丁酸盐通过靶向丙酮酸激酶M2和代谢重编程*抑制结肠直肠癌细胞的增殖*

  • 青兰李
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    中国药物大学天然药物国家重点实验室药物代谢与药代动力学重点实验室,南京,210009;
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  • 李娟曹
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  • 杨田
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    中国药物大学天然药物国家重点实验室药物代谢与药代动力学重点实验室,南京,210009;
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  • 裴张
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    国家蛋白质科学中心 - 北京北京南辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室,北京102206
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  • 楚杰丁
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    中国药物大学天然药物国家重点实验室药物代谢与药代动力学重点实验室,南京,210009;
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  • 文杰鲁
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  • 陈西佳
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    国家蛋白质科学中心 - 北京北京南辐射医学研究所北京蛋白质组学国家重点实验室,北京102206
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  • 昌邵
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    中国药物大学天然药物国家重点实验室药物代谢与药代动力学重点实验室,南京,210009;
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  • 刘文岳刘
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  • 董王
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  • 惠烨
    一致
    应解决谁对应的通信:中国制药大学天然药物的药物代谢和药代动力学的重点实验室,南京,210009。电话:86-25-83271179;或电话:86-25-83271128;
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  • Haiping Hao.
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    应解决谁对应的通信:中国制药大学天然药物的药物代谢和药代动力学的重点实验室,南京,210009。电话:86-25-83271179;或电话:86-25-83271128;
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    中国药物大学天然药物国家重点实验室药物代谢与药代动力学重点实验室,南京,210009;
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  • 作者脚注
    *本研究得到了中国天然科学基金(GRANTS No.81421005,81430091,81720103032,91429308,81603193至HH)的支持,是中央大学的基本研究资金(2632018ZD07到HY),主要新药物的项目创新和发展(2015ZX0950101010至HH),纪律创新的海外专业知识介绍项目(G20582017001到HH),大学生为r的创新项目&D新药物(J1310032至W.L.)和研究生研究&江苏省实践创新计划(KYCX17_0679至Q.L.)。
    本文含有补充材料。
    ‖ 这些作者同等贡献这项工作。
      丁酸盐是在肠腔内呈现高浓度的短链脂肪酸。通过用作能量代谢物,通过用作组蛋白脱乙酰酶抑制剂,促进正常结肠细胞的增殖,抑制正常结肠细胞的增殖。然而,丁酸盐中断结直肠癌细胞的代谢,最终导致细胞增殖的抑制仍然不清楚。在这里,我们采用了代谢组织 - 蛋白质组学的组合方法来探讨丁酸酯介导的增殖滞留和细胞代谢之间的联系。代谢组科研究揭示了一种改造的丙酮酸积累的重塑代谢曲线,降低了丙酮酸丙酯上游的糖酵母中间体,并降低了丁酸的HCT-116细胞中的核苷酸水平。补充关键代谢物中间体直接影响癌细胞代谢并调节丁酸丁酸在HCT-116细胞中的抑制作用。通过药物亲和力响应靶标稳定性(飞镖),基于定量蛋白质组学方法,我们揭示了丙酮酸激酶,PKM2的M2同种型,作为丁酸盐的直接结合靶标。丁酸盐通过促进其去磷酸化和四聚化而激活PKM2,从而重新编程结肠直肠癌细胞的代谢,抑制了Warburg效应,同时有利于能量代谢。因此,我们的研究提供了PKM2诱导的代谢重塑与丁酸盐的抗弃权功能的机械联系,并证明了广泛应用的方法来揭示具有生物功能的小分子的未知蛋白质靶标。
      丁酸盐是一种短链脂肪酸(SCFA)
      使用的缩写是:
      SCFA
      短链脂肪酸
      HDAC.
      组蛋白脱乙酰酶
      BSA.
      牛血清白蛋白
      TCA周期
      三羧酸循环
      HRMS.
      高分辨率质谱
      飞镖
      药物亲和力响应靶稳定性
      PKM2
      丙酮酸激酶M2
      CCK-8
      Cell Counting Kit 8
      BCA.
      双子素素酸
      SDS-PAGE.
      十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
      SEM.
      标准错误的平均值
      Anova.
      方差分析
      PVDF.
      聚偏二氟化乙烯
      PCA.
      主要成分分析
      OPLS-DA
      潜在结构判别分析的正交投影
      G6P
      葡萄糖-6-磷酸盐
      3PG
      3-磷酸​​甘油
      PEP.
      磷丙酮酸
      R5P
      核糖糖 - 5-磷酸盐
      5′-IMP
      Inosine 5'-单磷酸盐
      5′-GMP
      鸟苷5'-单磷酸盐
      5′-UMP
      尿苷5'-单磷酸
      p
      丙酮酸
      Lac.
      乳酸
      ac-coa.
      乙酰辅酶A.
      PPP.
      戊糖磷酸途径
      LDH.
      乳酸脱氢酶
      PTM.
      翻译后修改
      内标
      是。
      1使用的缩写是:SCFA
      短链脂肪酸
      HDAC.
      组蛋白脱乙酰酶
      BSA.
      牛血清白蛋白
      TCA周期
      三羧酸循环
      HRMS.
      高分辨率质谱
      飞镖
      药物亲和力响应靶稳定性
      PKM2
      丙酮酸激酶M2
      CCK-8
      Cell Counting Kit 8
      BCA.
      双子素素酸
      SDS-PAGE.
      十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
      SEM.
      标准错误的平均值
      Anova.
      方差分析
      PVDF.
      聚偏二氟化乙烯
      PCA.
      主要成分分析
      OPLS-DA
      潜在结构判别分析的正交投影
      G6P
      葡萄糖-6-磷酸盐
      3PG
      3-磷酸​​甘油
      PEP.
      磷丙酮酸
      R5P
      核糖糖 - 5-磷酸盐
      5′-IMP
      Inosine 5'-单磷酸盐
      5′-GMP
      鸟苷5'-单磷酸盐
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      尿苷5'-单磷酸
      p
      丙酮酸
      Lac.
      乳酸
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      PPP.
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      LDH.
      乳酸脱氢酶
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      内标
      是。
      通过在结肠内腔中通过微生物生物发酵膳食纤维的发酵。它通常以高浓度存在(>10 mm)通过单羧酸盐转运蛋白,在结肠上并升高到结肠的上皮细胞(
      • 谭杰。
      • McKenzie C.
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      短链脂肪酸在健康和疾病中的作用。
      )。然后通过在线粒体中进行β-氧化并支持代谢稳态(
      • KOH A.
      • devadder f.
      • Kovatcheva-二岩P.
      • 后面的F.
      从膳食纤维到宿主生理学:短链脂肪酸作为关键细菌代谢物。
      )。与其在促进正常结肠细胞中的作用相反,最近的研究表明,丁酸盐通过抑制直肠癌细胞的增殖或诱导细胞凋亡而表现出抗肿瘤功能(
      • Fung K.Y.
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      丁酸盐降低结直肠癌血管生成的潜在机制综述。
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      • 头r.j.
      HT29结直肠癌细胞中丁酸盐和4-苯甲酰丁丁诱导诱导细胞凋亡的潜在途径。
      )和其他几种其他癌细胞,如乳腺癌细胞,Medulloblastoma细胞和前列腺癌细胞(
      • 也没有C.
      • sassi f.a.
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      组蛋白脱乙酰化酶抑制剂钠丁酸钠促进细胞死亡和分化,并降低人髓质母细胞瘤细胞中的神经圈形成。
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      烟酸/丁酸酯受体GPR109a通过抑制细胞存活来抑制乳腺肿瘤内血。
      )。
      虽然复杂,以前的研究通常将丁酸盐的癌症抑制作用归因于其作为G-蛋白偶联受体(GPR)109A配体或组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(
      • Thangaraju M.
      • Cresci G.A.
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      GPR109a是一种用于细菌发酵产物的G蛋白偶联受体,并用作结肠中的肿瘤抑制剂。
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      • 优惠Manns S.
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      GPR109a的激活,烟酸的受体和非同酵母丁酸丁酯,抑制结肠炎症和致癌作用。
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      Warburg效应决定了丁酸酯介导的组蛋白乙酰化和细胞增殖的机制。
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      • Bultman S.J.
      八卵鼠小鼠模型表明,膳食纤维以微生物液和丁酸酯依赖性方式免受结肠直肠肿瘤鉴定。
      )。作为一种HDAC抑制剂,具体地,丁酸盐调节各种细胞命运相关基因的表达,例如Fas和Wnt10b,同时还介导GADD45B,CDKN1A和CDKN1C的FoxO3依赖性表达,随后导致结直肠癌中的增殖和凋亡细胞 (
      • donohoe d.r.
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      • Stappenbeck T.S.
      结肠隐窝保护微生物群代谢物中的干细胞。
      )。
      抑制癌症肠细胞同时刺激非癌性结肠细胞的正常生长的丁酸盐的有趣特征被称为“丁酸悖论”(
      • Burgess D.J.
      新陈代谢:Warburg在丁丁悖论后面?
      )。与其正常的对应物不同,癌细胞是已知的,据称是经过Warburg效应,并且优先使用葡萄糖而不是丁酸盐作为能源,这有利于他们的存活和快速增长(
      • 病房P.S.
      • 汤普森C.B.
      代谢重编程:甚至沃堡的癌症标志没有预料。
      ,
      • 路易斯P.
      • 持有G.L.
      • 弗林特H.J.
      肠道微生物肿块,细菌代谢物和结肠直肠癌。
      )。通过调节参与癌症代谢的关键酶的表达水平和活动,重新编程的代谢模式将癌细胞适应癌细胞至缺氧微环境和增殖的生物质积累(
      • donohoe d.r.
      • 柯林斯L.B.
      • 瓦利A.
      • 巨星r.
      • 太阳W.
      • Bultman S.J.
      Warburg效应决定了丁酸酯介导的组蛋白乙酰化和细胞增殖的机制。
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      • 凯恩斯r.a.
      • 哈里斯I.S.
      • MAK T.W.
      调节癌细胞代谢。
      )。先前已经提出,丁酸酯燃料在正常的结肠细胞中燃料燃料燃料循环(TCA循环),但积聚在经历Warburg效应的癌肠细胞中,从而用作HDAC抑制剂以抑制结直肠癌细胞的增殖。然而,由丁酸盐的代谢适应和增殖抑制之间的直接机械链接仍然难以捉摸。因为癌细胞的连续和快速增殖取决于代谢重编程的能力(
      • Boroughs L.K.
      • Deberardinis r.j.
      代谢途径促进癌细胞生存和生长。
      ,
      • Vernieri C.
      • Casola S.
      • Foiani M.
      • Pietrantonio F.
      • de brud f.
      • Longo V.
      靶向癌症新陈代谢:饮食和药理学干预措施。
      ),我们认为丁酸丁酸的增殖抑制作用可能与其调节癌细胞的代谢能力直接相连。丁酸盐可能对正常细胞及其癌症对应物之间的代谢产生差异影响,从而解释了“丁酸悖论”。因此,我们试图探讨丁酸盐抑制结直肠癌细胞增殖及其相应的代谢程序之间的机械关系,并鉴定介导这种联系的潜在蛋白靶标。
      在这方面,采用高分辨率质谱(HRMS)基代的代谢物技术探测丁酸盐引发的HCT-116细胞中的代谢变化。代谢组织数据显示丁酸酯介导的代谢重塑,并加下来的显着扰动的代谢途径,为负责丁酸抑制增殖的蛋白质靶标提供线索。随后,使用目标鉴定方法来揭示丁酸盐的结合蛋白,并揭示其中的任何一种是否参与受影响的丁酸酯的代谢。由于丁酸盐的结构简单,我们采用了一种无衍生化的蛋白质组学方法,即药物亲和力响应靶稳定性(飞镖),以表征丁酸盐代替丁酸酯的蛋白质靶靶标,这是需要衍生丁酸酯的衍生化的方法(
      • Lomenick B.
      • 郝·
      • jonai n。
      • 下午r.m.
      • Aghajan M.
      • 华堡顿S.
      • 王J.
      • 吴r.p.
      • 戈麦斯F.
      • lo j.a.
      • wohlschlegel j.a.
      • Vondriska下午
      • 颗粒J.
      • Herschman H.R.
      • 克拉迪J.
      • Clarke C.F.
      • 黄杰。
      使用药物亲和力响应靶标稳定性(飞镖)的目标鉴定。
      ,
      • pai m.y.
      • Lomenick B.
      • Hwang H.
      • Schiestl R.
      • 麦克布莱德W.
      • lo j.a.
      • 黄杰。
      药物亲和力响应靶标稳定性(飞镖)用于小分子靶标鉴定。
      )。与直接分配最高丰度的凝胶消化药物稳定蛋白作为靶的常规飞镖方法相比,我们使用无标记的定量蛋白质组学方法,并将外源蛋白质掺入作为内标(是)可靠且准确地定量凝胶消化的靶蛋白。因此,生物学方法的组合效用允许将丁酸酯结合的蛋白质鉴定为介导癌细胞增殖的潜在靶标。
      在这里,随着代谢引导的蛋白质组学方法,我们发现,在HCT116细胞中,注意到丁酸丁酸盐处理中,丙酮酸丙酮酸丙酯和其他糖浆中间体的水平降低的升高。基于飞镖的定量蛋白质组学结果和生物化学测定表明,丁酸盐结合并激活丙酮酸激酶同种型2(PKM2),随后负责逆转癌细胞和最终导致增殖捕获的代谢优势。因此,我们的研究通过将PKM2介导的代谢重塑与丁酸盐的抗肿瘤功能联系起来,提供了机械透视。

      材料和方法

       实验设计与统计理由

      我们首先通过HCT116,HT29和Lovo细胞系验证了丁酸丁酸对丁酸丁酯对结肠直肠癌细胞增殖的抑制作用。使用增加的丁酸酯剂量通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞活力。对于每种情况,使用了五种独立的生物重复。接下来,我们通过代谢组学评估了丁酸盐在重编程细胞代谢中的能力。进行了五种独立的生物复制实验。为了随后通过飞镖测定确定丁酸丁酸的潜在靶,将HCT116细胞的裂解物与丁酸盐,通过浸脱发消化,并通过SDS-PAGE分离。在Coomassie蓝染色(三个独立的生物重复)后,通过密度测定显示出丁酸盐结合稳定性较高的蛋白质。为了可靠地量化来自靶带的蛋白质,我们将每个裂解物样品中的外源蛋白质掺入,并且通过SDS-PAGE分离出肌肉掺入的样品,然后分离切除,凝胶中的消化和LC-MS分析。使用无标记的蛋白质组学方法来量化来自在四个样品中收集的特定蛋白质条带的所蛋白质蛋白质,包括对照样品和三种丁酸盐处理的不同剂量的样品(三种生物重复)。相对定量分析表明丁酸盐的潜在靶蛋白,其显示在丁酸酯剂量依赖性方式中显着增加。通过免疫印迹进一步证实通过蛋白质组学方法鉴定的靶蛋白(n = 3,生物重复)。通过Brdu细胞增殖试剂盒测定细胞增殖,将细胞接种并在96孔板中处理(n = 4,生物重复)。数据被呈现为平均值(S.E.)的平均值±标准误差。两组之间的统计差异由学生确定 t - 最低,而三个或更多组的比较被一次单向ANOVA分析,然后进行Tukey-Kramer测试。 p <0.05被认为是统计学意义。

       试剂和细胞系

      丁酸钠,缺氧,丙酮酸钠, l购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,Mo)购买 - 塞里宁,世昔仓,ADP,NADH,PEP,乳酸脱氢酶(LDH)和蛋白酶抑制剂混合物。 Tepp-46购自Merck Millipore(德国达尔马施特)。除非表明,否则其他化学试剂均可从中国药膏化学试剂(中国上海)获得。 HCT116,HT29和LOVO全部购买人结直肠癌细胞系从ATCC(Manassas,VA)购买,其中Hct116和HT29细胞在McCoy的5A培养基(Sigma-Aldrich)中培养,并且在DMEM / F12培养基中培养Lovo细胞(Gibco,Gland Island,NY)。培养基均补充了10%胎牛血清(FBS,生物行业,Kibbutz,以色列),100单位/ ml青霉素和1μg/ ml链霉素,并且细胞保持在潮湿的培养箱中,5%CO2 at 37 °C.

       免疫印迹实验

      用NP-40缓冲液(Beyotime,江苏,中国)在冰上裂解细胞,补充有1%蛋白酶抑制剂混合物。用双循环酸(BCA)测定试剂盒(Beyotime)定量总蛋白质浓度,用于归一化每个样品。然后将细胞裂解物加载并在8-12%SDS-PAGE上分离并转移到聚偏二氟化乙烯(PVDF)膜上。免疫印迹由5%的非乳醛封闭,并在4℃下与指定的初级抗体溶液过夜温育,然后与过氧化物酶 - 缀合的二抗孵育。使用化学发光试剂在ChemIdoc XRS系统(Bio-rad,Hercules,Ca)上检测所得条带,并且通过ImageLab(Bio-rad)通过密度测定来完成所选带的相对定量。提供抗体的细节 补充表S1,支持信息(SI)。

       丙酮酸激酶活性测定

      通过NADH依赖于NAD的LDH依赖性转化测定丙酮酸激酶(PK)的活性+。用补充有1%蛋白酶抑制剂混合物的NP-40裂解缓冲液裂解细胞。通过BCA测定试剂盒测定总蛋白质浓度并用裂解缓冲液稀释至1μg/μL。由50米组成的200μl反应混合物m Tris-HCl(pH = 7.5),5米m MgCl2,100米m KCl, 1 mm ADP, 0.5 mm PEP, 0.2 mm 在96孔板中,将NADH和8个单位的LDH加入到5μg细胞裂解物中。在短暂混合时,在37℃下测量样品,间隔为10秒,直至OD340 价值是恒定的。记录100S的荧光强度并用于使用以下等式计算PK活性:活动(U /μL)=(a0 s – A100 s)×200 / 6.22×100×5。

       药物亲和力响应靶稳定测定和蛋白质组学分析

      大约1×107 将未经处理的结直肠癌细胞在4℃下用NP-40裂解缓冲液裂解30分钟。丁酸钠溶于1×TNC缓冲液(50米m Tris, 50 mm NaCl, 10 mm CaCl2将pH = 7.4)加入到细胞裂解物(500μg总蛋白,5mg / ml)中以达到所示的浓度并轻轻混合。然后将裂解物置于室温下2小时,以允许足够的配体 - 蛋白靶相互作用,然后通过浸脱(Roche,Basel,瑞士人,溶解在1×TNC缓冲液中)的浸渍酶(Roche,Basel,溶解)(wt / wt)。恰好30分钟。通过将裂解液与4倍加载缓冲液(Bio-rad)和5分钟的沸点混合来淬灭蛋白水溶液。将预先存在的牛血清白蛋白(BSA)等分,然后掺入每个样品中,在每个样品中达到同等浓度的每个样品中的浓度为15μg/ ml,随后用作靶蛋白的定量分析(Fig. 4A)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4药物亲和力响应靶标稳定性(DART) - 蛋白质技术和免疫印迹实验显示丙酮酸激酶作为丁酸酯的结合靶。 A,通过基于飞镖的蛋白质组学方法和免疫印迹实验的丁酸盐的靶标识的示意性工作流程。 B,浸酶消化的细胞裂解物的SDS-PAGE分析,其次是Coomassie蓝染色鉴定在〜60kDa凝胶带内的丁酸盐稳定的蛋白,并且通过密度测定法测定丰度的相对定量(n = 3). C,从凝胶中的凝胶消化带的量化量化(B)通过无标签的蛋白质组学方法(n = 3)。使用BSA作为蛋白质。 D,丙酮酸激酶M的代表性独特肽的MS / MS光谱(PKM2作为优势形式)。 E,免疫印迹结果验证,PKM2变得不太敏感,不能在与丁酸丁孵育后浸出消化。 GAPDH被用作免疫印迹实验中PKM2丰度的对照(n = 3). F,SDS-PAGE分析浸酶消化的重组PKM2蛋白,其次是Coomassie蓝染色。数据作为平均值呈现为±s.e.,*p < 0.05, **p < 0.01.
      对于重组PKM2蛋白的蒸馏测定,将蛋白质用1×TNC缓冲液稀释至100μg/ mL。随后,将10μg蛋白质裂解物与在室温下在注射的浓度下在2小时的浓度下温育丁酸丁酸酯,然后用蛋白酶的蛋白酶消化30分钟,以1:750的比例(wt / wt)。通过将裂解物与4倍加载缓冲液和5分钟的沸腾混合来淬灭蛋白水溶液。重组PKM2蛋白的生产在支撑方法中详述。
      通过SDS-PAGE分离所得样品,用于靶蛋白的可视化。 SDS-PAGE分离的凝胶由Coomassie蓝色染色,并且通过ChemIdoc XRS系统捕获图像。通过测序级胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi),手动切除,脱脂,脱脂,脱脂,脱脂,脱脂,脱脂,脱脂,脱脂,脱脂,脱脂,凝胶带。
      然后萃取消化物并在C上脱沉18 Ziptips(Millipore,Milford,MA),真空干燥,并在含有0.1%甲酸的水中重建。用于LC-MS / MS分析的在线纳米纳米型UPLC系统耦合 - Synapt-Synapt-Synapt-synapt-synapt-synapt-simapt-synapt-manchester。捕获栏(Acquity UPLC M-Class 0.18×20mm,5μm100Å,c 18,采用水域,水)和分析柱(Acquity UPLC M级0.075×150mm,1.8μmHSST3,水)。流动相A和B分别在水和0.1%(v / v)甲酸中组成0.1%(v / v)甲酸,分别在乙腈中。以300nl / min的流速为90 min长度梯度为1-40%乙腈用于分离。 MS的扫描时间设定为0.2 s,全MS扫描范围设定为350-1500 m/z 扫描时间为0.2 s,MS / MS扫描范围设定为50-2000 m/z。将前10个丰富的前体与使用0.15秒的扫描时间在低能量(14-19eV)和升高的能量(60-90eV)之间进行MS / MS碎片,使用0.15秒的升高的能量(60-90eV)。
      Peaks Studio 8.5版(BioInformatics Solutions,Inc.,Waterloo,On,Canada)用于生成来自MS / MS光谱的峰值和鉴定人类Uniprot数据库(2017.10份,20,316个条目)。手动将牛血清白蛋白(BSA,P02769 ALBU_BOVIN)的序列添加到数据库中。将酶的特异性设定为胰蛋白酶,最多两个错过的裂解是可接受的,将半胱氨酸的氨基甲酰化被设定为固定改性,将蛋氨酸的氧化作为可变改性,并且前体离子和片段离子的质量耐受性分别设置为20 ppm和0.05 da。使用1%的假发现率用于过滤分配的肽,并保持≥2个独特肽的蛋白质鉴定。确定的蛋白质详述 补充表S2,si。
      选择从凝胶带中显示顶部丰度的蛋白质进行相对定量(基于由峰值工作室的标签FALE模块总结的#Unique肽排序的蛋白质的蛋白质)。然后采用可标记的方法。我们选择了量化的肽并计算了相应峰面积的总值。前体和片段离子的质量误差耐受分别设定为20ppm和0.05da,并将每个实验条件设定为相对定量的组。蛋白质定量的所选肽的标准包括(1)-10LGP值>30,(2)乳腺癌裂解≤2,(3)平均ppm肽<15,和(4)在所有样品上显示一致的色谱行为。从BSA鉴定的肽用于标准化。因此,通过a计算每个样品中的蛋白质的相对丰度 R = ∑(目标肽的峰面积)/σ. (肽的峰面积是蛋白质)。然后将丁酸丁孵育的蛋白质增加的蛋白质分配为潜在的靶蛋白。所有原料质谱数据都沉积到大量系统中,并可以访问 ftp://massive.ucsd.edu/MSV000082189.

       代谢组分分析和数据处理

      将HCT116细胞接种并在6孔板中培养培养物,基于先前报道的方法进行随后的代谢分析(
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      代谢组种 - 蛋白质组学组合方法鉴定衰老和凋亡之间的差异代谢相关分子事件。
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      代谢物生物标志物鉴定的代谢途径延伸方法。
      )。简而言之,用1ml冰冷的80%甲醇萃取细胞含有1.5μg/ ml 1,2-的甲醇13C2-glutamine作为一个。随后将细胞提取物浓缩成SPD2010-230 SpeedVAC浓缩器(Thermo Sciencific,Holbrook,Ny),并在进行LC-MS分析之前在100μL去离子水中重构。在LC-30A UFLC系统(Shimadzu,Kyoto,Japan)中,通过X桥酰胺HPLC柱(3.5μm,4.6mm×100mm,水域,Milford,MA)分离20μl等分试样的样品。柱烘箱的温度设定为40℃。移动阶段A由5米组成m 乙酸铵,95%水和5%乙腈(pH9.0),移动相B是乙腈。
      然后将洗脱剂引入以负离子模式操作的三重TOF 5600系统(SCIEX,Framingham,MA)中。 ESI条件设置如下:在33psi,在33psi的离子源气体1(GS1),在33psi,帘气体(Cur)处为25psi,源温度在475°C和离子喷射电压浮动-4500 V.质谱仪参数如下:n2 作为碰撞气体,Q1真空仪:2.2×10−5 Torr,TOF真空0.309×10−6 托尔。信息依赖性采集(IDA)用于代谢物鉴定。 TOF / MS扫描设置在其中 m/z 50至1000 da的范围,将降解电位(DP)设定为-95 V,碰撞能量(CE)设定为-5 V.对于TOF-MS / MS扫描,IDA设置设置如下:DP AT -95 V,CE在-30V,扩散为±10 V,充电状态-1,强度阈值,500cps,40℃的最大候选离子数量为4;排除4D内的同位素。 TOF-MS和MS / MS扫描的累积时间分别设定为250ms和100ms。
      对于代谢组数据处理,从原始数据中提取峰面积以产生数据矩阵并归一化反对每个样品的蛋白质浓度和蛋白质浓度。进行主成分分析(PCA)以确定控制之间的差异 相对 丁酸丁酸治疗组。随后用于根据项目(VIP)值的可变重要性,随后用于潜在结构判别分析(OPLS-DA)的正交突起进行筛选潜在的生物标志物。学生们 t - 表演,并且代谢物显示 p value<0.05分配为代谢生物标志物。这些代谢物通过匹配准确而具有显着水平变化 m/z 获得的前体(质量耐受性<10 ppm)和片段离子,来自包括人类代谢数据库(HMDB)的代谢物数据库的条目(HMDB, http://www.hmdb.ca/),massbank(http://www.massbank.jp)和梅林(http://metlin.scripps.edu)。

       活力和增殖速率测定

      确定细胞活力,200μl细胞悬浮液(~5×104 将细胞/孔)分配在96孔板中并用丁酸盐在指定浓度下预孵育24小时。在丁酸盐处理后,培养基含有10%储存CCK-8(Dojindo,Kanagawa,Japan)的10%储存溶液的100μl非烯醇红色培养基。将板在37℃温育30分钟,并得到的OD480 由自动微孔板读取器(Synergy H1,Biotek,Winooski,VT)记录值以确定可行细胞的数量。为了测定增殖,将细胞以6个单独的96孔板接种,密度为~1×10 4 细胞/孔并用含有2%FBS的培养基中的指定试剂处理。从播种细胞后第八天到第八天,通过CCK-8每24小时通过CCK-8测定细胞活力,并绘制增殖曲线。为了通过BRDU掺入测定,使用细胞增殖测定试剂盒(Merck Millipore)。将细胞镀在96孔板中并用所示的试剂处理。根据制造商的说明进行增殖率的测量。

       RNA干扰

      炒的小干扰RNA(siRNA)和靶向PKM2的siRNA购自Santa Cruz(达拉斯,TX)。用脂肪甲胺用糖浆(SC-37007)和PKM2 siRNA(SC-62820)转染HCT116细胞TM值 根据制造商的说明,RNaimax试剂(Invitrogen,Grand Island,Ny)在无抗生素培养基中进行24小时。

       统计分析

      数据显示为平均值±s.e.两组之间的统计差异由学生确定 t - 最低,而三个或更多组的比较被一次单向ANOVA分析,然后进行Tukey-Kramer测试。 p <0.05被认为是统计学意义。统计分析由GraphPad Prism V6.01(GraphPad Software,La Jolla,CA)进行。

      结果

       丁酸盐抑制了结直肠癌细胞中的Warburg效果

      我们首先验证了在HCT116细胞系中丁酸盐诱导的结肠直肠癌细胞的抑制性增殖。如此 Fig. 1A,丁酸盐以剂量依赖性方式显着抑制HCT116细胞的增殖。生长曲线研究验证了1米m 丁酸盐完全抑制HCT116细胞的增殖,甚至是0.25米的最低剂量m 丁酸盐能够尤其影响细胞增殖率(Fig. 1B)。我们还验证了丁酸盐对使用其他两种结直肠癌细胞系癌肠细胞增殖的这种抑制作用,即HT29(补充图S1A)和lovo(补充图S1B) 细胞。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1丁酸盐抑制抑制作用在结肠直肠癌细胞中的抑制作用。 A,用丁酸盐处理Hct116细胞24小时,并且通过CCK-8细胞活力测定法测定响应于处理的活细胞数量(n = 5)。数据作为平均值呈现为±s.e.,*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. B,6天的延长处理用CCK-8测定的丁酸盐的延长处理(n = 5)。数据显示为平均值±s.e.
      由于癌细胞的连续和快速增殖在很大程度上取决于称为Warburg效应的代谢重编程,我们询问丁酸盐是否破坏结肠直肠癌细胞的代谢以抑制细胞增殖。为此,我们使用基于HCRMS的代谢组种方法,并综合探讨了用丁酸盐处理后HCT116细胞的代谢物变化。通过通过PCA处理来自非残留的和丁酸酯处理的HCT116细胞(24h处理)的提取物的UPLC-Q / TOF数据来表征丁酸介导的代谢物变化。两组数据均显示PCA模型中的良好再现性和分离( Fig. 2A)。然后,我们使用OPLS-DA分析相同的数据集(补充图。S2A)并选择具有VIP值的内源代谢物>1,通过S-Plot进一步验证了对OPLS-DA模型和可靠性的贡献(补充图。S2B)。一种 t - 最终表演,那些代谢物 p value<0.05分配为潜在的生物标志物(补充表S3A,si)。基于精确的质量和MS / MS碎片信息,我们鉴定了总共48个代谢物,以响应丁酸盐处理而显着改变(补充表S3B.,si)。 Fig. 2B 显示热图,示出了来自所识别的生物标志物的代表代谢物的丰度水平变化。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2丁酸盐诱导结肠直肠癌细胞的代谢重编程。 用丁酸盐处理Hct116细胞(1米m)24小时,并通过LC-MS / MS萃取细胞内代谢物并通过LC-MS / MS分析。 A,将丁酸盐处理的HCT116细胞分化的主要成分分析模型的分数图与非处理细胞的细胞。 B,热爱图显示了丁酸盐处理的细胞和对照组所识别的潜在生物标志物的差异。 C,从丁酸处理细胞鉴定的潜在生物标志物的代谢途径富集分析。参与糖酵解的代表性代谢物(D),核苷酸合成(E)和TCA循环(F)在总结24小时丁酸盐处理后接受表达水平的变化(n = 5). G,丁酸盐诱导的结肠直肠癌细胞诱导的代谢重编程的示意性概述。数据作为平均值呈现为±s.e.,*p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001。 G6P:葡萄糖-6-磷酸盐; 3pg:3-磷胶; PEP:磷丙酮酸; R5P:核糖糖 - 5-磷酸盐; 5'-IMP:Inosine 5'-单磷酸盐; 5'-GMP:鸟苷5'-单磷酸盐; 5'-UMP:尿苷5'-单磷酸盐; PYR:丙酮酸; LAC:乳酸; AC-COA:乙酰辅酶A; TCA循环:三羧酸酸循环。
      为了获得代谢洞察丁酸丁酸的调节作用在介导HCT116细胞的代谢中,我们进行了一种途径富集分析,并将甲状腺发生的途径基于使用MetaboAnalyst的鉴定代谢物(Fig. 2C)。通过丁酸盐处理改变了各种途径,包括丙酮酸代谢,糖酵解,氨基/核苷酸代谢,TCA循环,PPP,氨基酸代谢和嘌呤/嘧啶代谢。具体而言,我们注意到,糖酵解的几种代谢物中间体如果糖1,6-双磷酸(FBP),3-磷酸甘油(3pg)和磷酸丙酮(PEP),以及参与核苷酸合成的那些,如核糖5-磷酸盐(R5P),谷氨酰胺和5'-NMPS(Fig. 2D2E),被显着降低。此外,丝氨酸和甘氨酸生物合成的代谢产物,如3'-磷酸 - l由甘油酵母中间体3-Pg转化的菌丝(3'p-ser),丝氨酸和甘氨酸,也降低(Fig. 2E)。相比之下,在丁酸处理的细胞中同时增加乙酰-CoA和下游TCA代谢物的水平,观察到丙酮酸的显着增加(〜3倍)(Fig. 2F)。这与发现丙酮酸从细胞溶胶传送到线粒体并代谢到乙酰-CoA,其进一步进入TCA循环并产生柠檬酸盐以及下游中间体。 Warburg效应,其特征在于从丙酮酸的代谢而且抑制TCA循环和氧化磷酸化的乳酸乳酸乳酸累积,是癌症代谢模式的标志。有趣的是,我们发现HCT116细胞的丁酸丁酸丁酸处理显着降低了乳酸水平,尽管具有显着富集的丙酮酸源(Fig. 2D),表示来自合成代谢过程的代谢转变,例如构建嵌段制剂和糖醇分解,对于肿瘤细胞增殖与氧化磷酸化和能量产生。 Fig. 2G 呈现了在HCT116细胞中丁酸盐处理诱导的诱导的诱导的诱导代谢重编程的示意性描述。

       丁酸盐诱导的代谢重编程是增殖性抑制的下潜

      在揭示丁酸盐处理诱导的结肠直肠癌细胞的显着改变改变的结肠直肠癌的代谢模式之后,我们试图发现重新编程的代谢表型和增殖性抑制效果之间的联系。因此,我们补充了涉及细胞丁酸酯改造的代谢途径的关键中间体,并研究了这种补充是否可以通过丁酸盐直接调节随后的增殖抑制。因为丙酮酸是代谢物,即通道糖酵解和TCA循环,并且响应丁酸盐处理的响应而显示出最显着的变化,首先将丙酮酸加入HCT116细胞并表征了相应的代谢模式。有趣的是,丙酮酸补充剂诱导的代谢程序类似于丁酸酯处理的细胞,表现出糖醇分解的整体下调和促进的TCA循环促进的TCA循环途径和核苷酸合成途径(Fig. 3A)。此外,丙酮酸的共同分子(5米m)用丁酸盐进一步加强抑制丁酸丁酸诱导的增殖速率(Fig. 3B)。这些事实表明,丙酮酸以像丁酸盐处理的HCT116细胞等方式重塑代谢表型,并且这种表型直接影响细胞的增殖决策。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3丁酸盐诱导的代谢重编程为其抑制对癌结肠直肠细胞增殖的抑制作用。 A,响应于HCT116细胞中丙酮酸的补充剂而改变了代谢性代谢物水平(n = 5,治疗持续24小时)。 B,丙酮酸补充剂的影响(5米m)关于丁酸盐处理细胞的细胞活力(n = 5,治疗持续24小时)。不同浓度的施用丁酸盐在图表中标记。 C,Brdu掺入显示出48小时丁酸盐处理与核苷酸合成的干扰(n = 4). D,丁酸丁酸酯和脱氧碱的共同分析的影响(500μm)对细胞活力进行24小时(n = 5)。不同浓度的施用丁酸盐在图表中标记。 E,向细胞添加次黄嘌呤逆转丁酸盐处理诱导的Brdu掺入率的降低(n = 4)。数据作为平均值呈现为±s.e.,*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
      我们下次试图阐明丁酸盐重组的代谢表型如何有助于抑制增殖。因为丁酸盐处理导致核苷酸的核苷酸合成和预先与增殖抑制相关的核苷酸的降低,我们使用Brdu掺入测定研究了丁酸盐处理细胞的增殖率。如图所示 Fig. 3C,丁酸盐以浓度依赖性方式降低了Brdu进入新合成的DNA。在HT29中还验证了通过丁酸盐抑制Brdu掺入(补充图S3A)和lovo细胞(补充图。S3B)。因此,我们将额外的核苷酸添加到丁酸盐处理的细胞中并测试该处理是否会逆转丁酸抑制的增殖。我们共同施用缺氧(500μm)用丁酸丁酸盐到HCT116细胞,并表明缺氧内的补充颠倒了丁酸丁酸诱导的Brdu的抑制并改善了丁酸盐的增殖抑制(Fig. 3D3E),表明核苷酸合成的代谢中间体水平降低部分解释丁酸丁酸酯的增殖抑制。这些观察结果表明丁酸盐可以以代谢依赖性方式起作用以抑制细胞增殖。丁酸盐从TCA循环脱蛋白代谢,从而抑制糖酵解并导致限制释放给PPP和压抑的核苷酸合成。

       丁酸酯靶向结肠直肠癌细胞的丙酮酸激酶m2

      因为我们的代谢组学数据强烈表明丁酸盐通过重塑代谢抑制结直肠癌细胞的增殖,我们假设丁酸盐可能直接靶向特异性代谢酶或其上游调节剂。基于飞镖的蛋白质组学方法用于发现丁酸盐的靶蛋白。我们选择了Darts作为目标发现的工具,因为它直接比较蛋白水解消化后丁酸盐处理细胞的蛋白质组学曲线,并将药物稳定的蛋白质鉴定为靶靶的靶标,而无需额外改变丁酸盐,而常规方法通常涉及丁酸的固定化,即丁酸盐容易改变其生物活性。介绍了用于目标识别和验证的飞镖的简单示意性工作流程 Fig. 4A.
      首先,首先用0,0.5,2和8M的浓度用丁酸盐孵育细胞裂解物m 并随后添加蛋白酶以消化丁酸孵育的裂解物。消化的裂解物通过SDS-PAGE分离并通过Coomassie蓝染色可视化。如图所示 Fig. 4B,密度测定法的相对定量表明,60kDa的带状与与其他带相比的丁酸剂量的增量表现出明显浓度的浓度依赖性增加。我们推理在缺乏和存在的情况下,发生这种差异丰度,因为该带内的蛋白质变得稳定并且通过结合丁酸酯而易受消化酶的影响。因此,我们试图通过定量蛋白质组学发现该特定凝胶带中存在的蛋白质靶标。
      为了增强凝胶消化蛋白质的蛋白质组学定量的可靠性,我们将相同量的BSA(MW〜66kDa)掺入每个样品中的蛋白质。 BSA的电泳行为预先评估,显示在〜60kDa的靶蛋白的凝聚(补充图S4a)并且表明BSA适用于这种情况下靶蛋白的相对定量。随后通过胰蛋白酶消化60kDa蛋白质带,并通过高灵敏度和高分辨率Q-TOF MS进行质谱分析。综述了鉴定的蛋白质 补充表S2,si。在〜60kDa带中最高丰度的蛋白质中,丙酮酸激酶PKM(p14618 kpym_human),60kda热休克蛋白(p10809 ch60_human)和ATP合酶亚基α(P25705 Atpa_human)排名在前3位的所有命中这个蛋白质带。
      然后我们使用与BSA的标签无定量方法量量化这些蛋白质(补充图S4B)并且发现PKM的丰度在浸润后浸润后孵育后突然消化后的丁酸盐剂量(Fig. 4C),而其他蛋白质显示出忽略的丰富变化(补充图S4B)。 Fig. 4D 显示有助于鉴定PKM的代表性独特肽的MS / MS谱 补充图。S4C 显示在丁酸盐治疗增加浓度后增加的PKM肽的丰度。总结了用于PKM和BSA的相对定量的所有肽的MS / MS光谱 补充表S4,Si和定量细节总结在 补充表S5,si。基于飞镖的蛋白质组学数据表明,丁酸盐直接与细胞裂解物中的PKM结合,并且丁酸酯结合的蛋白质复合物的形成保护PKM免受浸酶消化。考虑到PKM在催化丙酮酸的生产中PKM的生物学功能,丁酸盐重新编程HCT116结肠直肠癌细胞的代谢,并通过直接结合施加其增殖抑制作用,从而调节PK的生物活性。
      虽然PKM1和PKM2之间的差异不是MS由于高序列同源性而完成的,但QPCR和Western印迹实验均显示PKM2是HCT116细胞中PK的显性异构形式(补充图。S4D-S4E)。此外,进行Western印迹以分析在飞镖处理后HCT116细胞裂解物中的蛋白质,并显示PKM2的免疫印迹带在突然消化后孵育时呈较高的丰富,表明PKM2变得不易受到敏感丁基丁酸盐后突出消化(Fig. 4E)。对于蛋白质印迹实验的对照蛋白的丰富,即GAPDH,随着丁酸盐浓度的增加而保持恒定,表明通过丁酸盐诱导了对GAPDH的稳定作用。通过HT29和Lovo细胞中的Western印迹实验,还通过Western印迹实验证实了PKM2对PKM2的这种特异性稳定作用( 补充图。S4F)。为了进一步证明丁酸丁酸酯与PKM2的结合,我们使用丁酸丁酸酯和重组PKM2蛋白进行飞镖测定。将重组PKM2与不同剂量的丁酸盐一起温育,并进行浸渍消化,然后进行SDS-PAGE分离和Coomassie蓝染色。如图所示 Fig. 4F,丁酸盐也保护重组PKM2蛋白免于浸棋消化,证明丁酸盐和PKM2之间的相互作用。

       丁酸盐通过激活PKM2来重新汇流代谢

      在将PKM2识别为丁酸丁酸的结合靶后,通过LDH偶联的比色测定评估丁酸酯结合的PKM2的激酶活性。如图所示 Fig. 5A,丁酸盐处理以剂量依赖性方式加速了NADH的消耗,揭示了丁酸盐对细胞内PK活性的促进作用。此外,我们排除了通过实时PCR和免疫印迹通过实时PCR和免疫印迹通过预调节的PKM2表达,丁酸酯( Fig. 5B)。在HT29和Lovo细胞中还证明了丁酸盐对PK活性的提高(补充图S5A)。此外,通过丁酸丁酸丁酸丁酯的水平增加,通过丁酸盐的激活来证明PKM2(Fig. 2F)。丙酮酸水平升高不太可能源于乳酸的变化水平,因为表达水平和LDH的活性都没有通过使用QPCR和LDH测定的丁酸盐处理扰动(补充图S5B)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5丁酸盐通过激活PKM2来改变细胞代谢并影响细胞增殖。 A,通过LDH偶联的比色测定法测定与丁酸丁酸丁酸丁酸丁酸盐后的细胞裂解物的PK活性。通过底物消耗的速率计算丁酸盐处理后的PK活性,并与未处理基团的PK活性进行比较。 B,PKM2在mRNA和蛋白质水平上的表达不受影响,如实时PCR和免疫印迹所示。 C,HCT116细胞的代谢程序在24h处理后,用PKM2活化剂TEPP-46模仿通过丁酸盐调节的改造的代谢曲线。 D,TEPP-46的共同分析和丁酸盐对细胞活力的影响。 E,用PKM2抑制剂Shikonin的24 H处理诱导的代谢物水平改变。 F,Shikonin的共同分析和丁酸盐的影响24小时对细胞活力的影响。 GPKM2沉默对Brdu掺入率的影响通过丁酸盐处理干扰(24小时处理)。免疫印迹实验验证了SIPKM2的PKM2的沉默。数据作为平均值呈现为±s.e.,*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
      丁酸盐和丙酮酸含量被认为是乙酰-CoA的前体,其负责组蛋白乙酰化并通过调节基因表达来影响细胞代谢。为了评价丁酸酯诱导的丙酮化物过量对组蛋白乙酰化以及细胞代谢的影响,我们分析了丁酸盐和丙酮酸处理后组蛋白的乙酰化水平。如图所示 补充图S5C,丁酸盐诱导乙酰化组蛋白H3作为众所周知的HDAC抑制剂的显着积聚,而单独给予丙酮酸盐的给药未能改变H3的泛乙酰化水平,表明丙酮酸水平增加可能通过代谢重塑直接影响细胞增殖而不是通过组蛋白调制。我们的观察似乎与先前的研究相矛盾,所述研究报告用作HDAC抑制剂和乙酰化H4增加的丙酮酸。差异可以通过SLC5a8的低表达水平,转运蛋白负责癌细胞中的细胞外丙酮酸的摄取(
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      • Ganapathy V.
      SLC5A8通过丙酮酸依赖性抑制组蛋白脱乙酰酶来触发肿瘤细胞凋亡。
      ,
      • Thangaraju M.
      • Carswell K.n.
      • Prasad P.D.
      • Ganapathy V.
      结肠癌细胞保持低水平的丙酮酸液,以避免通过抑制HDAC1 / HDAC3引起的细胞死亡。
      )。由于我们在以前的研究中没有过度表达HCT116细胞中的转运蛋白,这可能会考虑在本研究中观察到的乙酰化H3水平的可忽略变化。因此,研究将丙酮酸含量增加与组蛋白乙酰化的贡献以及对未来研究中的细胞命名的影响是有兴趣的。
      接下来,我们的目标是通过丁酸盐验证丁酸盐中结肠直肠癌细胞中的PKM2是否负责抑制增殖。我们利用PKM2激动剂TEPP-46治疗HCT116细胞,并研究了是否通过丁酸处理诱导了类似的代谢程序。 Fig. 5C 表明TEPP-46增加了TCA周期中丙酮酸水平和代谢中间体,同时降低了PPP和糖酵解中代谢中间体的水平,模拟了通过丁酸酯调节的改造的代谢曲线。根据代谢物谱,细胞活力测定表明TEPP46治疗也加剧了丁酸诱导的增殖抑制(Fig. 5D)。此外,我们向HCT116细胞进行PKM2抑制剂Shikonin并检查相应的代谢谱。代谢组合数据显示,Shikonin治疗降低了具有上调的G6p(含量)患者参与TCA循环的丙酮酸水平和代谢中间体(Fig. 5E)。我们随后进行了细胞活力测定,并证明通过Shikonin对PKM2活性的抑制显着逆转了通过丁酸丁酸丁酯的HCT116细胞增殖抑制(Fig. 5F)。此外,当高浓度的丁酸盐(4米)时,逆转m给予细胞,暗示PKM2活化剂丁酸盐和抑制剂Shikonin之间的浓度依赖性竞争。为了进一步验证PKM2在丁酸丁酸的增殖抑制效果中的累积,采用PKM2沉默的方法。如图所示 Fig. 5G,靶向PKM的siRNA诱导PKM2的选择性沉默与扰的siRNA相比。在PKM2沉默之后,在丁酸盐处理的HCT116细胞中没有观察到BRDU掺入的显着变化,与加扰的siRNA处理的细胞形成鲜明对比。这些结果表明,PKM2的存在用作丁酸酯在调节细胞增殖中施加其功能的前提。

       通过抑制磷酸化并促进四聚化,丁酸酯激活PKM2

      整合性代谢组和化学蛋白质组学与所有生化证据一起致力于强烈支持,丁酸盐重塑代谢,从而抑制通过靶向PKM2的结肠直肠癌细胞的增殖。我们下次试图揭示丁酸盐激活PKM2的基础。 PKM2的活性通过其翻译后修改(PTM)状态紧密控制。例如,据报道磷酸化直接导致下调的细胞内PK活性。如图所示 Fig. 6A,Tyr.105在与非加入细胞相比,将细胞孵育细胞孵育细胞后,逐渐降低 - 磷酸化的PKM2形式,与非加注的细胞增加,与丁酸酯刺激的PK活性逆转。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6丁酸盐抑制PKM2的磷酸化,同时促进四聚化。 A,丁酸盐对tyr的影响105通过免疫印迹测定 - 磷酸化形式的PKM2(PKM2)。 B如通过免疫印迹所提出的,通过与戊二醛交联后,PKM2寡聚化合物以及包括TEPP和丝氨酸的其他PKM2活化剂,如受免疫印迹的那样,包括TEPP和丝氨酸的影响。通过具有短曝光(10秒)的图像最佳地呈现单体和二聚体形式的PKM2的丰度,而通过具有长曝光的图像可视化丁酸盐处理后的上调的四聚体形式,以便通过图像可视化( 90s)。
      还证明了PKM2的寡聚化以确定其PK活性;因此,我们进一步测试了丁酸丁酸是否可以诱导对PKM2的四聚化的变化。有趣的是,戊二醛交联实验表明,四聚体PKM2在HCT116细胞中依次在HCT116细胞中依赖于HCT116细胞,随着磷酸化的PKM2水平降低(Fig. 6B)。虽然PKM2的四聚化和磷酸化之间的关系仍然尚不清楚,但是可以脱磷酸化物质偏离PKM2四聚体的形成。有趣的是,我们发现一个4米m - 丁酸盐处理诱导显着较高水平的PKM2四聚体,而不是50米的诱导m 与丝氨酸相比,丝氨酸表明丁酸盐可能是较强的PKM2活化剂。因此,这些结果为丁酸盐提供了对PKM2刺激的机械解释。通过与PKM2结合,丁酸盐防止PKM2的磷酸化同时促进四聚体PKM2的形成,随后导致增强的PK活性。

      讨论

      以前,丁酸丁酸抗弃性函数的潜在机制主要与其作为HDAC的内源性抑制剂的作用以及随后通过介导HDAC依赖性转录激活来调节促凋亡基因和抗增殖调节剂(
      • Thangaraju M.
      • Cresci G.A.
      • 刘克。
      • Ananth S.
      • Gnanaprakasam J.P.
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      • Prasad P.D.
      • Ganapathy V.
      GPR109a是一种用于细菌发酵产物的G蛋白偶联受体,并用作结肠中的肿瘤抑制剂。
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      丁酸盐处理结直肠癌细胞的定量和时间蛋白质组分析。
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      HT29结直肠癌细胞中丁酸盐作用及丁酸丁酸抑郁率的蛋白质组学分析。
      )。然而,由于癌细胞的快速增殖在很大程度上取决于提供各种构建块的明确定义的重新编程代谢,因此我们推理丁酸盐可能直接影响结肠直肠癌细胞的代谢,以引发其增殖性抑制作用。在该研究中,综合的糖酵解PKM2的关键激酶被鉴定为丁酸盐的结合靶标,并显示出诱导代谢重塑,并最终通过丁酸盐激活而导致增殖停滞。由此建立了丁酸盐抑制结直肠癌细胞增殖和相应的代谢方案的机械关系。
      通常接受癌症肠细胞通过依赖于有氧糖酵解作为其主要能量来源而不是用正常细胞使用丁酸酯来接受癌症肠球的效果。虽然这种代谢程序是ATP生产方式不足,但它有利于对营养成分的吸收和诸如核苷酸的生物量的合成,因此需要支持癌细胞的快速增殖(
      • Lunt S.Y。
      • vander heiden m.g.
      有氧糖酵解:满足细胞增殖的代谢要求。
      )。考虑到癌细胞对代谢重编程能力的需求,因此高度可能通过丁酸盐引发的增殖滞留与其改造结直肠癌细胞的代谢的能力直接相关。因此,我们采用了OMICS技术来揭示丁酸盐是否可以在伴随抑制增殖的同时重新挤出结肠直肠癌细胞的新陈代谢。预期,代谢组科数据将溶解的代谢平衡从溶解对丁酸盐处理时从糖醇分解到氧化磷酸化,这逆转了癌细胞癌中获得的代谢优势。进一步补充通过丁酸盐在HCT116细胞中显着改变的关键代谢物,该方法用于调节丁酸酯诱导的增殖性逮捕。这些实验表明,受影响的丁酸酯的代谢用作抑制增殖的原因而不是结果。因此,我们试图确定丁酸盐的直接蛋白质靶标,介导结直肠癌细胞代谢的重塑。
      鉴于丁酸盐的简单结构,选择了一种基于飞镖的蛋白质组学方法进行靶发现,而避免了需要改变丁酸盐的经典亲和力珠/色谱法的方法(
      • Lomenick B.
      • 郝·
      • jonai n。
      • 下午r.m.
      • Aghajan M.
      • 华堡顿S.
      • 王J.
      • 吴r.p.
      • 戈麦斯F.
      • lo j.a.
      • wohlschlegel j.a.
      • Vondriska下午
      • 颗粒J.
      • Herschman H.R.
      • 克拉迪J.
      • Clarke C.F.
      • 黄杰。
      使用药物亲和力响应靶标稳定性(飞镖)的目标鉴定。
      )。发现的药物靶标本身与靶药物相结合而不是丁酸酯模拟物,随后通过粗定量通过密度测定通过密度测定,通过密度测量来直接在Coomassie蓝色染色的SDS-PAGE凝胶中可视化。通过蛋白质组学进一步鉴定。然后优先考虑从特定凝胶带鉴定的相关功能的高丰度的蛋白质以作为潜在目标进行生物验证。这种目标识别策略缺乏定量基础。相反,我们在执行相对定量时,我们使用尖刺蛋白质,因此设法避免了由凝胶消化和仪器波动引起的差异,与凝胶分离的蛋白质提供更准确和可靠的定量结果传统方法。有趣的是,我们发现PKM2作为丁酸蛋白蛋白之一,这可能考虑通过这种方法使用HCT-116细胞丁酸盐诱导的明显代谢变化。
      免疫印迹实验还证明,通过定量方法鉴定的靶蛋白,即PKM2与丁酸盐结合。进一步的生物化学测定表明,在结合丁酸盐时,PKM2被激活,并负责代谢重编程和随后的增殖逮捕(Fig. 7)。这是第一次通过PKM2靶向代谢转化影响细胞命运的第一次,更重要的是,除了先前鉴定的FBP和丝氨酸之外,丁酸盐还可以代表另一种内源性PKM2活化剂。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7通过靶向丙酮酸激酶M2和代谢重编程,脱丁酸丁酸丁酸抑制结肠癌细胞增殖的示意机制。 PKM2在正常HCT116细胞中以其无活性的二聚体形式显着存在。因此,它有利于有氧糖醇分子,其特征在于乳酸的明显积聚,但抑制TCA循环和氧化磷酸化以支持快速细胞生长。相反,丁酸盐处理在促进四聚体PKM2的形成的同时去磷酸盐的PKM2,增强PKM2的激酶活性。因此,我们发现HCT116细胞显着降低了乳酸水平,同时发出丙酮酸的丰度。同时,代表代谢谱,其代表代谢过程(例如构建嵌段制剂和糖酵解,这对于肿瘤细胞增殖至关重要的糖酵解)被观察到氧化磷酸化和能量产生,这解释了阻碍了核苷酸合成途径,因此抑制了诱导的增殖通过丁酸盐治疗。
      作为糖酵解酶,PK通过催化磷酸盐基团从PEP转移到ADP的同时产生丙酮酸的同时提出糖酵解的最终速率限制步骤。在哺乳动物中存在哺乳动物中的四种PK,包括L,R M1和M2,其中PKM1在大多数正常细胞中表达,并且其剪接变体PKM2仅在增殖细胞如癌细胞和干细胞中发现(
      • 罗W.
      • Semenza G.L.
      PKM2在细胞代谢和癌症进展中的新兴作用。
      )。有趣的是,低PKM2活性促进葡萄糖的助焊剂进入合成代谢糖型衍生途径,而PKM2的取代与组成型活性PKM1转移到远离Warburg衍生的糖酵解的代谢途径,导致氧气消耗增强,乳酸水平降低和损害细胞增殖(
      • Christofk H.R.
      • vander heiden m.g.
      • 哈里斯M.H.
      • ramanathan A.
      • Gerszten r.e.
      • 魏R.
      • 弗莱明M.D.
      • 舍瑞斯S.L.
      • 坎特利L.C.
      丙酮酸激酶的M2接头同种型对于癌症代谢和肿瘤生长是重要的。
      ,
      • Cortes-Cros M.
      • Hemmerlin C.
      • Ferretti S.
      • 张继夫
      • gounarides J.S.
      • 尹H.
      • Muller A.
      • Haberkorn A.
      • Chene P.
      • 卖家W.R.
      • Hofmann F.
      丙酮酸激酶的M2同种型是可分配肿瘤维持和生长的。
      )。因此,评估PKM2活性的调节作为阻碍癌细胞增殖的吸引装置。这种可能性已经严重调查 体内体外。例如,通过显着将葡萄糖衍生的碳掺入中间体(如核糖磷酸盐,所述葡萄糖衍生的碳(例如核糖磷酸盐,所述乙酰CoA和丝氨酸是生物质合成的关键前体(
      • Anastasiou D.
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      • vander heiden m.g.
      丙酮酸激酶M2活化剂促进四聚体形成并抑制肿瘤发生。
      )。根据我们的观察,这种合成代谢的这种干扰导致癌细胞增殖受损;此外,还有效地抑制了小鼠中人肺癌细胞H1299异种移植物的增殖(
      • Cortes-Cros M.
      • Hemmerlin C.
      • Ferretti S.
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      • gounarides J.S.
      • 尹H.
      • Muller A.
      • Haberkorn A.
      • Chene P.
      • 卖家W.R.
      • Hofmann F.
      丙酮酸激酶的M2同种型是可分配肿瘤维持和生长的。
      )。相比之下,ROS诱导的PKM2氧化阻碍了活性并导致通过增加抗氧化代谢物来减轻氧化应激,从而保持肿瘤 - 细胞存活率(
      • Anastasiou D.
      • Poulogiannis G.
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      • 勃艮第G.
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      • 托马斯C.J.
      • vander heiden m.g.
      • 坎特利L.C.
      通过反应性氧物种对丙酮酸激酶M2的抑制有助于细胞抗氧化反应。
      )。结合先前的临床研究,这些临床研究报告的结肠癌患者的结肠含量明显小于正常个体和我们的研究结果(
      • 陈苗。
      • yu y.n.
      • 王J.L.
      • 林Y.W.
      • 孔X.
      • 杨C.Q.
      • 杨L.
      • 刘Z.J.
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      • 刘F.
      • 吴j.x.
      • 钟L.
      • 方D.C.
      • 邹W.
      • 方J.Y.
      晚期结直肠腺瘤患者降低膳食纤维摄入量和肠道微生物的结构改变。
      ,
      • o'keefe s.j.
      饮食,微生物及其代谢物和结肠癌。
      ),结肠癌发育过程中的还原丁酸丁酸盐产生可能占PKM2活性的受损和改造的代谢,并有利于生物质的产生,以促进结肠癌的发育。
      以前的研究已经证明了影响癌细胞存活的内源性PKM2活化剂的FBP和丝氨酸(
      • Jurica M.S.
      • Mesecar A.
      • 希思P.J.
      • 施W.
      • Nowak T.
      • stoddard b.l.
      果糖-1,6-双磷酸羟基磷酸酯的丙酮酸激酶的变构调控。
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      • Chaneton B.
      • 希尔曼第P.
      • 郑L.
      • 马丁A.C.
      • Maddocks O.D.
      • Chokkathakalam A.
      • Coyle J.E.
      • Jankevics A.
      • 持有f.p.
      • Vousden K.H.
      • Frezza C.
      • 奥里利米
      • Gottlieb E.
      丝氨酸是丙酮酸激酶M2的天然配体和变构激活剂。
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      • Maddocks O.D.
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      • Mason S.M.
      • 郑L.
      • Blyth K.
      • Gottlieb E.
      • Vousden K.H.
      丝氨酸饥饿诱导癌细胞中的应力和p53依赖性代谢重塑。
      ),而我们的发现揭示了PKM2的另一个内源性配体。特别是,我们的发现为丁酸盐在正常和癌细胞中的差异效应提供了合理的解释,称为“丁酸悖论”。因为正常和癌症的结肠细胞在代谢丁酸盐中具有不同的能力,因此结肠癌细胞主要采收葡萄糖,同时代谢丁酸盐,导致高水平的丁酸盐积聚。在这种情况下,由于丁酸盐直接激活,因此诱导了相应的高pKM2活性,这随后导致受干扰的癌细胞代谢和增殖逮捕。对于正常细胞,丁酸盐大多代谢为能量源,PK的主要同种型是组成型活性PKM1而不是PKM2。对PKM2的差异代谢序和功能影响以及正常细胞与其癌症对应物之间的代谢,从而解释了丁酸盐在正常和癌细胞中的相反效果。
      最后,我们的研究探讨了丁酸酯诱导的PKM2活化的分子机制。有趣的是,我们发现丁酸盐促进了PKM2的四聚化,但是降低了其二聚体形式,这与先前的知识是PKM2的四聚体形式具有高的PK活性,而不是其几乎活泼的二聚体(
      • Anastasiou D.
      • yu Y.
      • 以色列人W.J.
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      • Brimacombe K.r.
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      • Lunt S.Y。
      • 约翰逊Z.R.
      • 日元。
      • kunii k。
      • 戴维森下午
      • Christofk H.R.
      • 奥斯汀C.P.
      • inglese J.
      • 哈里斯M.H.
      • asara j.m.
      • Stephanopoulos G.
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      • vander heiden m.g.
      丙酮酸激酶M2活化剂促进四聚体形成并抑制肿瘤发生。
      )。伴随着四聚体/二聚体变化,我们也发现了 105丁酸盐酸化的PKM2通过丁酸盐降低。以前,报道了PKM2的不同PTM,包括磷酸化 37105y,氧化 358C,乙酰化 305k和琥珀酰化 311k(
      • Anastasiou D.
      • Poulogiannis G.
      • asara j.m.
      • 拳击手M.B.
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      通过反应性氧物种对丙酮酸激酶M2的抑制有助于细胞抗氧化反应。
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      ERK1 / 2依赖性磷酸化和PKM2的核易位促进了Warburg效应。
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      • aboubechara d.
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      蛋白酪氨酸磷酸酶1B调节丙酮酸激酶M2酪氨酸磷酸化。
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      乙酰化靶向丙酮酸激酶的M2同种型,用于通过伴侣介导的自噬降解并促进肿瘤生长。
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      • 杨P.
      • yu h.
      SIRT5 Sirt5--反应丙烯酸琥珀酸酯并激活丙酮酸激酶M2以阻止巨噬细胞IL-1Beta生产并防止小鼠中的DSS诱导的结肠炎。
      ),它们与酶活性的降低相关。虽然PKM2的磷酸化与四聚化之间的确切关系不清楚,但我们的结果指出了磷酸化对四聚化的可能因果效果。丁酸丁酸酯与PKM2的结合可能会诱导不易磷酸化的构象变化(
      • Bettaieb A.
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      结论

      在这里,我们介绍了一种用于丁酸盐目标发现的代谢引导蛋白质组学策略。首先使用代谢组科来监测使用HRMS改变丁酸丁酯处理改变的癌细胞的代谢谱。有趣的是,在增殖阻断的HCT116细胞中,注意到通过明显丙酮酸丙酮酸丙酸盐和抑制水平的丙酮酸和抑制水平的重组代谢程序,在增殖阻断的HCT116细胞中,建立了代谢重编程和丁酸丁酸的增殖之间的联系。为了解释丁酸盐重塑的代谢,随后使用基于飞镖测定法的定量蛋白质组学方法来解作丁酸酯的结合靶标。蛋白质组学结果表明,糖酵解酶丙酮酸激酶同种型2(PKM2),其负责转化磷酸丙酮酸(PEP)转化为丙酮酸,与丙酮酸结合,指向PKM2影响丁酸酯介导的代谢重塑的潜在累及结直肠癌细胞。免疫印迹实验和生物化学测定的额外证据支持我们的观察结果并证实了丁酸盐在结合后激活PKM2并诱导对应于抑制增殖的代谢表型。因此,我们的研究通过将PKM2介导的代谢重塑与丁酸酯的抗肿瘤功能相关联提供了机械透视。该发现表明,通过靶向PKM2微调结肠直肠癌细胞的新陈代谢是未来治疗结直肠癌的未来具有显着的治疗价值,同时保留正常的结肠细胞功能。

      数据安全性

      所有原料质谱数据都沉积到大量系统中,并可以访问 ftp://massive.ucsd.edu/MSV000082189 使用MSV000082189的项目ID。

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        • aboubechara d.
        • Melhem R.
        • 斯坦霍普K.
        • 卡明布B.
        • 格雷厄姆J.
        • 云彩A.
        • 张某。
        • Lyssiotis C.A.
        • 张Z.Y.
        • 坎特利L.C.
        • 哈维尔P.J.
        • Haj f.g.
        蛋白酪氨酸磷酸酶1B调节丙酮酸激酶M2酪氨酸磷酸化。
        J. Biol。化学。 2013; 288: 17360-17371
        • LV L.
        • 李德。
        • 赵D.
        • 林R.
        • 楚Y.
        • 张H.
        • zha z.
        • 刘Y.
        • 李Z.
        • 徐Y.
        • 王G.
        • 黄扬
        • 熊Y.
        • 关卡。
        • 雷Q.Y.
        乙酰化靶向丙酮酸激酶的M2同种型,用于通过伴侣介导的自噬降解并促进肿瘤生长。
        摩尔。细胞。 2011; 42: 719-730
        • 王F.
        • 王克。
        • 徐W.
        • 赵某。
        • 你D.
        • 王Y.
        • 徐Y.
        • 周L.
        • 楚Y.
        • 张C.
        • 秦X.
        • 杨P.
        • yu h.
        SIRT5 Sirt5--反应丙烯酸琥珀酸酯并激活丙酮酸激酶M2以阻止巨噬细胞IL-1Beta生产并防止小鼠中的DSS诱导的结肠炎。
        细胞代表。 2017; 19: 2331-2344