抗原血浆抗体使用的抗原分析 大肠杆菌 Proteome Chips*

  • Te-Yao Hsu
    一致
    应讨论谁对应:食品安全/卫生和风险管理部,医学院,国立程功大学,8F,8F,138,盛丽路,东区,台南市704,台湾704。 Tel.:003535 Ext。 5964
    隶属关系
    台湾高雄昌涌纪念医院高雄昌涌纪念医院妇产科,台湾高雄,高雄大学医学院;
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  • 吉云 - 林
    隶属关系
    国家中央大学毕业生生物学与生物信息学研究所,台湾仲利32001;

    国家中大学生物医学科学与工程系,台湾仲利32001;
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  • 迈 - 旺T. Nguyen
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    国家中央大学毕业生生物学与生物信息学研究所,台湾仲利32001;

    国家中大学生物医学科学与工程系,台湾仲利32001;
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  • 冯鸿忠
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    国家中央大学毕业生生物学与生物信息学研究所,台湾仲利32001;

    国家中大学生物医学科学与工程系,台湾仲利32001;
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  • 清昌蔡
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    台湾高雄昌涌纪念医院高雄昌涌纪念医院妇产科,台湾高雄,高雄大学医学院;
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  • Hsin-Hsin Cheng
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    台湾高雄昌涌纪念医院高雄昌涌纪念医院妇产科,台湾高雄,高雄大学医学院;
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  • 云菊莱
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    台湾高雄昌涌纪念医院高雄昌涌纪念医院妇产科,台湾高雄,高雄大学医学院;
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  • Hsuan-ning Hung
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    台湾高雄昌涌纪念医院高雄昌涌纪念医院妇产科,台湾高雄,高雄大学医学院;
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  • Chien-Sheng Chen
    一致
    应讨论谁对应:食品安全/卫生和风险管理部,医学院,国立程功大学,8F,8F,138,盛丽路,东区,台南市704,台湾704。 Tel.:003535 Ext。应讨论的5964谁:妇产科,高雄昌康纪念医院,123,Ta-Pei rd。,尼奥-Sung Dist。,台湾高雄市833号。 Tel.:006-7-7317123;传真:+ 886-7-7322915;
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    国家中央大学毕业生生物学与生物信息学研究所,台湾仲利32001;

    国家中大学生物医学科学与工程系,台湾仲利32001;

    食品安全/卫生卫生和风险管理,医学院,国民成公塘大学,台南市台南市704
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了科技部台湾,大多数104-2320-B-008-002-MY3和GRANTS NMRPG8D0251,以及台湾的退伍军人综合医院和大学系统。
    本文含有补充材料。
      预先普利坦斯预先是围产期死亡率和发病率的主要原因之一。已经发现了许多用于诊断前预普利坦斯预先诊断的生物标志物,但大多数精度低。因此,需要一种能够以高精度检测异丙普斯的潜在标记。已据报告感染是预先引发前的原因。近年来,蛋白质微阵列芯片已被认为是一种强大而强大的工具,用于对感染诊断的分析抗体。本研究的目的是在人类血浆的抗体中抗体,以鉴定合适的生物标志物。在这项研究中,一个大肠杆菌用来自29个个体的样品(16个生态蛋白酶和13名健康孕妇)的样品探测芯片,以思考血浆抗体。生物信息学工具用于分析结果,发现保守的图案,与整个人类蛋白质组进行比较,并进行蛋白质功能分析。使用抗体分类剂k - 收集盲化试验的分量对和其他样品。结果表明,与健康女性相比,普生动物前女性分别表现出108和130个差异免疫原性蛋白,分别针对人免疫球蛋白G和M。此外,与健康女性相比,Eclamptic妇女促进了更多免疫球蛋白G,但免疫球蛋白M对抗细菌表面蛋白。 K-Top Scoring对将五对免疫原性蛋白质鉴定为盲试验中具有90%的高精度的分类器。 [Ag] [ISV] GV [IE] L [LF]和[IV] RI [AG] [Ad] E是免疫球蛋白G和Immuncticic女性免疫球蛋白M中的免疫原性蛋白中观察到的共有基序,分别,但是,但Ga [Ag] [Al] 1 [LF]和[ILV] [ILV] [ILV] Gi [GH] [αEF] [AER] [ATY] [RG] N [IV]在免疫球蛋白G和免疫球蛋白M分别观察到健康女性的免疫球蛋白M。
      预先报道前(PE)
      使用的缩写是:
      PE.
      预先普利坦斯
      IgG.
      免疫球蛋白G.
      IgM.
      免疫球蛋白M.
      FDR.
      假发现率
      基因本体论
      ke
      Kyoto基因和基因组的百科全书
      林马
      微阵列的线性模型
      GLAM2
      隐形局部对齐的主题
      k-TSP.
      k-top得分对
      SVM
      支持矢量机器
      kNN.
      k-最近的邻居
      CS
      凯瑟西党
      vd.
      阴道分娩
      PP-13
      胎盘蛋白质13.
      s
      可溶性endoglin.
      sFlt-1
      可溶性FMS样酪氨酸激酶1
      PLGF.
      胎盘生长因子。
      1使用的缩写是:PE.
      预先普利坦斯
      IgG.
      免疫球蛋白G.
      IgM.
      免疫球蛋白M.
      FDR.
      假发现率
      基因本体论
      ke
      Kyoto基因和基因组的百科全书
      林马
      微阵列的线性模型
      GLAM2
      隐形局部对齐的主题
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      支持矢量机器
      kNN.
      k-最近的邻居
      CS
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      vd.
      阴道分娩
      PP-13
      胎盘蛋白质13.
      s
      可溶性endoglin.
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      可溶性FMS样酪氨酸激酶1
      PLGF.
      胎盘生长因子。
      是一种影响所有怀孕2-8%的全身疾病(
      • 周Y.
      • damsky c.h.
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      预口度与人类细胞母细胞的失败有关,以模仿血管粘附表型,在该综合征中有一种缺陷血管侵袭的原因?
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      • Milne F.
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      Waugh,J.前欧洲普拉明州社区指南(PROGOG):如何屏幕和检测社区前异国普拉克西亚的暂停。
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      • 米德C.A.
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      预测和预防预测预测和预防葛兰普查:系统审查了经济型号,健康技术的准确性和有效性文献。
      )和孕妇和胎儿发病率和死亡率的显着原因(
      • Jarvenpaa J.
      • Vuoristo J.T.
      • Savolainen e.r.
      • Ukkola O.
      • Vaskivuo T.
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      改变与宫内生长限制相关的前异常血管生成相关胎盘基因的表达。
      )。 PE的特征在于妊娠20周后显着的高血压和蛋白尿(
      • Milne F.
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      Waugh,J.前欧洲普拉明州社区指南(PROGOG):如何屏幕和检测社区前异国普拉克西亚的暂停。
      )。心血管疾病可能是由女性体育病学引起的(
      • 米德C.A.
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      • 梅瑟斯。
      • Juarez-Garcia A.
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      预先异常普利坦斯:病理生理学,诊断和管理。
      )和PE的女性出生的儿童可能有很大的发展中风,冠心病和成年期代谢综合征(
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      来自孕妇的孕产缺氧诱导转录因子HIF-2α的选择性过表达,胎儿患有先兆子痫的孕产病。
      )。体育患者分享了一些常见的症状,如头痛和水肿。 PE的原因是未知的。目前,血管生成障碍(
      • Rajakumar A.
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      早孕抗原因子的顺序变化及开发前普拉克西亚的风险。
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      • Sargent I.L.
      了解Preclampsia的最新进展。
      )或免疫变化(
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      正常妊娠免疫调节和预普利克斯预示:概述。
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      • 种子P.T.
      • 凯莉F.J.
      • 深南A.H.
      C孕妇预防患者预防妇女的胰腺炎患者维生素C和维生素E.(VIP试验):随机安慰剂对照试验。
      )可能与PE相关。母亲年龄,家族史和预先存在的疾病都增加了体育风险。
      已经测试了许多药剂以降低体育发展的可能性。维生素C和维生素E等补充营养素不会降低体育风险(
      • Poston L.
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      C孕妇预防患者预防妇女的胰腺炎患者维生素C和维生素E.(VIP试验):随机安慰剂对照试验。
      )。阿司匹林在妊娠早期消费时对PE有强烈的预防效果(
      • Duley L.
      • Henderson-Smart D.J.
      • 梅瑟斯。
      • 王J.F.
      用于预防预痫前的抗血小板剂及其并发症。
      )每日低水平膳食钙摄入量可以改善高风险群体的结果(
      • Hofmeyr G.J.
      • Atallah A.N.
      • Duley L.
      预防高血压障碍及相关问题的妊娠期钙补充剂。
      )。相比之下,妊娠期间的镁补充剂不会改善结果(
      • Makrides M.
      • Crosby D.D.
      • 贝恩E.
      • 霞鱼C.A.
      怀孕镁补充剂。
      )。 PE治疗在过去的50年里没有大幅改变(
      • 诺里斯米
      • Perico N.
      • Remuzzi G.
      疾病机制:预兴普症。
      )。然而,早期治疗可以具有强烈的预防效果,使早期诊断优先考虑。
      虽然成像技术是诊断PE最常见的方法,但它们的准确性是不一致的。由于其临床介绍的异质性,无需准确地预测PE的发作(
      • 特纳j.a.
      预先报道前的诊断和管理:更新。
      )。劳动诱导是PE危险症状表现的唯一明确的治疗方法。潜在的生物标志物应具有在最早阶段以高精度检测PE的能力。这种生物标志物的广泛实施可能能够以低风险显示谁。可溶性FMS样酪氨酸激酶1(SFLT-1),可溶性腹膜林(Seng),胎盘生长因子(PLGF)和胎盘蛋白13(PP-13)被认为是PE的生物标志物。然而,所有这些蛋白质在不同组之间表现出低的准确性或不一致的精度(
      • Stepan H.
      • Geipel A.
      • 施瓦茨F.
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      循环可溶性endoglin及其在二孕代妊娠期妊娠期妊娠期妊娠期妊娠期异常妊娠期妊娠期的预测价值。
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      随后开发出先兆子痫的女性中,溶于胚胎和转化生长因子-β1。
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      循环胎盘生长因子,血管内皮生长因子,可溶性FMS样酪氨酸激酶1和可溶性胚胎植物在预测前的循环胎盘生长因子,可溶性胚胎林:系统综述和荟萃分析。
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      先兆子痫风险评估的孕孕孕孕孕孕孕。
      )。许多研究专注于可能的体育生物标志物,但仍有待发现的有效。
      感染可能与PE开发有关(
      • Conde-Agudelo A.
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      母体感染与先兆子痫的风险:系统评论和细胞分析。
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      Preclampsia是一种传染病吗?
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      感染预口普拉姆斯的主要危险因素吗?
      )尿路感染可能是导致PE的危险因素(
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      急性母体感染与预兴高采烈的风险:基于人群的案例对照研究。
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      妊娠期尿路感染,血管生成因子谱和先兆子痫风险。
      )。一项研究发现,用抗生素治疗减少PE率为53%(
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      感染预口普拉姆斯的主要危险因素吗?
      )。蛋白质组微阵列是一种强大而有效的工具,用于分析抗体和鉴定感染的生物标志物(
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      Chen,CS,Sullivan,S.,安德森,T.,Tan,AC,Alex,PJ,Brant,SR,Cuffari,C.,Bayless,TM,Talor,MV,Burek,Cl,Wang,H.,Li, R.,Datta,LW,Wu,Y.,WinSlow,RL,朱,H.和Li,X.,使用大肠杆菌蛋白质芯片使用大肠杆菌蛋白质芯片鉴定炎症性肠病的新型血清生物标志物。摩尔。细胞。蛋白质组学8,1765-1776

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      蛋白质微阵列和传染病的生物标志物。
      )。在本研究中,探测人血浆 大肠杆菌 (大肠杆菌)蛋白质组微阵列发现潜在的生物标志物进行PE检测。将生物信息学工具应用于分析差异结合蛋白,用于发现保守的基序,这些蛋白质被针对整个人类蛋白质询问。另外,通过使用鉴定抗体分类剂 k-top得分对(k-TSP.S)和用于盲化测试的其他样品。

      实验步骤

       患者信息

      收集来自PE(ICD 10:O1413)和23名患有正常妊娠的女性的二十三种血液样本,并储存在乙二胺四乙酸管中。随后立即使用3000rpm和4℃的离心,并在-80℃下立即冷冻等离子体。使用ELISA试剂盒(eBioscience,San Diego,CA)测定每个血浆样品中的总IgG浓度。

       蛋白质组芯片测定

      一个 大肠杆菌 从-80°C冰箱中检索蛋白质组芯片,并在PBS缓冲液中封闭3%BSA 1小时。用PBS-T缓冲液轻轻漂洗芯片后,用一个单独探测所有4mg / ml PE和健康等离子体样品 大肠杆菌 蛋白质组芯片。探测Dylight 650标记的抗人均IgG抗体和Dylight 550标记的抗人IgM抗体分别检测等离子体样品中的IgG和IgM抗体。最后,用PBS-T缓冲液洗涤芯片三次,并使用微阵列扫描仪扫描(LuxScantm 10K MicroArray扫描仪; CapitalBio Corporation,北京,中国)。

       数据预处理

      使用Genepix Pro 6.O软件(Molecular Devices,Sunnyvale,CA)对齐蛋白质斑点的结合信号并提取。进行PCA以排除样本的异常值,该样品显示出明显偏离主要组。采用全球中位数缩放方法,使所有样品的蛋白质强调正常化。 128以下的信号被视为缺失值,并表示为128的最小值。

       鉴定差异结合蛋白

      我们进行了一个两个样本的学生 t 通过使用R环境中的Limma软件包来测试和多次测试校正以鉴定显着的蛋白质。 LiMMA是用于分析来自微阵列引起的基因表达数据的包装。严格的截止由FDR控制,不高于0.05。更严格的阈值由低于0.05的FDR控制,折叠变化高于2倍。进一步分析并使用双向等级聚类热图进行分析并证明蛋白质。虽然样品和分层集群对实际标签的比较,检查了体育和健康孕妇妇女分类中的准确性。仅选择具有高于0.7的精度的簇。

       PE.结合蛋白的功能性富集分析

      选自FDR阈值较小阈值的蛋白质<将0.05用作查询集,以研究其在体育和健康对照组中的生物学作用。使用David Bioinformatics Resources查询从两组鉴定的蛋白转化的官方基因符号(
      • 黄达W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      )。我们选择了三种功能类别,以进一步调查我们的蛋白质命中,即PEAG类别和KEGG途径的3级中的细胞成分,分子功能和生物过程。这 p 在条形图中可视化每个组中的前五个明显功能的值(Fig. 5)。用来 p 低于0.05的值被定义为显着富集的术语。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5体育患者富集生物过程的功能分析。 A,涉及IgG结合蛋白的五大重大过程。浅蓝色条表示PE患者IgG结合蛋白的显着生物过程。蓝杆表示健康对照中IgG结合蛋白的显着生物方法。 B,参与IgM结合蛋白的五个重要过程。浅蓝色条表示PE患者IgM结合蛋白的显着生物方法。蓝宝条表示健康对照中IgM结合蛋白的显着生物过程。

       主题搜索glam2

      具有低于0.05的FDR阈值的所鉴定的蛋白质和大于2倍的折叠变化被转化为Fasta格式,并通过使用Glam2工具(
      • Frith M.C.
      • 桑德斯N.F.
      • 科比B.
      • Bailey T.L.
      发现具有任意插入和删除的序列图案。
      )。 Glam2分析的参数是默认设置。通过使用Glam2Scan(prisck)在整个人类蛋白质组中进一步调查所得基序(
      • Frith M.C.
      • 桑德斯N.F.
      • 科比B.
      • Bailey T.L.
      发现具有任意插入和删除的序列图案。
      )。

       抗体分类器发现

      我们进行了三种监督学习方法来发现PE样品的抗体分类器。这 k-TSP.是一种用于计算的发布算法 k 最佳成对的蛋白质或基因,以基于每个轮廓内表达水平的相对比例分类样品(
      • Tan A.C.
      • 奈曼D.Q.
      • 徐L.
      • winslow r.l.
      • Geman D.
      从基因表达谱分类人类癌症的简单决策规则。
      )。蛋白质的外观 k-TSP.仅限于最多一个 k-TSP.对。的价值 k 通过交叉验证自动确定。这 k-TSP.方法使用R环境中的“KTSPAIR”包(

      Jeffrey,T.L.Tspair:Top Scrator对微阵列分类对,R包版1.10.0

      )。最初施用雷玛包以在FDR低于0.01的阈值下选择训练组中的蛋白质特征。我们使用从16名妇女获得的原始样品和13名健康的孕妇作为训练组,另外五个PE和五种健康等离子体样本作为测试组。进一步评估通过三种方法选择的这些抗体分类器的性能,以获得基于以下公式的精度,特异性和灵敏度:灵敏度=真正阳性(TP)/ [TP +假阴性(Fn)];特异性=真负(Tn)/ [Tn +假阳性(FP)];和精度= TP + TN /(TP + TN + FP + FN)。

      结果

       PE.患者分析血浆抗体的总体策略

      台湾昌涌纪念医院,从46个个体(23名患有PE和23名健康孕妇)的血浆样品中取出。继昌康纪念医院制度审查委员会政策之后(102-5739B)。为了确定PE和健康孕妇的妇女是否差异的总血浆免疫球蛋白G(IgG)水平差异,我们在芯片测定之前测量了总IgG浓度。结果表明,健康妇女的总IgG浓度明显高于PE患者组(p <0.0007),并在几个先前的研究中报告了这种回声调查结果(
      • 霍恩C.H.
      • Howie P.W.
      • Goudie R.B.
      血清α2-癌丙蛋白,转铁蛋白,白蛋白和IgG水平在Preclampsia中。
      ,
      • Arinola G.
      • arowojolu a。
      • BamgBoye A.
      • Akinwale A.
      • adeniyi A.
      尼日利亚妇女血清免疫球蛋白和急性期蛋白的血清浓度。
      ,
      • Sharma R.
      • Nandi D.
      • Shukla I.
      • Maheshwari V.
      妊娠期高血压对新生儿免疫球蛋白水平的影响。
      )。仅进一步测试平均值附近IgG浓度的样品,因为高IgG浓度会导致非特异性结合。因为我们通过一定折叠稀释所有样品,所以极高的IgG水平可能导致非特异性结合,从而误导结果。除去七个样品(5个健康的血浆和两种PE等离子体样品),并使用最终量的16 PE和13个健康样品来分析血浆抗体。剩余的10个样品(五种PE和五个健康样品)用于盲化测试。因为PE和健康组之间IgG水平不同,所以在探测之前,我们将IgG水平调整到相同的水平 大肠杆菌 微阵列。为了鉴定PE发病机制的潜在生物标志物,我们进行了芯片测定以将抗体在人血浆中使用 大肠杆菌 蛋白质组芯片含有超过4200个非冗余的碎片 大肠杆菌 proteins (Fig. 1)。 表I. 列出所选示例的人口统计数据。鉴定人血浆中的抗体,并观察血浆抗体之间的相互作用和 大肠杆菌 蛋白质组,我们用Dylight 650与Dylight 650缀合的抗人均IgG与Dylight 550缀合(测定设计 Fig. 2)。探测来自孕妇的16种16 PE和13种健康血浆样品 大肠杆菌 蛋白质组芯片在全球调查免疫原性曲线的差异 大肠杆菌 女性与健康女性的蛋白质。由于人血浆的异质性和潜在的实验误差,我们进行了原理分量分析(PCA)作为一种质量评估方法,以排除不属于主要组的异常值(补充图S1和S2 对于IgG和IgM探测结果)。排除了八个样本,即六名患有PE和两个健康女性的女性。在正常标准化后,我们进行了两次分析来描述免疫原性响应性谱。首先,我们通过使用微阵列(利马)软件包的线性模型来识别差异敏感的蛋白质,扫描具有基序的局部绑定基序(Glam2),使用Glam2Scan搜索人类蛋白质组,并使用数据库研究了它们的生物学功能用于注释,可视化和集成发现(David)。接下来,我们通过使用构建稳健的抗体分类器 k-TSP.S(Fig. 1)。代表性的图像 大肠杆菌 蛋白质组芯片显示在 Fig. 2B。代表性蛋白质鞭毛钩蛋白(vgE)和L-苏氨酸脱氨酶(ILVA)在PE血浆中表现出比在对抗IgG和IgM抗体的健康对照中的更高结合信号。脂蛋白28(NLPA)和YHBG分别对IgG和IgM抗体分别表现出逆行为。这些结果表明,我们的方法可以鉴定体育和健康女性的妇女中的高度免疫原性蛋白质。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1本研究中使用的工作流程。 探测了十六个生态蛋白和13种健康等离子体样品 大肠杆菌 蛋白质组芯片。在异常值排除后,中位数归一化和缺少价值估算,我们应用了两种策略来分析数据。一个是对差异结合蛋白的显着分析。另一个是抗体分类器发现使用 k-TSP.和包括盲化测试的额外样品。
      表I.健康怀孕的人口统计数据和严重PE的女性
      特征常规怀孕(n = 18)严重的预普利坦斯(n = 21)p value
      产妇年龄(年)33.5±4.733.4±4.2ns.
      胎龄(周)38.7±134.1±3.90.007
      送货上的体重(kg)66±6.673.5±12.60.05
      交付体重指数(kg / m2)26±3.428.9±3.30.027
      收缩压(MMHG)113.8±6.1180.4±18.2.<0.0001
      舒张压(MMHG)70.1±7.7115.9±8.7<0.0001
      蛋白尿(Dipstick)消极的+++<0.0001
      Multipara(%)75%(12/16)53%(8/15)ns.
      nullipara(%)25%(4/16)47%(7/15)ns.
      送货方式(CS:VD,%)37.5%:62.5%(6:10)80%:20%(12:3)0.02
      性爱胎儿(M:F,%)75%:25%(12:4)46.7%:53.3%(7:8)ns.
      婴儿出生体重(g)3111.1±274.71998.3±753.5<0.0001
      CS:剖腹产,VD:阴道分娩,M:男,F:女性,NS:不显着。数据显示为平均标准偏差。使用学生评估群体中差异差异的统计学意义 t 测试。 p <0.05被认为是统计学意义。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2大肠杆菌 蛋白质组芯片测定。 A,用于通过使用筛选前生态血浆样品的测定格式 大肠杆菌 蛋白质组芯片。第一步是收集血浆。 大肠杆菌 用BSA封闭蛋白质组芯片,并单独探测这些等离子体样品 大肠杆菌 蛋白质组芯片。随后,我们用与Dylight 650和与Dylight 550缀合的Dylight 650和抗人均IgM抗体缀合的抗花林IgG抗体孵育芯片。 B,代表性的形象 大肠杆菌 蛋白质组芯片和四种蛋白质,用于差异与生态植物样品和健康对照之间的差异结合斑点。

       对大肠杆菌蛋白质组的PE患者的全局免疫原性谱

      为了特别是PE和健康对照之间的差异免疫原性蛋白,我们使用Limma进行统计分析。在低于0.05的错误发现率(FDR)的阈值下,这是多种比较中假阳性呼叫的概率,我们发现108次差异免疫原性蛋白对人IgG进行比较,以健康女性和130例差异免疫原蛋白对比人IgM。在抗IgG的分化的免疫原性蛋白中,75个蛋白质在具有PE的女性中高度免疫原性,33例在健康女性中高度免疫原性。在抗IgM的分化的免疫原性蛋白质中,67和63个蛋白质分别在具有体育和健康女性的妇女中高度免疫原性。双向等级聚类热线图在每种表型中说明了免疫原性反应的显着差异(Fig. 3A)。这些分化的免疫原性蛋白质的免疫原性谱显示在体育和健康基团之间有效辨别。使用分层聚类方法获得的两组分类的准确性分别为IgG和IgM型材的95.2%和95.2%(Fig. 3A)。绘制了Venn图以证明这些分化的免疫原性蛋白质与人IgG和IgM抗体之间的重叠很少(Fig. 3B)。通常,这些结果表明,许多分化的免疫原性蛋白可以在血浆样品中彻底发现,随后可以被视为良好的分类器,用于将来自基于其免疫原性的健康女性的PE样品分化。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3鉴定通过雷玛分析PE的显着结合蛋白质。 A,热图显示差异表达的免疫原性蛋白质的归一化结合信号。凭借FDR的门槛<0.05,我们鉴定了108个显着高表达的免疫原性蛋白质,用于与健康对照进行比较,包括75名患者的强粘合蛋白,33个强蛋白质在健康对照中进行IgG反应。我们还确定了130个显着高表达的免疫原性蛋白质,以与健康对照进行比较,包括PE和63例患者中具有67例强蛋白质的强烈蛋白质,在健康对照中进行IgM反应的健康对照。 B,显示IgG-和IgM结合蛋白之间的蛋白质表达重叠的Venn图。

       PE.等离子体中发现免疫原性蛋白质的功能和定位

      为了描绘体育源性免疫原性的全球特征,我们将根据基因本体学(GO)和基因组(KEGG)途径的基因本体(GO)和Kyoto Encoycopia的分类分配到不同官能团中。 PE中的75个高度抗IgG免疫原性蛋白质,33种高度抗IgG免疫原性蛋白在健康女性中,对PE,67个高度抗IgM免疫原性蛋白在PE中,并在健康女性中具有63个高度抗IgM免疫原性蛋白质使用该方法David数据库分类其功能组。除去无与伦比的蛋白质条目。在这里,我们选择了第三级细胞组分,并专注于六个主要类别(细胞质,核糖体,膜,细胞壁,菌壁等)来描述这些免疫原性蛋白的亚细胞定位。我们进一步进行了富集分析,并应用了超高度统计测试,以计算每个类别涉及的蛋白质数量的概率与偶然的外观相比。亚细胞定位分布的比例显示较高百分比的蛋白质,在妇女的IgG衍生的高度免疫原蛋白中局部化的细胞膜和细胞壁隔室均比健康女性(29%) 相对 细胞膜的23%和15% 相对 细胞壁舱13%; Fig. 4A4B)。对于IgM衍生的高表达的免疫原性蛋白,相反是如此;百分比为23% 相对 细胞膜34%,7% 相对 与健康对照进行比较PE样品时,细胞壁为17%(Fig. 4C4D)。这些结果表明,具有体育的妇女更加IgG,但对细菌表面蛋白的IgM较少而不是健康的女性。关于GO术语的生物过程和分子功能,PE中妇女IgG衍生的免疫原性蛋白的生物过程中最丰富的术语与铁运输和前体代谢物和能量的产生有关,其既没有富含健康女性 (p 铁运输和前体代谢物和能量产生0.0048和0.0084; Fig. 5A)。在IgM探测期间获得对比结果,揭示了在健康女性的IgM衍生的免疫原性蛋白中发现了与转运相关的过程(p 氨基酸输送= 0.0056; Fig. 5B)。在差异免疫原性蛋白的细胞定位分析中,表面蛋白在发挥关键作用。我们发现,大多数表面蛋白质是与铁运输有关的具有特别高比例的转运蛋白。我们通过Kegg浓缩分析获得了类似的结果(p ABC转运蛋白分别用于IgG衍生的PE样品和IgM衍生的健康对照中的ABC转运蛋白的0.0045和0.00007; 补充图S3A)。然而,IgM衍生的免疫原性蛋白在患有PE中碳水化合物代谢过程中起更大的作用(p 碳水化合物代谢过程= 0.023; Fig. 5B)。去的分子功能的独特特征是阳离子结合活性在患有PE的妇女中的IgG衍生的免疫原性蛋白质上显着超过了p 阳离子结合活动= 0.009; 补充图S4)。我们还使用PFAM蛋白质系列数据库进行了分析,以发现这些免疫原性蛋白质中的超人蛋白质家族。我们发现在IGM衍生的健康对照组中显着富集了TRNA-SYNT_2D和PHE_TRNA-SYNT_N(p PF01409的= 0.000007:TRNA-SYNT_2D和PF02912:PHE_TRNA-SYNT_N; 补充图S5)。这些结果表明了IgG和IgM衍生的免疫原性蛋白质之间的功能关系和差异,并且PE的妇女中这些高度表达的免疫原性蛋白在细胞跨膜区域的离子转运过程中起主要作用,特别是响应于人IgG。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4IgG.-和IgM结合蛋白的蛋白质位置分布的比例。 A,具有IgG抗体探测PE患者患者强的蛋白质。 B,用IgG抗体探测健康对照中的强烈结合蛋白质。 C,具有IgM抗体探测PE患者患者的强粘合蛋白。 D,用IgM抗体探测的健康对照中强烈结合蛋白质。我们进行了Fisher的确切考验,以检查亚细胞位置的过度陈述(* p < 0.05, ** p < 0.005, *** p < 0.0005).

       使用盖住局部对齐的共识主题搜索

      为了检查来自体育女性和健康女性的高度免疫原性蛋白质是否存在共识主题,我们进行了Glam2分析。为此目的,我们通过增加阈值的严格来减少蛋白质的数量以发现差异免疫原蛋白。在低于0.05的FDR阈值下,绝对折叠变化高于1.7〜2,我们鉴定了七和六种IgG衍生的高度免疫原性蛋白质,分别为具有体育和健康女性的妇女,以及9和10个IgM衍生的女性高度免疫原蛋白与体育和健康女性分别。蛋白质清单总结在 补充表S1-S4。通过分层聚类方法,所有选定的蛋白质集的精度高于分类两组的精度。 IgG衍生的妇女分别为PE和健康女性的IgG衍生妇女分别为患有体育和健康女性的IgM衍生妇女的IgG衍生妇女76%和71%,分别为81%和90%(Fig. 6)。从32个蛋白质,18个注释的蛋白质具有细胞成分功能,并且这些蛋白质中的超过三分之一在细胞膜或鞭毛室中发挥作用(13个蛋白质,72.2%; 补充表S1-S4)。因为这些蛋白质在样品辨别方面具有类似的用于免疫原性反应和高精度的结合模式,因此它们进一步用于对图案富集进行Glam2分析。因此,我们发现它们中的共分基序在PE IgG和IgM中分别是[Ag] [ISV] GV [AE]和[IV] [IV] [Ag] [Ad] e和Ga [Ag] [Al] 1 [LF]和[Sry] [ILV] [ILV] [ILV] [acg] [GH] [GH] [GH] [GH] [RG] N [IV]为健康女性(Fig. 7)。仅在PE中结合的特异性抗体可能与相同的基序结合。因此,我们在特定的蛋白质命中搜索了共识基序,其在体育和健康对照组之间表现出不同的信号。由于人类蛋白质可能含有相同的共识基序,我们也寻找含有这些基序的人蛋白,使用这种基序通过Glam2scan来搜索整个人类蛋白质组,并从中检索蛋白质的亚细胞位置 定位 数据库。对于每组,将共有人蛋白质被鉴定为含有一种或多种上述共识局部。从这些共识蛋白,我们观察到膜蛋白和在PE组中的人细胞中的分泌蛋白质(补充表S5-S8)。这些结果与Go和Kegg浓缩分析结果一致。我们还观察到,两个分泌的蛋白质(三重组鸟氨核蝶核苷酸交换因子和基质1)在具有PE和三种分泌蛋白质(软骨相关蛋白质,N-乙酰化α-连接的酸性二肽酶样1和肝细胞生长的妇女中高度免疫原性因子活化剂)在具有PE的女性中较低的免疫原性。这些发现表明,人分泌蛋白质中的这些免疫原性差异也可参与PE发病机制。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6特定高度结合蛋白的次麦体图。 具有FDR统计阈值的蛋白质<0.05和绝对折叠变化>1.7被选中用于主题富集分析。 A,选择患有IgG的PE患者患者患者的七种强粘合蛋白质,分类的准确性为76%。 B,选择含有IgG探测的健康对照中的六种强结合蛋白质,分类的准确性为71%。 C,选择含有IgM探测器患者的九种强粘合的蛋白质,分类的准确性为86%。 D,选择探测IgM的健康对照中的十个强结合蛋白质,分类的准确性为81%。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7使用Glam2的共识主题搜索。 A,共有术中衍生自PE患者患者患有IgG患者的七种强结合蛋白质。 B,共有型基质衍生自与IgG探测的健康对照中的六种强结合蛋白质。 C,共有型基质衍生自PE患者患者患有IgM患者的九个强粘合蛋白。 D,共有型基质衍生自探测IgM探测的健康对照中的10个强结合蛋白质。

       通过K-TSP和盲化测试鉴定抗体分类剂诊断

      由于这些免疫原性型材表现出准确的分类能力,因此我们想知道是否存在一个或两个超级体类分类器,并且可以在样品之间表现出准确的识别。为此目的,我们应用了监督机器学习方法,包括另外10个等离子体样本(五个女性,具有PE和五种健康的孕妇),用于盲目的分类器性能测试。我们通过使用,构建了抗体分类器,用于将PE样本与健康孕妇的分解 k-TSP.,基于一组配对测量,从高吞吐量数据预测生物标志物预测的公开分类算法(
      • Geman D.
      • D'Avignon C.
      • 奈曼D.Q.
      • winslow r.l.
      分类基因表达谱从成对mRNA比较。
      )。产生五对免疫原性蛋白质,并以点图显示(Fig. 8)。这五对用IgM_yhcd,带有IgM_ybge的IGM_ILVA,IGG_CLPA,IGG_CSGF,IGG_RBSC与IGM_YHBG,以及IGG_SRLA的IGG_SRLA,所有这些都在培训组中表现出准确的绩效(准确度为95%到100%,而所有五对100%; Fig. 8)。对于致盲的测试,精度为90%,特异性为83%,并且在使用另外10个等离子体样品后,所有五对的敏感性为100%(Fig. 9)。这些结果表明,我们的蛋白质组芯片的方法不仅探索了特异性免疫原性谱 大肠杆菌 蛋白质还发现了稳健的PE诊断抗体分类剂。但是,这是一个初步研究;在临床诊断中使用进一步的验证。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8五对显示培训PE样品培训准确性能。 红点代表PE和灰点代表健康对照。用A作为示例,决策规则是,如果IgM探测的YIB的结合信号大于血浆样品中IgM探测的YHCD,则将其定义为属于具有PE的患者。相反,如果IgM探测的粘合信号小于血浆样品中的IgM探测的YHCD,则将定义为属于健康的女性。 A,第一对具有IgM和YHCD的YIB与IgM探测结果显示出识别来自健康对照的PE患者的100%精度。 B,第二对使用ILVA具有IgM和YBGE的IgM探测结果显示了100%的精度。 C,第三对使用CSGF具有IgG和CLPA的IgG显示出91%的精度。 D,第四对使用具有IgM和IgM的IgG和YHBG的rBSC.1的精度显示为91%。 E,使用具有IgG和TRPC的SRLA使用SRLA的第五对显​​示为91%的精度。 F,Heatmap显示了这五对中的结合信号的比率,显示了在体育和健康对照(100%精度)之间区分患者时的高精度分类。蓝色代表比率>1,黄色表示比例<1,白色表示基于大多数投票预测的= 0的比例;例如,患者N48只有一个高于1的蛋白质对比,但是有四个蛋白质对低于1.因此,患者N48被归类为健康,因为五个K-TSP对(一半以上)中的四个表明她是健康的。
      图缩略图GR9.
      Fig. 9五对显示PE样品测试集高性能。 热线图显示了5-TSP对中的结合信号的比率,其显示了体育患者和健康对照的准确歧视(精度为90%)。蓝色代表比率>1,黄色表示比例<1,白色表示基于大多数选票预测结果的比率。

      讨论

      用于早期诊断疾病的新型生物标志物对人类健康至关重要。蛋白质微阵列已被认为是一种强大而强大的工具,可用于发现有价值的生物标志物(
      • Ramachandran N.
      • Srivastava S.
      • Labaer J.
      蛋白质微阵列对生物标志物发现的应用。
      )(
      • Natesan M.
      • Ulrich r.g.
      蛋白质微阵列和传染病的生物标志物。
      )。在这项研究中, 大肠杆菌 蛋白质组芯片用于探测人血浆以鉴定PE生物标志物。本研究是第一次检查探讨人免疫球蛋白对体育和健康女性妇女整体细菌蛋白质组的差异的检查。结果表明,与健康组相比,PE的妇女IgG水平相当较低。这可能是雌激素和孕激素较低浓度的部分结果(
      • 霍恩C.H.
      • Howie P.W.
      • Goudie R.B.
      血清α2-癌丙蛋白,转铁蛋白,白蛋白和IgG水平在Preclampsia中。
      ),在妊娠期间较高浓度的类固醇,母体抗体对胎儿的转移,以及蛋白尿或生理候补性(
      • Sharma R.
      • Nandi D.
      • Shukla I.
      • Maheshwari V.
      妊娠期高血压对新生儿免疫球蛋白水平的影响。
      )。几份报告发现PE是由传染病引起的。在一项研究中,曾因患有性伴侣感染的抗体疫苗的妇女,包括单纯疱疹病毒型和巨细胞病毒,随后在怀孕期间发育原发性感染,更有可能开发PE(
      • trogstad l.i.
      • Eskild A.
      • Bruu A.L.
      • 珍森斯。
      • jenum p.a.
      Preclampsia是一种传染病吗?
      )。此外,存在感染剂如 芽孢杆菌,anaerobacillus,葡萄球菌,histeria,nocardiopsis,大肠杆菌,shigella,沙门氏菌,klebsiella,乳杆菌,拨号, 和 pediococcus. 在PE的女性胎盘上,增加了开发PE的风险(
      • Amarasekara R.
      • Jayasekara R.W.
      • Senanayake H.
      • 弥赛亚v.h。
      前普利坦斯胎盘中胎盘的微生物组支持细菌在预先普利坦斯的多因素原因中的作用。
      )(
      • 巴拉克斯。
      • Oettinger-barak O.
      • machteie.e.
      • SPRECHER H.
      • OHEL G.
      先兆子痫孕妇胎儿脑膜炎微生物的证据。
      )。这些传染病可激活炎症过程并促进可能导致PE的抗血管生成因子(
      • Amarasekara R.
      • Jayasekara R.W.
      • Senanayake H.
      • 弥赛亚v.h。
      前普利坦斯胎盘中胎盘的微生物组支持细菌在预先普利坦斯的多因素原因中的作用。
      )(
      • von dadelszen p.
      • Magee L.A.
      传染性触发可以解释对先兆子痫的共同胎盘病理和规范宫内生长限制的差异母体反应吗?
      )(
      • von dadelszen p.
      • Magee L.A.
      • 马歇尔J.C.
      • Rotstein O.D.
      先兆子痫的母体综合征:全身炎症反应综合征的甲骨染色。
      )。 IgM是在感染期间分泌的第一抗体。细菌的表面蛋白是感染早期IgM的唯一目标。这项研究表明,患有PE的女性对抗细菌膜和细胞壁蛋白具有较少的IgM,而不是健康的孕妇。该发现表明,具有PE的妇女在感染的早期阶段中具有较低的IgM-细菌结合,因此对细菌感染具有较少的防御能力。相比之下,具有PE的妇女中的更多IgG与位于细胞壁和膜中的蛋白质具有很强的结合。活细菌呈现比细胞内抗原更多的表面抗原,这表明PE的妇女对活细菌的妇女产生更多的IgG,而不是健康的孕妇,因为IGM在妇女感染早期阶段的效果无效用pe。对活细菌的这种长期免疫可能导致PE妇女炎症异常(
      • Ramma W.
      • Ahmed A.
      炎症是预先印痫的原因吗?
      )。需要进一步的实验来确认细菌相关炎症和PE之间的关系。如果细菌相关的炎症导致PE,抗生素和抗炎疗法可能会阻止PE。
      表二 总结报告的PE生物标志物。虽然其精度高,但PP-13被认为是一种生物标志物,不仅是体育植物,还被认为是宫内生长限制(
      • Chafetz I.
      • Kuhnreich I.
      • Sammar M.
      • tal
      • 吉尔y.
      • Meiri H.
      • 扣子H.
      • 狼M.
      先妊娠胎盘蛋白13筛选先兆子痫和宫内生长限制。
      ),表明PP-13是非特异性的。另一种生物标志物,Seng,跨膜糖蛋白,已被广泛研究(
      • Petla L.T.
      • Chikkala R.
      • 拉纳塔尔K.S.
      • kodati V.
      • Sritharan V.
      生物标志物为孕妇孕产前的异国普拉明血症管理。
      )(
      • Carty D.M.
      • 戴尔C.
      • Dominiczak a.f.
      用于预测预先普利坦斯的新型生物标志物。
      )(
      • Venkatesha S.
      • 拓扑人M.
      • 林C.
      • 哈伊J.
      • Mammoto T.
      • kim y.m.
      • BDOLAH Y.
      • 林K.H.
      • 袁H.T.
      • libermann t.a.
      • 蒂尔曼等等。
      • 罗伯茨D.
      • d'amore p.a.
      • 爱普斯坦F.H.
      • Sellke F.W.
      • Romero R.
      • Sukhatme V.P.
      • letarte m.
      • Karumanchi S.A.
      可溶性endoglan有助于预坦克西亚的发病机制。
      );然而,其敏感性,特异性和准确性在不同的研究中不一致。虽然一些研究表明了Seng的高精度,但其他研究报告了低精度。对于PLGF生物标志物,大多数研究表明敏感性低,特异性和准确性(
      • Kleinrouweler C.E.
      • Wiegerinck M.M.
      • RIS-Stalpers C.
      • Bossuyt下午
      • van der post j.a.
      • von dadelszen p.
      • 摩尔B.W.
      • PAJKRT E.
      • 合作e.c.
      循环胎盘生长因子,血管内皮生长因子,可溶性FMS样酪氨酸激酶1和可溶性胚胎植物在预测前的循环胎盘生长因子,可溶性胚胎林:系统综述和荟萃分析。
      )(
      • devivo A.
      • Baviera G.
      • Giordano D.
      • Todarello G.
      • corrado f.
      • D'Anna R.
      endoglin PLGF和SFLT-1作为预测Eclampsia预测的标记。
      )(
      • Tidwell S.C.
      • 何H.N.
      • Chiu W.H.
      • rrry r.j.
      • 打瑞D.S.
      低母体血清胎盘生长因子作为临床前普拉克患者的前驱。
      )(
      • Espinoza J.
      • Romero R.
      • 尼恩J.K.
      • 戈麦斯r.
      • Kusanovic J.P.
      • Goncalves L.F.
      • 麦地那L.
      • Edwin S.
      • 哈桑斯。
      • Carstens M.
      • Gonzalez R.
      利用子宫动脉多普勒测速和胎盘生长因子,鉴定早期发病和/或严重先兆子痫的风险患者。
      )。虽然一项研究表明,Podocyturia提出了高精度(
      • Garovic V.D.
      • Wagner S.J.
      • 特纳特。
      • 罗森希尔D.W.
      • Watson W.J.
      • 博罗斯坦
      • 玫瑰c.h.
      • Gavrilova L.
      • Craigo P.
      • Bailey K.R.
      • Achenbach J.
      • Schiffer M.
      • 格兰德·J.P.
      尿podyyte排泄作为预口普拉姆的标志物。
      ),另一个表现出非常低的精度(
      • 吉姆B.
      • Jean-LouisP.
      • QIPO A.
      • 加里D.
      • Matos T.
      • Provenzano C.
      • ACHAREA A.
      Podocyturia作为高危怀孕患者的预普拉姆西亚诊断标志物。
      )。多普勒超声检查还表现出低精度(
      • Stepan H.
      • unversucht A.
      • Wessel N.
      • Faber R.
      妊娠期妊娠期妊娠期妊娠期孕妇妊娠因素的预测价值。
      )。总之,先前报道的PE生物标志物具有低或不一致的准确性。与这些相比,我们的生物标志物表现出良好的性能。然而,本研究是初步研究。进一步验证需要更多样本。
      表二以前的生物标志物摘要
      生物标志物灵敏度, %特异性,%准确性, %参考
      PP-13(胎盘蛋白13)799085.5(
      • Chafetz I.
      • Kuhnreich I.
      • Sammar M.
      • tal
      • 吉尔y.
      • Meiri H.
      • 扣子H.
      • 狼M.
      先妊娠胎盘蛋白13筛选先兆子痫和宫内生长限制。
      )
      1008090(
      • Romero R.
      • Kusanovic J.P.
      • 而不是n.g.
      • Erez O.
      • gotsch f.
      • Espinoza J.
      • Edwin S.
      • Chefetz I.
      • 戈麦斯r.
      • 尼恩J.K.
      • Sammar M.
      • Pineles B.
      • 哈桑斯。
      • Meiri H.
      • tal
      • Kuhnreich I.
      • PAPP Z.
      • 克拉尔H.S.
      先兆子痫风险评估的孕孕孕孕孕孕孕。
      )
      Seng(可溶性endoglin)8043.261.6(
      • Stepan H.
      • Geipel A.
      • 施瓦茨F.
      • 克拉默特T.
      • Wessel N.
      • Faber R.
      循环可溶性endoglin及其在二孕代妊娠期妊娠期妊娠期妊娠期妊娠期异常妊娠期妊娠期的预测价值。
      )
      858585(
      • 林J.H.
      • 金S.Y.
      • 公园S.Y.
      • Lee M.H.
      • 杨杰夫。
      • 金米。
      • 钟J.H.
      • 李S.W.
      • ryu h.m.
      随后开发出先兆子痫的女性中,溶于胚胎和转化生长因子-β1。
      )
      186742.5(
      • Kleinrouweler C.E.
      • Wiegerinck M.M.
      • RIS-Stalpers C.
      • Bossuyt下午
      • van der post j.a.
      • von dadelszen p.
      • 摩尔B.W.
      • PAJKRT E.
      • 合作e.c.
      循环胎盘生长因子,血管内皮生长因子,可溶性FMS样酪氨酸激酶1和可溶性胚胎植物在预测前的循环胎盘生长因子,可溶性胚胎林:系统综述和荟萃分析。
      )
      80.884.682.7(
      • devivo A.
      • Baviera G.
      • Giordano D.
      • Todarello G.
      • corrado f.
      • D'Anna R.
      endoglin PLGF和SFLT-1作为预测Eclampsia预测的标记。
      )
      SFLT-1(可溶性FMS样酪氨酸激酶1)267249(
      • Kleinrouweler C.E.
      • Wiegerinck M.M.
      • RIS-Stalpers C.
      • Bossuyt下午
      • van der post j.a.
      • von dadelszen p.
      • 摩尔B.W.
      • PAJKRT E.
      • 合作e.c.
      循环胎盘生长因子,血管内皮生长因子,可溶性FMS样酪氨酸激酶1和可溶性胚胎植物在预测前的循环胎盘生长因子,可溶性胚胎林:系统综述和荟萃分析。
      )
      73.180.876.9(
      • devivo A.
      • Baviera G.
      • Giordano D.
      • Todarello G.
      • corrado f.
      • D'Anna R.
      endoglin PLGF和SFLT-1作为预测Eclampsia预测的标记。
      )
      8010090(
      • 赫希格A.
      • Berkane N.
      • lefevre g.
      • Toumi K.
      • 马蒂H.P.
      • Capeau J.
      • uzan s.
      • Rondeau E.
      母体血清SFLT1浓度是Preclampsia的早期可靠的预测标记。
      )
      PLGF(胎盘生长因子)327553.5(
      • Kleinrouweler C.E.
      • Wiegerinck M.M.
      • RIS-Stalpers C.
      • Bossuyt下午
      • van der post j.a.
      • von dadelszen p.
      • 摩尔B.W.
      • PAJKRT E.
      • 合作e.c.
      循环胎盘生长因子,血管内皮生长因子,可溶性FMS样酪氨酸激酶1和可溶性胚胎植物在预测前的循环胎盘生长因子,可溶性胚胎林:系统综述和荟萃分析。
      )
      92.380.886.5(
      • devivo A.
      • Baviera G.
      • Giordano D.
      • Todarello G.
      • corrado f.
      • D'Anna R.
      endoglin PLGF和SFLT-1作为预测Eclampsia预测的标记。
      )
      88.96476.5(
      • Tidwell S.C.
      • 何H.N.
      • Chiu W.H.
      • rrry r.j.
      • 打瑞D.S.
      低母体血清胎盘生长因子作为临床前普拉克患者的前驱。
      )
      69.151.460.25(
      • Espinoza J.
      • Romero R.
      • 尼恩J.K.
      • 戈麦斯r.
      • Kusanovic J.P.
      • Goncalves L.F.
      • 麦地那L.
      • Edwin S.
      • 哈桑斯。
      • Carstens M.
      • Gonzalez R.
      利用子宫动脉多普勒测速和胎盘生长因子,鉴定早期发病和/或严重先兆子痫的风险患者。
      )
      足粒细胞100100100(
      • Garovic V.D.
      • Wagner S.J.
      • 特纳特。
      • 罗森希尔D.W.
      • Watson W.J.
      • 博罗斯坦
      • 玫瑰c.h.
      • Gavrilova L.
      • Craigo P.
      • Bailey K.R.
      • Achenbach J.
      • Schiffer M.
      • 格兰德·J.P.
      尿podyyte排泄作为预口普拉姆的标志物。
      )
      387054(
      • 吉姆B.
      • Jean-LouisP.
      • QIPO A.
      • 加里D.
      • Matos T.
      • Provenzano C.
      • ACHAREA A.
      Podocyturia作为高危怀孕患者的预普拉姆西亚诊断标志物。
      )
      多普勒774661.5(
      • Stepan H.
      • unversucht A.
      • Wessel N.
      • Faber R.
      妊娠期妊娠期妊娠期妊娠期孕妇妊娠因素的预测价值。
      )
      我们的生物标志物1008390在这项研究中

      致谢

      我们要感谢Pramod Shah他的编辑和校对。

      补充材料

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