迷你研讨会

        MS.1
        定量彩易福彩组学:概述
        R. Aebbersold.
        分子系统生物学研究所,Eth苏黎世;瑞士苏黎世大学理学院;系统生物学研究所,西雅图,WA
        精确定量在彩易福彩组学实验中检测或鉴定的彩易福彩已成为彩易福彩组学研究的主要目标。定量信息在生物学和临床研究的许多领域是必不可少的,包括检测生物系统中的动态变化,用于样品之间的比较分析和生物过程数学模型中的边界条件。在过去的几年中,已经描述了多种用于定量彩易福彩组学的方法。在本演示文稿中,我们将概述目前可用的方法及其表现。具体而言,我们将讨论以下方法:定量彩易福彩组学基于稳定同位素标记或标记和串联质谱法;基于LC-MS模式匹配或没有同位素标记的定量;通过同位素的绝对量化标记为外标和靶向(多反应监测)质谱。我们还将讨论所有方法共有的问题,包括误差分析和定量准确度以及产生同位素的定量准确度和当前方法标记的参考肽。
        MS.2
        通过无标记的定量质谱法进行分析蛋白表达
        P. R. Cutillas. 和B. Vanhaesebroeck.
        BART的癌症学会,伦敦王后大学英国
        质谱法(MS)在彩易福彩组学中的作用已经演变为用于鉴定在2D凝胶斑点中存在的彩易福彩的技术,以成为定量分析的优选方法。实际上,现在使用MS来量化彩易福彩的几种策略;可以认为,所有这些所有这些都是基于同位素标记的使用ICAT试剂,一种使分析生物化学师的方法欣赏大规模彩易福彩量化的潜力。这项早期工作启发了其他,可能对全球彩易福彩量化的方法更加强大,其中大部分也基于同位素标记(突出和流行的例子包括Silac,Itraq和 18o标签)。最近,不需要彩易福彩标签的基于MS的定量方法也变得流行。这些无标签方法基于光谱计数或使用肽离子强度作为彩易福彩丰度的读出。光谱计数方法的越来越普及可能是由于其简单性,但这种方法的准确性很低。相比之下,基于测量肽离子强度的无标记方法显示了与标签技术提供的准确度的水平,并允许研究与不需要化学反应步骤或定制试剂的简单工作流程比较无限数量的样品。或者媒体。另外,无标记的LC-MS也可以允许以绝对单位获得彩易福彩丰度的估计。然而,尽管原则上非常强大,但这种方法的实施方式在基因组规模上量化彩易福彩(表达彩易福彩组学的最终目的)需要使用(I)适当的策略来比较待评估的样品中的相同肽, (ii)正常化程序,以纠正实验性的可变性来源,和(iii)的信息学工具,以自动化数据分析。在本演示文献中,我们将讨论我们如何通过创建一个被称为Pescal的计算机程序来接近这些问题,该计算机程序提取并比较在待比较的样品中至少一次选择用于MS / MS的肽的离子强度值。我们还实施了归一化程序,使我们能够在基因组规模上量化彩易福彩,其精确靠近使用同位素标记策略获得的精度。为了调查这种方法的限制,我们在一个具有挑战性的样本集中测试,其中包含5个鼠彩易福彩。使用第一代Q-TOF质谱仪,我们能够派生〜44,000个独立数据点,以量化5个器官中〜1000蛋白的表达。因此,通过适当的归一化程序和信息工具,无标签的LC-MS是对定量彩易福彩组学的同位素标记的强大替代品。
        MS.3
        谱分析未标记的肽离子:多功能的定量彩易福彩组学方法和翻译后修改的绘图
        G. Jaitly.1,E. Bonneil.1,N. Jaitly.2,C. Pomies.1,M. Marcantonio.4,p. drogaris.1, 和 P. thibault.1,3
        1免疫学和癌症研究所, 3化学系,和 4加拿大蒙特拉尔大学蒙特拉尔大学生物化学系; 2生物科学师,太平洋西北国家实验室,Richland,WA
        响应于生物系统的特定扰动(例如,细胞信号传导和分化,化学刺激等)来监测彩易福彩丰度的细微变化的能力在识别潜在的候选人中作为生物标记发现程序的一部分起着重要意义。然而,考虑到与细胞提取物相关的压倒性的样本复杂性和可变性,这项任务呈现了相当大的困难。为了概述跨细胞提取物的低丰度表达式,我们开发了MassSense,一种提供从不同MS平台的数据文件提供全面的肽检测和分段分析的软件。通过手动检查具有分布在3个数量级的离子强度的代表性肽图的致密区域来确定检测效率。我们评估了使用在复杂的细胞提取物中掺入的彩易福彩标准消化的缩放混合物在纳米-MS LTQ-轨体质谱仪上进行性能,再现性,统计显着性和动态范围。观察到所有尖刺蛋白的线性响应,超过2个数量级,检测限为1 FMOLE。我们还评估了定量彩易福彩组学在二维纳米-SMS / MS / MS实验中的应用,用于组合表达和用Phorbol酯刺激的人单细胞U937细胞的鉴定分析。通过Western印迹实验相关了几种彩易福彩,包括表现出差异表达和磷酸化的核磷林。在不同样本集中识别微妙丰度变化的能力也为在复杂细胞提取物中监测了修饰的网站提供了独特的优势。这种后一种方面将举例说明为暴露于干扰素-γ的J774巨噬细胞细胞的差分磷脂蛋白酶体分析,并在组蛋白乙酰基转移酶上用于定位乙酰化的精确位点。
        MS.4
        分析监管后修改分析的定量方法
        J. J. Gorman.1,T. P. Wallis1,K. A. Dave1,B. R. Hamilton1,M. J.浅蓝色1,林克2和D. J. Peet2
        1昆士兰医学研究所彩易福彩发现中心。布里斯班,澳大利亚昆士兰州; 2澳大利亚阿德莱德大学分子与生物医学学院,阿德莱德大学。
        翻译后修改提供了细胞彩易福彩网络中的功能开关和对接点。功能性重要的翻译后修改可以是动态的或暂时的,以响应需要途径的信号,以上或下调。必须能够检测这些修改并以动态方式定量地监测它们,以便能够评估其对彩易福彩网络的调节和功能性。
        因此,我们已经评估和/或开发了分析响应缺氧刺激的转录因子的翻译后羟基化的定量方法。与Maldi-Tof / Tof-MS / MS和ESI-LTQ-orbitrap分析与参与缺氧诱导症诱导症(FIH)的MALDI-TOF / TOF-MS / MS和ESI-LTQ-ORBITAP分析和ESI-LTQ-ORBITAP分析。因子调节。定量分析是该系统的研究的重要组成部分,以区分南冬酰胺的羟基化羟基化和甲硫氨酸氧化的特定区域。因此,我们在FIH催化剂中定义了在陷波中的两种特定的天冬酰胺羟化位点。
        我们还研究了一种稳定的同位素标记方法,用于对二恶英受体(DR)的转录活性的调节进行翻译后磷酸化的定量分析。
        本演示文稿将描述这些方法以及发现新城疫病毒彩易福彩上的博士和磷酸化位点的其他翻译后修饰。
        MS.5
        通过大型数据集中的光谱计数量化
        E. Deutsch.
        系统生物学研究所,西雅图,WA
        最近的几项工程已经使用光谱计数作为复杂样品中无标记彩易福彩定量的方法。该方法在霰弹枪彩易福彩组学实验中是有效的,因为较高的丰富彩易福彩将使更明显的肽带入可检测的范围内,并且尽管努力最小化这一点,仍将多次测序更丰富的肽。该技术的大多数例子在一个实验中比较了一小组样品内的彩易福彩丰度。我们将光谱计数方法应用于Peptiatlas内的大组数据集,以在特定样品类型(如人血浆)内设定近似彩易福彩丰度的规模。我们通过大型数据集中的光谱计数及其用于规划靶向彩易福彩组学实验的频谱计数,提出与量化相关的统计问题。
        MS.6
        微生物彩易福彩彩易福彩丰富比
        M. Hackett.,Q. xia,T. Wang,G. Bosch和F. Taub
        华盛顿大学化学工程系,西雅图,WA
        使用多维毛细管HPLC与串联质谱相结合,使原核生物体的高质量和定量彩易福彩组覆盖。在两个或更多个条件之间的彩易福彩丰度变化已经成熟到了错误发现速率(FDR)可以非常低,并且对于较小的彩易福彩造影覆盖率足够高,以明确考虑错误的负误差。将讨论使用这些用于全局彩易福彩丰富评估方法的选定方面。这些包括影响丰度比率的乐器问题;彩易福彩组学中的非线性,误差和数据压缩来源的比较和斑点cDNA阵列;光谱计数和其他非标签方法的优点和弱点与稳定同位素代谢标记;讨论全球丰度分析在彩易福彩水平的四种微生物应用。申请将包括来自持续研究的实例 Porphyromonas Gingivalis., Methanococcus maripludis., 农杆菌肿瘤术甲基杆杆菌有昵称 am1。口腔病原体 Porphyromonas Gingivalis. 将被讨论为有机体的实例,其中大百分比的彩易福彩组在细胞内和细胞外表型之间的相对丰度不同。这种全局分析对现有的标准化方法和多个假设检测具有特殊挑战,这通常假设仅少量的彩易福彩组相对于相对丰度而变化。进行全细胞定量彩易福彩组学分析,以研究来自细胞外的细胞内生活方式的变化 P. Gingivalis.,与牙周病相关的革兰氏阴性细胞内病原体。全球彩易福彩丰富数据 P. Gingivalis. 在足够的覆盖范围内获得人牙龈上皮细胞内部化为18小时,在暴露于牙龈细胞培养基中的对照,以提供有力的证据表明这些变化是深刻的。在内化中共出过385个彩易福彩 P. Gingivalis. 相对于控制;显示240蛋白被显示出低于表达。几种蛋白酶的生产,包括古典毒力因子RGPA,RGPB和KGP。进行了单独的验证研究,其中16倍稀释 P. Gingivalis. 将彩易福彩组与未稀释的样品进行比较,以评估定量的假负率(所有比例真正替代)或FNR。从技术复制中真正无效(没有变化)丰富的比率用于评估整个彩易福彩组上的定量误报(FPR)的速率。甲基甲基甲基的类似研究 M. Maripaludis. 进行的是,将整个彩易福彩组的已知稀释液作为未知视为未知,并将计算的丰度比与已知的真实值进行比较。光谱计数具有差的统计功率特性(1-FNR)但有利的FPRS和FDR。基于每个彩易福彩的总和信号强度的非标签方法具有更好的功率,但FPRS和FDR更高。使用传统的稳定同位素代谢标记实现FNR和FPR之间的最佳总体平衡。虽然FNR可能对其他应用不同时重要,但是对于微生物基因表达的研究,需要定量定量彩易福彩组覆盖,并且FNRS成为我们可以检测到给定电力水平的丰富变化的覆盖率和信心程度的方便度量任何特定的彩易福彩编码ORF。
        MS.7
        系统生物学背景下的定量彩易福彩组学
        S. J. Gaskell.
        迈克尔理发区质谱中心和英国曼彻斯特大学曼彻斯特大学综合系统生物学中心和曼彻斯特中心
        主要关注 相对的 表征在定量彩易福彩组学中绝大多数文献的量化现在需要扩展到允许 绝对 量化以满足系统生物学方法的新兴需求。无需新的分析概念 - 绝对量化仅表示相对量化,当其中一个比较器是已知的,但注意力被引导到需要多个定义的内部标准。在大多数定性彩易福彩组学实验中延伸成功应用的代孕原理,通常的定量标准通常是蛋白水解肽,其用作衍生它们的彩易福彩序列的签名。结合利物浦的蝶形实验室,我们通过表达对应于胰蛋白酶肽序列(1-3)的串联的人工基因来开发和利用多种同位素标记的肽内标。应用机器学习方法可以促进适当的签名肽,以预测曼彻斯特(4)中的哈伯德组进行的质谱检测工作。
        为了实现彩易福彩的准确和精确定量,需要应用来自测定小分子的分析课程。因此,在LC-MS和LC-MS / MS分析期间,在LC-MS和LC-MS / MS分析期间的选择离子监测和选择的反应监测等高占空比质谱模式存在明显的优点。此外,优化匹配分析模式的肽的性质可以导致分析的敏感性(以及因此定量精度)的显着提高。我们探索了使用N-末端硫酰胺衍生物(Edman衍生物和类似物)以促进N-末端肽键切割,从而在肽离子的碰撞激活后,在一个或两个片段离子中达到产物离子电流的浓度。已经实现了检测灵敏度的显着增强(5)。此外,已经证明了在分子量,N-末端残余物和色谱保留时间方面的胰蛋白酶肽分析物的隐性表征是足以高度选择性检测的。
        这些分析方法已应用于绝对定量的几个区域,包括测定酵母糖酵解途径(6)中涉及的酶。
        参考
        1. Beynon,R. J.,Doherty,M. K.,Pratt。 J. M.和Gaskell,S. J.(2005) NAT。方法 2, 587–589.
        2.普拉特,J.M.,SIMPSON,D. M.,Doherty,M. K.,Rivers,J.,Gaskell,S. J.,Jus和Beynon,R. J.(2006) NAT。协议 1, 1029–1043.
        3.河流,J.,SIMPSON,D. M.,Robertson,D. H.,Gaskell,S. J.和Beynon。 R. J.(2007年5月17日) mol细胞彩易福彩组学 10.1074 / MCP.M600456-MCP200。
        4. Kin Wai Lau,Siepen,J. A.,Wedge,D.,Eyers,C.,Gaskell,S. J.以及Hubbard S.J. (2007)印第安纳波利斯美国大众光谱学会年会。
        5. RIBA-GARCIA,I.,HART,S.,BEYNON,R. J.和Gaskell,S. J.,编制。
        6. Carroll,K.,Kell,D. B.,SIMPSON,D. M.,Beynon,R. J.,J.,S. J.,S. J.,未发表。
        MS.8
        用ITRAQ试剂对复杂样品的彩易福彩水平和磷酸化化学计量分析
        J. C. Trinidad.1,A. Thalhammer.2,C. G. Specht2,P. R. Baker1,A. J. Lynn1,R. Schoepfer2和A. L. Burlingame1
        1大众光谱设施,加利福尼亚大学制药化学系,旧金山,加利福尼亚州; 2英国伦敦大学学院药理学系
        该谈话将讨论彩易福彩水平和磷酸化化学计量定量分析所涉及的实际问题,专注于:使用ITRAQ试剂进行同位素定量;以及软件工具的开发,帮助实现结果。
        获取彩易福彩和翻译后动态的知识是理解复杂细胞环境的运作的关键步骤。为此,我们一直专注于开发获取,过程和从一系列生理条件下从生物样品的大规模研究中获得彩易福彩水平和磷酸化的洞察的方法。将讨论的实验涉及应用ITRAQ(相对和绝对量定量的异甲板标签)试剂。
        伊特拉克试剂为我们的目的有两种主要优点。首先,试剂与游离α和ε胺反应,导致基本上标记由胰蛋白酶消化引起的所有潜在肽(使用同位素标记进行磷酸化的关键考虑)。其次,试剂的多重性质允许同时加工四个样品。为了获得关于细胞状态的统计数据可靠的定量信息,需要分析大量的复制,而不是目前在文献中普遍存在。多路复用样本分析将有助于缓解样品处理管道中的这种瓶颈。
        在开发工具方面,有助于分析大规模定量彩易福彩组学数据,还有很多待完成的。我们使用彩易福彩探测器软件包对数据分析的定量方面进行了相当大的努力。该软件现在支持一系列同位素定量技术。我们已经开始将彩易福彩探测器与下游加工软件整合,该软件从多肽以及相对磷酸化化学计量(给定彩易福彩和磷酸化定量信息)中计算彩易福彩表达比例。

        参考

          • Beynon R.J.
          • Doherty M.K.
          • 普拉特准
          • Gaskell S.J.
          NAT。方法。 2005; 2: 587-589
          • 普拉特准
          • SIMPSON D.M.
          • Doherty M.K.
          • 河流J.
          • Gaskell S.J.
          • Beynon R.J.
          NAT。协议。 2006; 1: 1029-1043
        1. Rivers,J.,Simpson,D. M.,Robertson,D. H.,Gaskell,S. J.和Beynon。 R. J.(2007年5月17日) mol细胞彩易福彩组学 10.1074 / MCP.M600456-MCP200。

        2. Kin Wai Lau,Siepen,J.A.,Wedge,D.,Eyers,C.,Gaskell,S. J.和Hubbard S.J. (2007)印第安纳波利斯美国大众光谱学会年会。

        3. Riba-Garcia,I.,Hart,S.,Beynon,R. J.和Gaskell,S. J.,编写。

        4. Carroll,K.,Kell,D. B.,Simpson,D. M.,Beynon,R.J.,Gaskell,S.J.,未发表。