金纳米粒子组装微流体反应器用于有效的在线蛋白水解*

      设计有金纳米粒子网络诱捕胰蛋白酶的微芯片反应器被设计用于低水平蛋白的有效在线蛋白水解和源自小鼠巨噬细胞的复杂提取物。通过聚(二甲基甲基氯化铵)和金纳米颗粒的层逐层静电结合组装纳米结构表面涂层。通过UV可见光谱,原子力显微镜和石英晶微观测量来监测组装过程。在理论上基于Langmuir等温模型和安装γ的受控吸附是理论上研究的最大限度K值估计为1.2×10−7摩尔/米2和4.1 × 105 m−1, 分别。酶促动力学测定证实,胰蛋白酶捕获在生物相容的金纳米粒子网络中具有高负载能力的胰蛋白酶,保留了其生物活性。吸附胰蛋白酶的最大蛋白水解率为400米m/(最小·μg)。使用Microchip反应器消化每分析到每分析的少量彩易福彩,并通过MALDI-TOF MS / MS鉴定所得的胰蛋白酶。通过在线消化和LC-ESI-MS / MS分析有效地鉴定从小鼠巨噬细胞中提取的彩易福彩混合物。
      随着后期成员时代的出现,很多关注都针对破译可能与各种疾病状态相关的彩易福彩组(
      • Persidis A.
      彩易福彩组学 - 一种雄心勃勃的药物开发平台试图将基因序列链接在各种生理状态下表达表型。
      )。彩易福彩组学的主要任务之一是鉴定细胞或组织中的靶蛋白,其中彩易福彩分子量,等电点,序列和最终结构的信息有助于了解彩易福彩的生物学功能(
      • 铜J.W.
      • 陈杰斯。
      • 李Y.
      • 李C.S.
      基于膜的纳米级蛋白水解反应器,使彩易福彩消化,肽分离和使用质谱法鉴定彩易福彩鉴定。
      )。质谱和相关耦合技术的快速发展提供了一种以高度自动和快速的方式进行彩易福彩和肽分离和识别的机会;因此,可以获得细胞或组织中的更全面的彩易福彩映射。在通过质谱分析的彩易福彩表征之前,需要进行彩易福彩样品的受控酶促劣化以形成特异性碎片。常规的消化过程患有长消化时间,慢性自分泌的酶的局限性,以及样品损失,其影响蛋白水解效率并防止进一步随后的阳性鉴定感兴趣的彩易福彩。为了克服这些缺点,最近已经开发了许多技术。 Toyo'oka和同事(
      • Sakai-Kato K.
      • 加藤米
      • Toyo'Oka T.
      通过集成到毛细管电泳中的溶胶 - 凝胶法在线胰蛋白酶包封的酶反应器。
      )通过溶胶 - 凝胶法集成到毛细管电泳中的胰蛋白酶包封的酶反应器,显示出低分子量底物的良好酶活性。斯莱斯兹 等等。 (
      • Slysz G.W.
      • Lewis D.F.
      • Schriemer D.C.
      纳米胰蛋白酶体系中彩易福彩彩易福彩水平的检测和鉴定。
      )报告了使用柱系统进行敏感胰蛋白酶消化的柱系统的容易技术,该方法需要亚网上标准蛋白。然而,在非常小的体积中消化未知彩易福彩,与组织,细胞,亚细胞室和卵尿量相关,仍然是一个挑战(
      • 工艺D.
      • Doucette A.
      • Li L.
      彩易福彩的微柱捕获和消化与质谱结合彩易福彩鉴定。
      )。
      微流体芯片已被广泛认为是一种强大的技术,将在未来的生物分析中发挥重要作用,以满足大规模和高吞吐量要求(
      • 秦J.H.
      • 你是n.n.
      • 刘X.
      • 林B.C.
      用于分析细胞凋亡的微流体装置。
      )。它们的小型化架构提供了许多不同的优点,例如高样本处理速率,低制造成本,先进的系统集成以及减少的样品和分析量(
      • 狮子N.
      • Rohner T.C.
      • 天顿L.
      • Arnaud I.L.
      • 达莫e.
      • youhnovski n。
      • 吴Z.
      • Roussel C.
      • Josserand J.
      • Jensen H.
      • rossier J.s.
      • Przybylski M.
      • Girault H.H.
      彩易福彩组学中的微流体系统。
      )。特别地,微流体技术能够实现含有固定化酶的小型化平台,有助于提高缩短孵育时间的蛋白水解效率,用于在线彩易福彩组分析(
      • Calleri E.
      • Templini C.
      • Perani E.
      • PALMA A.D.
      • LUBDA C.
      • Mellerio G.
      • SATA A.
      • Galliano M.
      • Caccialanza G.
      • 马托里尼G.
      基于胰蛋白酶的单片生物反应器与LC / MS / MS系统偶联,用于彩易福彩消化和标准溶液和血清样品中的变体鉴定。
      )。与珠粒填充毛细管相比,开放微通道器件的理论板的数量较高,因为流动更均匀。除了开放微通道系统上的压降之外,对于包装柱的压力降低。斯莱斯兹 等等。 (4)建议将在其后续研究中使用基于芯片的设计。商业聚合物材料,如聚(甲基丙烯酸甲酯),聚(二甲基硅氧烷)和聚(对苯二甲酸乙二醇酯),由于成本低,不同的化学和机械性能,广泛地用于MicroDemices的大规模制造。然而,聚合物的较差的生物相容性性质对于固定酶和生物分子的固定性是不利的。因此,表面改性是对生物分析的聚合物微生物设计的关键问题。许多努力已经致力于化学官能化和图案化生物相容性表面以固定生物活性化合物。 Poros珠子对彩易福彩或肽具有非常好的亲和力。 Pearson和同事(
      • 安德森N.L.
      • 海南L.R.
      • Pearson T.W.
      使用孔珠和流式细胞术的免疫吸水性功能表征的有效且快速的方法。
      )开发了一种新的流式细胞术方法,允许快速评估大量的颗粒结合抗体。使用彩易福彩G-衍生的孔珠用于结合特异性的亲和纯化的抗体,所述抗体特异于来自人血浆蛋白的合成肽。 Fréchet和同事(
      • Peterson D.S.
      • rohr t.
      • SVEC F.
      • FréchetJ.M.J.
      使用固定在多孔聚合物整料上的胰蛋白酶含有固定在多孔聚合物和ESI TOF质量光谱仪的多孔聚合物整料中的高通量肽质量映射。
      ,
      • Peterson D.S.
      • rohr t.
      • SVEC F.
      • FréchetJ.M.J.
      酶MICREACTOR-on-A片:使用固定在微流体装置通道中模塑的多孔聚合物整体上固定的胰蛋白酶的彩易福彩映射。
      通过将胰蛋白酶固定在多孔聚合物整料上,制备毛细血管中的酶微反应器。在我们的组中,已经提出了几种方法,包括溶胶 - 凝胶夹带,层组件,共价结合和物理吸附,以改变进一步用于诱捕酶和靶蛋白的微流体通道的表面,用于彩易福彩鉴定和手性分析 (
      • qu h.y.
      • 王H.T.
      • 黄扬
      • 钟W.
      • lu h.j.
      • KONG J.L.
      • 杨p.Y.
      • 刘B.H.
      塑料微流体通道上的彩易福彩图案化稳定的微观结构网络:对芯片酶​​微反应器的策略和表征。
      ,
      • wu h.l.
      • 田Y.P.
      • 刘B.H.
      • lu h.j.
      • 王X.Y.
      • 翟j.j.
      • 金H.
      • 杨p.Y.
      • 徐y
      • 王H.H.
      二氧化钛和氧化铝溶胶 - 凝胶衍生的微流体酶 - 用于肽测绘的酶反应器:设计,表征和性能。
      ,
      • 刘Y.
      • lu h.j.
      • 钟W.
      • 歌P.Y.
      • KONG J.L.
      • 杨p.Y.
      • Girault H.H.
      • 刘B.H.
      用于酶固定化的多层组装微芯片作为低水平彩易福彩鉴定的反应器。
      ,
      • 黄扬
      • 山W.
      • 刘B.H.
      • 刘Y.
      • 张Y.H.
      • 赵玉。
      • lu h.j.
      • 唐y.
      • 杨p.Y.
      沸石纳米粒子改性微芯片反应器,用于有效彩易福彩消化。
      )。
      由于其良好的生物相容性,电荷稳定的金纳米颗粒(AUNP)
      使用的缩写是:AUNP,金纳米粒子; PDDA,聚(二丙二甲基氯化铵);宠物,聚(对苯二甲酸乙二醇酯); QCM,石英晶体微稳定; Baee,α-N - 苯并 - l-Arpulinine乙酯; cyt-c,细胞色素 c; SCX,强阳离子交换; RP,反向阶段; OVA,卵烧; PMF,肽质量指纹; IPI,国际彩易福彩指数。
      1使用的缩写是:AUNP,金纳米粒子; PDDA,聚(二丙二甲基氯化铵);宠物,聚(对苯二甲酸乙二醇酯); QCM,石英晶体微稳定; Baee,α-N - 苯并 - l-Arpulinine乙酯; cyt-c,细胞色素 c; SCX,强阳离子交换; RP,反向阶段; OVA,卵烧; PMF,肽质量指纹; IPI,国际彩易福彩指数。
      提供类似于天然状态中彩易福彩的温和微环境,并使彩易福彩分子更自由地取向。它们是生物相容性和无毒的,可以提供大的比表面积,用于就可以结合大范围的生物分子,例如氨基酸,彩易福彩和抗体(
      • Merkoci A.
      • 玛塔A.
      • Tarraso'n G.
      • Eritja R.
      • Alegret S.
      基于通过肽序列免疫的金纳米颗粒,朝向ICPMS链接的DNA测定。
      )。在该研究中,在聚(乙烯对苯二甲酸乙二醇酯)(PET)微通道的表面上组装聚(二咪啶甲基氯化铵)(PDDA)/ AUNP多层薄膜,以获得流通彩易福彩消化Biochip。阳离子聚电解质PDDA和阴离子涂覆的AUNP的顺序交替吸附导致形成生物相容性和大的比表面积与体积比网络以固定酶。与MALDI-TOF MS或二维LC-ESI-MS / MS相结合,鉴定了从小鼠巨噬细胞中提取的低水平彩易福彩样品(16个FMOL)和复杂的彩易福彩。该策略提供了一种简单而易于使用的协议,用于实现彩易福彩组学进一步发展所需的快速,高效和在线消化。

      实验步骤

       材料和化学品

      从杜邦(瑞士日内瓦)购买宠物床单(100μm厚的,melinex)。 PDDA是从Sigma获得的。 BSA,细胞色素 c从Sigma获得,肌球蛋白,卵蛋白和胰蛋白酶(牛胰腺的胰蛋白酶)(EC 3.4.21.4)。所有其他化学品都是分析级,并从上海化学试剂公司(中国上海)购买。

       细胞培养和彩易福彩提取

      巨噬细胞系AMJ2-C8(来自ATCC,CRL-2455)在高葡萄糖Dulbecco的改性鹰培养基中培养,其补充有10%胎牛血清,100个单位/ ml青霉素和100μg/ mL链霉素,并在37℃下孵育在5%的co2 气氛。收获生长的细胞,用冰冷的PBS洗涤两次,并储存在-80℃。用两种不同的溶剂用蛋白酶抑制剂混合物萃取彩易福彩:一个是水,另一个是4 m 尿素。将所得彩易福彩分别消化,分离和分析。

       宠物微流体芯片的制作

      通过预先报道的光纤和热层压制造微芯片(
      • 罗伯茨米
      • rossier J.s.
      • r
      • Girault H.H.
      紫外线激光加工聚合物基材用于开发Microdiagnostic系统。
      )。简而言之,PET板放在计算机控制上 XY. 翻译阶段(Physik Instrumente,Karlsruhe / Palmbach,Germany)并被紫外线准分子激光(氩气,193nm; LPX 2051,Lambda Physik,Gottingen,Gettingen,Gerober)扫描,用于产生2厘米长的通道梯形横截面形状约42μm深,宽107μm。直线通道在每端都有拍摄的储存器。在表面改造后,使用层压机(浙江省浙江省浙江省杭州富峰电子仪器有限公司)在110℃下通过聚乙烯/ PET层热密封微结构化PET。

       田间的合成

      根据以前的文献(
      • Grabar K.C.
      • 弗里曼r.g.
      • Hommer M.B.
      • 纳塔曼姆。
      Au胶体单层的制备与表征。
      )。简而言之,在1升圆形瓶中配有冷凝器的500ml 1米m HAuCl4 随着剧烈的搅拌而被卷起。快速添加50毫升38.8米m 柠檬酸钠与溶液的涡旋导致从浅黄色至勃艮第的颜色变化。培养持续10分钟;然后除去加热套,继续搅拌15分钟。所得胶体颗粒的溶液的特征在于520nm的吸收。

       宠物微通道表面改性和酶固定化

      用蒸馏水和乙醇冲洗PET微流体芯片,然后在室温下干燥。宠物用1水解了 m NaOH水溶液在60℃下16分钟,随后质子化以制备PET-COOH(
      • 陈W.
      • 麦卡锡T.J.
      层逐层沉积:用于聚合物表面改性的工具。
      )。该表面含有羧基和羟基官能团,并且在足够高的pH 13时负电荷。水解后,用0.1洗涤PET膜 m HCl(一次),蒸馏水(两次)和乙醇(一次)并在减压下干燥。随后,将PET膜在PDDA溶液中孵育(3mg / ml,含0.13 m 氯化钠和5米m 氨)20分钟吸附一层带正电荷的PDDA,然后用蒸馏水冲洗三次。在下一步骤中,通过吸附膜的表面上的电荷极性通过吸附一层aUnps,其孵育时间为40分钟,然后用水冲洗。在沉积不同数量的PDDA /金纳米粒子组件的双层之后,将薄膜在室温下在减压下干燥。然后将层逐层改性的PET芯片浸泡在含有50米的5mg / ml胰蛋白酶溶液中m Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)和20米m CaCl2 在4°C下至少2小时。随后通过水充分洗涤PET微芯片的通道。

       PDDA / AUNP多层组装PET表面的表征

       紫外线可见光谱 -

      在Shimadazu-2450 uV可见分光光度计上进行uV可见的吸附监测随后的AUNP层的沉积。

       原子力显微镜显像 -

      通过攻丝模式通过原子力显微镜(电化学扫描探针显微镜,PicoScan 2100)评估表面形貌。用纳米传感器蚀刻硅探针进行千分尺扫描。仪器参数设定如下:扫描尺寸,3.5μm;共振频率,60-80 kHz。使用纳米腔软件展平图像。

       石英晶体微稳定(QCM)测量 -

      确定涂层网络中的胰蛋白酶的受控吸附量 原位 使用QCM分析仪(CHI420,CH Instruments,Inc。)和石英晶体(7.995 MHz)夹在两个金电极(面积,0.196厘米之间2)。 AUNPS,PDDA和胰蛋白酶溶液组装在金表面上。每次沉积步骤的PDDA和AUNP的吸附时间分别为20至40分钟。沉积后,用纯水彻底冲洗金电极表面并在氮气下干燥。测量空气中的QCM频率变化。

       固定胰蛋白酶的活性测定

      通过流动α-检查微芯片中包封酶的活性N - 苯并 - l-Arguginine乙酯(Baee)溶液(5-20​​米m)在50米m Tris-HCl缓冲液(pH8.0)通过表面改性通道使用74900系列注射器泵(COLE-PARMER仪器CO.)以100μl/ h的流速。通过毛细管电泳系统(P / ACE系统5000,Beckman)分析所得产物。在214nm处,在15℃下在15℃下在磷酸盐缓冲溶液(pH2.5)中在磷酸盐缓冲溶液(pH2.5)中进行毛细管电泳。通过流速和吸光度差来计算胰蛋白酶活性。

       片上标准彩易福彩消化和鉴定

      细胞色素的标准彩易福彩溶液 c (Cyt-c),Myoglobin,BSA和卵磷蛋白(OVA)溶解在10米中m NH4HCO3 缓冲溶液(pH8.0),消化前热变性。通过74900系列注射器泵(COLE-PARMER仪器CO.)以120μL/ h的流速驱动样品溶液。通过数字移液管(2-20μL,EPPendorf Research)收集累积在外贮存器中的肽,然后通过MALDI-TOF MS分析。 MS实验是在4700个彩易福彩组学分析仪上进行的,具有TOF / TOF光学器件(Applied Biosystems,Framingham,MA)。在马尔达板上滴下每体积0.5μl肽溶液。蒸发溶剂后,将0.5μl基质溶液(将4mg / mlα-氰基-4-羟基氨基酸溶解在50%ACN水溶液中,0.1%TFA)的体积滴到样品层上。 MS仪器以加速电压为20 kV的操作。使用355nm的200 Hz脉冲钕掺杂的钇铝石榴石(ND:YAG)激光器。在鉴定样品之前,通过肌球蛋白的胰蛋白酶蛋白肽用外部校准模式校准MS仪器。所有光谱取自800激光镜头的信号平均,激光强度保持恒定。使用吉祥物作为搜索引擎和Swiss-prot作为数据库的GPS Explorer软件用于识别彩易福彩。使用肽指纹质谱与串联质谱结合鉴定所有彩易福彩。将肽质量耐受设定为80ppm,并将串联质量耐受设定为0.5Da。

       强阳离子交换(SCX)-RPLC-ESI-MS / MS分析

      使用如前所述的QSTAR XL质谱仪(Applied Biosystems)通过LC-Nanospray MS / MS分析进行彩易福彩鉴定,如前所述 等等。 (
      • 顾S.
      • 刘Z.H.
      • 潘S.Q.
      • 姜Z.Y.
      • 陆H..
      • amit o.
      • 布拉德伯里尤。
      • 胡c.a.a.
      • 陈X.
      通过使用对比氨基酸编码标记的定量彩易福彩组学分析全局调查P53诱导的细胞凋亡。
      )。使用由自动进样器(FAMOS),预先柱塞开关装置(Switchs)和HPLC泵系统(终极)组成的HPLC系统(LC填充,旧金山,CA)来实现消化肽的分离。将样品(10μL)加载到SCX柱(Biox-Scx-90Å,15cm×1000μm)上。然后用一系列乙酸铵梯度从SCX柱洗脱肽:0,50,100,200,400,800,1000和2000米m, 分别。每个洗脱的级分在c上分离在线18 柱(Grace Vydac,25cm×150μm,300埃),流速为1.2μl/ min。缓冲液A为5%ACN和0.1%的甲酸; Buffer B是95%ACN和0.1%的甲酸。梯度分离从0到10%B增加18分钟,在125分钟的125分钟内升至50%B,在130分钟内增加至90%B,保持在90%B 5分钟,在140分钟下降至30%B. ,并在145分钟返回0%b。随着肽的洗脱柱,将它们直接引入QSTAR Pulsar ESI-Hybrid Quadrupole-ToF仪器(应用生物系统/ MDS SCIEX)中,并使用MS和MS / MS模式之间的数据相关的切换进行分析:1-可以选择高达三个乘以带电的前体离子的MS MS光谱,用于3-S MS / MS光谱采集; TOF MS和MS / MS的质量范围分别为400-1600和100-2000DA。程序分析器(应用生物系统)用于数据采集和仪器控制。

       数据库查询和彩易福彩标识

      吉祥物服务器用于通过搜索符合物种来解释LC-MS / MS数据 亩肌肉 从内部彩易福彩指数(IPI)鼠标3.07数据库。数据库搜索的参数设置如下:1)MS和MS / MS的±0.8da的质量耐受性,2)允许胰蛋白酶特异性的一个切片,3)从2到3的电荷状态,和4)施加光谱的平滑。肽与重要同源性相匹配(p <0.05)被认为是鉴定的肽。为了进一步提高彩易福彩的置信度,利用反向的IPI鼠标3.07数据库来评估搜索结果(
      • Cargile B.J.
      • Bundy J.L.
      • Stephenson J.L.
      通过串联质谱法从大型数据库到误识别的潜力。
      ,
      • 摩尔里。
      • 年轻的M.K.
      • lee t.d.
      QScore:一种评估续集数据库搜索结果的算法。
      )。

      结果和讨论

      这项工作的目的是用大型比表面积构建生物相容的固定相,以容纳微通道表面上的胰蛋白酶。因为据报道,捕获的胰蛋白酶比散装溶液中的胰蛋白酶更有效(
      • 冯S.
      • 叶m.L.
      • 江X.G.
      • 金w.h.
      • zou h.f.
      将整体毛细血管的固定胰蛋白酶微反应器与μRPLC-MS / MS进行霰弹枪彩易福彩组分析。
      ,
      • Calleri E.
      • Templini C.
      • Perani E.
      • 斯特拉C.
      • Rudaz S.
      • LUBDA D.
      • Mellerio G.
      • Veuthey J.L.
      • Caccialanza G.
      • 马托里尼G.
      基于胰蛋白酶固定在整体载体上的胰蛋白酶的生物反应器的开发在整体载体上进行单片载体和鉴定彩易福彩。
      ),静止阶段旨在导致有效的彩易福彩消化和鉴定。因此,PDDA / AUNP多层网络的具体特征应该为酶固定提供高亲和力,但也为良好的微环境宿主宿主。 方案1 描述PDDA / AUNP组装微芯片中酶固定化的协议和进一步的彩易福彩鉴定。
      图缩略图GR8.
      方案1a,通过将固定的酶微芯片反应器与SCX-RPLC / MS / MS偶联来鉴定彩易福彩混合物的工作流程示意图。 b,PDDA / AUNP多层和胰蛋白酶固定在宠物微通道上的组装过程。

       PDDA / AUNP组装和胰蛋白酶固定的表征 -

      原子力显微镜图像用于表征PET表面上多层组件的地形特征(
      • 罗伯茨米
      • rossier J.s.
      • r
      • Girault H.H.
      紫外线激光加工聚合物基材用于开发Microdiagnostic系统。
      )。用于产生表面电荷的苛刻氧化处理增强了PET表面的粗糙度。实际上,必须化学处理PET基质以产生带负电的亲水基团(OH和COOH)可以通过静电相互作用交替地吸附多层电极电解质PDDA / AUNP。在PDDA / AUNP的第一个双层沉积后(图。1A),仍然可以观察到一些不均匀的分布突起,从基材的原始粗糙度源自肿胀。在形成第二双层后,可以清楚地看到它 图。1B AUNPS形成了更均匀的薄膜,平滑原始粗糙度。随着双层的数量增加,金纳米粒子聚集成为主要因素(图1C.)。为了形成聚电解质和AuNP的支架的目的,观察到的粗糙度和不均匀性是吸附酶的优点,同时保持底物接入和肽扩散的易于途径。 图。1D 显示PDDA / AUNP的胰蛋白酶加载双层的表面形态,表明酶的吸附/解吸没有显着改变网络组件的形态。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1改进的PET表面的原子力显微镜图像(攻丝模式)。a,单层PDDA / AUNPS。 b,双双层PDDA / AUNPS。 c,三双层PDDA / AUNPS。 d,胰蛋白酶固定在PET表面上组装在PET表面上的双双层PDDA / AUNP中。
      为了监视PET基板上的逐层组件的沉积过程,使用UV可见光谱法测量金等离子体频带的吸光度,如补充所示 图SI-1。吸光度强度随着AUNP层的数量而增加。然而,由于层数增加,可以在连续沉积时观察到从536到650nm的逐渐的αUAN最大吸光度从536到650nm的沉积观察到。这种聚集将导致比表面积的减少,这是不需要酶固定化的。

       Langmuir吸附等温线 -

      已经在数学上建模吸附和运输过程以更好地了解多层组装基板上的酶吸附过程。该模型基于Langmuir等温线,它使用吸附表达中的活动位点概念来解决其墙壁覆盖率的速率降低。该模型发现广泛的应用彩易福彩在基材上的吸附(
      • Lionello A.
      • Josserand J.
      • Jensen H.
      • Girault H.H.
      静态微系统中的彩易福彩吸附:表面对体积比的影响。
      ,
      • Lionello A.
      • Josserand J.
      • Jensen H.
      • Girault H.H.
      通过“止动”和连续流动在微通道中的动态彩易福彩吸附。
      )。根据Langmuir等温模型,表达将吸附在表面γ上的分析物浓度相关的表达到溶液中分析物浓度的浓度 C at equilibrium is
      Γeq.Γ最大限度=KC1+KC
      (eq。1)


      其中γ.eq. 是平衡,γ的表面浓度最大限度 是活跃点的初始浓度, K 是吸附热力学常数,和 C0 是溶液的初始浓度。吸附等温线(等式1)如下线性化。
      CΓeq.=1KΓ最大限度+CΓ最大限度
      (eq。2)


      为了研究等温线,我们对被视为宠物微通道表面的电极进行了QCM实验。以这种方式,可以测量在吸附来自块状的彩易福彩时多层组件的质量增加。胰蛋白酶吸附的实验等温线显示在 Fig. 2 用线性化等温线 插入线。报告. C0/γ.最大限度 与c0,γ.最大限度K 作为坡度和截距的相应倒转提供,给出拟合值γ最大限度 = 1.2 × 10−7摩尔/米2K = 4.1 × 105 m−1。该最大表面覆盖率对应于每分子13nm的区域2 在等效的紧凑型单层。这些数据清楚地表明,组件为酶提供了庞大的吸附剂固定相。这 K 值表明,组合带正电电解电极和带负电的剖腹产的网络支架可以广泛地从水溶液中提取彩易福彩。这些结果表明,组装涂层为反应器的设计提供了良好的结构。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2在从QCM实验结果中获得的PDDA / AUNP多层组装PET上的胰蛋白酶吸附等温仪。插入线,吸附等温线的线性化。

       动力学酶活性测定 -

      通过MICHAELIS常数的值评估PDDA / AUNPS不同双层内的吸附胰蛋白酶的活性(km.)最大速度(V最大限度),两者都是从Michaelis-Menten方程的线性化形式衍生的。
      [S]/V=(Km)/V最大限度+(1/V最大限度)[S]
      (eq。3)


      该等式适用于批量解决方案在其中 v 是酶促反应的速率,并且[S]是流动溶液中的基材的本体浓度。这 km. 值反映酶促亲和力,以及 V最大限度 值表示微反应器中固定的胰蛋白酶的活性。报告了通过PDDA / AUNP的不同双层制备的酶的微反应器中转化BAEE的曲线图 图3A,并且相应的动力学特性显示在 图3B.。可以看出,在两个PDDA / AUNP双层中固定的胰蛋白酶具有最高的 V最大限度这意味着可以实现对双双层涂覆的酶反应器的更高反应速率而不是任何其他涂层。另一方面, km. 三双层涂覆的酶反应器的值是最高的。双双层组件内的酶显示最大反应速率为2.0米m/ s, IE。 的价值 V最大限度 每单位胰蛋白酶约为400米m/(最小·μg)。因为胰蛋白酶仅位于生物反应器的壁上,所以该值可以反映微反应器中存在的大量胰蛋白酶。另外,高反应速率可能归因于高度的体积比和微观通道的微结构诱惑。由PDDA / AUNP组装的良好定义的支架可以提供用于酶吸附的高比表面积,以及用于保留生物活性的生物相容性微环境。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3a,用于在PET表面上吸附在PDDA / AUNPS不同双层的胰蛋白酶的胰胰蛋白酶。条件是:固定化,5mg / ml(w / v)胰蛋白酶水溶液;活动的测定,5-20米m BAEE in 50 mm TRIS缓冲液(pH 7.4)。 b,Michaelis常数的变异(km.)最大速度(V最大限度)在PDDA / AUNP的不同双层上的固定胰蛋白酶。

       片上彩易福彩消化和鉴定 -

      由于最近越来越多的新型高吞吐量和自动化彩易福彩组分析的需求,我们在这项工作中的目标是通过彩易福彩鉴定团结一个快速的在线蛋白水解事件。因此,使用PDDA / AUNP组装方法,我们开发了含酶的微芯片反应器,其能够在微通道的纳米宽度空间内限制大量胰蛋白酶。具有多个裂解位点的四种代表性彩易福彩,BSA(分子量= 66,000),OVA(分子量= 42,700),Cyt-c (分子量= 11,565),选择肌红蛋白(分子量= 16,700),以评估用制备的PDDA / AUNP组装的微反应器的性能。
      如上所述,双双层组装的酶反应器能够进行最有效的彩易福彩消化。接下来,使用MALDI-TOF-MS通过200ng /μlbsa实验研究组装双层数量对彩易福彩消化效率的影响。如补充所示 图SI-2,所鉴定的肽的数量随着不同数量的双层而显着变化。在双双层组装的反应器中,鉴定了从BSA消化消化的10个肽,而使用未修饰的PET微通道可以仅获得四种肽。因此,我们进一步证实,微芯片反应器组装有两种双层,其具有最高的酶促效率,用于下列细胞提取物样品的标准和实际彩易福彩的蛋白水解。
      卵蛋白是鸡蛋白色的主要彩易福彩,胰蛋白酶消化是抗性的,并且通常在消化前需要热变性(
      • van der Plancken I.
      • 范Remoortere M.
      • Indrawati I.
      • 范罗伊A.
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      蛋白蛋白易感性与酶水解的热诱导变化:动力学研究。
      )因为已知这种疏水性糖蛋白具有二硫化物桥,所以一个 N - 糖基化和四个磷酸化位点(
      • maccoss m.j.
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      纳米电子涂布离子源的分析性能。
      )。在本研究中,使用卵泡作为评估AS制备的片上彩易福彩分析的示例。以4.0μl/ min的流速,通过小型化微芯片反应器泵送200ng /μlova溶液,该反应器具有小于5 s的非常短的停留时间。将从微反应器收集的样品沉积在MALDI靶板上。基于多层的胰蛋白酶消化的MALDI质谱是没有显示的胰蛋白酶自分解伪像 Fig. 4。详细的识别信息总结在补充表Si-1中,其表明从OVA产生九种胰蛋白酶肽,与高达36-41%的氨基酸序列覆盖率相对应。鉴定结果可以与溶液消化的那些相当,需要6小时的反应时间(
      • 公园Z.Y.
      • 罗素D.H.
      热变性:肽质量映射中的一种有用技术。
      )。结果表明,在微通道中捕获的胰蛋白酶可以作为良好的生物催化剂,实现更快速的反应。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4使用PDDA / AUNP多层改性的微芯片反应器为4.0μl/ min的流速的MALDI-TOF卵磷酸消解。 彩易福彩在10米中为0.20μg/μlm NH4HCO3 缓冲溶液(pH8.1)。洗脱液到矩阵比为1:1。标有峰值 星号 代表匹配的肽。
      由制备的酶微芯片反应器由PDDA / AUNP多层形成多孔小尺寸骨架并提供相对高的表面积。同时,相对于蛋白样品的酶浓度大大增加。通常,酶对彩易福彩的比例约为1:30,因为高酶 - 样品比通常会产生高度的酶自分解,这可以容易地掩盖谱中样品肽的信号。为了在低浓度下产生靶蛋白的足够裂解,其中一些是天然抗蚀的,常规的胰蛋白方法需要更长的孵育时间。具有固定的胰蛋白酶的芯片基反应器是提高低水平彩易福彩消化的蛋白水解效率的有希望的选择。
      2 ng /μlcyt-c 用作用于评估该芯片基反应器的彩易福彩负荷降低的实例。 cyt-c 在分钟内易于消化,以便在溶液中消化,而使用片上微反应器,消化可以在几秒钟内完成。 图5A 显示所得PMF光谱,其中分配11种胞外肽,对应于Cyt的氨基酸序列覆盖范围c 高达68%。值得注意的是,光谱的信噪比高,并且可以观察到来自酶自分析信号的干扰信号。所识别的片段列于补充表Si-2中。浓度连续降低,cyt- c 在0.5ng /μl时,也可以用八个肽和50%序列覆盖率阳性鉴定(图5B.)。这些结果表明,PDDA / AUNP组装微芯片在非常短的消化时间内每分析的痕量蛋白(约16个Fmol)的有效消化尤其优越。另一个例子是浓度为2ng /μl的肌蛋白。使用微芯片酶微反应器,可以鉴定六种肽,对应于38%氨基酸序列覆盖率(图5C.)。目前已经开发了几种技术来克服常规消化的局限性。例如,与LC-MS系统偶联,已制备酶柱反应器以进行在线彩易福彩鉴定。然而,很少有这些技术已经应用于复杂的样品。为了实现快速和高通量蛋白酶分析,已经提出了基于芯片的技术在生物学分析中。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5a,MALDI-TOF质谱摘要2ng /μlcyt-c. b,MALDI-TOF质谱摘要0.5ng /μlcyt-c. c,使用PDDA /金纳米粒子多层改性的微芯片反应器为2.0μL/ min的流速,MALDI-TOF的摘要2ng /μl肌蛋白的消化谱。洗脱液到矩阵比为1:1。标有峰值 星号 代表匹配的肽。

       消化小鼠巨噬细胞提取的彩易福彩 -

      所提出的消化方案有效地应用于真正的彩易福彩组分析。鉴定了从小鼠巨噬细胞中提取的彩易福彩。巨噬细胞在正常发展和生理学中发挥着重要作用以及许多疾病的发病机制(
      • 陈C.W.
      • Boylan M.T.
      • 埃文斯C.A.
      • Whetton A.D.
      • 赖特e.g.
      二维差异凝胶电泳在研究骨髓巨噬细胞及其体内反应对电离辐射的应用。
      )。在骨髓中,它们是干细胞利基的关键组分和控制干细胞生物学和血细胞产生的调节基质微环境。因此,对巨噬细胞生物学的理解对于了解正常和异常的血液血症是重要的。
      为了检查这种基于AUNP的微反应器的蛋白水解效率,对于真实的生物复杂性样品,我们将芯片上的蛋白水解曲线进行了比较 相对 溶液从小鼠巨噬细胞用水萃取的彩易福彩的消化。以100μl/ h的流速,在仅1分钟的孵育时间内在固定化的酶微芯片反应器中消化细胞提取物(2μg/μl),然后用145-培养的孵育时间在仅1分钟的培养时间内。 - SCX-RPLC-ESI-MS-MS分钟梯度洗脱以进一步分离和鉴定。为了比较,将与胰蛋白酶溶液中孵育相同的彩易福彩提取物6小时(酶与彩易福彩的比例为1:30),并且在如上所述的相同条件下分离消化。在补充 图Si-3,碱峰色谱图显示了片上消化产生的肽信号的更多肽信号(补充 图SI-3A)比溶液消化(补充 图Si-3b.)。使用MS / MS肽测序具有严格标准的彩易福彩鉴定,可以通过片上和溶液方向方案肯定地鉴定了总共149和162个彩易福彩。这些结果清楚地表明,这种在线微芯片消化与常规的溶液消化相当,但孵育时间大大缩短为1分钟,因此蛋白水解效率显着提高。
      此外,可以从尿素变性的小鼠巨噬细胞中分离更多的彩易福彩级分,这也可能去激活酶。为了测试尿素是否具有对微通道内的亚麻酶固定的酶的副作用,使用我们的方案消化尿素中提取的彩易福彩,然后对所得的消化进行SCX-RPLC-ESI-MS / MS分离系统。 Fig. 6 是片上消化协议的基本峰色谱图。根据上面的搜索标准,580个彩易福彩的评分是吉祥物产生的分数的阈值,作为个体彩易福彩得分>28表示身份或广泛的同源性(p <0.05)。为了进一步提高所识别的蛋白的可靠性,我们利用了反转的IPI鼠标3.07数据库来评估搜索结果(
      • Cargile B.J.
      • Bundy J.L.
      • Stephenson J.L.
      通过串联质谱法从大型数据库到误识别的潜力。
      ,
      • 摩尔里。
      • 年轻的M.K.
      • lee t.d.
      QScore:一种评估续集数据库搜索结果的算法。
      )。如补充图所示。SI-4,在反向数据库评估之后,信心 p < 0.05 and p <当它们的相应分数分别超过25和35时,将0.01分配给那些肽。因此,吉祥物生成的分数>28被认为是过滤器,仅使用对给定前体的顶部等级肽命中。匹配两种或多种这样的有效肽的彩易福彩被保留为验证的鉴定。值得注意的是99%(肽分数>35)当匹配一个单一肽匹配的彩易福彩超过28时,需要确保验证的鉴定。结果,确定了497个彩易福彩。例如, 图7A 是PGK 1蛋白的PMF光谱,和 图7B. 是相应的MS / MS谱 m/z 707.1;两者都显示出良好的信噪比。补充图。Si-5显示所识别的彩易福彩的分子量和等电点分布。这些结果表明,片上消化是可行的;消化时间减少,并且简化了操作程序,两者都可以赞成快速彩易福彩鉴定。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6用于分离小鼠巨噬蛋白消化的微芯片反应器孵育1分钟的基峰色谱图。 通过SCX-RPLC-MS / MS分析约10μg彩易福彩的摘要。样品用尿素在50米中从小鼠巨噬细胞中提取10μl彩易福彩混合物m Tris-HCl缓冲液(pH8.1)。有关详细的分离条件,请参阅“实验程序”。 CPS.,每秒计数。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7a,PGK 1蛋白的PMF光谱。 b,MS / MS谱的 m/z 707.1.
      除了较大的表面到体积比和较短的扩散时间之外,微通道装置表现出非常小的体积(约50nl / cm)和均匀的流动。增强的蛋白水解效率可能是由于微通道中的快速传输性能。在这项研究中,我们选择了巨噬细胞系AMJ2-C8,以证明PDDA / AUNP多层组装的微流体芯片在真实样品的消化中的可行性。将进一步研究从各种生物系统中分离的彩易福彩复合物混合物的分析。我们预计该微芯片消化系统将用于实时,大规模和高通量在线彩易福彩分析。此外,虽然在当前工作中仅示例了胰蛋白酶 - 固定的PET片上反应器系统,但是在其他微芯片器件中的这种AUNP修改协议的多功能应用是有前途的。

       结论-

      提出了一种敏感的彩易福彩鉴定的片上消化方案。在PET微流体芯片表面上构造的PDDA / AUNP多层组件提供了具有大表面积的生物相容性界面,这对于受控胰蛋白酶的吸附是期望的。由于微通道局限于狭窄的胰蛋白酶,在几秒钟内可以在微芯片反应器上迅速消化低水平的标准彩易福彩样品。此外,通过从小鼠巨噬细胞分离的实际彩易福彩混合物的消化说明了在线微芯片生物反应器的性能。通过二维HPLC和ESI-MS / MS的组合鉴定497蛋白。最突出的优点之一是酶涂覆的微芯片可能与LC-MS耦合以实现在线彩易福彩鉴定。因此,该方法在各种真实样品提取物的表征中是可行的。进一步研究与LC或脱凝胶技术联系的酶反应器,用于在线彩易福彩分离,消化和鉴定是在我们的实验室中进行的。

      致谢

      我们感谢B. SU博士为有用的讨论,V.致致博的技术帮助,以及D. Yun进行数据搜索。

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