定量彩易福彩组和磷脂蛋白酶体分析 链霉菌 coelicolor 揭示彩易福彩和磷蛋白调节分化和次生代谢*

  • Beatriz Rioseras.
    脚注
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    rea demicrobiología,Deparamento deBiologíaQuopna,Facultad de Medicina,奥维耶多,33006奥维耶多,西班牙;
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  • Pavel V. Shliaha.
    脚注
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    南丹麦大学生物分析科学生物化学与分子生物学与村村,校园55,DK-5230,丹麦欧登塞M
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  • Vladimir Gorshkov.
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    南丹麦大学生物分析科学生物化学与分子生物学与村村,校园55,DK-5230,丹麦欧登塞M
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  • PaulaYagüe.
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    rea demicrobiología,Deparamento deBiologíaQuopna,Facultad de Medicina,奥维耶多,33006奥维耶多,西班牙;
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  • MaríaT.López-garcía
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    rea demicrobiología,Deparamento deBiologíaQuopna,Facultad de Medicina,奥维耶多,33006奥维耶多,西班牙;
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  • Nathaly Gonzalez-Quiñonez
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    rea demicrobiología,Deparamento deBiologíaQuopna,Facultad de Medicina,奥维耶多,33006奥维耶多,西班牙;
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  • Sergey Kovalchuk.
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    南丹麦大学生物分析科学生物化学与分子生物学与村村,校园55,DK-5230,丹麦欧登塞M
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  • 阿德利娜罗沃德卡 - Wrzesinska
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    南丹麦大学生物分析科学生物化学与分子生物学与村村,校园55,DK-5230,丹麦欧登塞M
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  • OLE N. Jensen.
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    南丹麦大学生物分析科学生物化学与分子生物学与村村,校园55,DK-5230,丹麦欧登塞M
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  • 天使曼卡卡
    一致
    应如何解决谁:ÁreaDeMicrobiología,DeafologíaUcconionee iuopa,Facultad de Medicina,De Oviedo Univeryido,33006 Oviedo,西班牙
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    rea demicrobiología,Deparamento deBiologíaQuopna,Facultad de Medicina,奥维耶多,33006奥维耶多,西班牙;
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了欧洲研究委员会(ERC启动授予; Strp-Commationiation 280304)和西班牙语“Ministerio deCongondíay竞争对手”(Mineco; Bio2015-65709-R)支持。本研究中使用的质谱和彩易福彩组学基础设施由南丹麦大学生物分析科学大学的村庄中心提供,由村庄基金会(O.N.J)的慷慨补助得到支持。 P.S.由丹麦Lundbeck基金会的博士后团契得到支持。 Nathaly Gonzalez-Quiñonez由Severo Ochoa奖学金(斯蒂特,ConsejeríaDequadiónyCiencia,西班牙Asturias)提供资金。
    本文含有补充材料。
    ‖ 这些作者同等贡献这项工作。
    ** 这些作者同等贡献这项工作。
      链霉菌是多细胞细菌,具有复杂的发育循环。它们具有生物技术重要性,因为它们产生了生物医学中使用的大多数生物活性化合物,例如抗生素,抗肿瘤和免疫压缩机化合物。链霉菌基因组编码许多Ser / Thr / Tyr激酶,使该属成为研究细菌蛋白磷酸化事件的优异模型。我们利用基于质量光谱法的定量彩易福彩组学和磷蛋白蛋白酶来表征细菌分化和激活次生代谢链霉菌 coelicolor。我们鉴定并定量了3461个彩易福彩,相当于44.3%的彩易福彩S. Coelicolor蛋彩易福彩组跨三个发育阶段:植物菌株(第一次菌丝);二次代谢产物生产菌丝(第二菌丝体);和孢子菌丝。在细菌分化过程中,总共1350个彩易福彩表现出超过2倍的表达变化。这些彩易福彩包括136调节剂(转录调节剂,换能器,Ser / Thr / Tyr激酶,信号蛋白)以及542个彩易福彩,没有明确同源性的已知彩易福彩,其可能在分化和次生代谢中起作用。磷彩易福彩显示出85个独特的彩易福彩磷酸化位点,其中58位在分化期间差异磷酸化。计算分析表明,这些调节的彩易福彩磷酸化事件涉及重要的细胞过程,包括细胞分裂,分化,次级代谢调节,转录,彩易福彩合成,彩易福彩折叠和应激反应。我们在关键细菌细胞分裂蛋白FTSZ(PSER319)中发现了一种新型磷酸化位点,其调节孢子率和调节Actinorhodin抗生素生产。我们得出结论,不同彩易福彩磷酸化事件的操纵可以改善工业链霉菌中的次生代谢产物产生,包括在筛选中筛选来自链霉菌的新次生代谢物过程中的隐秘途径的激活。
      链霉菌 is a genus of Gram-positive soil bacterium of great importance for biotechnology given their ability to produce a large array of bioactive compounds, including antibiotics, anticancer agents, immunosuppressants and industrial enzymes (
      • 霍普伍德D.A.
      )。 链霉菌 具有复杂的形态发生,调节次生新陈代谢(
      • 瑞利人B.
      • Lopez-Garcia M.T.
      • YAGUE P.
      • 桑切斯J.
      • Manteca A.
      Mycelium differentiation and development of Streptomyces Coelicolor in lab-scale bioreactors: 编程细胞死亡, differentiation, and lysis are closely linked to undecylprodigiosin and actinorhodin production.
      )。孢子萌发后,一个完全划分的菌丝体(第一菌菌丝体,MI)
      使用的缩写是:
      MI.
      第一个菌丝体
      MI.I.
      第二毫菌
      PCD.
      编程细胞死亡
      LC / MS / MS
      液相色谱 - 质谱 - 质谱法
      CPP.
      磷酸钙降水量
      TMT.
      串联质量标签。
      1使用的缩写是:MI.
      第一个菌丝体
      MI.I.
      第二毫菌
      PCD.
      编程细胞死亡
      LC / MS / MS
      液相色谱 - 质谱 - 质谱法
      CPP.
      磷酸钙降水量
      TMT.
      串联质量标签。
      发起发展(
      • YAGUE P.
      • Willemse J.
      • koning r.i.
      • 瑞利人B.
      • Lopez-Garcia M.T.
      • gonzalez-quinonez n。
      • Lopez-iglesias C.
      • Shliaha P.V.
      • Rogowska-wrzesinska A.
      • Koster A.J.
      • Jensen O.N.
      • 范威尔G.P.
      • Manteca A.
      杂交菌丝早期生长期间跨膜的子组分化。
      )直到它经过有序编程的细胞死亡(PCD)(
      • Manteca A.
      • Fernandez M.
      • 桑切斯J.
      抗生素表面培养中早期细胞拆解事件的细胞学和生化证据。
      )与第二种多核菌丝体(底物菌丝体,早期的第二菌丝菌丝,MII)分化,其激活二次代谢(
      • 瑞利人B.
      • Lopez-Garcia M.T.
      • YAGUE P.
      • 桑切斯J.
      • Manteca A.
      Mycelium differentiation and development of Streptomyces Coelicolor in lab-scale bioreactors: 编程细胞死亡, differentiation, and lysis are closely linked to undecylprodigiosin and actinorhodin production.
      )在开始表达编码构成生长所需的疏水涂层的彩易福彩中的螯合素和罗林林基因进入空气(空中菌丝体;晚期MII)(
      • YAGUE P.
      • Lopez-Garcia M.T.
      • 瑞利人B.
      • 桑切斯J.
      • Manteca A.
      链霉菌的孢子化阶段分化:最先进的和未来的观点。
      )。在循环结束时,存在悬垂荚膜和孢子(
      • Jakimowicz D.
      • 范威尔G.P.
      细胞分裂和DNA偏析在链霉菌中:如何在不知名的地方建立隔膜?
      )。
      丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸的可逆彩易福彩磷酸化是一种众所周知的动态转化后改性,具有令人惊叹的调节和真核生物的信号潜力(
      • Pawson T.
      • 斯科特J.D.
      信号传导50岁和计数中的彩易福彩磷酸化。
      )。相比之下,细菌中Ser / Thr / Tyr蛋白磷酸化的程度和生物学功能定义差。细菌中的磷酸化显着低于真核生物,使细菌磷彩易福彩组织攻击。已经报道了几种大规模的Ser / Thr / Tyr磷脂蛋白酶研究(
      • Aivaliotis M.
      • MACEK B.
      • GNAD F.
      • 重新躲成P.
      • Oesterhelt D.
      Ser / Thr / Tyr彩易福彩磷酸化在喀藻藻渣中 - 植物第三领域的代表。
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      • 白X.
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      磷肝蛋白蛋白酶研究溶剂酸梭菌乙酰丁基酯。
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      • Basell K.
      • 奥托阿。
      • 炼林
      • Zuhlke D.
      • rappen g.m.
      • 施密特S.
      • Hentschker C.
      • MACEK B.
      • ohlsen K.
      • Hecker M.
      • BECHER D.
      金黄色葡萄球菌中磷酸磷彩易福彩及其生理动态。
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      • GE R.
      • 太阳X.
      • 肖C.
      • 尹X.
      • 山W.
      • 陈祖
      • 他Q.Y.
      致病细菌幽门螺杆菌的磷脂蛋白酶组分析显示酪氨酸磷酸化和倍增磷酸化蛋白的过度表示。
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      • 胡人。
      • 林M.H.
      • 黄鹤。
      • Ku W.C.
      • yi t.h.
      • Tsai c.f.
      • 陈Y.J.
      • Sugiyama N.
      • Ishihama Y.
      • 胡安H.F.
      • 吴S.H.
      淡盆地磷蛋白蛋白酶分析Palustris揭示了丙酮酸磷酸磷酸磷酸酯磷酸酶磷酸化在脂质生产中的作用。
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      • 林M.H.
      • hsu t.l.
      • 林S.Y.
      • 潘y.j.
      • Jan J.T.
      • 王J.T.
      • Khoo K.H.
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      Klebsiella Pneumoniae NTUH-K2044的磷脂蛋白酶揭示酪氨酸磷酸化和毒力之间的紧密联系。
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      • 奥尔森J.V.
      • Mijakovic I.
      大肠杆菌的磷脂体分析显示了细菌Ser / Thr / Tyr / Tyr磷酸化的进化状态。
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      • MACEK B.
      • Mijakovic I.
      • 奥尔森J.V.
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      • Jensen P.R.
      模型芽孢杆菌枯草芽孢杆菌的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷脂体。
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      • Manteca A.
      • 烨j。
      • 桑切斯J.
      • Jensen O.N.
      链霉菌的磷脂蛋白酶体分析揭示了伴随细菌分化的广泛彩易福彩磷酸化。
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      • 米克拉斯。
      • Milohanic E.
      • 艾克F.
      • Mijakovic I.
      • 德意志J.
      • Monnet V.
      • 亨利C.
      丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸磷蛋白酶的分析揭示了与毒力有关的磷酸化彩易福彩。
      ,
      • 帕克J.L.
      • 琼斯上午
      • Serazetdinova L.
      • Saalbach G.
      • BIBB M.J.
      • Naldrett M.J.
      Analysis of the phosphoproteome of the multicellular bacterium Streptomyces Coelicolor A3(2) by protein/peptide fractionation, phosphopeptide enrichment and high-accuracy mass spectrometry.
      ,
      • 策略S.
      • Dankwa S.
      • 施瓦茨D.
      • Chou m.f.
      • locasale J.W.
      • 康下午
      • Bemis G.
      • 教堂。
      • 斯丁H.
      • Husson R.N.
      通过结核分枝杆菌丝氨酸丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶具有重叠特异性的广泛磷酸化。
      ,
      • Ravichandran A.
      • Sugiyama N.
      • Tomita M.
      • 催力乳汁
      • Ishihama Y.
      致病性和非致病性假单胞菌种类的SER / THR / TYR磷脂蛋白酶体。
      ,
      • 飙升.C.
      • 吐满
      • Mendez J.A.
      • naketi k。
      • 阿兰达J.
      • Bou G.
      血管杆菌的SER / THR / TYR磷脂蛋白酶组特征:参考菌株与高侵入性多药抗性临床分离的比较。
      ,
      • Soufi B.
      • GNAD F.
      • Jensen P.R.
      • Petranovic D.
      • Mijakovic I.
      • MACEK B.
      乳球菌乳酸酐IL1403的Ser / Thr / Tyr磷脂体揭示了乘法磷酸化蛋白。
      ,
      • 太阳X.
      • GE F.
      • 小C.L.
      • yin x.f.
      • GE R.
      • 张L.H.
      • 他Q.Y.
      磷蛋白酶分析揭示了磷酸化在致病性细菌中肺炎链球菌中的多种作用。
      ,
      • Takahata Y.
      • in
      • 金库克。
      • IIO Y.
      • Miyamoto M.
      • Masui R.
      • Ishihama Y.
      • Kuramitsu S.
      近距离磷酸磷酸磷酸酯在极端嗜热热嗜热素HB8中的配体附近。
      )(总结在 表I.),在大多数情况下,在营养生长期间获得的大量彩易福彩(毫克)以检测相对较低的磷酸肽(表I.)。这禁止应用等异质标记定量策略,因为标记如此大量的肽是非常昂贵的。这使得定量磷蛋白酶更加困难和我们的知识,只有六种量化的磷蛋白酶研究报告了细菌。一些研究用稳定同位素标记细胞培养氨基酸(Silac)(
      • 飙升.C.
      • 吐满
      • 克鲁格克。
      • MACEK B.
      大肠杆菌彩易福彩组和磷脂蛋白在最小培养基生长过程中的全局动态。
      ,
      • Ravikumar V.
      • Shi L.
      • 克鲁格克。
      • 德鲁奇阿。
      • 塞尔C.
      • 表弟C.
      • Kobir A.
      • Mijakovic I.
      • MACEK B.
      枯草芽孢杆菌的定量磷脂蛋白酶体分析揭示了激酶PRKC和磷酸酶PRPC的新型基材。
      ,
      • 米克拉斯。
      • Moussan Desiree Ake F.
      • 吴Z.
      • Milohanic E.
      • Cao T.N.
      • 哥萨尔P.
      • 德意志J.
      • Monnet V.
      • Archambaud C.
      • 亨利C.
      定量彩易福彩组分析鉴定李斯特菌单核细胞增生中的PRFA响应蛋白和磷蛋白。
      ),其他人使用预定的反应监测分析(
      • Licona-Cassani C.
      • LIM S.
      • Marcellin E.
      • Nielsen L.K.
      Saccharopopypora胺磷蛋白酶组的时间动态。
      ,
      • LIM S.
      • Marcellin E.
      • 雅各布S.
      • Nielsen L.K.
      改变培养条件下中央碳代谢中大肠杆菌磷酸磷蛋白酶的全局动态。
      )我们进行了磷酸肽分析(无标记)定量彩易福彩组学研究(
      • Manteca A.
      • 烨j。
      • 桑切斯J.
      • Jensen O.N.
      链霉菌的磷脂蛋白酶体分析揭示了伴随细菌分化的广泛彩易福彩磷酸化。
      ) (看 表I.)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4彩易福彩与二次新陈代谢,空中菌丝形成,孢子,细胞分裂和细胞过程调节有关的彩易福彩(TMT MII / MI的对数)(转录调节剂,转换器SER / THR / TYR激酶和信号传导蛋白)。 参与合成特异性次生代谢物的彩易福彩,分类为次生代谢组,即使它们适用于附加类别;参与细胞分裂调节的彩易福彩,包括在细胞分裂中(参见方法)。 A,热图概述了相对于MI的MII级具有显着变化的彩易福彩的TMT丰度。星号表示少数彩易福彩显示出在MII( IE。 upregulated at MII30h 并在mii下调65h 或相反亦然)。 B,文本中描述的关键彩易福彩的TMT丰富。丰富具有显着差异(Q值<0.01)并在除细胞分裂蛋白外,在MII阶段中的至少一个中通过了2倍阈值,其中还显示了低于2倍阈值的彩易福彩,但显示出显着差异。标号表示SCO号码。虚线表示2倍阈值。 “k”表示Ser / Thr / Tyr激酶。
      表I.磷酸磷蛋白酶与其他公开的原核和人磷蛋白蛋白酶的比较。定量磷蛋白酶研究由星号表示。 N.R.没有报道
      细菌彩易福彩(mg)
      a 表明了用于所有MS / MS或2D凝胶实验的彩易福彩的总量。
      磷彩易福彩磷肽磷酸化位点参考
      克+
          S. Coelicolor0.1489285这项工作
          S. Coelicolor0.3127260289(
      • Manteca A.
      • 烨j。
      • 桑切斯J.
      • Jensen O.N.
      链霉菌的磷脂蛋白酶体分析揭示了伴随细菌分化的广泛彩易福彩磷酸化。
      )*
          S. Coelicolor50404446(
      • 帕克J.L.
      • 琼斯上午
      • Serazetdinova L.
      • Saalbach G.
      • BIBB M.J.
      • Naldrett M.J.
      Analysis of the phosphoproteome of the multicellular bacterium Streptomyces Coelicolor A3(2) by protein/peptide fractionation, phosphopeptide enrichment and high-accuracy mass spectrometry.
      )
          S. erythraea.1088109N.R.(
      • Licona-Cassani C.
      • LIM S.
      • Marcellin E.
      • Nielsen L.K.
      Saccharopopypora胺磷蛋白酶组的时间动态。
      )*
          B.枯草芽孢杆菌107810378(
      • MACEK B.
      • Mijakovic I.
      • 奥尔森J.V.
      • GNAD F.
      • Kumar C.
      • Jensen P.R.
      模型芽孢杆菌枯草芽孢杆菌的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷脂体。
      )
          B.枯草芽孢杆菌12139177144(
      • 米兰尼L.
      • Petrillo M.
      • 套子L.
      • Boccia A.
      • d'agostino n。
      • Passamano M.
      • di nardo s。
      • Tasco G.
      • Casadio R.
      • Paolella G.
      人类激酶基因的系统分析:大量基因和替代剪接事件导致功能性和结构多样性。
      )*
          C.乙酰丁基26182107(
      • 白X.
      • 姬Z.
      磷肝蛋白蛋白酶研究溶剂酸梭菌乙酰丁基酯。
      )
          L. Lacis.206310279(
      • Soufi B.
      • GNAD F.
      • Jensen P.R.
      • Petranovic D.
      • Mijakovic I.
      • MACEK B.
      乳球菌乳酸酐IL1403的Ser / Thr / Tyr磷脂体揭示了乘法磷酸化蛋白。
      )
          玉米菌菌N.R.301380500(
      • 策略S.
      • Dankwa S.
      • 施瓦茨D.
      • Chou m.f.
      • locasale J.W.
      • 康下午
      • Bemis G.
      • 教堂。
      • 斯丁H.
      • Husson R.N.
      通过结核分枝杆菌丝氨酸丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶具有重叠特异性的广泛磷酸化。
      )
          S.肺炎184102163(
      • 太阳X.
      • GE F.
      • 小C.L.
      • yin x.f.
      • GE R.
      • 张L.H.
      • 他Q.Y.
      磷蛋白酶分析揭示了磷酸化在致病性细菌中肺炎链球菌中的多种作用。
      )
          L.单核细胞增生10112155143(
      • 米克拉斯。
      • Milohanic E.
      • 艾克F.
      • Mijakovic I.
      • 德意志J.
      • Monnet V.
      • 亨利C.
      丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸磷蛋白酶的分析揭示了与毒力有关的磷酸化彩易福彩。
      )
          L.单核细胞增生8191256242(
      • 米克拉斯。
      • Moussan Desiree Ake F.
      • 吴Z.
      • Milohanic E.
      • Cao T.N.
      • 哥萨尔P.
      • 德意志J.
      • Monnet V.
      • Archambaud C.
      • 亨利C.
      定量彩易福彩组分析鉴定李斯特菌单核细胞增生中的PRFA响应蛋白和磷蛋白。
      )*
          S.金黄色葡萄球菌50108N.R.76(
      • Basell K.
      • 奥托阿。
      • 炼林
      • Zuhlke D.
      • rappen g.m.
      • 施密特S.
      • Hentschker C.
      • MACEK B.
      • ohlsen K.
      • Hecker M.
      • BECHER D.
      金黄色葡萄球菌中磷酸磷彩易福彩及其生理动态。
      )
      克 -
          大肠杆菌207910581(
      • MACEK B.
      • GNAD F.
      • Soufi B.
      • Kumar C.
      • 奥尔森J.V.
      • Mijakovic I.
      大肠杆菌的磷脂体分析显示了细菌Ser / Thr / Tyr / Tyr磷酸化的进化状态。
      )
          K.肺炎308111793(
      • 林M.H.
      • hsu t.l.
      • 林S.Y.
      • 潘y.j.
      • Jan J.T.
      • 王J.T.
      • Khoo K.H.
      • 吴S.H.
      Klebsiella Pneumoniae NTUH-K2044的磷脂蛋白酶揭示酪氨酸磷酸化和毒力之间的紧密联系。
      )
          P.铜绿假单胞菌1.2395761(
      • Ravichandran A.
      • Sugiyama N.
      • Tomita M.
      • 催力乳汁
      • Ishihama Y.
      致病性和非致病性假单胞菌种类的SER / THR / TYR磷脂蛋白酶体。
      )
          P. Pivida.1.2595655(
      • Ravichandran A.
      • Sugiyama N.
      • Tomita M.
      • 催力乳汁
      • Ishihama Y.
      致病性和非致病性假单胞菌种类的SER / THR / TYR磷脂蛋白酶体。
      )
          H. Pylori.N.R.6782126(
      • GE R.
      • 太阳X.
      • 肖C.
      • 尹X.
      • 山W.
      • 陈祖
      • 他Q.Y.
      致病细菌幽门螺杆菌的磷脂蛋白酶组分析显示酪氨酸磷酸化和倍增磷酸化蛋白的过度表示。
      )
          R. Palustris(Ch)25410063(
      • 胡人。
      • 林M.H.
      • 黄鹤。
      • Ku W.C.
      • yi t.h.
      • Tsai c.f.
      • 陈Y.J.
      • Sugiyama N.
      • Ishihama Y.
      • 胡安H.F.
      • 吴S.H.
      淡盆地磷蛋白蛋白酶分析Palustris揭示了丙酮酸磷酸磷酸磷酸酯磷酸酶磷酸化在脂质生产中的作用。
      )
          R. Palustris(pH)2427459(
      • 胡人。
      • 林M.H.
      • 黄鹤。
      • Ku W.C.
      • yi t.h.
      • Tsai c.f.
      • 陈Y.J.
      • Sugiyama N.
      • Ishihama Y.
      • 胡安H.F.
      • 吴S.H.
      淡盆地磷蛋白蛋白酶分析Palustris揭示了丙酮酸磷酸磷酸磷酸酯磷酸酶磷酸化在脂质生产中的作用。
      )
          T. Hotherophilus.100485246(
      • Takahata Y.
      • in
      • 金库克。
      • IIO Y.
      • Miyamoto M.
      • Masui R.
      • Ishihama Y.
      • Kuramitsu S.
      近距离磷酸磷酸磷酸酯在极端嗜热热嗜热素HB8中的配体附近。
      )
          大肠杆菌9.8133N.R.108(
      • 飙升.C.
      • 吐满
      • 克鲁格克。
      • MACEK B.
      大肠杆菌彩易福彩组和磷脂蛋白在最小培养基生长过程中的全局动态。
      )*
          大肠杆菌10N.R.34N.R.(
      • LIM S.
      • Marcellin E.
      • 雅各布S.
      • Nielsen L.K.
      改变培养条件下中央碳代谢中大肠杆菌磷酸磷蛋白酶的全局动态。
      )*
          A. Baumanii. Abh12O-A2970N.R.80(
      • 飙升.C.
      • 吐满
      • Mendez J.A.
      • naketi k。
      • 阿兰达J.
      • Bou G.
      血管杆菌的SER / THR / TYR磷脂蛋白酶组特征:参考菌株与高侵入性多药抗性临床分离的比较。
      )
          A. Baumanii. ATCC 17879941N.R.48(
      • 飙升.C.
      • 吐满
      • Mendez J.A.
      • naketi k。
      • 阿兰达J.
      • Bou G.
      血管杆菌的SER / THR / TYR磷脂蛋白酶组特征:参考菌株与高侵入性多药抗性临床分离的比较。
      )
      archaea.
          H. salinarum.20264231(
      • Aivaliotis M.
      • MACEK B.
      • GNAD F.
      • 重新躲成P.
      • Oesterhelt D.
      Ser / Thr / Tyr彩易福彩磷酸化在喀藻藻渣中 - 植物第三领域的代表。
      )
      Eukarya.
          H. Sapiens.67832>5000038229(108)
      a 表明了用于所有MS / MS或2D凝胶实验的彩易福彩的总量。
      链霉菌 coelicolor, 该模型 链霉菌 strain (
      • kieser t.
      • BIBB M.J.
      • Buttner M.J.
      • Cheter K.F.
      • 霍普伍德D.A.
      ),具有47个预测的真核状蛋白激酶,其数量来自其他良好特征细菌的基因组的两倍,包括 大肠杆菌B.枯草芽孢杆菌,但比人类细胞少10倍(
      • 米兰尼L.
      • Petrillo M.
      • 套子L.
      • Boccia A.
      • d'agostino n。
      • Passamano M.
      • di nardo s。
      • Tasco G.
      • Casadio R.
      • Paolella G.
      人类激酶基因的系统分析:大量基因和替代剪接事件导致功能性和结构多样性。
      )。 S. Coelicolor 构成研究细菌Ser / Thr / Tyr磷酸化的突出模型(
      • Manteca A.
      • 烨j。
      • 桑切斯J.
      • Jensen O.N.
      链霉菌的磷脂蛋白酶体分析揭示了伴随细菌分化的广泛彩易福彩磷酸化。
      )。这 S. Coelicolor 预测染色体以编码30个次级代谢物生物合成途径,其中14个尚未经过实验观察(隐秘途径)(
      • Nett M.
      • Ikeda H.
      • 摩尔•B.S.
      天然产物生物合成多样性的基因组基础。
      )。这些次级代谢物都没有临床应用,但是 S. Coelicolor 仍然是寻找链霉菌的保守型磷酸二级代谢调节剂的最佳模型之一。
      在这里,我们调查了动态调节 S. Coelicolor 在固体孢子培养物中分化的彩易福彩组和磷蛋白酶在三个发育时间点,16-,30-和65小时,分别对应于植物菌丝(MI),抗生素产生菌丝(MII)和孢子花束菌丝。本研究报告了第一类石炭标记标记定量磷蛋白酶研究,以鉴定含有次级代谢和分化的SER / THR / TYR磷酸化 链霉菌。许多彩易福彩和磷酸化位点在营养培养物(MI)和次级代谢物中差异调节,产生菌丝体(MII)是无关的,但保守 链霉菌 属。它们是次生新陈代谢和分化的潜在调节剂。编码这些生物分子的基因的遗传操纵可以改善链霉菌中的生物活性化合物产生。

      实验步骤

       细菌菌株和媒体

      S. Coelicolor 本研究使用M145菌株(
      • kieser t.
      • BIBB M.J.
      • Buttner M.J.
      • Cheter K.F.
      • 霍普伍德D.A.
      )。用25ml固体健身房培养基(葡萄糖,酵母/麦芽提取物)(85mm)在培养皿(直径为85毫米)中生长固体培养物(
      • Novella I.S.
      • 倒钩C.
      • 桑切斯J.
      浸没培养中链霉菌抗生素ETHZ 7451的孢子素。
      用玻璃烷盘覆盖,用100μl孢子悬浮液接种(1×107 可行的孢子/ ml)并在30℃温育。 FTSZ. 突变体在固体SFM和mm(补充甘露醇)培养基(
      • kieser t.
      • BIBB M.J.
      • Buttner M.J.
      • Cheter K.F.
      • 霍普伍德D.A.
      )。液体培养物在无蔗糖-R5A中进行(
      • Fernandez E.
      • Weissbach U.
      • 桑切斯雷略C.
      • BRANA A.F.
      • Mendez C.
      • rohr J.
      • 萨拉斯J.A.
      从抗肿瘤药物Mithramcin的生物合成期间,鉴定编码参与二糖的转移的糖基转移酶的链霉菌胺的两种基因。
      )在100ml烧瓶中,含有20ml培养基,在200 rpm和30℃)。

       实验设计与统计理由

      分析了三个关键发育阶段:植物菌株(MI16h),二次代谢物生产菌丝(MII30h)和孢子菌丝(mii65h)(Fig. 1)。通过使用4:3:3的生物重复通过TMT-10-Plex进行定量彩易福彩组学和磷蛋白酶。16h,mii.30h和mii.65h respectively (Fig. 1)。在FTSZ突变体的情况下,在93小时内从蔗糖的R5A液体培养物中收集样品,使用最大表型差异(参见结果)和TMT-11-PLEX之前的发育时间点(4:3: 4来自Ser-Ser,Glu-Glu和Ala-Ala FTSZ等位基因的生物学复制)。如下所述,如果在不同的发育阶段(Q值小于0.01)之间通过差异表达测试,则丰度变化是统计学意义的。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1样品制备。 S. Coelicolor 用Syto 9染色的菌丝染色,在舱室化的Mi(16h),多核底物菌丝体(16小时)(MII)下观察在共聚焦显微镜下观察到的碘化丙锭30h)和孢子花束菌丝体(mii65h)显示阶段(上面板)。概述了TMT标记和磷肽富集工作流程。

       在整个分化周期中的分枝细胞的取样

      菌丝草坪 S. Coelicolor 在不同的时间点(16-,30-和65-H; MI,MII和孢子测量MII)上刮掉玻璃纸盘上生长的M145刮掉Fig. 1)使用普通的刮刀。在FTSZ突变体的情况下,通过以20,000×离心在93小时内从蔗糖的R5A液体培养物中收集样品 g 5分钟。将样品重新悬浮在2%SDS中,50米m pH 7 Tris-HCl, 150 mm NaCl, 10 mm MgCl2, 1 mm EDTA, 7 mm β-巯基乙醇,来自罗氏(巴塞尔,瑞士)和1%磷酸酶抑制剂混合物1和2(Sigma-Aldrich,San Luis,Mi)的EDTA的蛋白酶抑制剂混合片,并通过沸腾10分钟裂解;通过超声处理(MSE SONIPREP 150,在冰上的四个周期为10次)的样品粘度降低;在20,000×以20,000×离心后丢弃细胞碎片 g 10分钟;用丙酮/乙醇沉淀清洁样品(样品/ EtOH /丙酮1:4:4 [v / v / v]过夜,在-20℃下用EtOH /丙酮/ H洗涤2o 2:2:1 [v / v / v]);重新悬浮在水中;透析大量水(4°C,4℃,四个水变化);如前所述量化(
      • 布拉德福德M.M.
      利用彩易福彩染料结合原理定量微克数量彩易福彩的快速敏感方法。
      );在100μg等分试样中冻干;并储存在-80°C。

       彩易福彩消化

      将冻干彩易福彩溶于8 m urea in 100 mm 茶布缓冲。使用双子胆酸测定法测量彩易福彩浓度,并每毫升调节至2mg彩易福彩。用5米降低样品m 在室温下DTT 1小时; S-烷基化15米m 碘乙酰胺(黑暗中的室温15-30分钟);通过加入高达15米的DTT终止烷基化反应m;使用组合的胰蛋白酶/溶血性消化方案来消化300μg彩易福彩(
      • 格拉特T.
      • Ludwig C.
      • Ahrne E.
      • Aeberberold R.
      • Heck A.J.
      • 施密特A.
      不同溶液彩易福彩消化方案的大规模定量评估揭示了胰蛋白酶消化的串联Lys-C /胰蛋白酶蛋白溶剂的优异裂解效率。
      );使用Oasis HLB反向相柱(水,Milford,MA)脱盐样品。

       TMT.标签

      使用TMT-10-PLEX或TMT-11-POX试剂(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)标记样品。在生物三份分析30-和65h样品,并在全份数中分析16小时样品。分析来自含FTSZ SER-SER(野生型)和ALA-ALA等位基因的菌株的样品,而来自宿株的样品含有三份的FTSZ glu-glu等位基因。通过氨基酸分析量化肽浓度(
      • HOJRUP P.
      氨基酸分析分析肽和缀合物。
      )。对于每个条件,在制造商的方案之后,用0.5mg TMT-10-Plex试剂标记60μg肽。然后组合样品(Fig. 1)。

       磷脂

      使用如前所述的磷酸钙沉淀(CPP)预富集磷肽(
      • Manteca A.
      • 烨j。
      • 桑切斯J.
      • Jensen O.N.
      链霉菌的磷脂蛋白酶体分析揭示了伴随细菌分化的广泛彩易福彩磷酸化。
      ,
      • 张X.
      • 烨j。
      • Jensen O.N.
      • Roepstorff P.
      通过磷酸钙沉淀的高效磷酸富集,结合随后的IMAC富集。
      )。在TiO 2浓缩之前,使用CPP和使用反相色谱(Poros R3树脂)脱沉沉淀出一百微克标记肽。
      • Manteca A.
      • 烨j。
      • 桑切斯J.
      • Jensen O.N.
      链霉菌的磷脂蛋白酶体分析揭示了伴随细菌分化的广泛彩易福彩磷酸化。
      )(Fig. 1)。 TiO之间的最佳比例2 使用100μg标记的肽(CPP富集在CPP之前)和不同量的TIO进行测试珠粒和肽2 珠子。获得含有48±1.8%磷酸肽鉴定的富集样品的最佳磷酸富集效率,得到0.15mg TiO2 每100μg标记肽样品的每100μg珠子珠子, 相对 26±2.3%和20±2.6%,获得0.6和1.2 mg TiO2 TMT标记肽的珠子。

       LC-MS / MS分析彩易福彩组和磷脂蛋白酶体动态

      通过亲水性相互作用液相色谱(HILIC)分馏50微克标记的肽以产生12个级分。通过LC-MS / MS在Easylc系统Thermo Fisher Scientific上分析了每个级分,耦合到Orbitrap-Fusion-Lumos。 LC含水流动相含有0.1%(v / v)甲酸在水中,有机流动相含有0.1%(v / v)甲酸,以95%(v / v)乙腈。在注射之前,分别用15和3.5μL缓冲液A预平衡捕集器和分析柱。将样品注入定制的3厘米陷阱柱(100μmm 内径二氧化硅管填充Reprosil 120 C18 5-μm 用18μl缓冲液A脱落颗粒和脱盐。在自制的20厘米柱上进行分离(75-μm 内径二氧化硅管填充Reprosil 120 C18 3-μm 颗粒)在250nl min-1处用拉动的发射器。对于总彩易福彩组分析,在3分钟内用1至8%梯度进行分离,8至28%超过80分钟,超过10分钟,超过40%至100%超过5分钟,然后将柱保持在100 %缓冲b 8分钟。对于磷酸肽分析,用1至34%的缓冲液B分离肽,超过60分钟,34-100%超过5分钟,然后将塔保持在100%8分钟。
      在依赖于数据依赖性模式下分析洗脱的肽在横侧融合质谱仪上。在400-1600质量范围的侧面分析仪上获得MS1光谱,其120,000分辨率,AGC靶为5E5(最大喷射时间60ms)。对于MS2扫描,使用1.2-DA隔离窗口与四极孔分离肽,并以40%的常规碰撞能量分割。 AGC设置为5E4(最大喷射时间120 ms)和动态排除为20秒。
      通过Proteomexchange获得原始数据(http://www.proteomexchange.org/)标识符PXD005558。

       LC-MS / S. coelicolor FTSZ突变体的MS

      将50μg的TMT标记的肽通过高pH LC分馏成30分。使用Dionex Ultimate 3000系统(Thermo Fisher Scientific)通过互相连接到Thermo Orbitap Fusion Lumos电喷雾电离(ESI)串联质谱仪的LC-MS / MS分析每个级分。 LC流动相含有0.1%(V / v)甲酸在100%(v / v)乙腈(B)中的水(a)和0.1%(v / v)甲酸中。将样品注入商业陷阱柱(300μm ×5mm C18 Pepmap 100)和用18μl溶剂A脱盐。在自制的50cm柱上在1.1μl/ min下进行分离(150μmm 内径二氧化硅管填充inertsil C18 1.9-μm 颗粒)在35°C时,配备10μm Pepsep的ID发射器(PSFSE10)。梯度在1分钟内从2-10%的B次运行,2分钟内的10%至12%,44分钟的12至28%,从28%至35%,在3分钟内为35至47%。然后用95%B洗涤柱3分钟。
      LUMOS MS仪器在数据相关的MS / MS模式下使用推荐的SPS分析进行操作。使用orbitrap质量分析仪获取MS1谱 m/z 375-1500在质量分辨率120,000,AGC目标为4E5(最大注射时间50ms)。对于MS2扫描,使用0.7DA隔离窗口与四极孔分离肽,以35%的标准化碰撞能量碎片。在涡轮模式下在离子阱中收集质心谱。对于MS3扫描,在2DA隔离窗口中选择10个凹口,并在65nce下以65nce碎片,并在质量分辨率下检测到报告离子。 m/z 100–500 range.
      通过Proteomexchange获得原始数据(http://www.proteomexchange.org/)标识符PXD005558。

       数据分析

      在彩易福彩组发现者2.1软件中分析了数据。使用Mascot 2.3.2使用数据库搜索 链霉菌 coelicolor Uniprot数据库(在2015年6月3日检索,8038条目)。将甲硫氨酸氧化设定为可变改性,而Cys氨基甲酰基甲基化,TMT6PLEX(K)和TMT6PLEX(N-术语)被指定为固定修改。允许最多两种胰蛋白酶错过了切割。前体和片段质量公差分别为10ppm和0.02Da。来自MaxQuant网站的污染物(未检索到2015年5月)从最终分析中排除在外。通过吉祥物渗滤器验证肽,具有0.01后误差概率(PEP)阈值。对于磷肽分析,使用PTMRS算法验证磷酸化位置。肽评分,前体电荷,肽M / Z,PTMRS分数,所有磷酸肽的注释质量标记的光谱和其他细节可通过ProteomeXchange获得(http://www.proteomexchange.org/)标识符PXD005558。肽光谱匹配,每种彩易福彩和彩易福彩覆盖的肽 补充表S1。对于磷酸肽,我们向最高自信的PSM报告的费用,M / Z和吉祥物得分(显示我们数据集中最高的吉祥物评分) 补充表S2。由于定量数据中的噪声水平高,肽光谱与总总和记者强度的匹配率小于4E5的总和。将肽光谱匹配的定量结果转化为肽水平定量,这反过来使用R脚本转化为彩易福彩定量(
      • Polpitiya A.D.
      • 钱W.J.
      • jaitly n ..
      • petyuk v.a.
      • Adkins J.N.
      • 营2nd,D.G.
      • 安德森G.A.
      • 史密斯r.d.
      DANTE:用于测量 - 用于对 - 中型数据的定量分析的统计工具。
      )。仅考虑具有两种或更多种量化肽的彩易福彩。使用具有欧几里德距离矩阵的模糊C均值算法聚集具有相似时间丰度型材的彩易福彩(
      • Schwammle V.
      • Jensen O.N.
      一种简单而快速的方法,可以确定模糊C均值集群分析的参数。
      )。
      彩易福彩和磷酸肽对生殖阶段(MII)的丰富对营养阶段(MI)标准化。使用来自三个或四个生物重复的平均TMT丰度估计与MI相比的MII阶段(30-和65-h)的折叠变化。使用R中的Limma包分析对差异表达进行丰富(
      • 里奇M.E.
      • Phipson B.
      • 吴D.
      • 胡Y.
      • 法律C.W.
      • 施W.
      • Smyth G.K.
      LiMMA为RNA测序和微阵列研究进行差异表达分析。
      )。 p 使用R统计包进行调整差异表达的值。磷酸肽丰度进一步归一化,抵抗非磷酸化蛋白的丰度。与MI相比,三千和八十三蛋白至少表现出显着的表达变化(Q值小于0.01)(补充表S1); 78磷肽通过丰度表达试验(Q值<0.01)至少在与MI相比分析的MII级(补充表S2)。

       彩易福彩功能分析

      根据基因库数据库,出版物和同源性/功能,彩易福彩被分类为功能类别,根据基因本体论(
      • ashburner m.
      • 球C.A.
      • 布莱克J.A.
      • Botstein D.
      • 巴特勒H.
      • 樱桃准晚
      • 戴维斯A.P.
      • Dolinski K.
      • 德怀特S.S.
      • EPPIG J.T.
      • 哈里斯M.A.
      • 山D.P.
      • ISSEL-TARVER L.
      • Kasarskis A.
      • 刘易斯S.
      • Matese J.C.
      • Richardson J.E.
      • Ringwald M.
      • 鲁宾上午
      • Sherlock G.
      基因本体:生物学统一的工具。基因本体组织。
      ),保守域(//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)和Kegg途径(http://www.genome.jp/kegg-bin/show_organism?org=sco)数据库。当彩易福彩涉及特定次级代谢物的合成时,它在二次代谢组中分类,即使它符合其他类别。当彩易福彩涉及细胞分裂调节时,将其包含在细胞分裂中,而不是调节蛋白的类别。
      FTSZ. 定向诱变 - SER 319(补充表S2)和SER 387(
      • Manteca A.
      • 烨j。
      • 桑切斯J.
      • Jensen O.N.
      链霉菌的磷脂蛋白酶体分析揭示了伴随细菌分化的广泛彩易福彩磷酸化。
      )由Glu(磷酸磷酸群)和Ala(以模拟壬磷酸化)取代。订购FTSZ突变等位基因的合成致癌。他们包括 FTSZ. ORF和上游区域(380个核苷酸)足够大以含有FLÄRDH描述的三个启动子区域 等等。 (
      • Flardh K.
      • 莱比托斯E.
      • Buttner M.J.
      • Cheter K.F.
      Generation of a non-sporulating strain of Streptomyces Coelicolor A3(2) by the manipulation of a developmentally controlled ftsZ promoter.
      )。基因在整合质粒png3中克隆(
      • gonzalez-quinonez n。
      • Lopez-Garcia M.T.
      • YAGUE P.
      • 瑞利人B.
      • Pisciotta A.
      • alduina R.
      • Manteca A.
      新的PHIBT1位点特异性综合载体,中性表型在链霉菌中。
      )并引入 S. Coelicolor by conjugation (
      • kieser t.
      • BIBB M.J.
      • Buttner M.J.
      • Cheter K.F.
      • 霍普伍德D.A.
      )。本土 FTSZ. 使用由钳开发的CRISPR-CAS9系统进行突变 等等。 (
      • 桐y.
      • Charusanti P.
      • 张L.
      • 韦伯T.
      • 李S.Y.
      基于CASPR-CAS9的放射性基因组工程。
      )。在FTSZ基因内选择20-NT靶序列并使用引物SGRNA-F扩增(CatGccatggcgatgacttgatgactgcg.gttttagagctagaaatagc)和sgrna-r(acgcctacgtaaaaaaaagcaccgactcggtgtgcc)。用NCOI消化110个BPS的产物/我和克隆在NCOI /我消化了pcrispr-cas9。这 FTSZ. 通过PCR通过2082LFF(AGGCCTAGAGACGACCGCCGGAG)扩增周围区域(CCTATCACTCAGGAAGTCCGTGATGACGGGTAGTTCTG)和2082rightF(CAGAACTCCTCGCATCATCGAGGACTTCCTGAAGTGATGATGACGACGACGCA)引物。两种DNA片段通过重叠延伸PCR组合(
      • 李杰。
      • Shin M.K.
      • Ryu D.K.
      • 金斯。
      • ryu w.s.
      通过重叠扩展PCR插入和删除诱变。
      )使用引物2082LEFTR和2082rightF。克隆PCR产物并在PCR™-Blunt II-Topo®中测序。插入件被释放 埃森我充满了klenow酶并克隆到pcrispr-cas9(含20-nt靶序列)消化 英石UI。通过PCR使用引物2082LEFTF和2082Rightr在质粒间隙后确认突变(
      • 桐y.
      • Charusanti P.
      • 张L.
      • 韦伯T.
      • 李S.Y.
      基于CASPR-CAS9的放射性基因组工程。
      )。

       抗生素量化

      根据Tsao描述的分光光度法测量Undecylprodigiosin和Actinorhodin 等等。 (
      • Tsao S.W.
      • rudd b.a.
      • 他x.g.
      • chang c.j.
      • 牙线H.G.
      鉴别 of a red pigment from Streptomyces Coelicolor A3(2) as a mixture of prodigiosin derivatives.
      )和bystrykh. 等等。 (
      • bystrykh l.v.
      • Fernandez-Moreno M.A.
      • Herrema J.K.
      • Malpartida F.
      • 霍普伍德D.A.
      • Dijkhuizen L.
      Production of actinorhodin-related “blue pigments” by Streptomyces Coelicolor A3(2).
      )。通过加入0.1N KOH,细胞在培养基中破裂。在涡旋和离心后,Actinorhodin在上清液中量化(ε640 25,320)。在菌丝体真空干燥后测量的Undecylprodigio素,然后用甲醇萃取并用HCl酸化(至0.5 m)(ε.530 100,500)。分析在三种生物学复制品中进行。

       菌丝和细胞壁染色

      使用Live / Dead Baclight细菌活力套件(Invitrogen,)染色菌丝和细胞壁 l-13152)分别如前报道的(
      • Manteca A.
      • Fernandez M.
      • 桑切斯J.
      一种影响幼小舱室化菌丝体的死亡圆形在链霉菌抗生素的汇合表面培养物中拆除了空中菌丝体。
      )。如前所述,在Leica TCS SP8激光扫描显微镜下观察样品(
      • YAGUE P.
      • Willemse J.
      • koning r.i.
      • 瑞利人B.
      • Lopez-Garcia M.T.
      • gonzalez-quinonez n。
      • Lopez-iglesias C.
      • Shliaha P.V.
      • Rogowska-wrzesinska A.
      • Koster A.J.
      • Jensen O.N.
      • 范威尔G.P.
      • Manteca A.
      杂交菌丝早期生长期间跨膜的子组分化。
      )。

      结果

       MI.和MII表明了独特的彩易福彩组和磷蛋白蛋白酶

      共有3461个彩易福彩(44.3% S. Coelicolor 鉴定和量化彩易福彩组(补充表S1)。彩易福彩丰富在分析的生物复制方面高度一致(平均相关系数为0.95;中值系数6.5%)(Fig. 2补充表S1)。鉴定了五种具有相似时间丰度曲线的五种彩易福彩(Fig. 3, 补充表S1):簇1包括在MI阶段上调的345个彩易福彩;群集2包括在MI和MII上上调的241个彩易福彩30h 阶段;簇3-5包括在MII阶段上调的974蛋白。大多数彩易福彩在MII中展示了显着的变化(Q值小于0.01)30h 和 MII65h 阶段(与MI相比)显示出类似的趋势 IE。 它们在两者中起伏或下调(见热图 图。 4.AFig. 5A)(补充表S1)。为了专注于最突出的变化,我们专注于1350个彩易福彩的功能,具有显着表达的变化和至少2倍的变化(log 2比率/ mi低于-1或高于1)。关键彩易福彩的丰富作为直方图(图。 4.B5B),详细介绍(表二)并概述 Fig. 6.
      图缩略图GR2.
      Fig. 2TMT.丰富值分布和生物复制之间的相关性。 分析每个发育阶段的两种生物重复的TMT丰度的分布(MI16h,mii.30h 和 MII65h)(对角线中的面板),生物复制与不同发育阶段的相同发展阶段(黑色)的生物复制之间的TMT丰富的回归的相关性和系数和不同发育阶段(标记为红色)之间的TMT丰富的回归的相关性和系数,显示。注意相同发展阶段的复制与不同发展阶段复制之间的相关性之间的良好相关性。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3具有相似时间丰富型材的彩易福彩的簇。 簇1,彩易福彩在MI上上调16h 阶段;彩易福彩2,彩易福彩在MI上上调16h 和 MII30h;簇3-5,彩易福彩在MII阶段上调。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5与中央(初级)新陈代谢相关的彩易福彩(有氧能源生产,分解代谢,翻译/彩易福彩折叠)有丰富的彩易福彩(TMT MII / MI)。 A,热图。 B,文本中描述的关键彩易福彩的TMT丰富。统计数据和标签 .
      表二平均TMT彩易福彩丰富(从至少三种生物重复)的底物(MII)30h)和孢子花束菌丝体(mii65h)与MI阶段(16小时)相比。 MII / MI比率以对数(LOG 2)和线性形式示出。 CL,具有相似丰富型材的彩易福彩簇。 N.S.不显着(Q值高于0.01)。 ( - )未通过2倍阈值的重要值。表明了文中讨论的彩易福彩。除了细胞分裂蛋白外,仅显示了超过2倍或下调的变化。
      类别sco n°CL. 功能log 2(mii30h/ mi)log 2(mii65h/ mi)折叠变化(mii30h/ mi)折叠变化(mii65h/ mi)
      次生新陈代谢SCO6286.4CPK压缩机11.81.93.5
      SCO6276.3CPK生物合成2N.S.4N.S.
      SCO6277.31.9-3.8-
      SCO6278.31.4N.S.2.7N.S.
      SCO6279.N.S.2.61.663
      SCO628232.7-6.5-
      SCO6283.32.6-5,9-
      SCO0489.Coelichelin生物合成1−1.520.3
      SCO0492.31.1N.S.2.1N.S.
      SCO0498.31.6-3-
      SCO049931.2N.S.2.3N.S.
      sco5072.5作用生物合成N.S.3.6N.S.12.1
      SCO5073.5N.S.2.7N.S.6.5
      SCO5074.5N.S.4.6N.S.24.2
      SCO5075.5N.S.2.2N.S.4.6
      SCO5077.N.S.-2.1-4.3
      SCO5078.5N.S.3N.S.8
      SCO5079.5-3.4-10.5
      SCO5080.5N.S.3N.S.8
      SCO5083.5N.S.1.9N.S.3.7
      SCO5084.5N.S.3N.S.8
      SCO5086.N.S.N.S.1.6N.S.3
      SCO5087.5N.S.1.9N.S.3.7
      SCO5088.5N.S.1.6N.S.3
      SCO5089.N.S.-2.1-4.3
      SCO5090.5N.S.2.4N.S.5.3
      SCO5091.4-1.6-3
      SCO0381.5Deoxysugar合成酶N.S.2.5N.S.5.8
      SCO0382.N.S.-2.5-5.8
      SCO0383.5-2.7-6.3
      SCO0384.5N.S.2.4N.S.5.4
      SCO0385.5N.S.2.1N.S.4.3
      SCO0386.5-2.6-5.9
      SCO0387.N.S.-2.3-5
      SCO0388.5-2.8-7
      SCO0389.5-2.8-7
      SCO0391.5N.S.2.1N.S.4.2
      SCO0392.4-1.9-3.7
      SCO0393.N.S.13.128.2
      SCO0394.5-3.3-9.6
      SCO0395.N.S.13.128.7
      SCO0396.5-3.3-9.9
      SCO0398.5-2.7-6.4
      SCO039941.22.82.37
      SCO0400.N.S.-2.6-6.7
      SCO0401.N.S.-2-4
      秃头/ whi sapSCO0409.5萨巴-1.7-3.2
      SCO1489.N.S.BLDD.--1.5-0.3
      SCO3323.N.S.BLDN.1.51.92.83.7
      SCO3424.1BLDB同源物−1.8−1.80.30.3
      SCO3579.N.S.韦伯1.11.62.13
      SCO4091.N.S.BLDC.-−1.8-0.3
      SCO5112N.S.Bldka.−1.1N.S.0.5N.S.
      SCO5240N.S.w-−2.6-0.2
      SCO53155Whie Orfvi.N.S.1.6N.S.3
      SCO5321.5Whie Orfviii.N.S.1.8N.S.3.5
      SCO5723N.S.BLDB.-1.5-2.8
      SCO5819.N.S.wh-1.9-3.7
      SCO3897.1BLDA监管的可能目标−1.4−2.70.40.2
      SCO4301.4-1.5-2.8
      SCO6476.N.S.-1.4-2.6
      SCO6638.N.S.11.322.5
      SCO6717.N.S.-−1.4-0.4
      细胞分裂
      a 对于细胞分裂蛋白,±1间隔内的变化显示出显着变化(Q值< 0.01), are shown.
      SCO14165斯法N.S.0.8N.S.1.7
      SCO1662.N.S.par0.330.551.31.5
      SCO2077.N.S.Diviva.N.S.−0.9N.S.0.5
      SCO20822FTSZ.−0.2−0.80.90.57
      SCO26102MREC.N.S.−0.7N.S.0.6
      SCO3854.5CRGA.N.S.1.4N.S.2.6
      SCO3886.N.S.par−0.3−0.60.80.7
      SCO3887.2Parb.N.S.−0.3N.S.0.8
      SCO39044FEMX.N.S.0.57N.S.1.48
      SCO4114.N.S.孢子化相关彩易福彩0.40.21.31.1
      SCO4439.N.S.DD-CPASE.−0.4−0.70.80.6
      SCO5556.1h−2−1.70.250.3
      SCO5577.N.S.SMCN.S.0.6N.S.1.5
      法规SCO1468.5推定的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶N.S.1.9N.S.3.8
      SCO1596.N.S.ohka.-1.5-2.8
      SCO1628.4RARC.1.63.138.6
      SCO1629.N.S.r-2.6-6.1
      SCO16305rara.-3-8
      SCO2666.N.S.推定的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶N.S.1.3N.S.2.5
      SCO31025PKAE.N.S.1.5N.S.2.8
      SCO3360N.S.推定的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶−1.1N.S.0.4N.S.
      SCO36215推定的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶N.S.1.1N.S.2.1
      SCO3821.N.S.推定的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶−1.2−0.90.40.5
      SCO4776.N.S.推定的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶0.41.51.32.9
      SCO4778.N.S.PKAI.0.91.51.92.8
      SCO4069.N.S.萨拉-1.5-2.8
      SCO4118.4ATRA.-1.1-2.1
      SCO41905deva.N.S.1.3N.S.2.5
      SCO4325N.S.CSPB.-−2.2-0.2
      SCO4647.N.S.n--1.9-0.3
      SCO5582.4NSDA.-1.1-2.1
      SCO6265.N.S.SCBR.1.61.532.8
      未知SCO51911假设彩易福彩−3.4−30.090.12
      SCO6650.5假设彩易福彩N.S.4.8N.S.27.8
      翻译/彩易福彩折叠SCO1491.N.S.伸长因子-−2.3-0.2
      SCO1804.5TRNA罗基转移酶 - 异构酶N.S.2.9N.S.7.4
      SCO26202触发因子伴侣-−1.8-0.8
      SCO4648.1核糖体蛋白−1.3−2.20.40.2
      SCO47252翻译启动-−1.9-0.3
      SCO47341核糖体蛋白−1.2−2.20.40.2
      能源生产SCO0922.3琥珀酸脱氢酶2.1N.S.4.2N.S.
      SCO0923.3琥珀酸脱氢酶2.5N.S.5.5N.S.
      SCO4563.5NADH脱氢酶N.S.2.4N.S.5.1
      SCO4564.5NADH脱氢酶N.S.3.2N.S.9.4
      SCO4566.5NADH脱氢酶N.S.2.6N.S.6.1
      SCO5107.5琥珀酸脱氢酶N.S.2.6N.S.6.2
      分解代谢SCO16404彩易福彩彩易福彩1.22.82.67
      SCO1643.4彩易福彩彩易福彩-1.9-3.7
      SCO1646.N.S.彩易福彩彩易福彩-2.2-4.7
      SCO5443.5α-淀粉酶N.S.2.2N.S.4.7
      SCO64115水解酶-2-4
      SCO64144水解酶1.22.32.34.9
      a 对于细胞分裂蛋白,±1间隔内的变化显示出显着变化(Q值< 0.01), are shown.
      图缩略图GR6.
      Fig. 6融合的 S. Coelicolor 开发期间的彩易福彩组变异(MI16h,mii.30h 和 MII65h)。 文本中讨论的关键蛋白显示在它们显示出显着上调的发展阶段(Q值< 0.01).
      鉴定了来自92种磷酸肽和48磷蛋白的八十五个独特的磷酸化位点(48%Ser,52%Thr)(补充表S2)。检测到的所有磷彩易福彩也被鉴定并定量在彩易福彩组学集中,其使我们允许我们将磷酸肽丰度的变化对彩易福彩的变化进行标准化,避免由于彩易福彩量的变化而避免波动。由于比率抑制而防止人为改变(由于与具有相似的共选离子的共碎片而低估相对变化 m/z)(
      • Christoforou A.L.
      • Lilley K.S.
      定量彩易福彩组学中的等因素标记方法:UPS和Downs。
      )我们专注于通过丰度表达测试的磷酸肽(Q值<0.01)并且显示出至少2倍的增加或降低丰度(MII) 相对 MI)(58磷酸肽)(Fig. 7, Fig. 8表III)。在MII的磷酸化水平上有清晰醒目,特别是在65小时(红色棒中) Fig. 7)。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7S. Coelicolor phosphoproteome. A-B.,35个肽在发育过程中差异均匀磷酸化(Q值<0.01)至少在分组成功能类别的MII阶段中的一个中通过了2倍阈值。标号表示SCO号码。虚线表示2倍阈值。没有显示差异磷酸化的23个肽,属于具有未知功能的彩易福彩。 C,概述表明两种多磷酸化彩易福彩的磷酸化位点和保守彩易福彩结构域,具有未知的功能。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8S. Coelicolor 开发过程中综合磷脂彩易福彩变异(MI16h,mii.30h 和 MII65h)。 文本中讨论的关键蛋白显示在它们显示出显着的磷酸化位点上调的发育阶段(Q值< 0.01).
      表III平均TMT磷酸肽丰度(从至少三种生物重复)酪菌属(MII)30h)和孢子花束菌丝体(mii65h)与MI阶段(16小时)相比,磷酸肽和术语中讨论的磷蛋白。 MII / MI比率以对数(LOG 2)和线性形式显示。 N.S.不显着(Q值高于0.01)。 ( - )未通过2倍阈值的显着丰富值。磷酸化位点以粗体突出显示
      类别彩易福彩磷肽log 2(mii30h/ mi)log 2(mii65h/ mi)折叠变化(mii30h/ mi)折叠变化(mii65h/ mi)
      法规SCO0204.PS.eqgdntgspvr.N.S.3.1N.S.8.5
      deva(sco4190)alqedglltnv.PS.KN.S.2.1N.S.4.2
      DASR(SCO5231)英石dvssaenegga.Pt.VR.N.S.2.1N.S.4.3
      SCO5357.VNASAEQAAPADDAP.PS.N.S.1.6N.S.3
      SCO5544GHDEPD.PS.SRTDR.N.S.3.2N.S.9.2
      SCO5544GHDEPD.S.PS.RTDRTPR.N.S.1.9N.S.3.7
      SCO5544GHDEPD.PSPS.RTDRTPR.N.S.3.6N.S.12
      SCO5704.idirpdteqpsdaspeqs.PS.盖格格N.S.4.8N.S.27.8
      SCO7463.Tsdtpgasseghev.PS.N.S.2.8N.S.6.8
      细胞分裂Diviva(SCO2077)Qletqadd.PS.lN.S.1.6N.S.3.1
      SEPF(SCO2079)IAEGGFFNQ.PS.N.S.1.1N.S.2.1
      SCO2082(FTSZ)vtviaagfdggqpp.PS.KN.S.2N.S.4
      SCO4439.dgdadgydgpppvdqpPt.AVFK.1.31.92.43.7
      伴侣,患者,毒素和压力SCO1836.
      a 仅存在一个标记的位置的一个磷酸化位点。看 补充表S2.
      SGQDTIET.PS.GPt.AK.N.S.−1N.S.0.49
      PSPA(SCO2168
      a 仅存在一个标记的位置的一个磷酸化位点。看 补充表S2.
      )
      Qaieggqgqgea.PSPS.QSQQPQDTPR.N.S.1.72N.S.3.3
      格罗欧(SCO4761)IVVQPLDAEQ.Pt.Tasglvipdtak.-2.2-4.5
      格罗欧(SCO4761)ivvqpldaeqtta.PS.Glvipdtak.N.S.2.5N.S.5.5
      格罗欧(SCO4761)IVVQPLDAEQ.T.Pt.asglvipdtak.N.S.2.6N.S.5.9
      SCO5419.nvlaeepgn.Pt.EAKN.S.1.6N.S.3.1
      彩易福彩合成(翻译)RSPA(SCO1998)aaaegvdtagaapaasggggggsyssegddn.PS.加拉斯达达尔N.S.2.1N.S.4.3
      RSPA(SCO1998)Aaaegvd. Pt.Agaapaasgggggggsyssegddnsgalasdealaalr.N.S.2.4N.S.5.4
      SCO4703.AVD.Pt.EGSEA.N.S.3.3N.S.9.6
      SCO4711.S.E.PS.nvteetk.N.S.3.3N.S.10.2
      分解代谢SCO1646.
      a 仅存在一个标记的位置的一个磷酸化位点。看 补充表S2.
      APt.RPspt.Eeveeqaqdaqasedlk.N.S.1.1N.S.2.2
      SCO1646.psteeveeqaqdaqasedlk.N.S.1.2N.S.2.3
      SCO1646.APt.rseeveeqaqdaqasedlk.N.S.1.6N.S.3
      SCO1646.
      a 仅存在一个标记的位置的一个磷酸化位点。看 补充表S2.
      APt.RPS.Teeveeqaqdaqasedlk.N.S.3.1N.S.8.5
      SCO5864.ktdddvdsd.PS.leelk.N.S.3.3N.S.9.9
      SCO5864.TDDDVD.PS.dsleelk.N.S.3N.S.8
      SCO5864.ktdddvd.PS.dsleelk.N.S.4.4N.S.21.1
      核苷酸代谢纯净(SCO3059)efqqdlndqa.Pt.EK.N.S.3.2N.S.9
      SCO3542elpqidpdqapp.PS.RN.S.2N.S.4
      SCO3542elpqidpdqapp.PS.rr.N.S.2.2N.S.4.5
      叶酸生物合成SCO3401.sapfaqgpsdptvqpvpasvieqvdaadt.Pt.LSNPK.N.S.−1.5N.S.0.3
      Glycoslisis.SCO7443.Tsgladgvvvvtp.PS.HNPPADGGFK.N.S.1.4N.S.2.7
      未知SCO2668.agdidga.Pt.AK.N.S.1.1N.S.2.1
      SCO2668.Veeademtletr.Pspt.KPt.VR.N.S.1.9N.S.3.8
      SCO2668.avqlagvsgnad.Pt.AK.1.621.33.12.5
      SCO3859.sqggsvlsntt.Pt.TT.PSPS.SGAPTVK.N.S.3N.S.8.2
      SCO3859.sqggsvlsnttt.Pt.TPSPS.SGAPTVK.N.S.3.4N.S.10.4
      SCO3859.sqggsvlsnttt.PTPTPSPS.SGAPTVK.N.S.3.3N.S.9.6
      SCO3859.sqggsvlsntttt.PTPSPS.SGAPTVK.N.S.3.4N.S.10.4
      SCO3859.sqggsvlsn.Pt.tttts.PS.SGAPTVK.N.S.3.2N.S.9.3
      SCO3859.sqgg.PS.vlsnttttts.PS.SGAPTVK.N.S.3.5N.S.11.2
      SCO3859.sqggsvlsntttttt.PSPS.SGAPTVK.N.S.3.9N.S.14.8
      SCO3859.sqggsvlsntttt.Pt.SPS.SGAPTVK.N.S.5.3N.S.40.2
      SCO3859.sqggsvlsnt.Pt.TT.TS.PS.SGAPTVK.N.S.5.9N.S.61.1
      SCO3859.sqggsvlsntttt.Pt.SPSPS.GAPTVK.N.S.3.4N.S.10.9
      SCO3859.sqggsvlsntt.PTPT.TPSPS.SGAPTVK.N.S.3N.S.8
      SCO3859.sqggsvlsn.PTPTPT.TT.S.PS.SGAPTVK.N.S.4.1N.S.17
      a 仅存在一个标记的位置的一个磷酸化位点。看 补充表S2.

       负责次级代谢物生物合成的彩易福彩在MII阶段上调

      参与次生代谢物的彩易福彩,例如Actinorhodin,CPK,Deoxysugar和Coelichelin生物合成蛋白,在两个MII阶段上上调(簇3-5 Fig. 3)(图。 4.B6, 表二)。
      我们没有检测参与次级代谢物生物合成的彩易福彩中的任何SER / THR / TYR磷酸化。

       控制空中菌丝体形成和孢子的彩易福彩在MI和MII阶段显示出不同的丰度

      参与航空菌丝体形成和孢子(BLD,WHI,WBL,SAP蛋白)调节的彩易福彩在MI和MII之间显示出不同的丰度(图。 4.B6, 表二)。他们中的大多数是在SAPA的MII阶段上市(
      • Cheter K.F.
      Regulation of sporulation in Streptomyces Coelicolor A3(2): a checkpoint multiplex?.
      ),Whie Orfs VI和VIII(
      • 克莱门G.H.
      • Brian P.
      • Flardh K.
      • Chamberlin L.
      • Cheter K.F.
      • Buttner M.J.
      Developmental regulation of transcription of whiE, a locus specifying the polyketide spore pigment in Streptomyces Coelicolor A3 (2).
      ),BLDB(
      • 教皇M.K.
      • 绿色B.
      • Westpheling J.
      这 bldB gene encodes a small protein required for morphogenesis, antibiotic production, and catabolite control in Streptomyces Coelicolor.
      ),大气(
      • Cheter K.F.
      Regulation of sporulation in Streptomyces Coelicolor A3(2): a checkpoint multiplex?.
      ),SCO4301 / SCO6476 / SCO6638(潜在的BLDA目标;他们躲在TTA编码的Leu)(
      • Chandra G.
      • Cheter K.F.
      含有罕见亮氨酸密码子TTA的潜在BLDA依赖性链霉菌基因的进化通量。
      ),BLDN(
      • BIBB M.J.
      • Molle V.
      • Buttner M.J.
      sigma(BldN), an extracytoplasmic function RNA polymerase sigma factor required for aerial mycelium formation in Streptomyces Coelicolor A3(2).
      )和WBLA(
      • 福勒 - 奖品K.
      • 阵风B.
      • Mouz S.
      • Chandra G.
      • Findlay K.C.
      • Cheter K.F.
      这 actinobacteria-specific gene wblA controls major developmental transitions in Streptomyces Coelicolor A3(2).
      )。其他人在MII阶段下调为BLDD / BLDC / BLDKA(
      • Cheter K.F.
      链霉菌分化的遗传学。
      ),WBLE(
      • 首页rova D.
      • 塞维科州司
      • Kormanec J.
      Characterization of the Streptomyces Coelicolor A3(2) wblE gene, encoding a homologue of the sporulation transcription factor.
      ),SCO3897 / SCO6717潜在的BLDA目标和SCO3424,一个无声的BLDB同源物。
      我们在控制空中菌丝体形成和孢子的彩易福彩中没有检测到任何Ser / Thr / Tyr磷酸化。

       转录调节剂,传感器,Ser / Thr / Tyr激酶和信号蛋白在MI和MII阶段显示出不同的丰度和磷酸化

      一百三十六个调节蛋白(转录调节剂,换能器,Ser / Thr / Tyr激酶和信号蛋白)在与MI相比的至少一种MII阶段中具有不同的丰度(补充表S1)。这里包含良好的调节蛋白(图。 4.B6, 表二)。然而,大多数这些彩易福彩的调节作用已从氨基酸序列相似之处推断出与先前特征的调节剂。
      大多数这些调节蛋白在MII阶段上调(其中大部分分组到簇4和5)( Fig. 3):Ohka,次生新陈代谢和形态学的调节因子(
      • 卢y.
      • 他J.
      • 朱H.
      • yu z.
      • 王R.
      • 陈Y.
      • dang
      • 张W.
      • 杨科。
      • 江W.
      An orphan histidine kinase, OhkA, regulates both secondary metabolism and morphological differentiation in Streptomyces Coelicolor.
      ); RARA-C“恢复空中菌丝形成”彩易福彩(
      • 小松M.
      • Takano H.
      • Hiratsuka T.
      • Ishigaki Y.
      • Shimada K.
      • Beppu T.
      • UEDA K.
      Proteins encoded by the conservon of Streptomyces Coelicolor A3(2) comprise a membrane-associated heterocomplex that resembles eukaryotic G protein-coupled regulatory system.
      ); Sara,一种参与调节孢子和次生新陈代谢的彩易福彩(
      • ou x.
      • 张B.
      • 张L.
      • 董克。
      • 刘C.
      • 赵G.
      • 丁X.
      萨拉 influences the sporulation and secondary metabolism in Streptomyces Coelicolor M145.
      ); Atra,Actinorhodin生物合成基因表达的激活剂(
      • Uguru G.C.
      • 斯蒂芬斯K.E.
      • 英石ead J.A.
      • 毛巾J.E.
      • 鲍伯格S.
      • McDowall K.J.
      Transcriptional activation of the pathway-specific regulator of the actinorhodin biosynthetic genes in Streptomyces Coelicolor.
      ); Deva,一种类似GNTR样转录调节器控制空中菌丝体发育(
      • Hoskisson P.A.
      • 里加斯
      • 福勒K.
      • Findlay K.C.
      • Buttner M.J.
      deva., a GntR-like transcriptional regulator required for development in Streptomyces Coelicolor.
      ); NSDA,BLDD靶标调节形态分辨率和次生新陈代谢(
      • Den Hengst C.D.
      • tran n.t.
      • BIBB M.J.
      • Chandra G.
      • Leskiw B.K.
      • Buttner M.J.
      Genes essential for morphological development and antibiotic production in Streptomyces Coelicolor are targets of BldD during vegetative growth.
      );和SCBR,一种γ-丁内酯结合蛋白调节形态分子分化和次生新陈代谢(
      • Hsiao N.H.
      • Nakayama S.
      • Merlo M.E.
      • de Vries M.
      • 鸡尾笔R.
      • Kitani S.
      • Nihira T.
      • Takano E.
      Analysis of two additional signaling molecules in Streptomyces Coelicolor and the development of a butyrolactone-specific reporter system.
      )。相比之下,一些调节蛋白在MII阶段下调:CSPB,次生代谢的阻遏物(
      • Mikulik K.
      • khanh-hoang问:
      • Halada P.
      • Bezouskova S.
      • Benada O.
      • v.
      CSP蛋白家族在肺梗死中对冷冲击的表达及生产Tetryomyces Aurefacians。
      )和NUSG,一种转录抗真的蛋白抑制未释放的未索葡萄球菌生产(
      • 孟尔。
      • 杨S.H.
      • Palaniyandi S.A.
      • 李某。
      • 李i.a.
      • Kim T.J.
      • Suh J.W.
      Phosphoprotein affinity purification identifies proteins involved in S-adenosyl-L-methionine-induced enhancement of antibiotic production in Streptomyces Coelicolor.
      )。
      如上所述, 链霉菌 coelicolor 基因组编码47 Ser / Thr / Tyr激酶。在这项工作中,我们确定了这些激酶中的40个。大多数人在MII上上调 65h stage (补充表S2)。 8 Ser / Thr / Tyr激酶的变异在2倍阈值上(Fig. 4B):PKAE,Actinorhodin生产的抑制剂(
      • urabe h.
      • Ogawara H.
      • Motojima K.
      Expression and characterization of Streptomyces Coelicolor serine/threonine protein kinase PkaE.
      ),pkai,其中一种孢子壁合成所涉及的彩易福彩(
      • Kleinschnitz e.m.
      • Heichlinger A.
      • Schirner K.
      • Winkler J.
      • 拉丁A.
      • Maldener I.
      • Wohlleben W.
      • muth g.
      Proteins encoded by the mre gene cluster in Streptomyces Coelicolor A3(2) cooperate in spore wall synthesis.
      )和六种无表征诱发激酶(SCO1468,SCO2666,SCO3360,SCO3621,SCO3821,SCO4776)。
      在发育过程中,七种调节蛋白差异化,特别是在MII65h stage (表III)(图。 7.A8):SCO0204,孤儿响应调节器,其表达受孢子化的特定细胞分裂激活SSGA(
      • 王W.
      • 舒D.
      • 陈L.
      • 江W.
      • 卢y.
      Cross-talk between an orphan response regulator and a noncognate histidine kinase in Streptomyces Coelicolor.
      ); Deva,空中菌丝发育所需的GNTR样转录调节器(
      • Hoskisson P.A.
      • 里加斯
      • 福勒K.
      • Findlay K.C.
      • Buttner M.J.
      deva., a GntR-like transcriptional regulator required for development in Streptomyces Coelicolor.
      ); DASR,一种差异化的普利生级调节器(
      • 里加斯
      • Titgemeyer F.
      • 崩溃
      • Mulder S.
      • Thomae A.W.
      • 霍普伍德D.A.
      • 范威尔G.P.
      盛宴或饥荒:全球调节剂DASR通过链霉菌与抗生素产生的养分压力联系起来。
      ); SCO5357,RHO转录终止子参与RNA降解(Kegg Pathway SCO03018); SCO5544,CVN1学系统的一部分,一组参与调节抗生素生产和空中菌丝形成的基因(
      • Takano H.
      • Hashimoto K.
      • Yamamoto Y.
      • Beppu T.
      • UEDA K.
      Pleiotropic effect of a null mutation in the cvn1 conservon of Streptomyces Coelicolor A3(2).
      ); SCO5704,推定的NUSA转录伸长因子;和SCO7463,一种推定的组氨酸激酶。

       细胞分裂蛋白在分区化Mi和多核MII菌丝中差异表达和磷酸化。

      四十七个细胞分裂蛋白在MI和MII之间的丰富性显示出显着差异(补充表S1)。细胞分裂彩易福彩不存在大量差异 链霉菌 differentiation (
      • YAGUE P.
      • Willemse J.
      • koning r.i.
      • 瑞利人B.
      • Lopez-Garcia M.T.
      • gonzalez-quinonez n。
      • Lopez-iglesias C.
      • Shliaha P.V.
      • Rogowska-wrzesinska A.
      • Koster A.J.
      • Jensen O.N.
      • 范威尔G.P.
      • Manteca A.
      杂交菌丝早期生长期间跨膜的子组分化。
      )。然而,它们在分化中至关重要,控制Mi菌丝的舱室化(
      • YAGUE P.
      • Willemse J.
      • koning r.i.
      • 瑞利人B.
      • Lopez-Garcia M.T.
      • gonzalez-quinonez n。
      • Lopez-iglesias C.
      • Shliaha P.V.
      • Rogowska-wrzesinska A.
      • Koster A.J.
      • Jensen O.N.
      • 范威尔G.P.
      • Manteca A.
      杂交菌丝早期生长期间跨膜的子组分化。
      )和孢子(
      • 张L.
      • Willemse J.
      • 克莱森D.
      • 范威尔G.P.
      SepG coordinates sporulation-specific cell division and nucleoid organization in Streptomyces Coelicolor.
      )。因此,只有细胞分裂蛋白,我们讨论了所有良好表征的彩易福彩,显示出显着变化,包括那些没有通过上面定义的2倍阈值的彩易福彩(Fig. 4, Fig. 6, 表二)。据报道的一些细胞分裂蛋白在MII阶段上调(簇4和5)上调 Fig. 3):SFFA(
      • AUSMEES N.
      • Wahlstedt H.
      • Bagchi S.
      • elliot m.a.
      • Buttner M.J.
      • Flardh K.
      SMEA,一种小膜蛋白,具有多种中孢子症的功能,包括靶向SpoIIIE / FTSK样蛋白对细胞分裂隔膜。
      ),Parj(
      • Ditkowski B.
      • TROC P.
      • Ginda K.
      • Donczew M.
      • Cheter K.F.
      • Zakrzewska-czerwinska J.
      • Jakimowicz D.
      抗肌细胞签名彩易福彩PARJ(SCO1662)调节对聚合并影响链霉菌孢子症期间的染色体隔离和细胞分裂。
      ),crga(
      • del sol r.
      • Mullins J.G.
      • GrantCharova N.
      • Flardh K.
      • Dyson P.
      Influence of CrgA on assembly of the cell division protein FtsZ during development of Streptomyces Coelicolor.
      ),femx(
      • 洪H.J.
      • 赫对星M.I.
      • 山l.m.
      • Buttner M.J.
      这 role of the novel Fem protein VanK in vancomycin resistance in Streptomyces Coelicolor.
      ),sco4114(
      • 李W.
      • ying x.
      • 郭y.
      • yu z.
      • 周X.
      • 邓诗
      • kieser h.
      • Cheter K.F.
      • 陶米
      鉴别 of a gene negatively affecting antibiotic production and morphological differentiation in Streptomyces Coelicolor A3(2).
      )和SMC(SCO5577)(
      • dedrick r.m.
      • Wildschutte H.
      • McCormick J.R.
      Genetic interactions of smc, ftsK, and parB genes in Streptomyces Coelicolor and their developmental genome segregation phenotypes.
      )。其他特征在于MII阶段的细胞分裂蛋白:Diviva(
      • Hempel上午
      • Cantlay S.
      • Molle V.
      • 王S.B.
      • Naldrett M.J.
      • 帕克J.L.
      • 理查兹下午。
      • jungy.g.
      • Buttner M.J.
      • Flardh K.
      Ser / Thr蛋白激酶AFSK调节丝状细菌链霉菌中的极性生长和悬垂分支。
      ),FTSZ(
      • Flardh K.
      在链霉菌中的生长极性和细胞分裂。
      ),MREC(
      • Kleinschnitz e.m.
      • Heichlinger A.
      • Schirner K.
      • Winkler J.
      • 拉丁A.
      • Maldener I.
      • Wohlleben W.
      • muth g.
      Proteins encoded by the mre gene cluster in Streptomyces Coelicolor A3(2) cooperate in spore wall synthesis.
      ),para,parb(
      • Jakimowicz D.
      • Zydek P.
      • Kois A.
      • Zakrzewska-czerwinska J.
      • Cheter K.F.
      多染色体沿着螺旋杆脚手架在孢子杆菌链霉菌菌丝中的对准。
      ),SCO4439 DD-CPase(
      • 瑞利人B.
      • YAGUE P.
      • Lopez-Garcia M.T.
      • gonzalez-quinonez n。
      • BINDA E.
      • Marinelli F.
      • Manteca A.
      Characterization of SCO4439, a D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase involved in spore cell wall maturation, resistance, and germination in Streptomyces Coelicolor.
      )和核相关HUPS蛋白(
      • Salerno P.
      • Larsson J.
      • Bucca G.
      • 啦啦e.
      • 史密斯C.P.
      • Flardh K.
      One of the two genes encoding nucleoid-associated HU proteins in Streptomyces Coelicolor is developmentally regulated and specifically involved in spore maturation.
      )。
      参与细胞分裂和细胞壁合成的四种彩易福彩在发育过程中差异磷酸化(表III)(图。 7.A8)。三个细胞分裂蛋白在mii磷酸化65h 阶段:Diviva,其中一种调节顶端生长的彩易福彩之一 链霉菌,这被证明是通过磷酸化调节(
      • Hempel上午
      • Cantlay S.
      • Molle V.
      • 王S.B.
      • Naldrett M.J.
      • 帕克J.L.
      • 理查兹下午。
      • jungy.g.
      • Buttner M.J.
      • Flardh K.
      Ser / Thr蛋白激酶AFSK调节丝状细菌链霉菌中的极性生长和悬垂分支。
      ); SEPF包含在其中的彩易福彩之一 链霉菌 划分和细胞壁(DCW)簇(
      • Letek M.
      • FIUZA M.
      • ORDONEZ E.
      • Villadangos A.F.
      • 拉莫斯A.
      • mateos l.m.
      • GIL J.A.
      杆状放电素棒状杆菌谷氨酰胺细胞生长和细胞分裂。
      )和ftsz,关键的微管蛋白状细菌彩易福彩(
      • Flardh K.
      在链霉菌中的生长极性和细胞分裂。
      )。 SCO4439,A d - alanyl-d-alanine羧肽酶参与孢子件(
      • 瑞利人B.
      • YAGUE P.
      • Lopez-Garcia M.T.
      • gonzalez-quinonez n。
      • BINDA E.
      • Marinelli F.
      • Manteca A.
      Characterization of SCO4439, a D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase involved in spore cell wall maturation, resistance, and germination in Streptomyces Coelicolor.
      ),在mii磷酸化30h 和 MII65h stages.

       参与初级代谢的彩易福彩在发育过程中差异表达和磷酸化

      大多数涉及彩易福彩合成(翻译/蛋白折叠)的彩易福彩在MI(簇1中)上调 Fig. 3)(Fig. 5, Fig. 6, 表二)。涉及能量生产(克雷斯循环,氧化磷酸化),脂质代谢和分解代谢的彩易福彩在MII阶段上升高(Fig. 5, Fig. 6, 表二)。在MI或MII发育阶段中,涉及初级代谢途径的其他彩易福彩并不明确超过持续(补充表S1)。
      九种彩易福彩参与初级代谢(翻译,糖酵解酶,分解代谢,核苷酸代谢,叶酸生物合成)在发育过程中差异磷酸化。其中大多数在mii磷酸化65h stage (表III)(Fig. 7, Fig. 8)。

       应激彩易福彩和伴侣通过磷酸化调节

      应激彩易福彩和伴侣在MI或MII发育阶段没有明显过度持久化(补充表S1)。然而,其中一些在开发过程中差异均衡,主要是在MII65h (图。 7.B8, 表III):PSPA,噬菌体休克蛋白(
      • vrancken K.
      • van Mellaert L.
      • 安妮J.
      表征链霉菌虱子的PSPA响应。
      );伴侣SCO5419,一个推定的硫豆;和SCO1836,一种推定的应激彩易福彩。

       未知功能的彩易福彩和磷蛋白在MI和MII阶段显示出不同的丰度

      在与MI相比,在分析的MII级中的至少一种MII级中,五十四型四十二个无特性彩易福彩显示出不同的丰度。如下所述,这些彩易福彩构成了潜在监管机构的优秀数据库和分化的效果补充表S1)。例如,SCO5191在MI上上调11-和8倍16h 阶段与mii相比30h 和 MII65h 分别是SCO6650在MII上上调28倍65h (表二)。
      在发育过程中,具有未知功能的八种彩易福彩差异化。有趣的是,SCO2668和SCO3859分别在八个和九个位置进行多磷酸化(Fig. 7C)(补充表S2)(Fig. 8)(表III)。 SCO2668有一个“von Willebrand系数类型A”域(VWA,保守域数据库登录CD00198),其涉及各种重要的蜂窝功能(基础膜形成,细胞迁移,细胞分化,粘附,稳态); SCO3859具有“Helix-Turn-Helix”域(HTH,保守域数据库加入CL22854),其存在于几种转录调节器和其他DNA结合蛋白中。有趣的是,两种彩易福彩中的磷酸化都不会随意进行,因为它将其局部成小区(分别为58和13个氨基酸),在保守的结构域外(Fig. 7C)。

       FTSZ的磷酸化影响孢子率和次生新陈代谢

      如上所述,我们确定了SER 319的新型FTSZ磷酸化(补充表S2),在MII中显着上调30h 和 MII65h分别为1.25-和4.1倍。在我们以前的无标签研究中,我们在Ser 387发现了另一种FTSZ磷酸化(
      • Manteca A.
      • 烨j。
      • 桑切斯J.
      • Jensen O.N.
      链霉菌的磷脂蛋白酶体分析揭示了伴随细菌分化的广泛彩易福彩磷酸化。
      )。为了研究这些磷酸化的效果,我们取代了本地人 FTSZ. 具有两个突变等位基因的基因,一种模仿磷酸化(通过glu替代料理晶体),另一个模仿非磷酸化(取代ALA替代磷镜),是分析SEL磷酸化的效果的良好熟悉的方法(参见(
      • 赵玉。
      • Hawes J.
      • 波普夫夫夫夫夫夫夫
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      )和孢子菌在FTSZ突变体中受到影响。在含有“glu-glu”等位基因的菌株中并延迟患有“Ala-Ala”等位基因(Fig. 9A)。然而,我们没有观察到在营养阶段的FTSZ突变体和野生型应变之间的菌丝荚膜之间的差异(Fig. 9B)。 Ala-Ala突变体在早期发展中显示出与Glu-Glu突变体和野生型菌株相比的延迟生长(Fig. 9C)。最令人惊讶的表型,是次生新陈代谢的影响。 Altinorhodin,紫色着色聚酮抗生素,在Ala-Ala突变体中过度屈服(2.9倍),并在“glu-glu”突变体中抑制(0.53倍的野生型值)( Fig. 9C),在所有培养基(SFM,MM,健身房和R5A)和条件(固体和液体培养)中测试(Fig. 9C, 9D)。吉罗尔抗生素undylprodigiosin的生产略微减少(野生型值0.77倍,野生型值),在Glu-glu突变体中高度压抑(野生型值0.24倍)(Fig. 9C)。
      图缩略图GR9.
      Fig. 9表型 S. Coelicolor 窝藏 FTSZ. 野生型基因(Ser-Ser), FTSZ. 突变体模仿减去色素磷酸化(“glu-glu”)和 FTSZ. 突变体模仿磷酸化(“Ala-Ala”)。 A,SFM培养基中96小时孢子培养的宏观视图);灰色对应于孢子。 B,肽聚糖染色(WGA染色)植物菌株(在健身房培养15小时)。箭头表示隔膜。 C,无蔗糖的R5A液体培养物;上面板,生长曲线(彩易福彩/ ml);中间板Actinorhodin生产;低级面板Undecylprodigiosin生产。 D,固体培养的宏观视图; 72小时的SFM和健身房,96小时。紫色阳光素喉素,红颜色undeCylProdigiosin(在所示时间点不可见)。
      接下来,我们比较了FTSZ突变体和野生型菌株的彩易福彩片(补充表S3)。参与次级代谢的大多数彩易福彩显示出显着变化,在Ala-Ala突变体中上调,并在glu-glu突变体中下调(图10.A)。当我们专注于通过2倍阈值的彩易福彩(图10.B),我们观察到所有actinorhodin生物合成蛋白在Ala-Ala突变体中且不在Glu-glu突变体中,而不索蛋白生物合成蛋白与野生型菌株(Ser-Ser等位基因)相比,在两个突变体中下调。这些结果证实了在Ala-Ala突变体中观察到的Actinorhodin过量生产和在Ala-Ala和Glu-glu突变体中检测到的未索甲基蛋白抑制( Fig. 9C),受彩易福彩水平的调节。
      图缩略图GR10
      图10.与野生型菌株(Ser-Ser)相比,FTSZ Glu-Glu和Ala-Ala突变体中辅酶中含有次生代谢的彩易福彩丰富。 A,热图。 B,文本中描述的关键彩易福彩的TMT丰富。统计数据和标签 .

      讨论

      在这里,我们在MI和MII阶段中量化了3461个蛋白的变化 链霉菌 coelicolor。这相当于44.3% S. Coelicolor 我们在同一发展阶段的先前工作中鉴定的理论彩易福彩组和45%的转录组(
      • YAGUE P.
      • Rodriguez-Garcia A.
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      Transcriptomic analysis of Streptomyces Coelicolor differentiation in solid sporulating cultures: first compartmentalized and second multinucleated mycelia have different and distinctive transcriptomes.
      )。我们的结果超过了对此的任何以前的定量研究 S. Coelicolor proteome (
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      Quantitative proteomics analysis of Streptomyces Coelicolor development demonstrates that onset of secondary metabolism coincides with hypha differentiation.
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      Quantitative Proteomics Analysis Confirmed Oxidative Metabolism Predominates in Streptomyces Coelicolor versus Glycolytic Metabolism in Streptomyces lividans.
      ),对我们之前的MI和MII定量彩易福彩组学研究中量化的彩易福彩数量的Quintulicated(
      • Manteca A.
      • 烨j。
      • 桑切斯J.
      • Jensen O.N.
      链霉菌的磷脂蛋白酶体分析揭示了伴随细菌分化的广泛彩易福彩磷酸化。
      )。我们还通过彩易福彩组丰度在发育过程中量化了92种磷酸肽的变化,以使磷酸磷彩易福彩丰富并报告了在磷彩易福彩丰富的磷彩易福彩丰度期间的第一种定量数据集。 链霉菌 差异化。我们使用MS2 TMT来概况彩易福彩组和磷脂蛋白组颞型变化,这是一种已知抑制比率抑制的方法(
      • ow s.y.
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      • 诺里尔J.
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      ITRAQ低估了简单而复杂的混合物:“好,坏和丑陋”。
      )。然而,我们和其他人已经研究了基于TMT的定量彩易福彩组学的比例压缩问题,并且得出结论,除非需要高精度,否则可以忽略对彩易福彩组学研究的整体结果的影响(
      • 何格尔贝阿
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      用于定量彩易福彩组分析的高性能混合杂交玻璃质谱仪:观察和含义。
      )。为了减少比率抑制的干扰,我们专注于最可靠的定量数据, IE。 彩易福彩和磷酸肽在丰度变化至少2倍。尽管有这个非常严格的标准,我们发现1350个彩易福彩(补充表S1)和58种磷酸肽(补充表S2)正在改变,表明对此的重大重组 链霉菌 coelicolor 在整个生命周期中彩易福彩组和磷酸酯。如上所述,鉴定的40个SER / THR / TYR激酶中的大多数以及SER / THR / TYR磷酸化在孢子阶段(MII)呈现出覆盖物(MII)65h),表明SER / THR / TYR磷酸化在分化和孢子的调节中的作用。
      MI.和MII之间最清晰的生理差异是MII中的次生代谢激活(
      • YAGUE P.
      • Rodriguez-Garcia A.
      • Lopez-Garcia M.T.
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      Quantitative proteomics analysis of Streptomyces Coelicolor development demonstrates that onset of secondary metabolism coincides with hypha differentiation.
      )大多数涉及次生代谢的彩易福彩在MII阶段(CPK,ACT,Deoxysugar合成酶,Coelichelin)高度上调。相比之下,大多数参与初级代谢的彩易福彩,特别是参与彩易福彩合成,翻译和彩易福彩折叠的彩易福彩在MI阶段高度上调,这并不奇怪,考虑到MI对指数营养生长阶段相对应,而增长则被捕在mii阶段(
      • Manteca A.
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      Mycelium differentiation and antibiotic production in submerged cultures of Streptomyces Coelicolor.
      )。其他初级代谢蛋白涉及能量产生(克雷布循环,氧化磷酸化),脂质代谢,氨基酸代谢和戊糖磷酸途径,大多在MII阶段上升高,可能导致次生代谢所需的能量和前体。次生新陈代谢与MII相关联(
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      抗生素表面培养中早期细胞拆解事件的细胞学和生化证据。
      )但不同次级代谢物的表达需要特异性活化剂(elicetors)或阻遏物,并且并非所有次级代谢物在MII中同时产生(
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      链霉菌抗生素生物合成的分子调节。
      )。例如,ATRA(SCO4118),Actinorhodin生物合成基因的活化剂(
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      Transcriptional activation of the pathway-specific regulator of the actinorhodin biosynthetic genes in Streptomyces Coelicolor.
      )在mii略微上调65h (2.1倍),活化Actinorhodin生产,而PKAE,在MII也上调了Actinorhodin产量的阻遏物65h (2.8倍),表明猕猴桃生产在孢子菌菌状物(以前报道)(
      • YAGUE P.
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      )。 SCO6286,CPK压缩机(
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      Deletion of a regulatory gene within the cpk gene cluster reveals novel antibacterial activity in Streptomyces Coelicolor A3(2).
      ),在MII上上调65h,阻止在空中菌丝体阶段的CPK生产。 SCO3225和SCO3226,一种双组分系统压制CDA生物合成,在MI和MII阶段显示出类似的丰度(补充表S1),在这项工作中使用的培养条件下压制CDA产量。
      MI.I.之间最清晰的形态学差异30h (底物菌丝体)和mii65h (空中孢子菌丝体),是在MII中上调疏水悬气菌和患者疏水覆盖形成和孢子(BLD,WHI,SAPA,RARA-C)中的疏水涂层的存在。65h.
      没有一种合成次级代谢物的酶,或形成形成疏水性涂层的彩易福彩被检测为磷酸化,表明通过SER / THR / TYR磷酸化对这些方法的调节不是最终的效果。相比之下,参与中央代谢途径(翻译,糖酵解酶,分解代谢,核苷酸代谢,叶酸生物合成)的一些彩易福彩和酶在MI和MII中差异磷化,表明它们的活性通过磷酸化调节。
      有两个发展阶段 链霉菌 菌丝是划分的,mi和孢子mii,而mii(衬底和空中菌丝)的早期阶段由散疗隔膜的多核菌丝组成。 链霉菌 细胞分裂研究专注于孢子,而MI细胞分裂仍然众所周知。最近,我们的小组能够识别基于MI菌丝中没有可检测的肽聚糖的跨膜的新型细胞分裂的存在(
      • YAGUE P.
      • Willemse J.
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      杂交菌丝早期生长期间跨膜的子组分化。
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      交叉膜在链霉菌中协调分隔率和形态发生。
      ),其规则仍然基本上无表明。在这里,我们在MI阶段检测到几种细胞分裂彩易福彩比在孢子形成的MII阶段更丰富。该结果表明这些彩易福彩在MI跨膜基细胞分裂中的推定作用,因为它发生在FTSZ,细菌细胞分裂的关键效应子(
      • YAGUE P.
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      杂交菌丝早期生长期间跨膜的子组分化。
      )。这些彩易福彩构成研究控制跨膜细胞分裂机制的良好起点 链霉菌.
      在MII期间,细胞分裂蛋白如Diviva和FTSZ更磷酸化65h 阶段,暗示磷酸化在细胞分裂伴孢子调节中的作用。 FTSZ磷酸化在孢子中具有直接的疗效,其在模仿双磷酸化(“glu-glu”等位基因)中高度降低。这可能表明磷酸化影响FTSZ聚合,减少孢子,因为它发生在 结核分枝杆菌 (
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      由于其通过真核型Ser / Thr激酶,PKNA的转磷酸化,分枝杆菌FTSZ的GTPase活性受损。
      )。有趣的是,我们检测到FTSZ磷酸化在Actinorhodin生产中的显着效果。 FTSZ. 高度保守 链霉菌 属和“Ala-Ala”等位基因,可用于工业链霉菌,以增强其他抗生素的生产。进一步的工作是充分了解FTSZ磷酸化的生物学作用及其潜在的产业应用。
      一百三十六个调节蛋白(转录调节剂,传感器,Ser / Thr / Tyr激酶和信号传导蛋白),其中大多数由氨基酸序列同源性鉴定的无声推定调节剂,以及542个推定彩易福彩(没有任何清晰的同源性)在mi和mii期间显示差异丰度。关键调节蛋白在差异上磷酸化 S. Coelicolor 开发,如DASR或DEVA,两种抗性调节剂控制次生新陈代谢和空中菌丝体形成。这些结果表明磷酸化在调节次级代谢,空中菌丝形成和孢子中的调节作用,以在未来研究和特征。在发育过程中,没有已知功能的八种彩易福彩也差异磷酸化。例如,SCO2668在孢子菌丝体上高度多磷酸化(MII65h)和哈博尔突出的磷酸性真核VWA结构域,其参与了真核细胞中的各种重要的细胞功能(基础膜形成,细胞迁移,细胞分化,粘附,稳态)。这表明SCO2668在孢子中的复杂监管作用,类似于真核监管途径。 S. Coelicolor 尽管它不会产生商业次生代谢物,是最好的表征的链霉病。然而,许多磷酸化的彩易福彩以及具有未知函数的调节蛋白和彩易福彩在营养(MI)和次要代谢物中产生的未知函数(MII)(MII),并在保守 链霉菌 属。这些彩易福彩是在未来研究和特征的次级代谢和分化的潜在调节剂,因为它发生在FTSZ。该知识可以有助于优化工业链霉菌中的次级代谢产物生产,包括在筛选来自链霉菌的新次生代谢物(培养物)期间神秘的次级代谢物途径(在实验室培养中未激活的途径)的激活(
      • Onaka H.
      新型抗生素筛查方法在放线菌唤醒静音或隐秘的次生代谢途径。
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      数据可用性

      通过Proteomexchange获得原始数据(http://www.proteomexchange.org/)标识符PXD005558。

      致谢

      我们感谢Betriz Gutierrez Magan(DPTO oviedo Univeryido,DPTO。BiologíaUnclcional,ÁreaDemicrobiología)的实验室援助。

      补充材料

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