染色和存活癌细胞的比较蛋白质组学改善了药物靶标的鉴定,并在细胞生命/死亡决定上脱光*

  • 阿米尔ata saei.
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    从生理化学分工I,医学生物化学和生物物理学系,Karolinska Institutet,Scheelesväg2,Se-17 177 177 177斯德哥尔摩,瑞典
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  • Pierre Sabatier
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    从生理化学分工I,医学生物化学和生物物理学系,Karolinska Institutet,Scheelesväg2,Se-17 177 177 177斯德哥尔摩,瑞典
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  • ÜlküGülerTokat.
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  • Alexey Chernobrovkin.
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  • 穆罕默德·皮尔戈拉尼亚
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  • 罗马A. Zubarev.
    一致
    应涉及对应的通信:医学生物化学和生物物理学系的生理化学分工,Karolinska Institutet,Scheelesväg2,Se-17 177 177 177斯德哥尔摩,瑞典。电话:+ 46-(0)8-524-875-94。
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了来自Cancerfonden的赠款(2014/381和2016/546)的支持。 ÜlküGülerTokat感谢土耳其科技研究委员会(Tübi̇tak)的财务支持。
    本文含有补充材料。
      化学治疗剂导致粘附癌细胞的分离和死亡。在研究蛋白质组变化以确定抗癌药物的蛋白质靶标的和作用机制时,通常使用静止的细胞,而分离的细胞通常被忽略。为了测试分离细胞蛋白质蛋白质含有有价值信息的假设,我们分别分析了脱离和附着的HCT-116,A375和RKO细胞的蛋白质组,用5-氟尿嘧啶,甲氨蝶呤和紫杉醇处理了48小时。单独地,附着和分离细胞的蛋白质组学数据在靶标和药物机制卷积中具有相当的性能,而组合数据显着改善了紫杉醇的目标排名。附属的比较分析相对分离的蛋白质群体进一步了解细胞生命和死亡决策。六种蛋白质在分离中持续上调或下调相对无论药物和细胞类型都被发现,附着细胞;通过用siRNA沉默来测试它们在细胞死亡/存活中的作用。敲击USP11,CTTN,ACAA2和EIF4H具有抗增殖的效果,影响UHRF1另外敏感细胞对抗癌药物,同时敲击RNF-40增加的细胞存活率。因此,将分离的细胞添加到药物处理细胞的表达蛋白质组学分析中可以显着提高方法的分析值。数据已经沉积到蛋白质十种XDOMEXCHANGE,标识符PXD007686。
      与将化合物库的靶向筛查不同,其中测试与蛋白质结合的,在表型筛选中,使用基于机械盲的细胞的测定来鉴定诱导所需生物效果的化合物。因为在后一种方法中,读出是一种疾病相关的过程,并且可以在一次筛选中覆盖多个靶,所以认为铅复合发现的成功率高于目标方法。实际上,FDA经过1999 - 2008年批准的37%的一流化合物来自表型筛查(与目标筛查的23%相比),而目标筛查在追随者药物中更成功(51% 相对 18%来自表型筛选)(
      • Lee J.A.
      • Uhlik M.T.
      • Moxham C.M.
      • Tomandl D.
      • sall d.j.
      现代表型药物发现是一种可行的新古典药物制药策略。
      ,
      • Swinney D.C.
      • 安东尼J.
      如何发现新药物?
      )。尽管在最近的分析中发现了2008 - 2013年在批准由基于目标的方法发现的一类药物(
      • eder J.
      • SEDRANI R.
      • Wiesmann C.
      发现一类药物:起源和演变。
      ),表型筛查仍然是新型药物候选者的重要来源。给定目前对彻底表征的药物目标和行动机制(MOAS)
      使用的缩写是:MOA,行动机制; 5-FU,5-氟尿嘧啶; dthiothreitol; Fitexp,表达蛋白质组学的靶标功能鉴定; IAA,碘乙酰胺; LC-MS / MS,液相色谱相结合串联质谱; MCM,美胞组体维持蛋白; MTX,甲氨蝶呤; OPL,正交部分最小二乘分析; PCA,主成分分析; PCTL,紫杉醇; SDC,脱氧核酸钠; SDS,十二烷基硫酸钠。
      1使用的缩写是:MOA,行动机制; 5-FU,5-氟尿嘧啶; dthiothreitol; Fitexp,表达蛋白质组学的靶标功能鉴定; IAA,碘乙酰胺; LC-MS / MS,液相色谱相结合串联质谱; MCM,美胞组体维持蛋白; MTX,甲氨蝶呤; OPL,正交部分最小二乘分析; PCA,主成分分析; PCTL,紫杉醇; SDC,脱氧核酸钠; SDS,十二烷基硫酸钠。
      ,这些候选人的目标和MOAS需要通过一组复杂的分析方法来表征。此外,尽管大多数FDA批准的药物具有已知的靶和MOA,但也有多种有希望的实验化合物,没有可靠的机制信息(
      • Holbeck S.L.
      • 柯林斯金。
      • doroshow J.H.
      人肿瘤细胞系NCI60面板中食品和药物管理批准的抗癌剂分析。
      ,
      • 重温W.C.
      • 阳光M.
      • 刘H.
      • varma s.
      • KOHN K.W.
      • 莫里斯j.
      • Doroshow J.
      • Pommier Y.
      Cellminer:基于网络的基因组和药物工具套件,用于探索NCI-60细胞系列中的转录物和药物图案。
      )。此外,过去可能已经错误地分配了一些化合物的MOA,因为靶向方法倾向于忽视替代靶和途径(
      • Somlyai G.
      • 柯林斯T.Q.
      • meuillet e.j.
      • 斯坦德拉P.
      • D'Agostino D.P.
      • Boros L.G.
      Phenformin,Lipitor和Gleevec之间的结构同源物在白血病和黑色素瘤中瞄准相同的代谢性肿瘤靶。
      )。因此,设计了用于鉴定目标和MOA去卷积的新方法可以有助于抗癌药物发现,其中所需的效果是癌症细胞死亡。
      基于质谱基的蛋白质组学证明是抗癌药物发现不同阶段的有用工具。为了协助蛋白质靶标和小分子药物的蛋白质的去卷积,我们最近设计了一种典型的基于质谱的方法,称为通过表达蛋白质组学(FITEXP)的功能鉴定(
      • Chernobrovkin A.
      • Marin-Vicente C.
      • 签证N.
      • Zubarev R.A.
      表达蛋白质组学(FITEXP)靶标的功能鉴定显示蛋白质靶标并突出小分子药物的作用机制。
      )。该方法是基于观察,在癌细胞死亡的晚期阶段,小分子的蛋白质靶标的丰富变化特别强。 FITEXP可以针对几种常见的抗癌剂,包括紫杉醇(PCT1),多柔比星,5-氟尿嘧啶(5-FU),甲氨蝶呤(MTX),罗尔特拉特蛋白和喜树碱,在4000多个蛋白质中的已知靶标。该方法基于仅通过对其治疗治疗的治疗和特异性的调节来分类所有蛋白质的所有蛋白质来扣除药物靶标的药物靶标。为了引入内部阳性对照并通过过滤涉及细胞死亡的通用蛋白质来增加特异性,将几种已知的药物加入到化合物面板中。已经表明,通过将来自几个细胞系的数据组合并仅考虑在面板中始终如一的蛋白质,可以进一步增强特异性
      • Chernobrovkin A.
      • Marin-Vicente C.
      • 签证N.
      • Zubarev R.A.
      表达蛋白质组学(FITEXP)靶标的功能鉴定显示蛋白质靶标并突出小分子药物的作用机制。
      )。除了药物目标鉴定之外,Fitexp的益处是具有最大丰度变化和最高特异性的蛋白质可以在已知的蛋白质网络上映射以显示药物MOA。
      然而,需要通过提高目标解卷积的准确性和特异性来进一步改善方法。改善潜力在于抗癌药物适用于基质附着的癌细胞培养物引起细胞脱离,并且只有细胞死亡。当研究FITEXP和其他蛋白质组学方法的蛋白质组变化时,通常使用静止的细胞,而分离的电池被认为是缺乏结构完整性并且因此丢弃。许多分离的细胞确实可渗透到台盼蓝,因此通常被认为是死亡的。然而,当在新鲜培养基中重新腐殖时,分离的细胞群可以恢复和生长,因此分离的细胞蛋白质组可能包含与药物目标和作用相关的额外有价值的信息。因为脱离的细胞是受到抗癌剂最受影响的那些,因此它们的蛋白质组变化可能反映药物诱导的方法甚至比静物细胞更好。
      在这项研究中,我们试图测试上述假设和收集来自分离的细胞的附加信息,并评估Fitexp的这种方法的相对值。作为模型系统,我们使用了用5-FU,MTX和PCTL处理的HCT-116,A375和RKO人癌细胞50 浓度。分别获取来自基质连接和分离的细胞的蛋白质组学数据并用作FitexP分析的输入。基于上述药物的已知靶标评估所获得的信息的准确性。
      来自分离细胞的数据几乎与附带的细胞有关关于鉴定药物靶标和MOA的有价值。我们还可以识别在附着或分离的细胞中类似地调节的几种蛋白质(IE。 无论治疗和细胞类型如何,在垂死或存活的状态下。测试这些蛋白质可能涉及细胞死亡和生存决策的假设,我们研究了SiRNA对细胞活力和敏感性/抗性的敲击此靶标的效果。

      实验步骤

       实验设计与统计理由

      蛋白质组学数据衍生自3组样品并由LC-MS / MS分析。所有治疗方法在三种生物学复制中进行,从而可以进行适当的统计分析。在实验的每个部分中,包括用车辆处理的单独对照。以随机顺序分析样品以减少“注射率”效果。在Q辐射加质谱仪上以90分钟的梯度进行90种无标记分析。在第1部分中,用5-FU(24个样品)处理A375和HCT116细胞,而在第2部分中,用5-FU处理RKO细胞,用PCT1和MTX(30个样品)处理A375细胞。最后,在第3部分中,用MTX和PCTL(36个样品)处理RKO和HCT116细胞。通过计算复制之间的变化(CV)以及通过构建PCA模型来进行质量检查,以验证重复之间的小整体扩展。

       细胞培养

      人类结肠癌HCT116,结肠癌RKO和恶性黑色素瘤A375细胞从ATCC(Manassas,VA)中获得的Dulbecco的改良Eagle的媒介(DMEM - LONZA,MD)生长,补充有10%FBS优越(Biochrom,Berlin,德国) ,2米M L.-Glutamine(LONZA)和100个单位/ ml青霉素/链霉素(Thermo,Waltham,MA)在37°C中的5%CO2.

       IC的确定50 Values

      IC.50 通过MTT测定法测定(发生50%细胞毒性)的值(浓度)(
      • 艾哈迈迪人。
      • 巴拉尔J.
      • saii a.a.
      • Fakhree M.A.A.
      • omidi Y.
      MCF-7细胞系中纳米组织的细胞毒性:MTT测定。
      )。简而言之,将细胞以每孔的3000个细胞的密度接种到96个孔板中,并在培养24小时后,用相应药物的连续浓度处理(0-100μm)溶解在DMSO中。在48小时的总治疗期后,缩短培养基并用100μL新鲜培养基取代。向细胞中加入3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴溴(MTT),将板在37℃下孵育4小时。一百μL十二烷基硫酸钠(SDS)-HCl溶液(10mL 0.01 m 将含有1g SDS的HCl加入到每个孔中,将板孵育18小时。混合后,使用EPOC酶分光光度计(Biotek,Winooski,Vt),在570nm处读取吸光度。 IC.50 通过在Excel中计算浓度,从剂量反应曲线测定值,与未处理的对照相比,引起50%的吸光度降低的浓度。最终的IC50 结果显示在 补充表S1.

       治疗和细胞收获

      用IC的5-FU,MTX或PCTL处理细胞50 浓度在25厘米处2 烧瓶。用载体处理对照细胞(在处理中使用的最高DMSO浓度)。收集48小时后,收集上清液,将附着的细胞胰蛋白酶化5分钟,然后通过400×离心收获它们 g 5分钟。以上上述上清液以540×离心 g 5分钟,收集从基质中分离的细胞。耳蛋白蓝染料排斥测定法用于确定附着和分离的细胞群中收集的活细胞的百分比。细胞粒料立即裂解并消化。所有样品均以三种生物重复制备。

       裂解和消化

      消化是根据我们以前公布的工作流程进行的(
      • Pirmoradian M.
      • Budamgunta H.
      • Chingin K.
      • 张B.
      • 阿斯托加井J.
      • Zubarev R.A.
      单维霰弹枪蛋白质组学的快速和深层人类蛋白质组分析。
      )有轻微的修改。在4倍超过细胞沉淀的体积中加入由3%脱氧胆酸盐(SDC)组成的裂解缓冲液,在4次的体积中加入4次。在80℃温育10分钟后,用Branson Sonicator(Thermo)将样品超声处理1.5分钟(30%幅度,3S / 3S / OFF脉冲)。使用Pierce BCA蛋白质测定(Thermo)测量蛋白质浓度。用二硫噻唑醇(DTT)降低萃取的蛋白质,终浓度为15米 m (60℃持续20分钟)并用20米烷基化m 碘乙酰胺(IAA)(室温在黑暗中30分钟)。将SDC溶液稀释至1.5%的浓度,并以1:100型LysC的比例加入1.5%和质谱级溶酶(Wako Pure Chemical Industries,Osaka,日本)。将样品温育6小时,然后稀释至0.5%SDC。然后以1:100胰蛋白酶至蛋白的比例加入修饰的测序级胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi),然后加入过夜孵育。随后,将乙酸加入到最终浓度为5%,并在室温下将样品置于30分钟。通过以20,000×离心去除沉淀物 g 室温超过15分钟。根据制造商的协议使用滞镁(Thermo)进行并清洁上清液。使用SpeedVac离心蒸发器并在LC-MS / MS分析之前将样品干燥,向样品中加入0.1%甲酸溶液(Fluka)以达到0.2μg/μl的浓度。

       蛋白质组学

      通过LC-MS / MS以随机顺序分析蛋白质消化(1μg)。将样品装入50cm柱(易喷涂,75μm内径(ID),PepmapC18,2μm珠粒,100埃孔径),与缓冲A( 0.1%的甲酸在水中)并用120分钟的梯度洗脱,达到2%至30%的缓冲液B(98%ACN,0.1%FA,2%H.2o)以250nl / min的流速。在数据依赖模式下以17,500的标称分辨率在数据依赖模式中获得质谱,以orbitrap Q辐射加上质谱仪(Thermo Fisher Scientific)。 m/z 范围为375至1700.通过在28 nCE的能量设定的能量碰撞解离(HCD)进行肽片段化。离子选择丰度阈值设定为0.1%,排除单电荷离子。

       数据处理

      通过MaxQuant,1.5.3.8版分析来自质谱法的原始数据(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化PPB系列质量和蛋白质全组蛋白质量化。
      )。 Andromeda搜索引擎(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )对国际蛋白质索引数据库(人类版本2014_02,89054条目)搜索MS / MS数据。前体离子的质量耐受性为20ppm(初始搜索)和4.5ppm(主要搜索),MS / MS质量耐受设定为20ppm。用半胱氨酸氨基甲酰化用作固定改性,而N,Q-脱胺和甲硫氨酸氧化被选择为可变修饰。选择胰蛋白酶/ p和Lysc / p。不超过两个错过的乳沟。在蛋白质和肽水平下使用1%的假发现率作为过滤器。对于所有其他参数,使用默认设置。进行无标记定量肽和蛋白质。通过每次重复的总蛋白质丰度归一化蛋白质丰富。在最终数据集中仅包含具有至少两种肽的蛋白质,除去所有污染物。使用SIMCA(版本14,UMetrics,Sweden)进行多变量数据分析(
      • BYLESJÖM.
      • rantalainen m.
      • 克洛克o.
      • Nicholson J.K.
      • 福尔摩斯E.
      • Trygg J.
      OPLS判别分析:结合PLS-DA和SIMCA分类的优势。
      )。

       网络映射

      将顶部一致上调和下调的蛋白质映射到弦V.10上(http://string-db.org)蛋白质网络分析工具。中等置信阈值(0.4)用于定义蛋白质 - 蛋白质相互作用。随着整个基因组的内部基因设定富集分析,用于鉴定富集的基因本体论术语和途径。

       siRNA实验

      使用一对不同的功能验证(当可用)或预先设计的siRNA用于治疗三种细胞系,无需测试化合物。 SIRNA是从QIAGEN购买的,并列入 补充表S2.
      简而言之,在96孔板中以4000个细胞/孔的密度接种Hct116,A375或RKO细胞,并允许达到汇合〜40%。之后,将0.5μl与无血清培养基混合的脂肪射法胺2000(Thermo)加入到无血清培养基(每孔10pmol siRNA)中的siRNA中,在室温下孵育15分钟,随后用于治疗细胞。 SiRNA治疗在测试化合物的存在和不存在下进行,在4小时后用新鲜的全培养基取代培养基。此后将细胞在37℃下在CO中孵育44小时2 孵化器。使用MTT测定法测量细胞活力,如上所述。 siRNA分别在四个重复中应用。
      为了验证敲低,将RKO细胞用200pmol siRNA在每孔的密度为200,000个细胞的6孔板中处理,并为蛋白质组学分析消化并制备样品,如上所述。 USP11敲低验证在HCT116细胞中进行。在所有情况下,用糖浆siRNA(QIAGEN)处理对照。

      结果

      台盼蓝测定表明,65%至85%的分离细胞对染料渗透,因此大多数细胞可以是常规归类为死亡。脱离细胞的人口将被称为“死亡”,而不是“幸存”或“生活”的人口。

       生命和死亡对细胞蛋白质组产生了最大的影响

      总体而言,在所有样品中鉴定了属于5277个蛋白质的57,255个肽,并且用至少两种肽量化4885个蛋白质。仅考虑所有三个重复中具有非零丰度值的蛋白质,最终数据集包含了1950个蛋白质(补充表S3)。如我们以前所表明,甚至数百个最丰富的蛋白质的丰度可以如实地反映染色细胞的状态(
      • chernobrovkin a.l.
      • Zubarev R.A.
      形态学如何评估细胞死亡方式?蛋白质组学研究。
      )。
      使用多变量分析,构建PCA模型以量化和可视化样本之间的差异。对于5-FU处理,第一(主要)分离的染色(分离)细胞来自存活(附着的)细胞,而第二组分将细胞系和第三个细胞分离,从未治疗的对照中分离治疗细胞(补充图。S1)。对于整个数据集,第一组分分离从存活细胞和第二组分分离的染色细胞分离细胞系(Fig. 1)。为了分析负责分离第三组分中的样品的效果,提取50个蛋白质促进组分的蛋白质并进行串分析。这些蛋白质主要被映射到代谢途径(16个蛋白质,在Kegg中的途径ID:01100, P值 = 4.47e-06),尤其是细胞碳水化合物代谢过程(P值 = 0.0111),如半乳糖(P值 = 0.00698),果糖和甘露糖(P值 = 0.00698),也是谷胱甘肽新陈代谢(P值 = 0.0133).
      图缩略图GR1.
      Fig. 1整个蛋白质组数据集的主成分分析(Q2 = 0.705)。 A,第一个主要成分分离染色(分离) 相对 生物(附着)细胞,而第二组分分离细胞系。 B,第三个组分似乎将不同的状态分离基于碳水化合物代谢状态,例如半乳糖,果糖,甘露糖和谷胱甘肽代谢。

       分离的细胞与药物靶标去卷中的附着细胞

      遵循我们的FITEXP程序,蛋白质是根据其分类和排名的 规定 (在分离的HCT116,A375和RKO细胞中折叠在处理时)。 特异性 通过将蛋白质中的中值调节除以治疗a中的所有其他治疗中相同蛋白质的中值调节来计算。通过在所有分离和附加的国家内的不同细胞系列中的个体级别来完成整体排名。将用于所有三种细胞系组合的基质分离细胞的数据与附着细胞进行比较,以研究哪一个可以更好地识别药物靶标。 表I. 表明,将存活细胞的排名与染色细胞相结合改善了药物靶标的作用,特别是对于5-FU和PCT1。
      表I.药物靶标具有调节和脱离细胞的调节和特异性计算,以及组合排名。通过总结各个排名和排名总和来生成组合排名
      药品已知的目标规定特异性规则+特异性
      L
      a L =活细胞; d =分离或染色细胞。
      combined
      D
      a L =活细胞; d =分离或染色细胞。
      combined
      L & D combinedl组合D组合L & D combinedl组合D组合L & D combined
      5-FUTYM.726296352211
      MTX.DHFR.1162111121
      PCTL.tub2A197711113171915163
      tub827037359416117295
      tub4B909720530414756
      tub2033126411493132388
      TUBA1B1165416421954217539
      TUBA1A13246293176437811
      TUBA1C23230713051123274411022
      tub35852121095081501814625
      a L =活细胞; d =分离或染色细胞。
      在这种方法之后,将胸苷合酶(TYM)从5-FU的第5位置提升到顶部位置,而二氢醇还原酶(DHFR)仍然在MTX的第1位,与这些药物的已知靶标一致。在靶向β-管蛋白的PCT1的情况下,在25个顶部上调的蛋白质中鉴定出八个小管蛋白亚基,其中11个顶部排名蛋白质中的六个是管蛋白的,其中Tubb2a是排名最高(3)。相比之下,对于仅限活性细胞,八个小蛋白素在72个顶部位置铺展。因此,将蛋白质组学数据与附着和分离的细胞组合改善了三种化合物中两种的药物靶标鉴定程序。
      为了可视化药物靶标和其他涉及蛋白质的特定响应,我们构建了区分蛋白质为治疗的蛋白质的正交部分最小二乘(OPLS)模型 相对 所有其他州(治疗和控制)。在这种绘图中,蛋白质响应于治疗的所有细胞系中特异性和始终如一地下调的蛋白质分别位于图的左侧和左侧。如图所示 Fig. 2,DHFR正在为MTX处理的​​蛋白质组反应提供最大的贡献,而小核糖组维持蛋白(MCM)复合物的几个成员,则涉及DNA复制过程的DNA螺旋酶复合物,是下调的。类似地,Tyms和微管蛋白亚基分别在基本上有助于5-FU和PCTL反应的顶部蛋白质中。响应于5-FU可以看到核糖体蛋白的显着下调,这与FITEXP分析一致和我们之前公布的结果(
      • Marin-Vicente C.
      • Lyutvinskiy Y.
      • 罗马书屈费尔斯P.
      • Zubarev R.A.
      • 签证N.
      5-氟尿嘧啶对结肠癌细胞蛋白质组的影响。
      )。对于PCT1,一组上调管蛋白在微管核核酸因子TPX2之前。有趣的是,已显示TPX2敲低敲击胰腺癌细胞至紫杉醇(
      • 华纳S.L.
      • 斯蒂芬斯B.J.
      • nwokenkwo s。
      • HOSERETER G.
      • 苏恒A.
      • Hidalgo M.
      • 特伦特星期三。
      • 韩H.
      • von hoff d.d.
      验证TPX2作为胰腺癌细胞中的潜在治疗靶标。
      )并参与该药物的细胞效果(
      • 卞M.
      • 傅J.
      • 阎y.
      • 陈问:
      • 杨C.
      • 施Q.
      • 江Q.
      • 张C.
      通过促进棱腺球杆组件,紫杉醇的短暂暴露于紫杉醇诱导多极纺锤体形成和交氮细胞。
      )。还注意到涉及细胞极性和微管动态调节的丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶MARK2的上调(
      • 德鲁斯G.
      • eBneth A.
      • 罚款U.
      • Mandelkow E.-M.
      • Mandelkow E.
      Mark,一种新型的蛋白质激酶系列,其磷酸化微管相关蛋白质并引发微管破坏。
      )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2OPLS投影 A,mtx, B,5-fu和 C,PCTL. 相对 所有其他化合物和不同细胞系的控制。 药物靶标和其他机械涉及的蛋白质如颜色所示。 (变化 x 轴对应于调节和特异性和变化 y 轴从OPL中的正交组件出现)。

       分离的细胞与附着细胞:死亡与幸存的过程

      用抗癌剂处理的癌细胞中的差异调节蛋白通常被解释为参与细胞死亡,而其中一些实际上可能涉及存活过程。通过将受管制的蛋白质与分离的调节蛋白质对比,可以对来自存活途径的死亡过程的分化 相对 附着细胞。例如,这种比较显示,与染色细胞相比,在活细胞中,核糖体蛋白的下调在5-FU处理中更普及(Fig. 3)。在该研究中定量的69个核糖体蛋白质中,与对照相比,平均68在存活细胞中下调,而在染色细胞中平均下调核糖瘤蛋白数量较少,有些是显着上调的(补充表S4补充图S2)。在附着细胞中的核糖体下调 - 在分离的细胞中低至更低程度,可能是存活机制的一部分,停止细胞分裂以存活5-fu治疗。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3与染色细胞相比,活细胞5级治疗后核糖体蛋白的显着下调。 A,核糖体亚基的调节频率响应于活细胞5-FU的响应 B,在染色细胞中。 C,所有三种活细胞系中核糖体亚基调控的平均频率 相对 死亡。虚线表示1倍的调节(L =活,D = Dying,H = Hct116细胞,A = A375细胞,R = RKO细胞,F = 5-FU,M =甲氨蝶呤和P =紫杉醇)。
      通常,只有8个核糖体蛋白(RPL4,RPL5,RPS15,RPL23,RPL26,RPS27,RPL27a和RPS28)显示了一个>垂死下的5%下调 相对 存活细胞(浓度的rps27和rps28-倍数二,其余蛋白质≤20%)。大多数核糖体蛋白质(
      • björkblomb.
      • Padzik A.
      • 穆罕默德H.
      • Westerlund N.
      • Komulainen E.
      • 霍洛斯州
      • Parviainen L.
      • papageorgiou a.c.
      • iljin K.
      • Kallioniemi O.
      C-Jun N-末端激酶磷酸化Marcksl1决定了神经元和癌细胞中的肌动蛋白稳定性和迁移。
      )显示A.>垂死5%上调 相对 存活细胞,具有最上调的(2.5倍)是RPS17L和RPL21。大多数核糖体蛋白在治疗和附着地位(59蛋白 - 强烈)上用RPL21进行核心蛋白质用RPL21 - r≥. 0.7),只有6个蛋白质(RPLP1,RPS15,RPS21,RPL23,RPS27和RPS28)显示了一个 r<0.4相关性,其中RPS15,RPS27和RPS28表现出反相关。后者“雷格多”核糖体蛋白质的存在不是意外:各种细胞类型和细胞状态之间的核糖体化学计量的差异是一种相当有记录的现象,并且可以与细胞健身和生长相的不同阶段相关(
      • Slavov N.
      • Semrau S.
      • Airoldi E.
      • Budnik B.
      • 范欧雅纳州A.
      核心核糖体蛋白中的差分化学计量。
      )。然而,我们对RPS27和RPS28的强烈CoreGulation以及与其他核糖体蛋白质的反向/存活过程中的反向吻合似乎是文献和蛋白质 - 蛋白质相互作用数据库的新颖。例如,String数据库列出了RPS27的10个交互伙伴,但RPS28不是其中之一。根据Uniprot数据库,RPS27有两个二进制交互伙伴,其中一个是MDM2。以前,已经表明,在核糖体应激后,核糖体蛋白可以与MDM2结合并抑制MDM2介导的P53泛素化和降解,导致P53依赖性细胞分裂抑制p53依赖性抑制(
      • 张Y.
      • lu h.
      信号传递至p53:核糖体蛋白发现他们的方式。
      ,
      • 吉尔克斯下午
      • 陈L.
      • 陈杰。
      P53对核糖体应激的影响MDMX调节。
      因此,在附着细胞中,2倍上调RPS27(及其核心型合作伙伴RPS28) 相对 分离的细胞可以是阻塞细胞分裂的一般机制。

       附加与脱离细胞的始终规则蛋白质:参与生死决策

      在治疗的脱离细胞中 相对 治疗的附着细胞,我们发现至少六种蛋白质,其在相同方向(上或下)始终调节,而不管使用的细胞系和抗癌剂(表二补充表S5)。作为代表性示例,描绘了EIF4H的调节 Fig. 4。这些蛋白质中的三种涉及泛素化途径,与其存活的对应物相比,染色细胞中全部上调。
      表二无论细胞系和治疗如何,在处理的脱离的与附着细胞中差异表达的选定蛋白质
      基因名称蛋白质名称肽数量附加细胞中的平均比对控制分离细胞中的平均比对控制分离/附加的平均比率p-Value(治疗脱离的调节与附加细胞)
      EIF4H真核翻译开始因子4h111.040.420.402.647E-06.
      CTTN.SRC衬底皮质素221.100.350.322.782E-06.
      ACAA23-酮酰基-CoA硫酶,线粒体190.972.482.560.0013
      RNF40E3泛素蛋白质连接酶BRE1B200.862.122.470.0006
      UHRF1E3泛素 - 蛋白质连接酶UHRF1260.410.922.240.0047
      USP11泛素羧基 - 末端水解酶11231.172.902.480.0100
      图缩略图GR4.
      Fig. 4EIF4H作为用不同抗癌剂处理的所有类型的分离处理细胞下调的蛋白质的实例。 误差栏(标准偏差)不适用于DAF和DHF,因为EIF4H未在1-2重复中量化(H = HCT116细胞,A = A375细胞,R = RKO细胞,F = 5-FU,M =甲氨蝶呤和p = paclitaxel)。
      我们假设这种蛋白质可能参与细胞生命和死亡决策,因此分析了SiRNA在药物存在或不存在中的细胞活力对细胞活力的影响。选择候选人的理由和siRNA实验的工作流程 Fig. 5。每种蛋白质单独使用两种不同的siRNA。对于六个中的五种蛋白质,敲低减少细胞活力,并且在UHRF1的情况下,增加对测试药物的敏感性,而RNF-40敲低效果(Fig. 5)。蛋白质组学在所有12例中确认在RKO或HCT116细胞中的选定蛋白质的成功敲低,下调因子为3至6(补充图S3补充表S6)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5A,选择6种蛋白质的基本原理对细胞死亡或存活影响。 B,功能随访siRNA实验的工作流程。 C,siRNA敲低对细胞活力在5-FU,MTX和PCT1的情况下的影响。 CTTN,USP11,ACAA2和EIF4H的敲低对药物存在下的细胞活力没有影响(误差栏代表4个重复的三个独立实验的标准差)。

       用于未经处理的对照的分离与附着细胞中的受管制蛋白

      由于天然死亡过程,即使未经处理的对照也产生少数(≈2-10%)分离细胞。多种蛋白质在未处理的附加方面一致 相对 确定未经处理的分离细胞。脱离细胞中的许多上调蛋白质早期与转移和癌症进展相关(补充表S7)。在字符串分析中,在拆除的细胞中映射到能量相关途径的30个最上调的蛋白质(补充表S8, 补充图S4)。上调的途径是细胞呼吸,电子传输链,ATP代谢和氧化磷酸化。

      讨论

      癌细胞对抗癌化合物的未指定响应阻碍了通过表达蛋白质组学的化合物靶和MOA的辨别,掩盖了真正的药物靶标。在Fitexp中,从多个细胞系合并蛋白质组学数据有助于增加分析特异性。使用面板的抗癌化合物使能 特异性 进一步提高分析效率的计算(
      • Chernobrovkin A.
      • Marin-Vicente C.
      • 签证N.
      • Zubarev R.A.
      表达蛋白质组学(FITEXP)靶标的功能鉴定显示蛋白质靶标并突出小分子药物的作用机制。
      )。然而,为了进一步改进,需要额外的分析维度。假设这样的尺寸是最初矩阵附着细胞的分离状态。虽然在本环境中死亡,但许多这些细胞保留了它们的结构完整性。他们的蛋白质蛋白质是从存活的静物细胞(Fig. 1),由于死亡可以说是细胞生命周期中最重要的事件并不令人惊讶。然而,药物靶标的表达水平原始和定量地与附着细胞中的定量相似。当组合脱离和附着细胞的排名时,饲料分析的特异性得到改善。因此,将分离的细胞包含在FITEXP工作流中表示该方法的进一步发展。研究抗癌机制的常见做法,当分离仍然被忽略并丢弃时,可以进行分析静止的细胞。
      值得注意的是,许多如果不是大多数,则尚未死亡。几个组包括我们自己,已经观察到,当分离的细胞被重新升压时,它们可以再次开始生长并且可以在板上形成菌落。此观察结果支持对细胞死亡委员会(NCCD)的命名委员会的结论,即“定义生命和死亡比一个人猜测更具成问题”和“细胞死亡的最佳生化标志性是死亡本身”(
      • 罗布佐L.
      • Bravo-San Pedro J.
      • Vitale I.
      • Aaronson S.
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      • 安德鲁斯D.
      • Annicchiarico-Petruzzelli M.
      细胞死亡的基本与附件方面:2015年NCCD的建议。
      )。因此,脱离的细胞应该被认为属于生死之间的灰色区域,但尚未坚定地致力于消亡(实际上,上述NCCD报告的问题是否是严格的边境,超出细胞牢固致力于死亡,存在全部)。
      虽然在染色细胞中,一些下调的蛋白质可能泄漏,因为在细胞的一小部分中的细胞膜的结构完整性的损失,发现上调的蛋白质必须真正过表达。此外,台盼蓝是一种相对较小的分子,分子量为873Da,比细胞蛋白的大小小得多;因此,对锥虫蓝的渗透性并不一定意味着细胞膜的总破坏(
      • 罢工W.
      耳网蓝色排除测试细胞活力。
      )。在未经治疗的分离的细胞中,上调蛋白质映射在能量相关途径上,这提供了进一步了解线粒体的假定作用在程序化细胞死亡的调节/协调中的假设(
      • kroemer g。
      • 芦苇J.C.
      细胞死亡的线粒体控制。
      ,
      • kroemer g。
      线粒体作为细胞死亡途径的积分器/协调器。
      )。可以提出两种替代解释:线粒体努力产生更多能量以驱动细胞死亡过程,或在生存的尝试中,细胞试图提高ATP生产以避免细胞死亡(
      • Ricci J.E.
      • Waterhouse N.
      • 绿色D.R.
      细胞死亡期间的线粒体功能,复杂(I-V)困境。
      )。
      特别兴趣的是,在PCA图上的事实(Fig. 1“存活细胞的蛋白质蛋白质组占据更紧凑的区域,而不是染色细胞的相应蛋白质蛋白质,后者呈现出大量的PCA图。这一发现可能具有兴趣和深远的后果。要求解决的问题是以下(等)。首先,这种抗性表型与原始电池如此不同,以便有资格成为一种不同的细胞类型(换句话说,可以药物辅助的近死经验将一种细胞类型转化为另一种细胞类型)?在任何情况下,如果没有药物的情况,存活细胞会有存活的细胞,具有表观遗传记忆,这将使它们更耐药(
      • Shaffer S.M.
      • Dunagin M.C.
      • Torborg S.R.
      • Torre E.A.
      • 埃斯特B.
      • Krepler C.
      • Beqiri M.
      • 刺刀K.
      • Bradford P.A.
      • 萧米
      稀有细胞变异性和药物诱导的重编程作为癌症耐药模式。
      )?如果是,这些过程经常发生在临床实践中,它们是否有责任患有化疗治疗的癌症患者的疾病复发?
      并行,我们确定了几种蛋白质,它们在治疗的脱离中始终升高或下调 相对 无论使用的细胞类型还是抗癌剂如何,附着细胞。我们假设这种蛋白质可以参与细胞生命和死亡决策,并且为了测试这一假设,在存在和不存在5-FU,MTX和PCTL的情况下击倒了六个最有前途的候选者。正如预期的那样,所有选定的蛋白质对细胞生命和死亡结果都有一定的影响。虽然CTTN,USP11,ACAA2和EIF4H的敲低对药物存在没有对细胞活力没有影响的一般毒性作用,但UHRF1将细胞敏感到测试处理中,RNF40给予细胞对治疗的促进的优势( Fig. 5)。六种蛋白中的三种参与泛素化途径,并且在染色细胞中均上调 相对 由于泛素蛋白酶体系在编程的细胞死亡中的作用,存活细胞特别有趣(
      • Bernassola F.
      • Ciechorover A.
      • 梅里诺G.
      泛素蛋白酶体系及其参与细胞死亡途径。
      )。在上述蛋白质中,E3泛素 - 蛋白质连接酶UHRF1可能是最有趣的,因为它似乎似乎被广泛称为癌症的生物标志物(
      • 阿什拉夫W.
      • 易卜拉欣A.
      • alhosin M.
      • Zaayter L.
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      • 布朗纳C.
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      表观遗传积分器UHRF1:在道路上成为癌症的普遍生物标志物。
      )。 UHRF1可以有助于肿瘤生长(
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      • 郎W.
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      UHRF1,核戒指手指蛋白,肿瘤细胞生长中泛素连接酶活性的关键作用。
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      UHRF1通过在结肠直肠癌中抑制p16ink4a来促进细胞生长和转移。
      )是细胞衰老的主要调节剂(
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      泛素样与PHD和环形指导域1(UHRF1)/ DNA甲基转移酶1(DNMT1)轴是细胞衰老的一次调节器。
      )。 UHRF1在维持哺乳动物细胞中的DNA甲基化方面具有关键作用(
      • Bostick M.
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      UHRF1在维持哺乳动物细胞中的DNA甲基化方面发挥作用。
      )其耗竭与细胞周期停滞有关,激活DNA损伤反应和凋亡(
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      • Senbanerjee S.
      • Kulkarni A.
      • Mudbhary R.
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      UHRF1耗竭导致G2 / M的抑制,激活DNA损伤反应和细胞凋亡。
      )。已经记录了几种天然抗癌化合物的UHRF1的下调(
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      与肿瘤抑制基因重新表达相关的UHRF1的下调是具有抗癌性质的天然化合物的常见特征。
      )。因此,染色和存活的癌细胞的比较蛋白质组学可能会发现这种重要的潜在药物靶标。
      UHRF1敲低的敏化效果可能不一定是因为蛋白质本身,而是从细胞环境中出现。由于UHRF1是参与DNA甲基化的多功能蛋白质,染色质修饰和DNA修复,其敲击可以接合不同的机制,最终导致对抗癌化合物更高的敏感性。例如,已经表明,UHRF1耗竭可以通过XRCC4的下调和抑制MDR1基因转录,使Rehinablastoma和乳腺癌细胞敏化对抗癌药物(
      • 金W.
      • 刘Y.
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      • 李j.-j.
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      UHRF1抑制MDR1基因转录,并​​敏感乳腺癌细胞对抗癌药物。
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      • kim j.k.
      UHRF1耗竭通过XRCC4的下调使视网膜细胞瘤细胞敏化至化学治疗药物。
      )。此外,UHRF1参与了几种肿瘤抑制基因的灭活或降解,其表达可以在UHRF1敲低时恢复(
      • 关d。
      • 因子D.
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      表观遗传调节剂UHRF1促进泛素介导的肿瘤抑制蛋白突出细胞细胞白血病蛋白的降解。
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      UHRF1介导的肿瘤抑制因子基因灭活Nonsmall细胞肺癌。
      )。
      RNF40形成与RNF20的e3泛素蛋白质连接酶复合物,其进行组蛋白H2b的Lys-120的单次素化(
      • 朱禄
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      • PHAM A.-D.
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      人类组蛋白H2B的单突:所涉及的因素及其在Hox基因调控中的作用。
      )。因此,这种复杂的作用在通过组蛋白代码中的基因调节中起着核心作用。已显示RNF40敲低,以增强雌激素无关的细胞增殖和乳腺癌中细胞存活途径的激活(
      • Prenzel T.
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      • 克莱默F.
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      • 西蒙斯米
      人乳腺癌细胞中的雌激素依赖性基因转录依赖于组蛋白H2b的蛋白酶体依赖性的单突。
      )。另一方面,已经提出了RNF20是推定的肿瘤抑制因子,因为其耗尽增加了细胞迁移和增强的转化和肿瘤瘤。已知RNF20抑制几种原癌基因的表达(
      • Shema E.
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      组蛋白H2B特异性泛素连接酶RNF20 / HBre1通过选择性调节基因表达来充当推定的肿瘤抑制剂。
      )。这些假设提供了对UHRF1和RNF40敲低的观察到的效果的初步解释,但他们需要进一步测试。
      需要细胞基质相互作用来提供细胞生长或表面附着细胞存活的必要信号。从表面脱离的细胞通常通过Anoikis或细胞 - 脱离诱导的细胞凋亡(
      • 弗里斯奇
      • Ruoslahti E.
      整合派和anoikis。
      )。将其他器官殖民的转移细胞 体内然而,据信以某种方式逃离厌氧病(
      • 瓜达米菌M.C.
      • Cerezo A.
      • del pozo m.a.
      克服Anoikis-途径以纳入癌症的独立生长。
      )。因此,结构蛋白也可能涉及细胞死亡决策过程。与附着细胞相比,在未处理的脱离中发现三种结构蛋白质,角蛋白2,17和19。在分离的Hct116,RKO和A375细胞中,角蛋白2分别上调68-,7-和54倍;角蛋白17和19的上调较少但仍然显着。角蛋白2是晚期上皮细胞分化标志物,并已与终端弯曲有关,涉及角质形成细胞活化,增殖和角质化(
      • Bloor B.K..
      • 德曼N.
      • leigh i.M.
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      • Ghali L.
      • 侨居A.
      角质蛋白K2E在皮肤和口腔病变中的表达:与角质形成细胞活化,增殖和角质化相关联。
      )。角蛋白2与DSP(DESMOLOPHAKIN)的尾部结构域结合,其在我们的数据中也上调(排名第10),并据报道将中间细丝锚定向DESMOSOMES(
      • Broussard J.A.
      • 杨R.
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      • Nathamgari S.P.
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      • godsel l.m.
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      DESMOPOPHAKIN /中间丝连杆调节细胞力学。
      )。中间细丝Vimentin蛋白,其也参与角质化过程(
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      通过TGF-β-SLUIN信号坐标坐标坐标伤口愈合中的成纤维细胞分化。
      ),是第20次最上升的蛋白质。
      发现在分离的细胞中的许多蛋白质已经提前与转移相关(补充表S7)。例如,细胞角蛋白免疫染色常用于检测转移性肿瘤细胞(
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      肠系膜淋巴结中的分离肿瘤细胞的存在预测II期结肠癌患者的预后差。
      )。在Uleberg的一项研究中 等等。,细胞角蛋白2在宫颈活组织检查中的LC-MS / MS鉴定的其他蛋白质中具有最强的独立歧视力,并且可以在90%的病例中正确分类2级和3级宫颈上皮内瘤形成(
      • Uleberg K.-e.
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      通过从宫颈活组织检查中回收的水溶性蛋白分析来辨别2级和3宫颈上皮内瘤形成。
      )。已经显示人乳腺癌细胞中Vimentin和角蛋白中间细丝的共表达,导致表型相互互连和增加这些细胞的侵袭性(
      • Hendrix M.
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      • Trevor K.T.
      人乳腺癌细胞中的Vimentin和角蛋白中间细丝的实验共表达导致表型相互转化和增加的侵袭性行为。
      )。类似的研究表明,人黑色素瘤细胞中的Vimentin和角蛋白中间细丝的共表达导致动力增加(
      • Chu Y. -w.
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      人黑色素瘤细胞的Vimentin和角蛋白中间细丝的实验共表达,增强了运动性。
      )。在其他上调的蛋白质中,ATP5i,TM9SF4,MAPRE2,CSPG4,MARCKSL1和两种整联蛋白,即ITGAV和ITGB1也被报告为恶性肿瘤,侵袭和/或转移表型的标志物(
      • lozupone f.
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      结论

      我们的研究结果表明,对细胞死亡的过渡对细胞蛋白质组的影响最大,其在相对幅度的相对幅度上比不同癌症类型的细胞系或不同治疗诱导的变化之间的差异更大。数据还表明,基质分离的细胞是药物靶标,MOA和细胞死亡机制的基于蛋白质组学的研究中的附着细胞的有用伴侣。对给定化合物的这些因素的表征可以大大减少药物发现中的时间和劳动,特别是当使用复合文库的表型筛选时。
      然而,该方法具有几个固有的局限性。首先,它可以仅与患有培养物粘附的癌细胞。此外,该方法几乎加倍在Fitexp中进行的蛋白质组学实验的数量。最后,破坏细胞完整性的抗癌剂会产生这种技术的问题。
      本研究中最重要的发现之一是,无论细胞系和治疗类型,还有蛋白质似乎是细胞死亡或存活的特征。在这项研究中,发现了六种这样的蛋白质候选物,并通过siRNA验证其作用。潜在地,其中一些蛋白质可以代表抗癌药物发现的目标。

      数据可用性

      包含分析数据的Excel文件以补充材料提供。质谱蛋白质组学数据已经沉积在Proteomexchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过自豪的合作伙伴存储库(
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      致谢

      我们感谢MarieStåhlberg和Carina Palmberg在蛋白质组学实验的不同步骤中的帮助下。

      补充材料

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