国慕尼黑)。预制4至20%梯度1-mm厚聚丙烯酰胺迷你凝胶来自名称的Elektrophorese(Rodau,德国)。

       彩易福彩标准和氨基酸

      彩易福彩标准:牛血清白蛋白(BSA),糖原磷酸化酶(GP),醇脱氢酶(ADH),烯醇酶(ENO)和泛素(UBI)被用作Sigma-Aldrich的冻干粉末。通过1D SDS-PAGE和氨基酸分析(瑞士苏黎世功能基因组学中心)检查了它们的纯度。 Pierce BSA标准和重组人类组织的安瓿分别从Thermo Fisher Scientific(Waltham,MA)和新英格兰Biolabs购买。氨基酸来自Applichem(德国达姆施塔特);同位素标记 13C615N4-l-Arginine和 13C6-l-Lysine来自桑丹斯(慕尼黑,德国)。

       GELC-MS / MS的彩易福彩分析

      为了使彩易福彩泳道凝结用Coomassie CBB R250和凝胶板染色彩易福彩泳装凝胶,覆盖着质量范围的凝胶板 加利福尼亚州 关闭±20 kda Mr 切除靶蛋白。彩易福彩是 凝胶 用胰蛋白酶消化(
      • 舍甫琴科A.
      • Tomas H.
      • Havlis J.
      • 奥尔森J.V.
      彩易福彩和彩易福彩彩易福彩谱位的质谱表征的凝胶分解。
      )通过纳米洛LC-MS / MS分析回收的胰蛋白肽(
      • Vasilj A.
      • 格子米
      • UEEBERHAM E.
      • Gebhardt R.
      • 舍甫琴科A.
      一维凝胶电泳组织彩易福彩组学与无标记彩易福彩定量联合。
      );关于GELC-MS / MS程序的全部详细信息在补充方法中提供。在LTQ orbitrap Velos或Q辐射HF质谱仪上以数据依赖性采集(DDA)模式获得质谱,来自Thermo Fisher Scientific(不来梅,德国)。 DDA设置提供 补充表S5.

       数据处理

      为了将肽与靶彩易福彩匹配,由Mascot V.2.2.04软件(矩阵科学,伦敦,英国)进行MS / MS光谱,其针对包含所有靶蛋白,人角蛋白和猪胰蛋白酶的序列的定制数据库(总,234彩易福彩条目)。我们施加5ppm的前体质量耐受性;片段质量耐受0.6Da和0.03da,用于LTQ orbitrap Velos和Q辐射HF仪器;固定修饰:氨基甲酰基(C);可变修饰:乙酰基(蛋白N末端),氧化(M);标签:13C(6)(K)和13C(6)15N(4)(R);切割特异性:胰蛋白酶,允许最多2个错过的乳沟。接受具有高于20的离子评分的肽(意义阈值 p <0.05),如果通过MS / MS和XIC峰的保留时间鉴定了相同肽的光和重形状,则仅进行量化。 XCALIBUR(Thermo Fisher Scientific)和后期LC-MS V.4.1(非线性动力学,英国)软件用于从LC-MS / MS数据集中提取肽特征。

       实验设计与统计理由

      对于MS Western的基准和验证,我们设计了四种Qconcat嵌合蛋白(CP01至CP04),其具有35至264kDa的范围,并包含来自不同性质的彩易福彩的彩易福彩肽( 例如 细胞溶质,跨膜),尺寸(从8至2065kDa)和有机体起源。 HeLa细胞中的敲除实验在生物三份酸盐中进行,并通过技术复制品中的LC-MS / MS分析。在通过连续稀释HeLa细胞的总彩易福彩提取物中进行的15个样品中的每一个进行MS西部基准测试实验。核心组蛋白在斑马鱼胚胎中定量三个生物学重复,并在技术复制品中获得LC-MS / MS运行。无论适用,我们都提供标准偏差(±S.D。),方差系数(CV)和鲁棒系数的方差系数(RCV)计算为中位绝对偏差的1.4826倍(
      • 无缝的C.
      • 霍尔曼S.W.
      • 布朗桥P.
      • Lanthaler K.
      • 哈曼五。
      • Watkins R.
      • 哈蒙德D.E.
      • 米勒R.L.
      • SIMS P.F.
      • 授予C.M.
      • eyerc.e.
      • Beynon R.J.
      • 哈贝德S.J.
      通过选定的反应监测直接和绝对定量超过1800酵e蛋白。
      ,
      • VizcaínoJ.
      • Csordas A.
      • Del-Toro N.
      • 戴安斯J.
      • 怜悯J.
      • Lavidas I.
      • Mayer G.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • Ternent T.
      • 徐Q.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      2016年更新自豪数据库和相关工具。
      )。

       彩易福彩的定量掺入大肠杆菌裂解物中

      过夜文化(OD600 = 1.5) 大肠杆菌 在4℃(JLA 8.1000离心从Beckman Coulter,Brea Ca)以5000rpm以5000rpm离心5分钟,将菌株BL21(DE3)T1 PRARE沉积5分钟。将细胞沉淀重新悬浮在2×PBS中,在存在蛋白酶抑制剂存在下裂解,并使用Pierce BCA彩易福彩测定试剂盒定量总彩易福彩含量(Thermo Fishific)。将含有25mmol至25pmol每种彩易福彩标准(通过氨基酸分析量化的氨基酸分析量化)的等摩尔混合物被掺入50μg 大肠杆菌 彩易福彩提取物并如上所述进行1D SDS-PAGE。在对应于尖刺蛋白的表观MWS的电泳凝胶切片上,切除,用CP01的凝胶带,并通过LC-MS / MS定量回收的肽。

       人重组组蛋白H4的绝对定量

      将浓度为1mg / ml的重组人H4的储备溶液的等分试样适当稀释并与2×Laemmli缓冲液的相等体积混合。如上所述对含有0.05,0.1和0.3μg组蛋白H4的三种样品进行1D SDS-PAGE。同时,在单独的凝胶上运行Cp02和含有0.066μg的皮尔刺穿BSA标准的等分试样。组蛋白H4,CP02和BSA的切除条带混合并用胰蛋白酶分解。后 凝胶 在46μl5%的5%水溶液中重构Codigestion和萃取,通过LC-MS / MS分析5μl。

       HeLa细胞中的击倒实验

      Akt1,Cat,PLK1和Tuba4a基因使用RNAi(Eupheria Biotech,Dresden,Dresden,Dresden,Dresden)在Hela细胞中被击倒(KD)。 KD实验一式三份进行;在单独的板上进行Renilla Luciferase转染作为RNAi特异性控制。进一步的细节以补充方法提供;有关抗体和RNAi探针的细节 补充表S6和S7, 分别。

       Western和Li-Cor Odyssey Ms的彩易福彩量化比较

      HeLa细胞在Dulbecco的改性鹰培养基中培养,补充有10%胎牛血清和1%青霉素 - 链霉素(Gibco™Life Technologies)。 1×107 在含有完全蛋白酶抑制剂混合物的100μL缺钙缓冲液中重新悬浮Hela细胞,无核(Roche)。加入等体积的2×LaemmlI缓冲液,并在80℃下,用间歇涡旋在80℃下孵育15分钟。将上清液转移到新的小瓶中并进一步用RIPa:2x Laemmli缓冲液(1:1,v / v)稀释。在每个稀释步骤中获得的样品在两种不同凝胶上进行1D SDS-PAGE。 Li-Cor Odyssey分析了一种凝胶,另一种由CP03和BSA的CP03和BSA的BUSS作为标准和参考蛋白分析。在每个稀释步骤中,消化等当量的靶蛋白并将其注射到LC-MS / MS中或由卫生间成像。

       监测Hela蛋白凝胶中的凝胶病毒的动力学

      彩易福彩提取物 加利福尼亚州 。 1×107 如上所述制备HeLa细胞,然而在一系列实验中,将相同量的细胞在缓冲液的两倍体积中均化。将相当于回收的彩易福彩材料总量的4%的细胞提取物的等分试样被加载到多个聚丙烯酰胺迷你凝胶的多个泳道上。在SDS-PAGE上,凝胶板 Mr 对应于Tuba和Cat蛋白的切除; CP03和参考蛋白BSA的凝胶带与每个凝胶板混合,所有样品都与胰蛋白酶一起分解。在指定的时间段后,将每种消化实验的一个样品取出,从整个中提取肽 - 凝胶 如上所述,通过LC-MS / MS进行消化和量化。在技​​术复制品中分析了每个样品。通过平均来自大鼠和BSA的五种独立定量的肽和来自猫的三种肽的量来计算在每个时间点消化的彩易福彩。

       西部MS Zebrafish Embryos中组蛋白的绝对定量

      野生型(TLAB)斑马鱼胚胎立即在施肥中剥离,同步并使其在28℃下显影至所需的阶段。每次发育阶段(1个细胞阶段除外5个胚胎除外)的十个胚胎被手动脱溶,并在液氮中冷冻。将样品在Laemmli缓冲液中在98℃下煮沸10分钟并进行SDS-PAGE。将含有所有组蛋白的单个凝胶板从每个样品泳道中切除,并且通过CP02和BSA的带分别作为标准和参考蛋白来定量组蛋白。将回收的胰蛋白肽的总量的10%注入LC-MS / MS中。

       Li-Cor Odyssey Zebrafish Embryos中组蛋白的绝对定量

      在特定的发育阶段收集斑马鱼胚胎(n = 5对于H3和H2B; n H2A和H4的10)。如上所述加工胚胎,并对SDS-PAGE进行总彩易福彩提取物。将彩易福彩呈涂成硝化纤维素膜(GE生命科学)。初级抗体(补充表S8)在室温下在室温下孵育1小时或在4℃下过夜;二次抗体(补充表S8)在室温下孵育45分钟。使用管蛋白定量彩易福彩通过锂·甘露孔定量作为负载控制。重组人组蛋白的标准用于制备校准图以进行相应的斑马鱼同源物的定量。

      结果和讨论

       女士西部:彩易福彩量化概念和工作流程

      有效地,MS Western MS融合了三种建立的分析方法:GELC-MS / MS(
      • 舍甫琴科A.
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      彩易福彩和彩易福彩彩易福彩谱位的质谱表征的凝胶分解。
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      一维凝胶电泳组织彩易福彩组学与无标记彩易福彩定量联合。
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      通过GELC-MS / MS与配对存档新鲜冷冻和福尔马林固定样品产生的差分彩易福彩组学数据的可比性和光谱计数。
      );彩易福彩肽杆杵杆与“顶部 N 肽“彩易福彩量化(
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      用彩易福彩肽探针评分彩易福彩彩易福彩。
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      层状组织的彩易福彩组学分析显示出光感受器细胞的独特糖酵解专用。
      )和Qconcat合成同位素标记的蛋白嵌合体,包括彩易福彩肽的级联序列(
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      替代拟肽人工QCAT蛋白的彩易福彩组学中的多路复用绝对量化。
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      QConcat基因编码的级联签名肽的多路复用绝对量化彩易福彩组学。
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      通过选定的反应监测直接和绝对定量超过1800酵e蛋白。
      )。我们称之为这种方法,因为西方为强调它的目标(而不是全球性),定量,依赖于粗蛋白提取物的SDS-Page和以这种方式,符合古典西方。然而,由于质谱读出,它不需要任何印迹,最重要的是,没有抗体。
      通过MS Western来定量彩易福彩,我们首先选择少数(通常,三到六个)彩易福彩典型肽(
      • Kuster B.
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      用彩易福彩肽探针评分彩易福彩彩易福彩。
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      彩易福彩蛋白肽对定量彩易福彩组学的计算预测。
      )在初步GELC-MS / MS实验中,该实验还验证了分离粗彩易福彩提取物的电泳凝胶车道中靶蛋白的带的位置。但是,也可以从LC-MS / MS光谱的收集中挑选肽(
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      用于分析,验证和存储彩易福彩识别数据的开源系统。
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      PeptidAtlas项目。
      )或通过软件预测(
      • 无缝的C.
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      用于定量彩易福彩组学的替代肽选择的错失蛋白水解切割预测。
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      • Gaskell S.J.
      • 哈贝德S.J.
      结果:使用达成机器学习方法预测绝对定量彩易福彩组学的参考肽。
      )。
      以同样的方式,我们进一步从两种参考蛋白中选择的彩易福彩肽肽 - 在这项工作中,我们使用糖原磷酸化酶(GP)和牛血清白蛋白(BSA)。来自靶标的肽序列和参考彩易福彩均相 在硅片里 以任意顺序除了同一彩易福彩的肽连续定位。整个肽序列侧翼在N-和C-末端,分别具有双搏动标签的序列,然后分别为3C蛋白酶切割位点和HIS-TAG(Fig. 1)。这些标签保护来自产物酶降解的靶肽,并且只有在认为必要时,才可用于富集表达的嵌合物免于全细胞裂解物。完全我们设计了四种项目特定的嵌合蛋白(CP),范围为35至264kDa,总共超过300多种彩易福彩肽(补充图。S1,S3,S5和S7)。设计理由与Qconcat蛋白中的相同(
      • Beynon R.J.
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      • 普拉特准
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      替代拟肽人工QCAT蛋白的彩易福彩组学中的多路复用绝对量化。
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      • 普拉特准
      • SIMPSON D.M.
      • Doherty M.K.
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      • Gaskell S.J.
      • Beynon R.J.
      QConcat基因编码的级联签名肽的多路复用绝对量化彩易福彩组学。
      )在这里,我们仅使用CP首字母缩略词进行呈现清晰度。在这项工作中制造的所有CP都非常表达 E.coli. (补充图。S2,S4,S6和S8)并入超过99.5%的重质精氨酸和赖氨酸残留物(补充图S9 )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1在西部MS中使用的嵌合蛋白(CP)的模块化组织。 来自每种靶蛋白(颜色编码)的彩易福彩肽(示意性地显示为盒子)的序列 在硅片里 串联成单个嵌合体,用来自参考蛋白GP(在N-末端侧的侧面)和BSA(在C-末端侧)和BSA(在C-末端侧)和两个亲和标记与3C切割位点一起侧翼。
      与相对(折叠变化)定量相比,绝对(以摩尔数)定量尺寸统称取决于恰好已知的内标浓度。在Qconcat和相关方法中,通常由氨基酸分析或光学或比色测定确定(
      • 普拉特准
      • SIMPSON D.M.
      • Doherty M.K.
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      QConcat基因编码的级联签名肽的多路复用绝对量化彩易福彩组学。
      )。然而,这需要高度纯化的CP,并且容易批量批量变化和实验室间不一致。相反,MS Western使用简单的解决方法解决方案,无需CP净化(Fig. 2 )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2MS西部绝对彩易福彩量化的工作流程。 含有已知量的参考蛋白BSA的凝胶带(A),CP的凝胶带是代谢标记的 15N4, 13C6 - arg和 13C6 而( B)在预期的范围内切除凝胶板块 Mr 靶蛋白(S)(C)用胰蛋白酶和回收的肽通过LC-MS / MS分析回收的肽(D)。通过比较未标记的XIC峰的丰度(从参考蛋白BSA)来量化CP(E)标记(来自CP)(F)肽(G)。接下来,从匹配的XIC峰的丰富的比率推断出靶蛋白的量(来自靶蛋白)(H)标记(来自CP)(I)彩易福彩肽(J)来自如上所述确定的CP的量。为清楚起见,显示了标记/未标记肽的仅两对(几种)匹配对。溶解的颗粒 大肠杆菌 未经富集CP,对细胞(面板B)进行SDS-PAGE。从Norpa蛋白的定量来自 d.melanogaster. 使用CP04 Chimera作为示例。
      为了量化感兴趣的彩易福彩,对细胞或组织裂解物进行SDS-PAGE。凝胶板大致匹配 Mr 切除靶蛋白并与从车道中切除的CP的带混合 大肠杆菌 裂解物和参考蛋白的带( 例如 BSA)。用胰蛋白酶分解三个条带,通过LC-MS / MS分析回收的肽并通过考虑匹配的光和重肽对的丰度XIC峰来进行量化。通过平均几种(通常为三至六个)彩易福彩肽的摩尔丰度来计算每个定量彩易福彩(包括CP)的摩尔丰度。 CP,BSA和凝胶板与靶蛋白的凝胶带是 凝胶 从相同的摘要中萃取消化,光和重肽在相同的LC-MS / MS实验中萃取并定量。因此,在MS Western工作流程中,从CP的摩尔量推断出每种靶蛋白的摩尔量,其又被称为已知摩尔量的BSA标准。然而,无需用恰好已知的浓度纯化CP或维持其储备溶液。在所有实验中,所有CPS的绝对(摩尔)量为相同的商业蛋白标准(Pierce BSA),具有保证的化学纯度,储备浓度和分批再现性。
      女士议定书议定书应根据 Mr 和丰富的靶蛋白。 Coomassie染色并非旨在可视化靶蛋白的带。相反,切除彩易福彩在稍微较大(通常,±20kDa)凝胶板(Fig. 2C)以他们的预期为中心 Mr 并通过初步GELC-MS / MS验证。如果在几个相邻的凝胶切片上涂抹在几个相邻的凝胶切片上,则应总结每个切片中的每种肽的摩尔量(但不是原料峰面积)。为了最佳地,应通过考虑同位素纯度(≥99.5%)的重度精氨酸和赖氨酸氨基酸而不是大(优于10)来调节光和重肽之间的丰度比4 - 折叠)锻造分析仪的线性动态范围(
      • Scigelova M.
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      orbitrap质量分析仪 - 彩易福彩组学中的概述和应用。
      )。我们通常是代形的 加利福尼亚州。 100毫米的CPS,取决于靶蛋白的丰度。如果需要,使用DDA具有预期列表的DDA,可以进一步增强检测灵敏度 m / z. 靶肽前体,通过T-SIM或并联反应监测(PRM)(
      • Bourmaud A.
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      平行反应监测使用四极氧铝砂质谱仪:原理和应用。
      )。
      连同,一个非常简化的MS Western Workflow提供了几种实验优势。首先,通过几种彩易福彩肽在同一实验中独立地量化CP和靶蛋白,预计它们应该产生定量一致的测定(
      • Vasilj A.
      • 格子米
      • UEEBERHAM E.
      • Gebhardt R.
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      一维凝胶电泳组织彩易福彩组学与无标记彩易福彩定量联合。
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      LCMSE绝对定量彩易福彩:平行MS采集的德形。
      )。其次,MS Western议定书仅需要Femtomole of InsoTopole标记的标准。所有四个CP都是高产的 E.coli. (补充图。S2A,S4A,S6A和S8A ) 和 加利福尼亚州 1毫升细胞培养物在一百单皮摩摩中提供它们。在我们的经验中,表达实验中的表达实验都没有或低产CPS在MS Western定量之前所需的富集。此外,我们没有维持预结的CP股票,但只需直接从装载的凝胶中切除乐队 大肠杆菌 裂解物。第三,因为彩易福彩在4%SDS中溶解并通过GELC-MS / MS分析,量化不受CPS和靶蛋白的溶解度或纯度的影响。 SDS-PAGE还改善了肽检测的动态范围和敏感性。与Arnott的无凝胶“群众西式”方法形成鲜明对比 等等。 (
      • Arnott D.
      • Kishiyama A.
      • luis e.a.
      • ludlum s.g.
      • 玛斯特J.C.
      • 心理J.T.
      无需抗体的膜蛋白的选择性检测 - 彩易福彩印迹的质谱形式。
      “也与彩易福彩的SDS提取相容我们的方法,我们的方法使其能够绝对(而不是相对)量化(也包括膜蛋白),并且不使用化学衍生化和/或多步的彩易福彩肽的重对和光对的清除。最后,与常规WB相比,西方女士不依赖于抗体并在当前价格水平下订购合成基因 加利福尼亚州 每种肽10至15欧元,保证质量和几周的交货时间只是对发电和验证可靠单克隆抗体所需的成本和努力是无可比的。

       西部MS的验证与属性

      虽然西方西部的概念看起来有吸引力,但一个主要的问题仍然存在 凝胶 嵌入聚丙烯酰胺凝胶基质中的靶蛋白的靶蛋白的CODIGETION与丰富的背景蛋白和纯BSA标准相同的彩易福彩肽产率相同?
      要回答这个问题,我们设计并表达了 加利福尼亚州。 42 kda chimera cp01(补充图S1和S2A)包含来自五种商业彩易福彩标准的31种彩易福彩肽:GP,BSA,ENO,ADH和UBI(补充表S1)。其凝胶带的GELC-MS / MS产生100%序列覆盖率(补充图。S2B)并确认同位素标记效率≥99.5%(补充图S9 )。
      这五种靶蛋白中的每一个的凝胶带与CP01的带状有代码粒。通过LC-MS / MS分析提取的肽,并进行了相对的光(归一化至所有光线)的相对丰富,并进行重(归一化至所有重的)彩易福彩型肽(补充图S10)。我们观察到,在31种肽对中,相对丰富的相对丰度不足5%(补充图S10)尽管光和重肽起源于结构性不同的嵌合体和内源蛋白。确实,之前 凝胶 消化嵌合体,靶和参考蛋白首先通过SDS完全变性,然后通过Coomassie染色期间通过乙酸/甲醇完全变性。此外,由于SDS-PAGE的粗提取物的预备,只有一小部分的背景彩易福彩组与靶蛋白一起被尖头。符合以前的发现(
      • 无缝的C.
      • 霍尔曼S.W.
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      • Watkins R.
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      • eyerc.e.
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      • 哈贝德S.J.
      通过选定的反应监测直接和绝对定量超过1800酵e蛋白。
      ),我们观察到靶蛋白和CPS的大小和组成没有明显的影响,并推测SDS-PAGE和 凝胶 消化甚至可能会放松约束(
      • Lowherhal M.S.
      • 梁y.x.
      • Phinney K.W.
      • Stein S.E.
      定量自下而上的彩易福彩组学取决于消化条件。
      )施用于选择彩易福彩肽。
      只有几个情况(补充图。S10B和S11F)并非所有相对丰富的都是由于胰蛋白酶切错或翻译后修改(PTMS)。然而,无论它们都错配的原因,“有问题”对肽可以通过其不间断的相对丰度来发现并忽视彩易福彩量化。
      我们接下来询问肽相对丰富的肖像吗? 凝胶 CP和靶蛋白的消化保证了它们的准确摩尔量化。作为试验台,我们使用来自四个核心组蛋白H2A,H2B,H3和H4的CP02包含肽的CP02 D.Rerio. (补充图S3,S4补充表S2)。我们还获得了作为储备溶液提供的人重组组蛋白H4的标准,其具有恰好已知的浓度。人类和斑马鱼组蛋白H4共享99%全长序列标识(补充图。S12)并且我们测试了使用来自CP02的相同肽可以量化人H4,其摩尔丰度参考BSA标准。对含有不同量的人H4的三种等分试样进行SDS-PAGE并由西部MS量化。来自BSA和组蛋白H4的光肽的相对丰度以及CP02的相应重肽是良好的一致性(Fig. 3AFig. 3B, 分别)。一种BSA(Qtalvellk)和一种组蛋白H4(TVTAMDVVYALK)肽的相对丰度因内源性蛋白序列中的侧翼二元氨基酸残基引起的胰蛋白酶白藜芦醇蛋白(
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      )。当加入XIC峰的XIC峰的区域加入到计算中时,预期的相对丰富被恢复。接下来,对于每种肽和每种量的组蛋白H4,我们计算它们的光的相对丰度(归一化至所有光线)和重(归一化至所有重)肽形式的比率。如果这些标准化的相对丰富保持相同,则其比率应接近1.0的值,这也与我们的研究结果一致(Fig. 3C)。总共,在三个独立的实验中,MS Western Stationification依赖于五种彩易福彩肽(Fig. 3B)正确地确定了在凝胶上装载的不同摩尔量的组蛋白H4(Fig. 3D )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3通过对重组人组蛋白H4的绝对定量验证MS Western。 A,分别由BSA和CP02带的CODIGESTION产生的轻质和重和重和重和重的BSA肽的相对丰度。 B,分别通过重组人H4和CP02的带状带分别产生的光和重肽的相对丰度。与相应的彩易福彩肽补充的白切片肽的丰度和序列是红色的。 C,轻质和重肽的相对丰度的比例(如在面板中) B)在组蛋白H4的三种不同的载荷中。 D,装载和MS Western定量摩尔量的组蛋白H4。提供了CodeGested CP02的量作为参考。数据显示为平均值±S.D. (面板 A B N. = 3;面板 C D N. = 2).
      最后,我们检查了目标,嵌合体和参考蛋白是否为 凝胶 在其自身的动力学上各代码物,如果需要精确的绝对量化所需的消化率匹配?为此,我们监控 凝胶 在SDS-PAGE中消化α-微管蛋白(Tuba,50kDa)和过氧化氢酶(猫,60kDa)从HeLa细胞分离出总彩易福彩提取物。凝胶板在记者中被切除 Mr,具有72 kda chimera蛋白Cp03的带状症状(补充图S5,S6补充表S3)包含来自Tuba和Cat的彩易福彩肽,以及参考蛋白BSA的带。从中提取的肽 凝胶 通过LC-MS / MS量化消化以产生动力学图 Fig. 4A, 4B , 和 4C。在Hela提取物中的大量大量的大量不同 加利福尼亚州 100-fold (Fig. 4B, 4C)他们和他们一起消化了 加利福尼亚州 1100转接背景蛋白。作为一致性检查,我们独立地消化了同一提取物的两种负荷,其总彩易福彩量不同2倍。符合上一个报告 在解决方案中 消化嵌合蛋白(
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      )Qtalvellk的产量在延长的消化时间内没有改善,而来自CP03的释放是迅速和完整的。来自TUBA的肽QLFHPEQLITGK也以缓慢的速度产生,但是在12小时后释放完成(Fig. 4E, 补充图S14)。重要的是,通过偏离其光和重形式的相对丰度的比率并支持接受或排除彩易福彩量化的明智决定,清楚地反映了所有消化时间点的两种肽的偏置产率。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4动力学 凝胶 内源性和嵌合蛋白的十思植物。 A,消化CP03。 B , 和 C分别消化大鼠和猫。虚线表示预期的50%蛋白在实验中用2倍稀释提取物。 D, E,分别分别来自BSA(参考蛋白)和Tuba的光和重肽的相对丰度的比率。绘制为100%的载荷和载荷50%的负荷分别用于消化来自未稀释的和2倍稀释的HeLa提取物的彩易福彩。所有Codigestions中CP03的数量是相同的。 Y轴处的彩易福彩量表示两种技术复制品的平均值。

       基准测试彩易福彩量化由西部MS

      我们通过三种方式进一步基准MS Western Station。首先,我们检查其线性动态范围是否受到伴随蛋白背景的影响。其次,我们测试了WB和MS Western都在全细胞裂解物中的内源蛋白定量相互作用的确定。最后,我们对目前最先进的定量Westernssy(进一步称为Odyssey)的最先进的定量Western印迹系统(进一步称为Odyssey)的基准测试,依赖于识别靶蛋白的丰度的近红外免疫荧光读数。
      首先分析了一系列含有25mmol至25pmol的四种彩易福彩(GP,BSA,eno,ADH和UBI)的25 pmol的11种样品掺入50μg 大肠杆菌 彩易福彩提取物。对每个样品进行SDS-PAGE,通过在CP01的带状条件下通过CODERESTINGS Western Ms aseied来定量五种彩易福彩。 eno和ADH的密切迁移带(δMr 加利福尼亚州 10 kda)被切除并一起消化。通过绘制与每种彩易福彩相关的彩易福彩彩易福彩消化的每种彩易福彩相关的彩易福彩肽绝对丰富的彩易福彩肽的绝对丰富的比例的平均值来制备校准图,并在整个彩易福彩载体范围内是线性的(Fig. 5A)。用于制造的21个单独肽的校准图 Fig. 5A 提供 补充图。S15 并提出肽恢复与消化的凝胶板中的彩易福彩大小和丙烯酰胺的百分比无关,并且不受彩易福彩背景的影响。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5基准测试彩易福彩量化由MS西部。 A,MS西方彩易福彩的定量尖刺到恒定的背景下 大肠杆菌 裂解物; Y轴:彩易福彩丰度表示为光和重彩易福彩肽丰富的平均比例; X轴:负载彩易福彩量,PMOL。 B,Li-Cor Odyssey的凝胶图像加载了来自HeLa细胞的连续稀释的彩易福彩提取物。具有绿色和红色荧光的条带分别是Tuba4A / 1A和GAPDH(加载控制)。 C,Coomassie用相同的稀释系列染色凝胶。盒装从每个车道中切除的凝胶板,用于MS Western定量的Tuba1a / 4a。 D,车道9,12,13,14,15,16,17和Lanes 5,6,7,8,9,12,13,11,15,16,17,18,19的大量距离的大管1a / 4a和Gapdh的丰富。从面板中的凝胶图像 B 奥德赛报道。 E,由西部的硅酸盐从凝胶中从凝胶中的凝胶中切割的板中的摩尔量为由西方的板块中的硅酸盐。 C。车道1,10,11,20和车道1,10,15和20是板中的MW标记 BC, 分别。
      接下来,我们在Li-Cor Odyssey和MS Western上进行了测试,提供了全细胞裂解物中内源蛋白的一致性。与西方女士相比,卫生间的绝对量化需要纯彩易福彩标准,因为依赖于可视化带的整体强度的校准图的倾斜不同的单个彩易福彩。因此,为了比较这两种方法,我们通过RNAi耗尽了Hela细胞中的几种彩易福彩。然后,我们通过卫生症和西部MS由MS和KD细胞分析了相同的提取物,并检查了彩易福彩丰富的一致性变化。
      对于MS Western Stationification,我们设计了一种72 kda嵌合蛋白CP03,其包含来自六种人类彩易福彩的47个彩易福彩肽:猫,大桶,PLK1,AKT1,GAPDH和PTEN(补充图S5,S6补充表S3)对于可获得商业单克隆抗体的每种。与荧光素酶对照相比,奥德赛和女士西部均确定地确定了KD细胞中内源桶,PLK1,猫和Akt1的定量交响水平(补充图S16)。有趣的是,MS Western可以分别地量化Tuba4a和tuba1a的相对丰富,共享96%的全长序列标识。两种彩易福彩的丰富受到RNAi的影响,但它们没有区别于奥德赛(补充图。S16F )。
      我们使用相同的彩易福彩与奥德赛相比,基准测试MS Western定量的动态范围和敏感性。为此,从Hela细胞连续稀释的总彩易福彩提取物的样品加载到两种不同的凝胶上。我们调整了加载的体积,使得对于每种稀释,对同一量的彩易福彩提取物(这里举例说明为当量的提取的细胞)进行渗透成像并注射到LC-MS / MS中。因此,彩易福彩摩尔量(如甜蛋白条带的综合强度(由Odyssey确定)可以与不进一步调整相关(Fig. 5B, 5C )。
      Fig. 5D5E 将由MS Western(As Tuba1a)和Odyssey(作为Tuba1a和Tuba4a)定量的稀释块的稀释图分别进行比较。在WB实验中,GAPDH用作加载控制,其丰度遵循稀释Hela提取物。在MS Western中,每种样品都有相同的CP03 CP03,因此其恒定的丰度证明了分析一致性。与奥德赛相比,女士展示了至少60倍的敏感性(低至1.5英尺的Tuba1a)以及更高的动态范围(>16000倍)和优异的线性度(r2 = 0.9983) (Fig. 5E)。在地块中间(Fig. 5D)奥德赛还向GAPDH和TUB1A / 4A展示了良好的线性。然而,在较低的载荷下,奥德赛未识别目标彩易福彩,而在更高的载荷时,系统在较高的系统不正确地整合错过彩易福彩带的丰度并丧失了响应线性。常急,我们还可以量化来自凝胶车道的彩易福彩,没有可见彩易福彩带(Fig. 5C, 5E);为了更好的可视化,我们还提出了扩展的凝胶图像,显示了相应校准图的四个最稀释的样本(补充图S17 )。
      与WB相反,往往伴有误阳性,西方女士似乎更容易出现错误的否定,特别是如果压倒性背景消除了彩易福彩肽的电离和/或靶彩易福彩极低的电离。然而,我们能够在复杂的生物提取物中量化亚次麦粉的彩易福彩到一百个抗摩托范围。 补充图S18 呈现校准图的BSA掺入总彩易福彩提取物的BSA的定量 大肠杆菌 . 补充图S19 在两种生物条件下,呈现229kDa跨膜蛋白腋生的抗摩托量化从总提取物 果蝇 眼睛使用264 KDA Chimera CP04(补充图S7,S8补充表S4)。该图提供了BPC和XIC痕迹以及两种腋窝肽的光和重形式的FT MS光谱,并从相同的量化实验中获取的BSA中的五种参考肽。我们还提供了光和重肽的相对丰富的比例,表明即使在百分之百抗体水平彩易福彩定量,两种肽也是一致的。
      我们注意到,与常规GELC-MS / MS相比,MS Western工作流程不会增强检测灵敏度,并且可能无法量化非常低的丰富彩易福彩,这些彩易福彩可能仍然可以通过古典西部可检测到。虽然在MS Western中,可以将线性校准图延长至100-脂肪的凝胶分离蛋白标准(补充图。S20),仍然可以始终从初步GELC-MS / MS实验开始,在设计CPS之前,以确保靶蛋白是可检测到的并且选择彩易福彩肽的最佳星座。

       斑马鱼胚胎中组蛋白的绝对量化

      组蛋构成染色体的基本单位,核心。每个核小组由147对缠绕在组蛋白八寡发物周围的147对DNA组成,所述组蛋白八寡发物包括四个核心组蛋白中的每一个拷贝:H 2 A,H2B,H3和H4。胚胎继承了母亲的组蛋白(
      • Marzluff W.F.
      • 瓦格纳e.j.
      • Duronio R.J.
      代谢和调节大彩易福彩mRNA:没有聚(a)尾的寿命。
      )之前的WB分析表明,尽管胚胎生长,但在两者的早期开发的早期阶段都是稳定的 Xenopus. (
      • Amodeo A.A.
      • jukam d。
      • 直A.F.
      • Skotheim J.M.
      对基因组的组蛋白滴定设定了Xenopus midblastula转变的DNA对细胞质阈值。
      )和斑马鱼(
      • Vastenhouw N.L.
      • 张Y.
      • 伍兹i.g.
      • 伊玛目F.
      • Regev A.
      • 刘X.S.
      • rinn J.
      • Schier A.F.
      在基因组活化期间建立胚胎多能性的染色质特征。
      ),但在基因组激活时迅速增加。我们推断可预测的化学计量和总含量的时间过程使胚胎作用是验证西部MS的良好模型 体内 experiments.
      我们在Zebrafish胚胎中使用MS Esteire Ms Endior确定H2A,H2B,H3和H4的摩尔含量,其十个发育阶段范围从1个细胞阶段到屏蔽阶段。斑马鱼胚胎(1个细胞阶段 n = 5;除此以外 n = 10)被收集和(除了1细胞阶段除外)手动脱胶(
      • 链接V.
      • 舍甫琴科A.
      • Heisenberg C.P.
      早期斑马鱼胚胎的彩易福彩组学。
      )。从脱泡胚胚中提取的彩易福彩进行SDS-PAGE。平板对应的板坯 Mr 范围 加利福尼亚州 。含有所有核心组蛋白的5至25kDa被从每个凝胶中切除,并且使用CP02和BSA的带量化了组蛋白。我们观察到彩易福彩肽的相对丰度的比例(Fig. 6A)在所有胚胎发生阶段中的不同程度不足,并且得出结论,内源性肽不含PTM。准确(简介<10%)四种组蛋白的绝对量化(Fig 6B; 补充表S9)显示,与之前的报道相反,在开发的早期阶段,组蛋白含量已经稳步增加(
      • 约瑟夫斯。
      • Palfy M.
      • 希尔伯特L.
      • Kumar M.
      • Karschau J.
      • Zaburdaev V.
      • 舍甫琴科A.
      • Vastenhouw N.L.
      组蛋白和转录因子结合之间的竞争调节斑马鱼胚胎中的转录发作。
      )。这表明在斑马鱼胚胎中,母亲沉积在1000细胞阶段围绕1000细胞阶段的Zygotic转录开始前翻译的组蛋白蛋白和相应的mRNA。正如预期的那样,在基因组激活之后,组蛋白含量越来越迅速增加。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6斑马鱼胚胎中核心组蛋白的绝对量化。 A,分别在不同发育阶段和CP02的内源性组蛋白中产生的光和重彩易福彩肽的相对丰度的比例。 B,由西部MS量化的胚胎胚胎的个体组蛋白的摩尔含量。 C,四种组蛋白的化学计量比由西部Ms确定。 D,由Li-Cor Odyssey定量的组蛋白含量。数据显示为平均值±S.D. (n = 3).
      单个组蛋白的摩尔量与预期的等摩尔化学计量一致(Fig. 6C)。在显影的早期阶段,组蛋白化学计量略微略微偏离等摩尔比,然而在后期阶段密切接近。我们注意到,如果将它们组装成核小体或与伴侣相关联(
      • Marzluff W.F.
      • 瓦格纳e.j.
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      代谢和调节大彩易福彩mRNA:没有聚(a)尾的寿命。
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      • 博勒阿A.
      • desvignes t.
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      • Chesnel T.
      • fauvel C.
      • Bobe J.
      母体遗传的NPM2 mRNA对于斑马鱼的鸡蛋发育能力至关重要。
      )。
      我们还通过奥德赛量化了组蛋白(Fig. 6D)并将其与西部Ms(补充图S21)。我们发现,奥德赛的量化通常是不确定的,各个组蛋白之间的化学计量无处可靠近预期的等摩尔比。这再次突出显示WB量化对抗体和彩易福彩标准的质量非常敏感。
      在一起,MS Western EnapEd Enabled能够直接从总彩易福彩提取物直接从总彩易福彩提取物中脱蛋白的四核组蛋白的摩尔量的精确和一致地定量,并且在早期胚胎发生过程中揭示了它们意外的个体动态。

       结论和观点

      我们认为西方女士是一种实用而技术上简单的解决方案,用于彩易福彩的准确多重靶向绝对量化。在MS Western工作流程中,SDS-PAGE避免靶和嵌合蛋白的有限溶解度;它还除去干扰缓冲剂和洗涤剂,包括SDS。总彩易福彩提取物的预备改善了对量化的动态范围和敏感性。彩易福彩定量依赖于多种彩易福彩肽和匹配对重对和光肽的相对丰度之间的一致性提供了对定量一致性的独立验证。然而,西方女士的一个概念限制是难以预测低丰富的彩易福彩( 例如 可以通过GELC-MS / MS检测转录因子。在我们经验中,通过经典的Western印迹或从转录组织突出的彩易福彩的检测没有通过GELC-MS / MS替代初步分析,并建议在规划系统西部实验之前确定可检测蛋白的范围。然而,一旦检测到目标蛋白,它们的准确绝对多路复用量化成为直接的技术任务。
      在未来,探索单一,合理的CP可以涵盖代谢和/或信号传导途径的所有必要成员,并使我们将其摩尔丰度与相应代谢物的摩尔浓度相关联。如果CP可以用作模板来探讨探索也是有趣的,以便通过某种化学或遗传方式合并特定的现场后翻译改性。

      数据可用性

      彩易福彩组学数据已经通过Proteomexchange登录:PXD005654和DOI:PXD005654和DOI:10.6019 / PXD005654,通过普遍存在的彩易福彩组学数据(33)伙伴储存库存放在ProteomeXchange联盟中。

      致谢

      我们感谢AS,NV和FB实验室的成员,以获得有用的讨论和专家技术支持。我们特别感谢Henrik Thomas博士(MPI CBG)开发有用的数据处理工具。

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