一种选择性细胞外基质蛋白质组学方法通过血栓样蛋白类型1基序(AdamTs16)的抗胶质蛋白样和金属蛋白酶域鉴定纤连蛋白蛋白分解,其对球体形态发生的影响*

  • Rahel Schnellmann.
    一致
    应涉及谁的通信:生物医学工程系(ND20),克利夫兰诊所Lerner研究所,9500欧元大道,克利夫兰,俄亥俄州44195。电话:(216)445-3278;传真(216)444-9198; Friedrich Miescher生物医学研究所,Maulbeerstrasse 66,4058巴塞尔,瑞士。电话:+ 41-61-697-66-51;传真+ 41-61-697-397;
    隶属关系
    来自瑞士巴塞尔的Friedrich Miescher研究所;

    瑞士巴塞尔大学科学大学理学院;

    生物医学工程系(ND20),Cleveland Clinic Lerner Research Institute,9500 Euclid Avenue,俄亥俄州克利夫兰44195;
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  • ragna麻袋
    隶属关系
    来自瑞士巴塞尔的Friedrich Miescher研究所;
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  • Daniel Hess.
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    来自瑞士巴塞尔的Friedrich Miescher研究所;
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  • Douglas S. Annis.
    隶属关系
    威斯康星州麦迪逊大学生物分子化学系
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  • Deane F. Mosher.
    隶属关系
    威斯康星州麦迪逊大学生物分子化学系
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  • 孙伊斯州的APTE.
    一致
    应涉及谁的通信:生物医学工程系(ND20),克利夫兰诊所Lerner研究所,9500欧元大道,克利夫兰,俄亥俄州44195。电话:(216)445-3278;传真(216)444-9198; Friedrich Miescher生物医学研究所,Maulbeerstrasse 66,4058巴塞尔,瑞士。电话:+ 41-61-697-66-51;传真+ 41-61-697-397;
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    生物医学工程系(ND20),Cleveland Clinic Lerner Research Institute,9500 Euclid Avenue,俄亥俄州克利夫兰44195;
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  • 作者脚注
    †死者。
    Ruth Chiquet-Ehrismann
    脚注
    †死者。
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    来自瑞士巴塞尔的Friedrich Miescher研究所;

    瑞士巴塞尔大学科学大学理学院;
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了赠款来自:Schweizerischer NationalfondsZurförderungder Wissenschaftlichen Forschung(SNF,生物学和医学(第三次)项目资金)授予否定。 31003A_156740(至R.C-E),HHS / NIH奖HL107147和EY024943(至S.A.),以及Paul G. Allen Frientiers Group和美国心脏协会(至S.A.)的支持。
    本文含有补充材料。
    †死者。
      分泌细胞表面蛋白酶是细胞外基质(ECM)周转的主要介质,但它们的机制和监管影响很差。我们使用生产无细胞ECM开发了一种质谱方法体外鉴定纤连蛋白(Fn)作为分泌的金属蛋白酶AdaMTS16的新型底物。 Adamts16在其(i)之间切割fn5和我)6模块,释放N-末端30KDA肝素结合域,对于FN自组装是必需的。 Adamts16损害Fn纤维生成作用以及纤维蛋白-1和Tenascin-C组装,从而通过培养的成纤维细胞抑制形成成熟的ECM。此外,Adamts16对肾小管衍生的MDCKI细胞具有明显的形态发生影响。由Adamts16上调MMP3发布的N末端FN结构域,该MMP3(i)切割5-(一世)6类似于Adamts16的Fn的连接器,因此产生蛋白水解前馈机制。因此,FN蛋白质不仅调节Fn转换,还具有Fn组装,具有对ECM组装和形态发生的潜在的长期后果。
      细胞外基质(ECM)
      使用的缩写是:ECM,细胞外基质; FBN1,Fiblillin1; Fn,纤连蛋白;凝胶,戈尔洛林; LTBP1,潜在转化的生长因子β结合蛋白1; PG-S1,Biglycan; Plec,Plectin;垫种,蛋白酶和长春蛋白域; Postn,periostin;塞尔普,蛇素H1; TNC,TenAscin-C; TSR,血压素型1型重复。
      1使用的缩写是:ECM,细胞外基质; FBN1,Fiblillin1; Fn,纤连蛋白;凝胶,戈尔洛林; LTBP1,潜在转化的生长因子β结合蛋白1; PG-S1,Biglycan; Plec,Plectin;垫种,蛋白酶和长春蛋白域; Postn,periostin;塞尔普,蛇素H1; TNC,TenAscin-C; TSR,血压素型1型重复。
      是蛋白质,糖蛋白和复合碳水化合物的网络,其通常经历连续重塑通过偶联的蛋白水解降解和生物合成。在形态发生期间沉积临时ECM,已知通过培养细胞的组织再生或ECM组件依赖于FN的组装,ECM糖蛋白的组装,其是关键的细胞粘附分子和Pro-迁移基质(
      • Schwarzbauer J.E.
      • desimone d.w.
      纤连蛋白,其原纤化,和体内功能。
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      • Hynes R.O.
      )。等离子体和细胞Fn分泌为二硫键二聚体,其与细胞表面整合蛋白结合。随后,细胞收缩性和向中心整联蛋白易位暴露在Fn二聚体中的隐秘结合位点,其允许其关联和促进Fn原纤维组件(
      • Schwarzbauer J.E.
      • desimone d.w.
      纤连蛋白,其原纤化,和体内功能。
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      • 格鲁兹科T.
      • Franz C.M.
      用原子力显微镜研究活细胞纤连蛋白原纤维生殖的早期阶段。
      )。介导初始自组装和促进原纤维生成的主要FN结构域是N-末端肝素结合域,跨越我重复的前五种类型(
      • Pankov R.
      • 山田。
      纤连蛋白一目了然。
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      • Schwarzbauer J.E.
      鉴定组装纤维状基质所需的纤连蛋白序列。
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      纤连蛋白的细胞粘合结构域和氨基末端基质组装结构域参与其组装成成纤维细胞围粒体基质。
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      • McKeown-Longo P.J.
      • mosher d.f.
      纤连蛋白与成纤维细胞基质组装受体的70,000mol-WT氨基末端片段的相互作用。
      )。 FN网络用作成纤蛋白,胶原蛋白,腱蛋白-C,潜在TGFβ结合蛋白和其他分子组装的模板,因此在成熟ECM的形成中具有至关重要的作用(
      • Sabatier L.
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      Fiblillin组件需要纤连蛋白。
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      Tenascin变体:细胞培养物和组织中的纤连蛋白和不同分布的差异含义。
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      机械力调节纤连蛋白和胶原I在细胞外基质中的相互作用。
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      • kielty c.m.
      纤连蛋白通过控制潜伏的TGFβ结合蛋白-1的基质组装来调节潜伏的变性生长因子-β(TGFβ)。
      )。与观察到对ECM组来,细胞粘附和迁移的显着影响一致 体外,灭绝的 Fn1 小鼠的基因导致胚胎致命妊娠8.5天,胚胎显示心血管发育受损和其他形态发生缺陷(
      • 乔治E.L.
      • Georges-Labouesse E.N.
      • Patel-King R.S.
      • Rayburn H.
      • Hynes R.O.
      小鼠胚胎缺乏纤连蛋白的中胚层,神经管和血管发育中的缺陷。
      )。
      虽然FN纤维组件的启动已被广泛调查,调节原纤维周转和成熟的机制尚不清楚(
      • Schwarzbauer J.E.
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      纤连蛋白,其原纤化,和体内功能。
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      MT1-MMP调节细胞外基质纤连蛋白的周转和内吞作用。
      )。即使已知许多蛋白酶裂解FN(
      • Pankov R.
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      人巨噬细胞弹性蛋白酶谱系细胞外基质蛋白的水解。
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      组织型纤溶酶原激活剂和尿激酶的人血浆和细胞外基质纤连蛋白的降解。
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      • Moali C.
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      Adamts2,3和14的基材测定的测定显着拓宽了它们的功能,并鉴定了细胞外基质组织和TGF-β信号传导作为主要目标。
      )对于如何影响FN网络而众所周知,迄今为止,尚未具体研究了FN蛋白水解与组件之间的关系。 Adamts(一种Disinteglin-limly和金属蛋白酶域与血小板活性蛋白I型图谱)家族包括19个分泌的蛋白酶,其中大部分是ECM的作用,是形态发生的关键调节因子(
      • 克恩C.B.
      • Wessels A.
      • 麦克里斯J.
      • 迪克森L.J.
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      • menick d.r.
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      由于ADAMTS9卵泡水能而减少了Versican裂解与心脏和主动脉体异常相关。
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      • Kelwick R.
      • Desanlis I.
      • 惠勒G.N.
      • Edwards D.r.
      Adamts(一种Disintegin和金属蛋白酶与血小板上蛋白质序列)的家庭。
      )。 Adamts16是一个特征在于没有已知基材的家族成员,但据报道据据报道,在肾和性腺发育中发挥作用。纯合子 Adamts16 敲除雄性大鼠不孕,减少睾丸大小和密码晶状体(
      • Abdul-Majeed S.
      • 梅勒B.
      • Nauli S.M.
      • 乔B.
      大鼠的碱性刺激性和不孕症,具有目标破坏Adamts16基因座。
      )和Adamts16与肾发展期间的分枝形态发生联系在一起(
      • Jacobi C.L.
      • Rudigier L.J.
      • 斯科尔斯H.
      • Kirschner下午茶
      WILMS肿瘤蛋白的转录调节WT1表明金属蛋白酶ADAMTS16在鼠泌胺群中的作用。
      )。除了在胚胎发生期间的作用, Adamts16 涉及大鼠和人类的血压调节(
      • Gopalakrishnan K.
      • Kumarasamy S.
      • Abdul-Majeed S.
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      • 摩根·莫尔根
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      高血压大鼠遗传模型中Adamts16基因的靶向破坏。
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      • 楔子A.B.
      • Chakravarti A.
      • Rao D.C.
      • Bouchard C.
      与遗传性高血压有关的Adamts16变体的位置鉴定。
      )与卵巢癌和食管鳞状细胞癌(
      • Sakamoto N.
      • oue n.
      • noguchi t.
      • Sentani K.
      • Anami K.
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      • Yasui W.
      食管鳞状细胞癌基因表达的序列分析:Adamts16在食管鳞状细胞癌中上调。
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      • Yasukawa M.
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      • Gharpure小时
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      • Nagaraja A.S.
      • 撒华
      • 张W.
      Adamts16突变敏化卵巢癌细胞以铂基化疗。
      )。因此,Adamts16与形态发生和人类疾病有良好连接,但没有了解其潜在机制, IE。 其分子特性,底物和其参与的分子途径。
      在这里,我们通过新的质谱(MS)方法将FN用作Adamts16基板,使用产生的脱细胞产生的ECM 体外 通过成纤维细胞进行底物发现。我们表明Adamts16在其N末端附近切割FN,并对ECM组装的立即和长期影响。通过上调上皮细胞系MDCKI中的MMP3,ADAMTS16产生一种有趣的双蛋白酶前馈环,可用于限制和微调FN组装和控制管状的形态发生。

      实验步骤

       抗体

      列出了所有抗体和二手稀释液 补充表S1.

       表达质粒

      Adamts16 CDNA克隆(含有序列NM_172053)购自创造性的生物导体(Shirley,NY)。在制造商的协议之后,通过PCR使用该克隆作为模板和Hifidelity聚合酶(Qiagen,Hombrechtikon,瑞士)产生的所有构建体。所有构建体都是C-terminally myc_his6 标记并克隆到PCEP_PU(Invitrogen,Carlsbad,CA)中,用于表达并通过Sanger测序验证。通过现场发表的方案,通过现场定向诱变PCR获得Adamts16突变体构建体(
      • 郑L.
      • Baumann U.
      • Reymond J.L.
      有效的一步点定向和站点饱和诱变协议。
      )。用于克隆和诱变引物序列见 补充表S2.

       细胞培养

      HEK293-EBNA(CRL-10852,ATCC,Manassas,VA)细胞在补充有10%FBS的DMEM中生长。为了产生稳定地表达小鼠的HEK293-EBNA细胞16,将小鼠ADAMTS16-SH,小鼠ADAMTS16-EA或小鼠ADAMTS16-SH-EA,细胞接种在0.1%明胶涂层的菜肴(0.1%明胶(Sigma Aldrich,St.Louis ,mo)在h2o),使用Jetpei®(Polyplus Transfection,Illkirch,France)进行转染制造商的说明书,并用嘌呤霉素(2μg/ ml,Sigma Aldrich)选择14天。小鼠BALB / C 3T3成纤维细胞(CCL-163,ATCC),人皮肤成纤维细胞(HDF,ATCC)和LN229细胞(CRL-2611,ATCC)在补充有10%FBS的DMEM中生长。 MDCK菌株I(MDCKI)细胞由Martin Spiess(瑞士巴塞尔)博士提供,在补充10%FBS的α-Mem中生长。为了获得稳定表达小鼠的MDCKI细胞ADAMTS16,使用Fugene®6(Roche,Basel,瑞士)转染小鼠AdamTs16-Sh,小鼠AdamTs16-Sh,小鼠AdamTs16-EA,细胞,细胞用嘌呤霉素选择14天。实验中使用的所有细胞系对MyCoalert进行了支原体的支原体污染 TM值 支原体检测套件(LT07-218,Lonza Basel,瑞士)。

       Western Blotting.

      在Laemmli加载缓冲液中制备细胞提取物和条件培养基,其具有或不含2-巯基乙醇并通过SDS-PAGE分离。将蛋白质转移到PVDF膜(Immobilon F1,用于荧光检测,EMD Millipore,Billerica,MA)并用一抗抗体探测(补充表S1)通过使用Odyssey CLX扫描仪(Li-Cor Biosciences,Lincoln,Ne)来通过增强的荧光技术来检测。

       蛋白质纯化

      通过0.22μm过滤器(康宁,康宁,NY)过滤1L条件培养基。过滤后,将溶液应用于4℃的预平衡的1mL IMac柱(Ni-NTA琼脂糖,Qiagen,瑞士)。用250米洗脱结合的蛋白质m imidazole in 50 mm TRIS缓冲液(pH 7.5)。除了咪唑的去除,蛋白质溶液透析TBS(50米m Tris-HCl, 150 mm NaCl,pH 7.5)补充有5μm ZnCl2。用NanoDrop ND-1000光谱仪(Thermofisher Scientific,Regach,瑞士)测定蛋白质浓度。使用PDB ProtParam工具计算蛋白质吸收系数。将蛋白质溶液在-20℃下储存在50%(v / v)甘油中。

       免疫荧光

      HEK293-EBNA细胞接种在8孔玻璃室载玻片(Falcon培养载玻片,Thermo Fisher Scientific)上并在含有10%FB的DMEM中培养,直至它们达到80%汇合。仅使用Lipofectamine 3000(Invitrogen / Life Technologies,CA)瞬时将细胞瞬时转染Adamts16-Sh和Adamts16-CT,AdamTs16或空载体。在无血清条件下48小时后,用4%甲醛(PFA)固定细胞20分钟。将样品与抗myc和抗层蛋白一起温育1小时,然后与alexa缀合的二抗孵育。用DAPI(Life Technologies)在延长金中安装样品并用Leica TCS5 SPII共聚焦显微镜进行成像。图像比较条件是在相同的相机设置下获得的,并使用imagej软件(美国国家卫生学院,贝塞斯达,马里兰州)分析。将LN229细胞接种在8个孔玻璃室上,并在含有10%FBS的DMEM中培养,直至它们达到90%汇合。使用Lipofectamine 3000瞬时转染细胞。在固定和染色之前,将细胞在DMEM中以10%FBS保持10%FBS。

       从HEK-EBNA细胞制备无细胞ECM

      Hek-EBNA细胞在DMEM / 10%FBS中瞬时转染并培养48小时。使用萃取缓冲液(0.5%Na-脱氧胆酸盐,10米去除去细胞m 在4℃下补充有蛋白酶抑制剂(完全™,迷你蛋白酶抑制剂混合物,Sigma-Aldrich)的Tris-HCl,pH7.5)。 ECM用2米洗净m Tris-HCl(pH7.5)。通过SDS-PAGE在还原条件下分析总蛋白质。

       培养BALB / C 3T3成纤维细胞制备ECM的制备

      BALB / C 3T3成纤维细胞在补充有10%FBS的DMEM中培养,用于制备如前所述的无细胞ECM(
      • Beacham D.A.
      • Amatangelo M.D.
      • Cukierman E.
      培养和原发性成纤维细胞产生的细胞外基质的制备。
      )。简而言之,1×106 将成纤维细胞接种在含有0.1%明胶的6cm培养皿(康宁)上,并允许粘合24小时。 24小时后,将培养基含有含有10%FBS和50μg/ mL抗坏血酸的新鲜培养基(Merck Millipore,Darmstadt,德国)。每24小时更换培养基5天。使用含有0.5%Triton X-100和NH的PBS从基质中提取细胞4哦。加入PBS以稀释细胞碎片,将板在4℃下储存过夜。除去碎片,通过冷PBS洗涤ECM。 5×105 HEK细胞稳定地表达小鼠ADAMTS16,小鼠ADAMTS16-SH,小鼠ADAMTS16-SH-EA或用空载体转染作为对照,在该基质上播种并在无血清培养基中培养24小时。 ADAMTS16-SH-EA作为WTADAMTS16和ADAMTS16-SH的控制。通过LC-MS / MS分析条件培养基。

       质谱法制备和分析消化的ECM

      使用三氯乙酸(TCA)沉淀培养基中的蛋白质,用HPLC级冰冷丙酮洗涤并溶解在0.5中 m TRIS pH 8.6包含6 m 盐酸胍和等四分之一的四个部分,用于用TCEP减少后用内肽酶Lys-C(Wako,Neuss,德国)或胰蛋白酶(测序级修饰,Promega,Dübendorf,瑞士及其组合及其组合。用碘乙酰胺(Fluka,Buchs,Switzerland)和进一步添加消化缓冲液(50米)烷基化(50米m Tris/HCl pH 8.6, 5 mm CaCl2)。在配备有C18的易于N-LC 1000液相色谱系统上分离肽100个捕获孔100捕获柱(75μm×2cm,3μm,100)和C.18 新的客观分析柱(75μm×25cm,Reprosil,3μm)耦合到热绕融合质谱仪(Thermo Scientific)配备新的客观数字微微视图源。从2%的缓冲液B(乙腈中的0.1%甲酸)到25%缓冲液B的30分钟的线性梯度上收集数据,然后从25%至40%缓冲液B.缓冲液A含有0.1%甲状腺的5分钟的线性梯度。酸在水中。用三氟乙酸(PiCER)酸化样品摘要以终浓度为0.1%TFA。

       LC-MS / MS的分析和肽鉴定

      通过将SwiSsprots被限制在哺乳动物蛋白(2015-01型,搜索的条目数量:16920次鼠标蛋白的条目中,使用吉祥物蒸馏器(3.5.1,矩阵科学)和吉祥物(2.5.1版,矩阵科学)来鉴定肽。允许以下翻译后修改;固定修饰:氨基甲酰基(C),可变修饰:蛋白质n末端的乙酰化,紫酰胺和谷氨酰胺的脱染,甲硫氨酸氧化和丝氨酸/苏氨酸的磷酸化,没有酶特异性。最大数量。错过的裂解设置为1,具有肽质量耐受±10ppm和片段质量耐受±0.6 da。通过支架(版本Scaffold_4.4.1.1,蛋白质组软件)编译和评估数据,考虑用至少五种肽鉴定并具有90%的蛋白质和肽的阈值,肽FDR 2.1%(先知)和蛋白质FDR 0 % (预言家)。使用以下参数使用脚手架软件计算FDR:蛋白质分组策略:用二元肽 - 蛋白重量进行实验宽分组。肽阈值:最小90.0%和蛋白质阈值:最小90.0%和5个肽。脚手架软件用于ADAMTS16切割产品的定性分析。对于单肽的定量分析,使用标签方法分析单肽的MS1光谱的曲线下的区域。为此,将相应的数据文件加载到蛋白质组学(版本2.0.5556.29015,Waters)的后代QI中,并使用程序的默认设置进行分析(中敏感性和肽电荷:1-20)。单个运行的所有原始数据文件,脚手架文件(.sf3)和相应的吉祥物结果文件(文件名:f077701-5.dat)以及吉祥物峰列表(MGF文件)和相应的搜索文件(用于代理量化的XML文件可通过Proteomexchange使用标识符PXD007284可用。

       样品制备和LC-MS / MS分析人纤连蛋白切割产品

      将12孔组织培养皿涂有纯化的人血浆纤连蛋白(Fc010-10mg,Merck Millipore),终浓度为PBS的终浓度为30μg/ ml。 HEK293-EBNA细胞在无血清条件下稳定地表达各种ADAMTS16构建体的细胞,并孵育24小时。通过Western印迹或通过LC-MS / MS进行分析上清液,用于潜在切割产品。在LC-MS / MS分析之前,通过在前一部分中描述的方案之后用LysC沉淀和消化调节培养基。产生的肽用1μl20%TFA酸化,并通过毛细管液相色谱串联质谱法分析,使用双柱设置(Thermo Scientific),用易NLC 1000分析。将肽加载0.1%甲酸,2%乙腈 2o在800巴的恒定压力下涂在肽阱(适度的Pepmap100,75μm×2cm,c18,3μm,100)上。肽以150μl/ min的流速分离,在3分钟内,在缓冲液中,在缓冲液中,在3分钟内,在40分钟内的线性增加,在9分钟内为22-28% ,8分钟内,28-36%,1分钟内36-80%,最终在80%B(缓冲液A:0.1%甲酸,缓冲液B:0.1%甲酸中)在a上洗涤14分钟14分钟安装在DPV离子源(新目的)上的50μmx 15cm es801,2μm,100Å柱连接到连接到横向融合质谱仪(Thermo Scientific)。根据制造商(Thermo Sciencific)的推荐,使用120,000次用于杂交中的肽测量的肽测量和顶部​​T(3S)方法,并根据制造商(Thermo Scientific)的推荐,在LTQ中进行HCD碎片和片段测量的HCD碎片。
      使用吉祥物(2.5.1版,矩阵科学)和吉祥物蒸馏器(2.5.1版,矩阵科学)鉴定肽,允许以下翻译后修改;固定修饰:氨基甲酰基(C),可变修饰:蛋白质N末端的乙酰化,在天冬酰胺和谷氨酰胺的脱胺,甲硫氨酸氧化和丝氨酸/苏氨酸的磷酸化。最大数量。错过的切割被设定为1,肽质量耐受±5ppm和片段质量耐受±0.6Da,并使用蛋白质组学的后QI定量(版本2.0.5556.29015,Waters)。单个运行的所有原始数据文件,脚手架文件(.sf3)以及Mascot峰值列表(MGF文件)和对应的原始搜索文件(MGF文件)和对应的搜索文件(XML文件)通过Proteomexchange具有标识符PXD007284。

       体外原纤维化

      HDF和HEK293细胞在含有10%FBS的DMEM中的3:5(成纤维细胞:HEK细胞)比分别为24小时,48小时或4天。对于8天的共培养物,将细胞接种在4:1(成纤维细胞:HEK细胞)的比例中。将细胞固定在4%PFA中,使用Leica TCS5 SPII共聚焦显微镜染色和成像。使用imagej软件分析图像。

       3D培养染色和成像

      MDCKI细胞嵌入3D胶原凝胶中。将酸溶解的胶原(康宁胶原I)与10x PBS中的1:1的比例混合,然后用0.1的pH调节至7.5 m naoh。使用α-MEM / 10%FBS将胶原浓度调节至2.5mg / ml的终浓度。 150μL含有1.5×10的胶原蛋白4 将细胞倒入8孔玻璃室的每个孔中,并使其在37℃下固化。在凝胶化α-MEM含有10%FBS后,每24小时替换。
      在培养4天或8天后,使用4%PFA在室温下使用4%PFA固定3D凝胶,在室温下使用0.3%Triton X-100在PBS中渗透3×15分钟。将原发性抗体在PBST中稀释,并在4℃下施加过夜。用PBST洗涤凝胶,并在室温下与PBST中的二抗孵育2小时。用Leica TCS5 Spii共聚焦显微镜拍摄图像,并用ImageJ软件进行分析。

       QRT-PCR的RNA分析

      使用RNEasy Plus Micro Kit(Quiagen)分离出总RNA。 RNA被反转转录,并如上所述检测相对mRNA水平(
      • Asparuhova M.B.
      • Ferralli J.
      • 剧温米
      • Chiquet-Ehrismann R.
      转录调节剂MegakaryoBolast Meukemia-1通过机械应力介断血清反应因子无关的Tenascin-C转录。
      )。使用铂(Invitrogen)使用Platinum®Sybr®GreenQPCRSupermix-UDG测量归一化至TBP的基因的相对mRNA水平。使用标准循环型材在SeperoonePlus实时PCR系统中进行实时PCR(应用生物系统,Rotkreuz,瑞士)进行。所有样品均以三份酸盐进行。通过ΔΔCT方法分析数据(
      • Schmittgen T.D.
      • Livak K.J.
      用比较C(T)法分析实时PCR数据。
      )。 RT-PCR引物列于 补充表S3.

       标签FN

      使用Alexa Fluor 488蛋白标记试剂盒(A10235,Thermo Fisher Scientific)在制造商的说明之后标记0.5mg等离子体Fn(F0895,Sigma-Aldrich)。将30μg/ ml标记的Fn镀在8孔玻璃室载玻片上。在无血清条件下接种稳定表达WTADAMTS16,AdamTS16-EA或空载体的HEK-EBNA细胞,并在固定和阴辐素染色之前允许在48小时内接种。

       fn裂解

      将纯化的Adamts16-Sh用血浆Fn(Sigma-Aldrich)或500ng的70kDa n末端Fn片段或在昆虫细胞中产生的4F1-2F2孵育(
      • 马鲁塞勒L.M.
      • Tomasini-Johansson B.R.
      • 马W.
      • Annis D.S.
      • Eickstaedt n.l.
      • Ensenberger M.G.
      • Satyshur K.A.
      • mosher d.f.
      纤连蛋白的延长粘合位点用于链球菌蛋白F1蛋白F1的功能上游域。
      )在37°C的TBS(pH7.5)中为4小时,补充有10米m CaCl2。通过免疫印迹在还原条件下进行切割产品。

       实验设计和统计理性

      所有分组数据都是平均值±S.E.使用GraphPad Instat版本3.05执行统计分析。使用双尾学生评估两组之间的差异 t 测试参数数据。价值 p <0.05被认为是统计学意义。空向量和Adamts16的无活性突变体用作所有实验的控制。所有QRT-PCR实验均以三重次数进行。使用imagej软件量化Fn的相对量。每个条件一式三份完成,分析了每种条件的总共12个图像。对于球形尺寸定量,评估了三种独立实验的每个条件的50个球体总数。对于腔量化,量化3个独立实验的每条条件总共16个球体。
      人FN消化在生物学酸盐中进行,并且通过LC-MS / MS分析所有三份酸盐,得到统计上相关的裂解肽的量化。使用不同的工作蛋白酶的两种单独运行验证鉴定的小鼠Fn肽的存在,并通过使用相同的Adamts16-Sh,Adamts16-Sh-EA和载体控制来通过完全重复实验进行进一步验证。

      结果

       Adamts16通过其C终端模块分泌并与ECM绑定

      表达WT Myc标记的Adamts16及其相应的活动位点突变体(E432A)(Fig. 1A)在HEK293-EBNA细胞中瞬时或稳定地表达。在稳定或瞬时转染的HEK-EBNA细胞的条件培养基中可以检测到有源全长Adamts16(WTADAMTS16)也不是无活性的ADAMTS16(ADAMTS16-EA)(Fig. 1B)。相反,这些细胞介质的液相色谱 - 串联质谱(LC-MS / MS)分析检测到跨越催化结构域至间隔物的丰度的肽,但没有衍生自C末端血栓样蛋白(TSR)重复蛋白酶和长春素(PLAC)结构域(Fig. 1A, 补充图。S1, 补充表S4)。这些发现表明,WTADAMTS16被C-末端加工,通过将催化畴通过间隔模块释放到介质中,而剩余的C末端模块被保留在ECM和细胞表面内。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1Adamts16绑定ECM并是C末期加工。 A,Adamts16构建的域组织。 B,使用抗myc抗体和增强的化学发光,用指示的构建体或空载体(V)转染的HEK293-EBNA细胞的条件培养基的Western印迹分析。黑色箭头和星号分别表示Adamts16的自催化和非自动催化C末端末端碎片。 C,用所示构建体或空载体(V)转染HEK293-EBNA细胞裂解物的Western印迹分析。星号表示Adamts16的自催化和非自动催化C末端片段。 Z和M表明Furin加工产生的酶原和成熟的形式。 D,来自HEK293-EBNA细胞的无细胞ECM的Western印迹分析,表达各种AdamTs16构建体或用空载体转染(V)。星号表示C末端碎片。 Z和M表明Furin加工产生的酶原和成熟的形式。 E,HEK293-EBNA单层用抗myc(红色)和层蛋白(绿色)染色WTADAMTS16,ADAMTS16-CT和ADAMTS16-SH作为ECM标记。该图像显示比ADAMTS16-SH的adamts16-ct对细胞层的较强定位。白色箭头表示Adamts16和Laminin的共同定位。秤杆为50μm。右侧面板是左侧柱箱区域的2倍放大。
      为了进一步了解ADAMTS16的C终端处理,我们设计了缺少C终端TSR和PLAD域(ADAMTS16-SH)的构造,从而在C末端加工后模仿WTADAMTS16并释放到介质中(Fig. 1A)。与Adamts16相比,使用抗Myc(Fig. 1B)。 ADAMTS16的报告同种型,缺少C终端PLAD域(ADAMTS16-TS6)(
      • 钙S.
      • Obaya A.J.
      • 骆砂米
      • Garabaya C.
      • Quesada V.
      • lópez-otínc。
      七种新型人体Adamts的克隆,表达分析和结构特征,一种脱胶苷和血小板素-1结构域的金属蛋白酶。
      )( Fig. 1A)在转染的HEK-EBNA细胞的条件培养基中也检测到)(Fig. 1B),建议C末端模块,例如垫子可以调节AdamTS16的结合和/或ECM。小于预期的Adamts16-Sh和Adamts16-Ts6在培养基中的分子片段表明除了TSR2-Place区域(辅助结构域)内的环境蛋白酶蛋白分解外,还表明了自催化分析(Fig. 1B, 1C)。这些发现支持假设间隔物和TSR2之间的Adamts16的C末端处理,并在细胞层中保持C末端模块并将其余的AdamTS16释放到介质中。
      此外,与其他Adamts蛋白酶一样,Adamts16可能在共识遗址RHKR进行弗林素加工279,释放N-末端的肽。符合此,通过抗体在培养基中观察到的C-末端MyC标签的AdamTS16构建体为小于细胞裂解物中的〜30kDa(Fig. 1 B, 1C)。为了确定全长Adamts16是否结合并保留ECM,我们使用瞬时转染的HEK-EBNA细胞进行DOC不溶性测定。可以在无细胞ECM中检测到所有ADAMTS16构建体(Fig. 1D)。与Adamts16-EA相比,在转染的HEK293-EBNA细胞(Fig. 1D)。这进一步证实了发现自身蛋白解体对全长AdamTs16具有复杂的影响,与其他构建体相比增加了较高的韧性。用层粘连蛋白(ECM标志物)的Adamts16转染细胞的免疫染色显示,AdamTs16(Adamts16-CT)的C末端域强烈局部地定位于ECM。与Adamts16-CT相比,Adamts16-Sh也被定位于ECM,但与Adamts16-CT(Fig. 1E)。这些发现一起提供了表现出AdamTs16的细胞和ECM结合主要由其C末端辅助结构域介导,并且由于复杂的蛋白水解加工,包括自催化加工(Fig. 1B1E 补充图。S1 )。

       质谱仪将FN识别为AdamTs16衬底

      因为Adamts16与ECM结合并被广泛​​加工,所以全长催化活性酶的纯化是不可行的。因此,为了鉴定Adamts16基材,我们设计了一种策略,其中由小鼠BALB / C 3T3成纤维细胞沉积脱细胞的ECM 体外,通过表达WTADAMTS16,AdamTS16-SH或其催化活性突变体AdamTs16-Sh-EA的HEK293-EBNA细胞消化。通过LC-MS / MS分析来自这些培养物的培养基,以鉴定ADAMTS16基材(Fig. 2A, 表I.ii)通过从用于产生LC-MS / MS的蛋白酶的蛋白酶中寻找没有产生的乳化剂的肽。该分析鉴定了小鼠Fn肽 270CerhalqsAsagsgs.285 (Genbank ID. np_034363.)仅通过两个活性Adamts16构建体,但不是催化活性突变体和/或载体控制(Fig. 2B, 2C, 补充图。S2A)。 Fn肽的存在 270CerhalqsAsagsgs.285 在与工作蛋白酶或Lysc组合使用Lysc的活性样品(WTADamTS16和Adamts16-Sh)中被发现,与ASPN组合(表I., 补充表S5-S7)。该发现可以在第二个独立实验中复制(具有标识符PXD007284的ProteomexChange中可用的数据)。此发现表明Adamts16在域(i)之间的N末端链接器序列内切割FN5和我)6 (Fig. 2C)。我们确定了额外的肽,显示出从样品制备过程中没有出现的切割位点(表I.)。因为这些肽也被鉴定在对照样品中,但在较低的丰度下,我们得出结论,它们并未被Adamts16唯一瞄准,并且没有进一步追求(表I.,ii, 补充表S5, S7, 补充图。S2C,S2D)。获得WTADAMTA16和ADAMTS16-SH获得的类似结果表明,尽管C末端加工影响酶定位,但它不会显着影响FN识别和蛋白水解。尽管作为ADAMTS16的潜在基质的独特肽鉴定为FN,但是FN序列覆盖率在不同的样品之间没有变化,表示条件介质中相同的总量的FN(Fig. 2C, 补充图。S2C, 补充表S7)。另一方面,鉴定了大型葡聚糖,perctin和SerpinH1的差分序列覆盖,但没有发现由AdamTs16切割产生的独特肽(表二, 补充表S7)。这些分子也可以是潜在的Adamts16基质,其中LC-MS / MS未检测到独特的切割肽。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2识别和验证FN作为Adamts16基板。 A,用于鉴定ADAMTS16底物的蛋白质组学策略的示意图。 B,在WTADAMTS16的LysC-ASPN消化中鉴定的双电荷的FN肽CerhalqsAgsgs的MS2光谱。 C,LOG10的直方图的LC-MS / MS在LCSC / ASPN消化中鉴定的FN肽CerhalqsAGSG的直方图显示其存在于与活性AdaMTS16和AdamTS16-Sh的基质中的存在,但不在对照样品中。 LOG10比率将WTADAMTS16与Adamts16-Sh-EA,Adamts16-Sh与Adamts16-Sh-EA以及带有Adamts16-Sh-EA的矢量进行比较。所有识别的FN肽的LOM10比率的平均值显示在样品之间的相似值,表明每个样品中的相等量的FN。 D,具有畴(I)之间接头的氨基酸序列的膨胀视图的Fn的结构域结构5和我)6 显示由LC-MS / MS(黄色突出显示)鉴定的肽和潜在的ADAMTS16切割位点。 E,Fn的域结构和N末端70kDa Fn片段(Fn70K)。单克隆抗FN-NT(MAB1936)的抗体结合位点和多克隆抗FN(RUTH CHIQUET)的全长FN表示。 F,在EDTA的存在或不存在下用纯化活性Adamts16-Sh孵育Fn70k的Western印迹分析。用于FN的N-末端肝素结合结构域的抗FN抗体(MAB1936)用于鉴定30kDA n末端肝素结合结构域(黑箭头)的释放。 G,用FN原纤维共同定位Adamts16。致短暂的转染的LN229细胞培养48小时,并用抗myc(红色)和Fn(绿色)染色Adamts16-EA和Adamts16-Sh-EA。该图像显示使用FN纤维的Adamts16-EA和Adamts16-Sh-EA的共定位,表明AdamTs16的C末端对于Fn结合不是必需的。白色箭头显示Adamts16的共定位与FN。秤杆为50μm。下面板显示出顶部排中的盒子区域的2×放大。
      表I.从Adamts16消化Balb / C 3T3细胞外基质获得的肽和肽比例
      蛋白质名称在氨基酸之前肽SEQ。继承氨基酸前兆费质量/充电( m / z. )工作蛋白酶log10 wtadamts16 / adamts16-sh-ealog10 adamts16-sh / adamts16-sh-ealog10矢量/ adamts16-sh-ea
      FN. K271CerhalqsAsagsgs.285F2+759.34LYSC / ASPN.2.333.29−0.01
      FN. K271CerhalqsAsagsgs.285F2+759.34 Lysc. 3.514.501.66
      FN. K271CerhalqsAsagsgs.285F3+506.56 Lysc. 3.424.291.66
      FN. D557pidqcqdsetr.567T2+674.79LYSC /胰蛋白酶0.650.370.15
      LTBP-1Y1581grdalvdfseqygpetdpyfiqdr.1604F3+940.10LYSC /胰蛋白酶0.620.320.07
      post T604llvnelk.610S2+415.25 Lysc. 0.20.14−0.08
      凝胶 R450Iegsnkvpvdpaty.463G2+745.38aspn / trypsin.0.37−0.010.18
      用脱脂BALB / C 3T3 ECM(小鼠)释放的肽的比较用稳定地表达WTADAMTS16,AdamTS16-SH-EA,ADAMTS16-SH和载体控制的HEK-EBNA细胞,如列标题所示。示出了由不同于用于样品制备(工作蛋白酶)的蛋白酶从蛋白酶产生的肽。肽丰度没有变化给出了近0的比例。活性样品中的肽丰度增加给予比率>0.使用黄色QI软件计算比率。表中所示的所有肽是鼠(BALB / C 3T3)起源。
      用于量化肽比和丰度的所有吉祥物峰值列表和搜索文件可通过Proteomexchange获得标识符PXD007284。
      表二从Adamts16消化Balb / C 3T3细胞外基质中获得的ECM蛋白的独特肽计数和序列覆盖
      蛋白质名称加入NR。独特的肽数(WTADAMTS16)独特的肽数(Adamts16-Sh)独特的肽数(Adamts16-Sh-EA)独特的肽计数(向量)序列覆盖%(wtadamts16)序列覆盖%(ADAMTS16-SH)序列覆盖%(Adamts16-Sh-EA)序列覆盖%(向量)
      FN. P1127620615018618071667072
      LTBP1Q8CG194127212528201721
      post Q620092323252332333730
      凝胶 P130204632464057455850
      PGS1P2865358101216333039
      serP1932434121412173939
      PLEC. Q9QXS143231411116.44.23.3
      为其他ECM蛋白获得序列覆盖以及肽计数的差异。使用脚手架软件计算序列覆盖和独特的肽计数,将在吉祥物搜索中包括以下发生后改变的修饰:蛋白质N-末端,氧化,磷酸化和脱胺的乙酰化。没有将酶特异性应用于搜索参数以识别潜在的ADAMTS16切割产品。表中所示的所有ECM蛋白质是鼠(BALB / C 3T3)起源。原始脚手架文件和相应的吉祥物搜索文件可通过Proteomexchange获得标识符PXD007284。
      为了进一步验证FN作为Adamts16的底物,涂覆细胞培养皿与人血浆Fn,并且在无血清条件下接种稳定表达不同Adamts16构建体的细胞。允许Adamts16介导的FN蛋白水解24小时。通过使用对人FN的N-末端结构域的抗体进行抗体,通过蛋白质印迹分析调节培养基的FN切割产物。与Adamts16-SH孵育的样品显示在与无活性突变体和载体对照(补充图S3A)。为了进一步验证Fn作为基质,通过质谱法分析调节培养基,其在与AdamTs16-Sh温育24小时后进行特定的Fn切割肽。具体的乳化肽 270cerhtsvqttssgsgpftdvraa.292 from the (I)5-(一世)6 在活性Adamts16-Sh样品中的非常高的丰度中鉴定了Fn的接头序列,但不在无活性的AdamTS16-Sh-EA和载体对照样品中,尽管总体FN肽丰度是可比的 补充图。S3B-S3D ; 补充表S8,S9)。此发现进一步表明Adamts16在N终端(I)内切割FN5-(一世)6 链接器。我们将另外的人FN切割肽朝向该切割的C末端侧鉴定表明除了所表征的N末端切割位点之外,AdamTs16可以在其他地方裂解Fn(补充表S8 )。
      由于广泛的分泌后处理,使用C末端标签的全长AdaMTS16的纯化不可行,但纯化了AdamTs16-SH,并通过裂解通用蛋白酶衬底α2-癌胶质蛋白的裂解来证明其蛋白水解活性(补充图S4a)如前所述(
      • 高达
      • 杰伊C.D.
      • Kossowska K.
      • 张H.
      FSH刺激Adamts-16蛋白酶在成熟的人卵巢卵卵中的表达。
      )。为了获得生物化学验证,纤连蛋白是ADAMTS16的基材,并确定蛋白水解的要求,我们用不同的FN构建体孵育纯化的AdamTs16-SH。从模块(i)延伸的重组70kDa fn片段1 to module (I)9 切割以产生30kDa n末端片段(Fig. 2E, 2F)。全长等离子体Fn,其球状结构可能掩盖易感肽键,未净化的Adamts16-Sh裂解 体外 (补充图S4B)。 Adamts16-Sh无法切割跨越(i)的较短重组Fn片段的链接器4 to (II)2 表明Adamts16与Fn的结合可以通过远离切割位点的域(图S4C,S4D)。我们还测试了WTADAMTS16使用基于细胞的方法切割FN的能力。 Hek-EBNA细胞的播种表达WTADAMTS16,但在alexa488上标记的Fn上的adamts16-ea显示出细胞下面的Fn荧光的损失( 补充图S4E),表明与溶液中的血浆FN相反,结合的等离子体Fn可以通过AdamTS16表达细胞切割。在瞬时转染的LN-229胶质母细胞瘤细胞中,Adamts16与FN原纤维共同定位 体外 (Fig. 2G)在表达WTADAMTS16的细胞中降低了FN网络(补充图。S4F)。这些发现表明,FN由AdamTS16直接切割,但是通过细胞收缩通过牵引需要裂解在Fn上需要远处结合区域和剪粘接粘合。

       Adamts16抑制FN组装和阐述成熟的FN依赖性ECM

      通过WTADAMTS16释放的30kDA N-末端肝素结合结构域预先显示在原纤溴期间调节FN自我关联(
      • Schwarzbauer J.E.
      鉴定组装纤维状基质所需的纤连蛋白序列。
      ,
      • 麦当劳J.A.
      • Quade B.J.
      • broekelman t.j.
      • Lachance R.
      • Forsman K.
      • Haegawa E.
      • Akiyama S.
      纤连蛋白的细胞粘合结构域和氨基末端基质组装结构域参与其组装成成纤维细胞围粒体基质。
      )。为了调查Adamts16是否对FN原纤维网络直接影响,我们研究了AdamTs16对FN网络的时间效果。用用载体或无活性AdamTS16-EA稳定地转染的HEK细胞共培养的人的皮肤成纤维细胞(HDF)在含有10%FBS的培养基中建立了鲁棒FN网络。相比之下,尽管细胞密度相当,但在24小时之后,在WTADAMTS16的存在下,观察到FN原纤维的深度减少(Fig. 3A)。实际上,在WTADAMTS16的存在下,FN可见为局部局部局部地局部化的点状结构,而不是在明确定义的纤维状网络中。在继续共同培养至2,4和8天后,观察到对网络的类似影响,表明对FN组件的持续影响,尽管不能排除预制原纤维的消化(Fig. 3A, 3B, Fig. 4)。这种颞序列在Fn纤维发生中的降低表明,Adamts16在初始原纤维组件的点处或短暂后影响了Fn原纤维成熟,因此减少了进一步的组装和原纤维成熟。 FN. 1 mRNA水平在各种共同培养物中相当(补充图S5A),表明在活性Adamts16存在下的原纤维的减少没有转录基础。 C末端截短的构建体,Adamts16-Sh对Fibril成熟的效果类似,作为全长Adamts16,表明Fn的催化特异性和抗原纤维发生的抑制不依赖于蛋白酶的C末端(补充图。S5B,S5C)。此外,在由小鼠BALB / C-3T3成纤维细胞形成的FN网络上观察到类似的影响,该FN网络用于与表达HEK-EBNA细胞的WTADAMTS16共培养(补充图S5D)。 FN组装在LN-229细胞中的损伤,HDF和3T3细胞表明,Adamts16的效果与细胞类型无关。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3Adamts16通过人的皮肤成纤维细胞(HDF)影响FN Fibril组件。 AHDF与Adamts16表达HEK293-EBNA细胞的24,48或96小时后的FN网络的共焦分析显示出降低的Fn原纤维染色(绿色)。秤条是50微米。下面板是上行盒子区域的3倍放大。 B,在WTADAMTS16,Adamts16-EA和载体对照共培养物中测量每种细胞的纤维状FN的相对量。数据是平均值±s.e., n =来自3个独立实验的12个图像。 (*) p < 0.05 by Student t 测试, (**) p < 0.01, Student t test.
      图缩略图GR4.
      Fig. 4在Adamts16存在下的Fn纤维发生减少抑制ECM成熟。 A,8天的HDF与表达Adamts16的HEK细胞的共培养,显示出Fn(红色,单克隆Fn-NT)和Tenascin-C(绿色)网络的形成。 B,具有AdamTs16表达HEK细胞的8天的HDF共培养,显示出Fn(红色)和纤维蛋白-1(绿色)网络的形成。 C,8天的HDF与表达Adamts16表达HEK细胞的共培养,表明胶原IV束的增厚和缩短。 Fn(红色,单克隆Fn-nt(7d5))和胶原素IV(绿色)。秤条是50微米。
      因为Fibrillin-1(FBN1)和TenAscin-C(TN-C)组件需要预先形成的Fn网络,所以我们用它们作为在形成原始Fn矩阵后形成稳定的成熟ECM的记者。除了FN原纤维发生之外,还研究了为适当的FBN1和TN-C组装的8天的共培养。虽然Adamts16活性位点突变体对FBN1和TN-C原纤维的形成没有影响,但活跃的AdamTs16强烈损害了FBN1和TN-C网络的形成(Fig. 4A, 4B)。虽然胶原蛋白IV在Adamts16-EA的存在下形成了长薄纤维的网络,在暴露于WTADAMTS16的HDF培养物中累积的较厚和较短的胶原IV纤维(Fig. 4C)。因此,我们得出结论,Adamts16过表达可以通过干扰FN组件来影响其他ECM组件的完整性。

       Adamts16通过FN蛋白水解在3D胶原凝胶中的MDCKI细胞损害球体形态发生

      由于事先在肾发展中表明ADAMTS16的作用(
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      高血压大鼠遗传模型中Adamts16基因的靶向破坏。
      ),肾小管衍生的mdcki细胞,其水平非常低 Adamts16 MRNA用作探讨AdamTs16对小管发生的影响的模型。用AdamTs16构建体稳定转染的MDCKI细胞未显示单层培养(数据未显示的数据)任何明显的形态学差异。当在三维胶原凝胶中生长时,MDCKI细胞形成球状体,其中细胞布置具有严格的顶端基础极性。在该球体形成测定中,WTADAMTS16转染的细胞在基底膜中显示出较小的浓度Fn染色,而表达球状体在3D培养4天和8天后的载体对照中,表达球状体具有更强的FN染色(Fig. 5A, 5B)。该发现建议在Adamts16存在下增加Fn消化,并且Adamts16-EA可以在3D培养物中稳定FN纤维(Fig. 5A, 5B)或与Adamts16-EA结合的结合保护它们免受切割。此外,我们观察到培养8天后在培养8天后在培养物中表达WTADAMTS16的球蛋白染色的降低的薄片染色,与载体或Adamts16-EA表达球状体(补充图。S6A)。与Fn的减少一致,与载体对照和表达细胞的载体对照和Adamts16-EA相比,在4天和8天后表达型球状体显着较小。Fig. 5A, 5B)。除了明显的尺寸差异之外,与由用空载体转染的MDCKI细胞制成的球状体相比,拟大尺寸差异形成多个胶质体。此外,表达ADAMTS16-EA的球状体未能形成腔(Fig. 5C)。表达WTADAMTS16的球状体的E-钙粘蛋白染色显示较弱的E-Cadherin染色,而不是表达空载体的球状体(Fig. 5D) 虽然 CDH1 mRNA was unaltered (补充图。S6B)。在表达Adamts16-EA的球状体中,将E-Cadherin局部定位于附着于基石外侧Fn基质的细胞膜中,而球体中心的细胞显示出没有e-cadherin表达(Fig. 5D)。为了进一步研究这些细胞的极性,我们在8天培养后染色了Golgi Marker Gm130的球状体。虽然由载体转染的细胞形成的球形表现出透明的顶端GM130分布,但是通过表达ADAMTS16-EA的细胞形成的球形缺乏极性,如GM130的随机分布所证明的(Fig. 5E)。表达WTADAMTS16的细胞形成的球状体显示含有单层细胞的部分中的偏振GM130染色,其中在形成多种胶质的情况下被破坏(Fig. 5E)。 MDCKI单层的蛋白质印迹分析显示在2D中培养的同类E-钙粘蛋白水平并在表达Adamts16-EA的细胞中获取N-Cadherin表达(Fig. 5F)。这些研究结果表明,WTADAMTS16过表达降低了球状生长并促进了多重球体的形成,而ADAMTS16-EA的过表达促进了球状体中的上皮 - 间充质转变,通过丧失细胞极性和N-Cadherin的获取证明。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5Adamts16损害3D胶原凝胶中的MDCKI细胞的球体形态发生。 A,4天后通过3D胶原凝胶中表达3D胶原凝胶中的Adamts16表达MDCKI细胞的球体共聚焦显微镜。染色球体染色β-连环蛋白(红色),Fn(绿色)和核(DAPI,蓝色)。 3D胶原凝胶中球状直径的定量分析显示WTADAMTS16过表达在4天后对载体和AdamTS16-EA控制相比的尺寸减小。 n =来自3个独立实验的50个球体。 (****) p < 0.0001, Student t 测试 B,8天后,通过Adamts16表达3D胶原凝胶中的MDCKI细胞形成的球状体的共聚焦显微镜。 Fn(红色)和核(DAPI,蓝色)染色球状体。观察到表达WTADAMTS16的球状体中FN染色的FN染色,而表达ADAMTS16-EA的球形染色增加。与载体和AdamTS16-EA控制相比,球形直径的定量分析显示在8天后与载体和Adamts16-EA对照相比的adamts16过表达的尺寸。 n =来自3个独立实验的50个球体。 (**) p < 0.01, Student t 测试。 C在8天培养后,在8天后染色粉体染色粉状蛋白(红色)和DAPI(蓝色)。培养8天后球状体中腔形成的定量。 n =每实验和构建体16,重复实验3次。 (*) p < 0.05, (**) p < 0.01, (***) p < 0.001 D,8天后3D胶原凝胶中MDCKI球体的共聚焦显微镜显微镜显示出在表达WTADAMTS16的球状体中的e-cadherin染色的扰动。染色体用于E-cadherin(绿色)和核(DAPI,蓝色)染色。 E,8天后,通过Adamts16表达3D胶原凝胶中的MDCKI细胞形成的球状体的共聚焦显微镜。球体染色GM130(红色)和核(DAPI,蓝色)。白色箭头显示极化的GM130染色。较低的图像是2×放大器上面板。 F单层培养中MDCKI细胞的蛋白质印迹分析。在表达Adamts16-EA的细胞中强烈增加N-Cadherin表达。没有观察到e-cadherin或Fn水平的变化。秤条含有50μm A, BE 和25μm C, D。 **, p < 0.01 by student t-测试。

       Adamts16过表达UP-COMPEDMS MDCKI细胞的MMP3表达式

      尽管在2D中培养的MDCKI细胞的细胞裂解物的蛋白质印迹分析未显示出不同AdamTs16构建体的细胞之间的Fn水平的显着差异(Fig. 5F),在WTADAMTS16-表达细胞的浓缩介质中,N-末端30kDA Fn片段是明显的(Fig. 6A)。询问该FN片段是否诱导MDCKI细胞中的MMP3表达,如前所述在软骨细胞中(
      • 丁L.
      • 郭D.
      • Homandberg G.A.
      纤连蛋白片段的软骨软骨组合机制涉及地图激酶:三个片段和天然纤连蛋白的比较。
      ),我们将其添加到MDCKI Monolayers并量化 MMP3 mRNA表达。我们发现了一个重要的上调 MMP3 治疗mdcki细胞24小时后mRNA(Fig. 6B) 和 MMP3 在3D培养物中表达WTADAMTS16的细胞中,mRNA水平也显着增加(Fig. 6C)。因为mmp3在(
      • Schwarzbauer J.E.
      • desimone d.w.
      纤连蛋白,其原纤化,和体内功能。
      )5-(一世)6 链接器 IE。 生成类似于ADAMTS16的30 KDA片段(
      • muir d.
      • Manthorpe M.
      Stromelysin产生抑制施曼细胞增殖的纤连蛋白片段。
      ),很可能是观察到的 MMP3 mRNA上调导致前馈回路,其可以在MDCK I球状体中增强FN蛋白水解。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6通过Adamts16释放30kDa n末端肝素结合域的释放通过ADAMTS16上调 MMP3 mdcki细胞mRNA产生蛋白水解前馈回路。 A,在无血清条件下表达WTADAMTS16,AdamTS16-EA和48小时后表达WTADAMTS16,Adamts16-EA和空载体对照的蛋白质印迹分析,显示了通过WTADAMTS16活性(黑箭头)释放的30kDA FN片段。 B, MMP3 用重组30kDa N-末端肝素结合结构域(1F1-5F1)处理的MDCKI细胞中mRNA表达显着增加。 (*) p < 0.05 by Student t 测试。实验是重复的。 C,定量RT-PCR分析 MMP3 在胶原凝胶中培养6天后稳定地表达Adamts16,Adamts16-EA和载体对照的MDCKI细胞中的表达。表达 MMP3 在表达活性AdamTS16的细胞中上调。 (*) p < 0.05, (**) p < 0.01 by Student t 测试。; n =每个构造3个独立实验。 D,定量RT-PCR分析 FN. 1 在胶原凝胶中培养6天后稳定地表达Adamts16,Adamts16-EA和载体对照的MDCKI细胞中的表达。 FN. 1 MRNA在表达ADAMTS16-EA的细胞中进行上调。 (**) p < 0.01 by Student t 测试; n =每个构造3个独立实验。 E, F,描绘了所提出的途径和Adamts16在HDF和MDCKI细胞中的途径和撞击的原理图。 Adamts16是Furin-加工并分泌到细胞外空间中,其与ECM结合,并进一步C-末端加工。 Adamts16在其N末端切割Fn释放30kDa N-末端肝素结合结构域,该结合结构抑制成纤维细胞培养物中的FN纤维发生和ECM成熟(E)。在mdcki球状体(F),由Adamts16释放的Fn的30kDa n末端肝素结合结构域诱导 MMP3 表达,产生前馈蛋白水解环。与活性Adamts16相比,无活性突变体Adamts16-EA与防止其降级的Fn结合。这增强了ECM中的FN积累,可能会干扰ECM刚度并导致增加 FN. 1CDH2 expression.

      讨论

      鉴定蛋白酶的新底物是一个具有挑战性的,这是为了更好地了解它们在多种细胞和疾病过程中的功能,如开发,组织修复,癌症和炎症等功能。因为蛋白水解是不可逆的翻译后修饰,所以衬底鉴定可以限定通过具有持久后果的蛋白酶基本上改性的途径。到目前为止,Adamts16是一种孤儿蛋白酶, IE。 一个没有已知基材的。虽然它已与几种人类疾病相关联,例如癌症和高血压,其基材及其作用机制远远未知。我们的数据表明,Adamts16是一种分泌的金属蛋白酶,其在电池邻接位置起作用。分泌后,AdamTs16在其C末端结构域中被广泛切割,使得与C末端表位标签的抗体未检测到成熟的全长AdaMTS16。这导致释放截断形式的ADAMTS16,我们使用ADAMTS16-SH构造进行建模。 Adamts16-Sh在所用的测定中具有与Adamts16的相似的活动,表明TSR2-PLAC结构域主要是通过但是通过未确定的相互作用将ADAMTS16定位为ECM,尽管ADAMTS16-SH显然也保留了一些ECM结合能力。
      在这里,使用无细胞ECM产生 体外 通过BALB / C成纤维细胞使用LC-MS / MS允许衬底发现,而无需在ADAMTS16的优先纯化。这种方法适用于研究其纯化,如Adamts16的其他ECM降解蛋白质是具有挑战性的。该方法中使用的ECM提供了含有广谱潜在基质的生理ECM,因为成纤维细胞通常产生几种分泌的分子,该分泌的分子组装成良好组织的ECM。质谱策略不仅鉴定为ADAMTS16的潜在底物,还鉴定了重复(I)之间的接头区域中的切割位点5和我)6 Fn。释放30kDa n末端肝素结合结构域,可能以两种方式影响FN组件:缺少该区域的Fn二聚体可能无法正确组装,并且通过占用细胞表面受体,30kDa片段可以干扰完整的Fn二聚体的组装或与FN自组装相关的网站(Fig. 6E)。 FN组件在存在野生型或催化活性Adamts16的情况下,特别是在24小时初到24小时时间点的时间分析表明,AdamTs16主要干扰Fn原纤维的启动和成熟。然而,在消化预形成的ECM后,通过LC-MS / MS观察到30kDa Fn片段的释放表明,Adamts16还能够降解Fn原纤维。 Fn二聚体的构象似乎对调节蛋白水解易感性至关重要,因为Adamts16-Sh没有切割可溶性等离子体Fn,这假设球状符合性(
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      Adamts2,3和14的基材测定的测定显着拓宽了它们的功能,并鉴定了细胞外基质组织和TGF-β信号传导作为主要目标。
      )已被证明在其(i)内切割fn5-(一世)6 接头序列,表明其对蛋白水解的高易感性。研究结果表明,蛋白酶的纤连蛋白加工方面存在相当大的冗余。因此,通过蛋白酶释放Fn的30kDa片段可能是未被广泛研究的FN组件的普及调节。
      Adamts16的电池邻近位置是相关的,因为通过整合到分泌二聚体的整合蛋白结合在细胞表面处启动FN组件(
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      矩阵组件中整合素激活的调节作用及纤连蛋白的协同素。
      ),因此,Adamts16的Fn蛋白分解可能是围粒体的。 MDCKI细胞中的WTADAMTS16过表达导致MDCK衍生的球状体尺寸的显着降低与减少的FN染色和检测30kDA FN片段的检测。另外,我们观察了多血管形成的形成。这些发现与先前描述的Spheroid尺寸的减少和MDCKI细胞中的多个内腔形成在FN敲低时(
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      纤连蛋白沉积在Madin-Darby犬肾细胞分枝形态发生中的作用。
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      纤连蛋白纤维生成调节三维新肠溶形成。
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      )。有趣的是,表达催化活性Adamts16-EA的球状体在其基底膜中增加了Fn积聚。最有可能的Adamts16-EA无需蛋白质的蛋白水解的Fn,并且以主要的负面方式作用以防止其他蛋白酶结合。得到的Fn积累可以改变矩阵刚度,导致升高调节 FN. 1 表达,进一步有助于Fn的广泛积累。总体而言,这些球状体较大,并且与载体或WTADAMTS16表达的球状体相比,未形成腔。表达球状体的细胞显示出在FN积聚时上皮 - 间充质转换(EMT)的特征,如N-Cadherin的上调所示( Fig. 5F)。以前的研究表明,MDCK细胞中的TGFβ过度表达通过EMT诱导阻断腔形成(
      • Santos O.F.
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      通过细胞外基质和TGF-β调节HGF诱导的小微分细胞和上皮细胞的分支。
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      转化生长因子-β选择性地抑制分支形态发生但没有小管发生。
      )在MDCK球状体的ECM中层蛋白,纤维素和胶原蛋白IV的水平可能影响其形成适当腔的能力(
      • Santos O.F.
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      通过细胞外基质和TGF-β调节HGF诱导的小微分细胞和上皮细胞的分支。
      )。因此,Adamts16的FN营业额可能会影响3D培养系统中的细胞极性,EMT和形态发生。在HEK293-EBNA培养物中与Adamts16和Laminin的重叠染色一起染色六蛋白染色的薄膜染色的减少,表明层内也可以是潜在的ADAMTS16基材。然而,BALB / C 3T3细胞产生非常低的层蛋白水平,我们在LC-MS / MS筛网中没有识别独特的层蛋白肽。
      由Adamts16释放的Fn的30kDa n末端肝素结合结构域不仅与FN纤维生成功能相关,而且先前显示为激活 MMP3 通过Chondrocytes中整合蛋白信号传导的表达(
      • 丁L.
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      纤连蛋白片段的软骨软骨组合机制涉及地图激酶:三个片段和天然纤连蛋白的比较。
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      )但对规定知之甚少 MMP3 表达其他蛋白酶。我们的数据显示,Adamts16释放的30kDA片段的FN释放增加 MMP3 在MDCKI细胞中的表达。通过MMP3在域(I)之间的接头区域内的MMP3裂解5和我)6如Adamts16,之前显示出释放30kDa n末端肝素结合结构域(
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      Stromelysin产生抑制施曼细胞增殖的纤连蛋白片段。
      )。因此,我们建议诱导 MMP3 在AdamTs16过表达时,产生前馈循环增强Fn蛋白溶解(Fig. 6F)。因此,ADAMTS16和MMP3可以在FN原纤维成熟和ECM组件的调节中协同作用(Fig. 6F)。虽然数据表明Adamts16直接切割纤维菌素, IE。 通过表明它与纤连蛋白结合并且纯化的Adamts16切割纤连蛋白,Adamts16可能不仅可以作为末端蛋白酶作用,而且可以通过在蛋白水解途径中的较早步骤的激活,例如通过MMP3或激活的上调其他蛋白酶。
      总之,我们已经证明,Adamts16的FN营业额对Fn网络的形成具有深远的影响,因此有可能改变细胞行为并影响ECM组成和延长时间尺度的完整性。另外,我们已经表明,Adamts16驱动前馈蛋白水解回路,因为n末端Fn片段产生增加 MMP3 在MDCKI细胞中的表达。虽然蛋白酶通常在ECM营业额的背景下考虑,但目前的工作支持ADAMTS16在调节ECM组装方面的主要作用。这些发现具有广泛的影响,用于了解细胞行为并扩展蛋白酶网的概念(
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      )为了说明蛋白酶在离散级联和电路中的复杂性和相互依存性。

      数据可用性

      作者声明,所有支持本研究结果的数据都可以在文章及其补充信息文件中提供,或者可根据要求可从R.SC获得。质谱蛋白质组学数据通过骄傲的伙伴储存库(PROSE)沉积在Proteomexchange联盟上(//www.ebi.ac.uk/pride/archive/)使用DataSet标识符PXD007284。项目网页: http://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD007284; FTP下载: ftp://ftp.pride.ebi.ac.uk/pride/data/archive/2018/04/PXD007284; PubMed ID:29669734。

      致谢

      作者表示赞赏,对已故露丝狂热 - EHRISMANN(2015年9月4日发布于2015年9月4日)致力于谁的贡献。我们感谢Nancy E. Hynes教授的批判性阅读剧本和剧集 - Ehrismann和Apte实验室的建设性评论。我们进一步感谢Martin Spiess博士为Mdcki Cells和Jan Seebacher博士进行MS分析。

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