由短开放阅读框架编码的彩易福彩,而不是通过注释的编码序列编码,是双编码基因的主要基因产物 伤害1*

  • vivian delcourt.
    隶属关系
    Départementdebiochimie,UniversitédeSherbrooke,Québec,加拿大

    大学。 Lille,Inserm U1192,LaboratoireProtéomique,Réponstnamatammire和Spectrométriede Masse(棱镜)F-59000里尔,法国

    PROTEO,Québec彩易福彩功能,结构和工程研究,Québec,加拿大
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  • MylèneBrunelle.
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    Départementdebiochimie,UniversitédeSherbrooke,Québec,加拿大

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  • Annie V. Roy.
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    Départementdebiochimie,UniversitédeSherbrooke,Québec,加拿大

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  • Jean-Françoisjacques
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    Départementdebiochimie,UniversitédeSherbrooke,Québec,加拿大

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  • Michel Salzet.
    隶属关系
    大学。 Lille,Inserm U1192,LaboratoireProtéomique,Réponstnamatammire和Spectrométriede Masse(棱镜)F-59000里尔,法国
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  • 伊莎贝尔四帝
    隶属关系
    大学。 Lille,Inserm U1192,LaboratoireProtéomique,Réponstnamatammire和Spectrométriede Masse(棱镜)F-59000里尔,法国
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  • Xavier Roucou.
    一致
    应当解决谁对应:DépartementdeBiochimie,UniversitédeSherbrooke,Québec,加拿大。
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    Départementdebiochimie,UniversitédeSherbrooke,Québec,加拿大

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  • 作者脚注
    *本研究得到了加拿大卫生研究院(CIHR)的支持(CIHR)Grants Mop-137056和Mop-136962,并由加拿大研究椅子在功能彩易福彩组学中,并发现新型彩易福彩到X.R.
    本文包含补充数据和数据。
      蛋白素组织和核糖体分析同时表明,基因可以分别代码为一个或多个小蛋白,分别由注释的编码序列(CDSS)和未经发布的替代开放阅读帧(命名的替代ORF或Altorfs)进行编码,但是大于和的化学计量从同一基因翻译的小彩易福彩未知。伤害1,最近鉴定为双编码基因的基因,HARBORS A CD和位于5'UTR中的新注释和主动翻译的Altorf。这里,我们使用具有稳定同位素标记的肽和平行反应监测的绝对定量,以确定两种人细胞中和人结肠中的两种彩易福彩的水平。我们举报了主要的伤害1翻译产品不是规范463氨基酸MID51蛋白,但小70氨基酸替代MID51蛋白(ALTMID51)。这些结果表明了单一CD概念的不足,并为在功能注释中掺入Altorfs和小彩易福彩的强烈争论。
      根据彩易福彩合成的传统观点,每种彩易福彩编码基因哈勃单个注释的开放阅读框架(ORF)
      使用的缩写是:
      ORF.
      开放阅读框架。
      1使用的缩写是:ORF.
      开放阅读框架。
      或编码规范彩易福彩的编码序列(CDS)。然而,基因含有多于一个ORF,并且最长的ORF通常被称为基因组注释中的规范CD(
      • dinger m.e.
      • 庞克。
      • Mercer T.R.
      • Mattick J.s.
      区分彩易福彩编码和非致rna:挑战和含糊不清。
      )。在真核生物中,除了规范蛋白外,还导致替代剪接结果在产生几个mRNA和不同同种型的翻译。因此,彩易福彩编码基因的平移输出目前隐藏在规范蛋白和一种或几种同种型中。
      该概念最近被两种现代方法所反驳的方法,以准确测量翻译,核糖体分析和彩易福彩组织。核糖体谱图地图通过核苷酸分辨率积极翻译的转录组的区域(
      • 布鲁尔G.A.
      • Weissman J.s.
      核糖体分析揭示了彩易福彩合成的时间,何种和方式。
      )。彩易福彩组织方法使用定制的彩易福彩数据库和质谱(MS)基于基于彩易福彩组学来检测翻译的彩易福彩(
      • Vanderperre B.
      • Lucier J.F.
      • Bissonnette C.
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      直接检测人类中的替代开放阅读框架翻译产品显着扩展了彩易福彩组。
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      • Gevaert K.
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      基于核糖体分析的深度彩易福彩组覆盖艾滋病质谱蛋白和肽发现,提供替代翻译产品和近同源翻译起始事件的证据。
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      • Jungreis I.
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      在细胞系和组织中发现人sorf编码的多肽(SEP)。
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      将彩易福彩组学和核糖体分析整合的彩易福彩组织方法提高了彩易福彩识别的效率,并能够发现替代翻译开始点。
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      彩易福彩组:概念,应用和计算策略。
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      改进小型开放阅读框架编码多肽的识别与分析。
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      • Menschaert G.
      小型新型编码序列的鉴定,彩易福彩素质伴随。
      )。这两种方法都透露了推荐CDS和框架外ORF(Altorfs)之外的ORF的普遍翻译
      • 布鲁尔G.A.
      • Weissman J.s.
      核糖体分析揭示了彩易福彩合成的时间,何种和方式。
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      • 纽曼J.R.
      • Weissman J.s.
      用核糖体分析与核苷酸分辨率的语言范围分析。
      )。这些发现呼吁质疑真核生物MRNA中单个CD的概念(
      • Mouilleron H.
      • Delcourt V.
      • roucou x.
      教条的死亡:真核生物MRNA可以编码多种彩易福彩。
      )。此外,它们还突出了重新定义翻译序列的需要(
      • Ingolia N.T.
      核糖体占地面积在整个基因组中翻译。
      ),现代化功能基因组注释与较短的ORF(
      • Delcourt V.
      • Staskevicius A.
      • Salzet M.
      • 四分之一。
      • roucou x.
      由未经爆发的ORF编码的小彩易福彩是彩易福彩组的升高的恒星,确认基因组注释中的缺点和mRNA的当前视觉。
      ),并且除了较大的规范蛋白外,通过考虑较小的蛋白来重新评估彩易福彩编码基因的翻译输出。典型彩易福彩的细胞化学计量 相对 编码在同一基因的小彩易福彩及其各自的浓度是未知的。然而,彩易福彩是生物学过程的主要效应和解密的生物和疾病中基因的功能需要准确地表征其产品。
      线粒体伸长因子1基因或 伤害1 也称为 SMCR7L / mid51.,本地化在CHR22Q13.1基因座,DRP1的线粒体受体的代码,一种在线粒体裂变中起作用的GTP酶(
      • Palmer C.S.
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      MID49和MID51,线粒体裂变机械的新组件。
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      D. DRP1,MFF,FIS1和MID51协调,以在紫外线照射诱导的细胞凋亡期间介导线粒体裂变。
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      DRP1适配器MFF,MID49和MID51在线粒体裂变中的合作与独立角色。
      )。
      核糖体分析和产彩易福彩组织研究最近展示了在5'UTR定位的Altorf中编码的稳定70个氨基酸彩易福彩产品的翻译(Fig. 1A)(
      • Vanderperre B.
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      单核苷酸分辨率下哺乳动物细胞翻译起始位点的全局映射。
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      • 托马斯J.K.
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      • Leal-Rojas P.
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      • sahasrabuddhe n.a.
      • Balakrishnan L.
      • Advani J.
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      • Renuse S.
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      • Patil A.H.
      • 南jappa五。
      • radhakrishnan A.
      • Prasad S.
      • 分组ayt.
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      • Marimuthu A.
      • sathe g.j.
      • Chawan S.
      • datta k.k.
      • SubBannayya Y.
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      • JAYARAM S.
      • Rajagopalan P.
      • Sharma J.
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      • Khan A.A.
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      • Mudgal K.
      • Chatterjee A.
      • 黄T.C.
      • 钟杰。
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      • Zahari M.S.
      • Mukherjee K.K.
      • Shankar S.
      • Mahadevan A.
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      • 米切尔C.J.
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      • 施罗德J.T.
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      Samandi,S.,Roy,Av,Delcourt,V.,Lucier,JF,Gagnon,J.,Beaudoin,MC,Vanderre,B.,Breton,MA,Motard,J.,Jacques,JF,Brunelle,M。, Gagnon-Arsenault,I.,Fournier,I.,Ouangraoua,A.,狩猎,DJ,Cohen,AA,Landry,Cr,Scott,MS,Roucou,X.,深度转录组注释使得神秘的小的发现和功能表征能够进行发现和功能表征彩易福彩。 Elife 6,E27860

      )。因此, 伤害1 是针对大彩易福彩和小彩易福彩的原型基因。为简单起见,我们称为这种新的彩易福彩“替代 - Mid51”或Altmid51。值得注意的是,两种彩易福彩都在线粒体定位。 Mid51是外部线粒体膜蛋白(
      • Osellame L.D.
      • 辛格A.P.
      • stroud d.a.
      • Palmer C.S.
      • Stojanovski D.
      • Ramachandran R.
      • Ryan M.T.
      DRP1适配器MFF,MID49和MID51在线粒体裂变中的合作与独立角色。
      )虽然Altmid51位于线粒体矩阵(

      Samandi,S.,Roy,Av,Delcourt,V.,Lucier,JF,Gagnon,J.,Beaudoin,MC,Vanderre,B.,Breton,MA,Motard,J.,Jacques,JF,Brunelle,M。, Gagnon-Arsenault,I.,Fournier,I.,Ouangraoua,A.,狩猎,DJ,Cohen,AA,Landry,Cr,Scott,MS,Roucou,X.,深度转录组注释使得神秘的小的发现和功能表征能够进行发现和功能表征彩易福彩。 Elife 6,E27860

      )两者都参与了线粒体裂变(
      • Osellame L.D.
      • 辛格A.P.
      • stroud d.a.
      • Palmer C.S.
      • Stojanovski D.
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      • Ryan M.T.
      DRP1适配器MFF,MID49和MID51在线粒体裂变中的合作与独立角色。
      ,

      Samandi,S.,Roy,Av,Delcourt,V.,Lucier,JF,Gagnon,J.,Beaudoin,MC,Vanderre,B.,Breton,MA,Motard,J.,Jacques,JF,Brunelle,M。, Gagnon-Arsenault,I.,Fournier,I.,Ouangraoua,A.,狩猎,DJ,Cohen,AA,Landry,Cr,Scott,MS,Roucou,X.,深度转录组注释使得神秘的小的发现和功能表征能够进行发现和功能表征彩易福彩。 Elife 6,E27860

      )。据报道,Altmid51也被据报道是线粒体核糖体的新装配因子,并涉及其生物发生(
      • 棕色A.
      • rathore s.
      • Kimanius D.
      • Aibara S.
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      组装土生物态中人体线粒体核糖体的结构。
      )。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1人的示意图 伤害1 Refseq变体1 mRNA和ALTMID51和MID51蛋白。 A, 人类 伤害1 包括11个外显子(Refseq,Grch38.p7)。这里显示的mRNA变体1(NM_019008.5)包含6个外显子。 CDS(蓝色)在外显子3至6之间共享Altmid51 ORF在外显子2内本地化,作为非编码外显子注释。 B,AP-MS实验中的序列覆盖以浅色表示。显示彩易福彩肽序列和位置(A.A.)。选择EAVLSLYR和AISAPTSPTR肽以绝对定量。 *,已知的磷酸化残余物(磷酸盐.org,(

      Hornbeck,P. V.,Zhang,B.,Murray,B.,Kornhauser,J. M.,Latham,V.和Skrzypek,E.,PhosphopePlus,2014:突变,PTM和重新校准。核酸RES。 43,D512-D520

      )))。
      在此,我们采用基于Aqua肽的目标彩易福彩组学方法,以可靠地量化两种人细胞系和一个人类组织中的251和Altmid51的绝对量,因此我们建立了改进的平移输出图 伤害1/SMCR7L/MiD51 通过直接测量最终的彩易福彩产品。

      实验步骤

       实验设计与统计理由

      在这项研究中,我们的目的是确定在基因内编码的两个不同彩易福彩的化学计量 伤害1,规范彩易福彩mid51和Altmid51。 Altmid51是在5'UTR区域中由短ORF编码的70个氨基酸蛋白。我们希望使用靶向彩易福彩组学和稳定的同位素标记合成肽的两种彩易福彩的化学计量。为了确定彩易福彩肽,我们首先在两种彩易福彩上进行AP-MS DDA实验。然后使用靶向彩易福彩组学在过表达和内源条件下验证肽。使用技术复制测试所选肽以进行变异系数(CV),如果其CV低于20%,则验证。每种彩易福彩的一个稳定的同位素肽被购买并在各种浓度下使用两种技术复制来用于肽混合物中的线性度。两种肽在40醇和250摩尔之间显示出线性范围。然后以两种细胞系(每次三种生物复制)和结肠组织(三种技术重复)进行绝对量化实验,在Mid51敲除HeLa细胞和Altmid51敲除HeLa细胞(每个生物重复)。使用WelCH的两个样品T检验进行比较彩易福彩量。

       组织收集和道德

      从Biobanque Des Matradies消化物Du Crchus获得正常人结肠组织样品。患者提供了知情同意银行和使用组织样本。中心Intégré大学的伦理审查委员会Sociaux de L'Estrie - Centre Shieldiere De Sherbrooke(Ciusss de L'Estrie-Chus)批准了本研究的使用这些样本。简而言之,在切除结肠直肠癌后,将结肠彻底洗涤,并且在肿瘤的大于10cm的肿瘤中进行正常组织取样,在通过肿瘤细胞(H.)通过病理学家确认的区域内进行&拍摄)。在手术切除30分钟内,新鲜样品在液氮中冷冻冷冻。

       细胞培养

      细胞生长在Dulbecco的改性鹰媒体(DMEM,Wisent,St-Bruno,魁北克,加拿大)补充有10%胎牛血清(FBS,WiseNt)和抗生素 - 抗致症混合物(智慧)。细胞是支原体(常规测试)。对于转染,细胞在100mm培养皿中生长,直至80%汇合,并通过在2ml FBS /抗生素的DMEM中加入10μg粒子DNA和10μlGoecellin(Eurobio,Les Ulis,France)并让在细胞裂解之前生长24小时。对于并联反应监测(PRM)实验,将细胞在60mM培养皿中生长至约80%汇合。

       DNA构建体

      DNA构建体由Gibson组装(
      • 吉布森D.G.
      • 年轻的L.
      • 庄罗.Y.
      • venter J.C.
      • 和尚C.A.
      • 史密斯H.O.
      DNA分子的酶促组装高达几百千碱基。
      )根据制造商的推荐,使用Nebuilder Hifi DNA组装克隆套件(新英格兰Biolabs,Massachusetts)的综合DNA(Gblocks,Idt,Skokie,Illinois)。 DNA块的C末期圈标记(
      • 谢谢者。
      • 德赖A.
      本地化和串联亲和力纯化彩易福彩复合物的定位和串联纯化的组合方法。
      )MID51和GFP标记的ALTMID51分别插入PCDNA 3.1( - )表达载体(Thermo Fisher Scientific,Waltham,Massachusetts)。上下文构造是基于包含ALTMID51编码序列的完整5'区域的组装,其中C末端2标记标签和C-T​​erminal HA标签(转录NM_019008.4)进入PCDNA 3.1的C末端MID51编码序列( - )表达载体。通过测序控制DNA序列。

       线粒体提取物

      对于Hela和CrispR-Cas9 Hela克隆的Western印迹分析以及PRM优化,根据(以()进行线粒体提取物(
      • Antonsson B.
      • Montessuit S.
      • 桑切斯B.
      • 马蒂诺J.C.
      在凋亡细胞的线粒体膜中作为高分子量低聚物/复合物存在。
      )具有微小的修改。将细胞生长为三种100mm的菜肴直至80%汇合,用PBS 1×冲洗两次并使用细胞刮板收集。通过以500×离心沉淀细胞 g 在4°C下10分钟。将上清液被丢弃,并且细胞悬浮在线粒体缓冲液中(Mito缓冲液:210米m mannitol, 70 mm sucrose, 1 mm EDTA, 10 mm Hepes-NaOH,pH 7.5,2mg / ml牛血清白蛋白(BSA),0.5米m PMSF和EDTA的蛋白酶抑制剂(Thermo Fisher Scientific))通过通过25G1 0.5×25针注射器造成的冰上的通道中断,然后在2000×以3分钟内离心 g 在4°C。收集上清液,将沉淀重悬于线粒体缓冲液中。断裂程序重复四次。含有线粒体的所有四个上清液再次通过MITO缓冲液中的注射器针,并通过2000×通过离心3分钟清除3分钟 g 在4°C。收集上清液并以13,000×离心10分钟10分钟 g 在4℃至颗粒线粒体。用无BSA的线粒体缓冲液洗涤粒料两次并合并。在SDS缓冲液中裂解最终线粒体颗粒(4%SDS,Tris-HCl 100Mm pH 7.6)。超声处理后,使用BCA测定(Thermo Fisher Scientific)评估彩易福彩含量。

       质谱样品制备

       初步亲和纯化(AP)

      用冷PBS 1x冲洗细胞两次并用1ml AP缓冲液(NP-40 0.5%,Tris-HCl 50M裂解m pH 7.5, NaCl 150 mm,不含EDTA蛋白酶抑制剂1×)。通过离心清除裂解物(2000× g收集5分钟)和上清液。 GFP-Trap琼脂糖珠子(Chromotek,Planegg-MartinsRied)用三个连续的PBS 1×洗涤后三次接下来是三个AP缓冲液洗涤。将裂解物上清液与珠子混合,并在旋转装置上在4℃下温育18小时。然后用AP缓冲液洗涤珠子3次,50米用5次洗涤3次 m NH4HCO3 (ABC)。通过在37℃下在100μlABC过夜将1μg胰蛋白酶(Promega,Madison,Wiscosin)加入珠粒上进行消化。将消化用甲酸淬灭以终浓度为1%,并收集上清液,含有肽。然后用乙腈/水/甲酸(1/1 / 0.01 v / v)洗涤珠子一次洗涤一次,并用上清液合并。使用SpeedVAC干燥肽,使用C18拉链尖端(Millipore Sigma,Etobicoke,Ontario,Canada)脱盐,并在MS分析之前将在水中重悬于25μl1%的甲酸中。

       PRM实验

      对于线粒体提取物,使用如上所述的SDS缓冲液裂解线粒体沉淀。对于全细胞裂解物,用冷PBS 1×冲洗细胞两次并使用SDS缓冲液裂解。使用组织样品使用SDS缓冲液中的组织突发体(Qiagen,多伦多,安大略省)均质化。裂解物超声处理以减少粘度,然后以14,000×以5分钟的离心离心 g 丢弃碎片和不溶的零件。使用BCA彩易福彩测定(Thermo Fisher Scientific)评估彩易福彩含量。总共100μg彩易福彩和1μg重组谷胱甘肽S-转移酶(GST, 日本血吸虫瘤通过将二硫代噻唑醇添加到50米的最终浓度来降低m 并在55℃下孵育15分钟。根据过滤剂辅助样品制备方案(FASP)制备裂解物(FAP),细微修饰(
      • wisniewski J.R.
      • 邹格曼A.
      • Nagaraj N.
      彩易福彩组分析的通用样品制备方法。
      )。用500μl稀释裂解物8 m 尿素溶液并转移到3kDa离心装置(Amicon Ultra,Millipore Sigma)中并以14,000×离心30分钟 g。一个8之后 m 尿布洗涤和离心,用200μl50μm稀释样品m 碘乙酰胺在8中 m 尿素,在室温下留在黑暗中30分钟。将样品离心并用8次洗涤3次 m 尿素。然后将缓冲液交换为50米m ABC连续三个200μL洗涤。在40μLABC和Aqua中,在37℃下在37℃下消化最终滞留物过夜,在40μL和Aqua(
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • STEMMAN O.
      • Kirschner M.W.
      • Gygi S.P.
      通过串联MS从细胞裂解物中绝对定量彩易福彩和磷蛋白。
      )肽(Pepotec Ultimate,Thermo Fisher Scientific)。通过过滤离心收集胰蛋白酶肽,然后进行三个ABC洗涤和离心。使用SpeedVac浓缩含肽的滤液,然后通过甲酸酸化至终浓度为1%。使用C18拉链尖端脱盐肽并使用SpeedVac干燥。

       小牛肠磷酸酶治疗

      肽使用小牛肠道磷酸酶(CIP)进行去磷酸化(
      • 吴R.
      • 哈斯W.
      • Dephoure N.
      • Huttlin E.L.
      • 翟德
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      一种测量绝对彩易福彩磷酸化化学物质测定的大规模方法。
      )。简而言之,在50μl的CIP缓冲液中用10单位的CIP(新英格兰Biolabs)溶解5μg脱盐肽(100米m NaCl, 50 mm Tris-HCl, 10 mm MgCl2 和 1 mm DTT; pH 7.9)并在37℃下孵育2小时。通过将三氟乙酸(TFA)加入0.5%的终浓度来酸化混合物。使用C18拉链尖端(Millipore Sigma)脱盐,用25μl1%甲酸在水中干燥并溶解肽。

       Nanolc-MS / MS分析

       仪器设置

      将总共​​12μl的肽混合物装载到捕集柱(适应百分点100C18柱,0.3mm ID×50mm,Thermo Fishific)的恒定流速,恒定流速为4μL/ min。使用0-35%梯度(0-215分钟)的90%乙腈,0.1%甲酸,0.1%甲酸,0.1%甲酸以200nl / / MIN,然后是乙腈洗涤和柱重新平衡,总梯度持续时间为4小时,具有RSLC终极3000(Thermo Fisher Scientific,Dionex)。使用Easyspray源(Thermo Fisher Scientific)以2kV喷涂肽,耦合到四轴 - 围绕(Qexactive,Thermo Fisher Scientific)质谱仪。

       亲和纯化和MS分析(AP-MS)

      对于GFP标记构造的初步AP-MS,质谱仪用于数据相关的采集模式(DDA)。全毫米光谱 m/z 通过1E6的自动增益控制(AGC)目标获得350-1600质量范围,具有1E6的自动增益控制(AGC)目标,最大累积时间(最大值)为20毫秒。在全MS扫描中检测到的前十个离子的碎片(MS / MS)为17,500分辨率,AGC靶为5E5,最大值为60毫秒,固定的第一质量为3 m/z 归一化碰撞能量(NCE)的隔离窗口为25.动态排除设置为40秒。

       数据依赖性彩易福彩鉴定AP-MS样品

      和romeda搜索大众光谱原始文件(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      ),在MaxQuant 1.5.5.1中实现的搜索引擎(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化PPB系列质量和彩易福彩全组彩易福彩量化。
      )。胰蛋白酶/ p被设定为消化模式,每种肽最多有两个错过的裂解。将N-末端的甲硫氨酸和乙酰化的氧化设定为可变的修饰。将半胱氨酸的氨基甲酰化被设定为固定改性。前体和片段公差分别设定为4.5和20 ppm(默认设置)。使用目标诱饵方法搜索文件(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模彩易福彩鉴定的置信度提高。
      )针对Uniprot-Human 03/2017释放(

      uniprot。 UNIPROT:通用彩易福彩知识库。核酸RES。 45,D158-D169

      )和GST(92,949个条目),在肽 - 谱匹配,肽和彩易福彩水平下以1%的假发现率。从MaxQuant输出文件中恢复肽序列。

       PRM方法细化

      开发和应用的PRM分析是Tier 2测定。用大量肽测定第一PRM方法,以便区分在过表达中可检测到的肽以及线粒体提取物中的内源条件。首先使用Nextprot肽唯一性检查员检查肽单性(

      Schaeffer,M.,Gateau,A.,Teixeira,D.,Michel,P. A.,Zahn-Zabal,M.和Lane,L,。 NextProt肽唯一性检查器:彩易福彩组学群落的工具。 Bioinformatics 33,3471-3472

      )。然后手动检查MS / MS光谱,并选择具有最高MS强度的肽,没有切错衰减和高鉴定评分用于初步PRM肽评估。在各种电荷状态下,肽列表组成,对应于MID51(11个肽),ALTMID51(4肽),HSP60(4肽)和GST(5肽)的独特肽的电荷。具有3E6的AGC靶的全MS光谱拍摄方法,最大值为70ms,70,000的分辨率,然后是具有5E5离子的AGC靶标的未划分的靶向-S2方法,最大值为130ms,分辨率17,500带2 m/z 隔离窗口和NCE为27。
      使用第二种方法来评估在内源线粒体提取物上的CIP处理后回收的信号。基于与MID51(3个肽),ALTMID51(2肽),HSP60(3肽)和GST(3肽)的肽相对应的先前PRM实验,基于先前的PRM实验组成的肽列表。具有3E6的AGC靶标的全文谱获取的方法,最大值为70ms,70,000的分辨率,然后是具有5e5离子的AGC靶的未划分的靶向-S2方法,最大值为150ms,分辨率17,500带2米/ z隔离窗口和NCE为27.所有方法优化文件都是使用天际线处理的(

      Maclean,B.,Tomazela,DM,Shulman,N.,Chambers,M.,Finney,GL,Frewen,B.,Kern,R.,Tabb,DL,Libler,DC和Maccoss,MJ,Skyline:开放用于创建和分析目标彩易福彩组学实验的源文档编辑器。生物信息学26,966-968

      )。

       高灵敏度PRM.

      对于全细胞提取物和线粒体提取物以及绝对量化实验的内源性CV分析,根据(
      • 加利斯S.
      • Bourmaud A.
      • 金S.Y.
      • 达蒙 B.
      基于平行反应监测分析的技术考虑。
      )。具有3E6的AGC靶标的方法组成的方法,其最大值为70ms,70,000的分辨率,然后是具有1E6离子的AGC靶标的未划分的靶向MS2方法,最大值为250ms分辨率70,000 NCE为27.隔离列表含有来自Altmid51的一种肽,一个用于Mid51及其Aqua标准,一种来自GST峰值的肽以及来自HSP60的一种肽,用作样品处理控制。

       高灵敏度PRM样本分析

      通过Xcalibur 2.2(Thermo Fisher Scientific)通过测量3ppm质量精密窗口内的每种肽单位素过渡的区域进行分析质谱原料文件。对于Aqua肽校准曲线,将内标掺入Hela消化中,并在上述条件下用高灵敏度PRM分析。对于每种肽,评估从N末端在3ppm的质量偏差内开始的五种前体 - 片段转变,用于线性度和CV分析,考虑到在给定浓度下的CV低于20%的转变是可量化的。对于内源性CV分析,对3 ppm精密窗口中的每种肽测量最量化的前体转发,并比较两种重复。对于绝对量化实验,通过将内源性肽与尖刺式的比率与其在3-ppm质量精密窗口内的片段转变相同的前体的浓度来确定彩易福彩浓度。肽比保持在25以下。通过将原始文件导入天际线来控制光谱相似性,如果它们的光谱对比度角度(
      • WAN K.X.
      • Vidavsky I.
      • 毛利。
      比较类似光谱:从相似性指数到光谱对比度。
      )或比率点产品接近1,以及匹配Aqua标准的保留时间。
      质谱彩易福彩组学数据通过骄傲沉积在Proteomexchange联盟中(
      • VizcaínoJ.A.
      • Csordas A.
      • Del-Toro N.
      • 戴安斯J.A.
      • 怜悯J.
      • Lavidas I.
      • Mayer G.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • Ternent T.
      • 徐Q.W.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      2016年更新自豪数据库及其相关工具。
      )与数据集标识符PXD008147的合作伙伴存储库。

       CRISPR-CAS9介导的MID51和ALTMID51敲除(KO)

       敲门克隆细胞生成

      CarrpR-Cas9介导的MID51和ALTMID51 KO HELA细胞(
      • ran f.a.
      • HSU P.D.
      • 赖特J.
      • agarwala五。
      • 斯科特D.A.
      • 张F.
      基因组工程使用CRISPR-CAS9系统。
      )具有微小的修改。简而言之,使用广泛的SGRNA Designer(Crisprko)工具(Cashprko)工具设计了SGRNAhttp://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design,(
      • doiond J.G.
      • Fusi N.
      • Sullender M.
      • Hegde M.
      • vaimberg e.w.
      • Donovan K.F.
      • 史密斯I.
      • Tothova Z.
      • Wilen C.
      • 果园R.
      • 维珍H.W.
      • Listgarten J.
      • 根D.E.
      优化的SGRNA设计,以最大化活动并最大限度地减少CRISPR-CAS9的偏离目标效果。
      ))并用CCTOP工具确认(http://crispr.cos.uni-heidelberg.de/,(
      • SENTMER M.
      • Thumberger T.
      • Del Sol Keyer M.
      • Wittbrodt J.
      • Mateo J.L.
      CCTOP:直观,灵活可靠的CRISPR / CAS9目标预测工具。
      )))。 CRISPR-CAS9相关的寡核苷酸描述于 表I.。通过退火的顶部和底部寡核苷酸来制备含有U6 RNA聚合酶III启动子所需的额外g的SGRNA插入物(表I.)并克隆到PSPCAS9(BB)-2A-GFP质粒(Addgene#48138,Cambridge,Massachusetts(
      • ran f.a.
      • HSU P.D.
      • 赖特J.
      • agarwala五。
      • 斯科特D.A.
      • 张F.
      基因组工程使用CRISPR-CAS9系统。
      )))。通过测序验证所得质粒。通过单细胞FACS分选进行转染后24小时进行CAS9-2A-GFP表达细胞和克隆细胞群分离的富集。通过使用MissMatch测定引物的T7内切核酸酶I(NEB),基因特哺乳动物基因组DNA miniprep试剂盒(Millipore Sigma),通过Mismatch-Cleavage测定来完成基因组编辑的初始验证。表I.)。通过Western Blotting确认细胞版本(Fig. 3)并通过测序衍生自目标位点的PCR扩增子。
      表I.用于CRISPR-CAS9基因组编辑实验的寡核苷酸序列
      Altmid51的寡核苷酸序列敲除来Mid51寡核苷酸序列敲除来
      基因组目标位点5'-tggagccgagaggcggtgct-3'5'-cgctggcagttaagcgggta-3'
      顶部寡核苷酸5'-CACCGAGCACCGCCTCTCGGCTCCA-3'5'-CACCGTACCCGCTTAACTGCCAGCG-3'
      底部寡核苷酸5'-aaactggagccgagaggcggtgctc-3'5'-aaaccgctgccagttaagcgggtac-3'
      T7内切核酸酶1个不匹配测定引物5'-ggggtctctgaacttggat-3'5'-tccttttctcggtcccttgc-3'5'-ggtcccagtacttatggcg-3'5'-ccacgcagaaaatctcaggg-3'
      图缩略图GR3.
      Fig. 3CRISPR-CAS9基因组ALTMID51和MID51编辑。 A,CRISPR-CAS9实验策略的示意图。为清楚起见,只显示了5个外显子。外显子2内的Alt-Mid51以红色显示。 Mid51编码序列(蓝色),重叠外显子3,4和外显子5的一部分。 B,在未编辑的HeLa细胞和相应序列中编程切割位点周围的基因组序列。 PAM位点以黄色突出显示,并以指导RNA瞄准的基因组序列以绿色突出显示。还在外显子2和外显子3中的核苷酸40处示出了编程的切割位点。 C,Crisp-Cas9编辑的HeLa细胞中编程切割位点周围的基因组序列。在ALTMID51编辑的克隆中,在切位点发生1bp A / T插入(以红色的红色标记,红色星形和红色星形)发生。在中午克隆中,在编程的切位点(红星)上游检测到不同序列的混合物,表明存在不同的等位基因。 D如图,通过彩易福彩印迹与针对MTHSP70,MID51和定制ALTMID51抗体的抗体裂解并分析来自未编辑,MID51编辑的和ALTMID51编辑的HELA细胞的线粒体提取物,并通过抗体抗体。 E,CRISPR-CAS9 MID51敲除序列分析。序列与面板C的电泳图对齐。 *是指Mid51抗体的非特异性靶标(
      • Osellame L.D.
      • 辛格A.P.
      • stroud d.a.
      • Palmer C.S.
      • Stojanovski D.
      • Ramachandran R.
      • Ryan M.T.
      DRP1适配器MFF,MID49和MID51在线粒体裂变中的合作与独立角色。
      )。

       杂合子中含量的特征

      使用Mid51 Mismatch测定引物扩增基因组DNA,其中引物延伸,允许其插入线性化(EcoRI,BamHi,新英格兰Biolabs)pcDNA 3.1( - )表达载体 通过 如上所述吉布森装配。纯化质粒并测序。

       Western Blotting.

      对于每个样品,将50μg的线粒体彩易福彩提取物混合1/1(v / v),具有Laemmli缓冲液(4%Sds W / V,20%甘油v / v,Tris-HCl 100Mm pH 6.8,5%β-巯基乙醇v / v)并在95℃下加热5分钟。对于Altmid51,用甘氨酸缓冲液以200V恒定电压在4%堆叠/ 15%丙烯酰胺 - 双丙烯酰胺(29/1W / W)分离SDS-PAGE中分离彩易福彩。对于Mid51,在4%堆叠/ 10%丙烯酰胺 - 双丙烯酰胺中分离彩易福彩(49.5%T,3%C)分辨三分析SDS-PAGE(
      • Palmer C.S.
      • Osellame L.D.
      • Laine D.
      • Koutsopoulos O.S.
      • Frazier a.e.
      • Ryan M.T.
      MID49和MID51,线粒体裂变机械的新组件。
      ,
      • SchäggerH.
      tricine-sds-page。
      )使用0.2的18小时凝胶(16×18厘米) m Tris-HCl pH 8.9作为阳极缓冲液和0.1 m TRIS-HCL,0.1 m 三序,0.1%SDS pH 8.25作为阴极缓冲液(25 mA恒流)。将彩易福彩转移到聚酰茚二烯二氟化膜上。膜被含有5%的牛奶补充剂,Tris缓冲盐水0.2%Tween-20(TBST)。用定制的抗Altmid51兔抗体(Proteintech,Rosemont,伊利诺伊州)探测膜(Proteintech,Rosemont,见下文),一种多克隆抗Mid51兔抗体(Proteintech 20164-1-AP)和小鼠单克隆抗线粒细胞HSP 70抗体(MA3028,Thermo Fisher Scientific)在4°C过夜。然后用TBST洗涤膜并用山羊抗小鼠(SC-2005,Santa-Cruz Biotechnology,Mississauga,Ontario,Canada)或山羊抗兔 - 共轭辣根过氧化物酶抗体(7074s,细胞信号传导技术,Danvers探测,马萨诸塞州)。

       Altmid51抗体

      兔多克隆抗Altmid51抗体升高,抗全长70个氨基酸重组Altmid51蛋白和亲和纯化(Proteintech)。

       统计数据

      所有图形和统计数据都使用R(
      • r核心团队
      )3.3.2和ggplot2(
      • 威克姆H.
      )2.2.1或更高。

       用伸长核糖体交叉验证

      从GWIPS中提取了两个ORF的Ribo-SEQ覆盖率(
      • Michel A.M.
      • 福克斯G.
      • 米基兰A.
      • de bo c.
      • O'Connor P.B.
      • heaphy s.m.
      • Mullan J.P.
      • donohue c.a.
      • 希金斯D.G.
      • 巴兰诺夫P.V.
      Gwips-viz:ribo-seq基因组浏览器的开发。
      )HEK和HELA细胞。使用UCSC基因组浏览器的UMAP轨道被认为将两个ORF的所有核苷酸视为可涂抹(
      • Karimzadeh M.
      • 恩斯特C.
      • Kundaje A.
      • 霍夫曼半
      Umap和Bismap:量化基因组和甲基杂志可用性。
      )在Altmid51和Mid51 Orf之间比较核糖体密度。

      结果

       测定Mid51和Altmid51彩易福彩肽肽

      除了规范CD(共识CDS CCDS13995; Refseq NM_019008.5; Ensembl Enst00000325301)和相关蛋白(Refseq NP_061881,Uniprot Q9NQG6; Ensembl ensp00000327124),人类 伤害1 包含功能和最近注释的Altorf(Genbank HF548110)编码小彩易福彩(Uniprot L0R8F8; Genbank CCO13821.1.; Ensembl ensp00000490747)(Fig. 1A1B)。因此, 伤害1 显然是一种原型的双编码基因,其中大型和小彩易福彩产品的绝对量化是未知的。我们评估了Mid51和Altmid51在胰蛋白酶消化后产生彩易福彩蛋白肽的能力。彩易福彩肽对于每种彩易福彩是特异性的,并且必须始终如一地用优质的前体和片段质量转变(
      • Kuster B.
      • Schirle M.
      • Mallick P.
      • Aeberberold R.
      用彩易福彩肽探针评分彩易福彩彩易福彩。
      ,
      • Mallick P.
      • Schirle M.
      • 陈氏
      • 浮动M.R.
      • 李H.
      • 马丁D.
      • ranish J.
      • 骑B.
      • 施密特R.
      • Werner T.
      • Kuster B.
      • Aeberberold R.
      彩易福彩蛋白肽对定量彩易福彩组学的计算预测。
      ,
      • Wilhelm M.
      • Schlegl J.
      • Hahne H.
      • GOLYMI A.M.
      • Lieberenz M.
      • Savitski m.m.
      • Ziegler E.
      • Butzmann L.
      • Gessulat S.
      • 马克思H.
      • Mathieson T.
      • Lemeer S.
      • Schnatbaum K.
      • reimer u.
      • 文字H.
      • Mollenhauer M.
      • Slotta-huspenina J
      • Boese JH.
      • Bantscheff M.
      • Gerstmair A.
      • FAERBER F.
      • Kuster B.
      群体彩易福彩组的质谱。
      ,
      • ZOLG D.P.
      • Wilhelm M.
      • Schnatbaum K.
      • Zerweck J.
      • knaute t.
      • Delanghe B.
      • Bailey D.J.
      • Gessulat S.
      • Ehrlich H.C.
      • Weininger M.
      • 是的。
      • Schlegl J.
      • Kramer K.
      • 施密特T.
      • Kusebauch U.
      • 德意曲e.w.
      • Aeberberold R.
      • 莫里茨R.L.
      • 文字H.
      • Moehring T.
      • Aiche S.
      • Huhmer A.
      • reimer u.
      • Kuster B.
      基于完整的合成人群构建彩易福彩池。
      )。为了促进两种彩易福彩的特异性胰蛋白酶肽的检测,我们使用与质谱法偶联的亲和纯化。中午 GFP. 和 altMiD51GFP. 在Hela细胞中独立过表达。两种彩易福彩纯化并通过数据依赖性(DDA)纳米毛细管液相色谱质谱(Nanolc-MS / MS)分析并分析。检测几种彩易福彩肽肽的总序列覆盖率为Altmid51和Mid51的总序列覆盖率为68.6%和71.9%(Fig. 1B补充数据S1)。手动评估(参见方法部分)后,选择最佳质量的彩易福彩肽进行平行反应监测(PRM)优化(
      • 加利斯S.
      • Bourmaud A.
      • 金S.Y.
      • 达蒙 B.
      基于平行反应监测分析的技术考虑。
      ,
      • Bourmaud A.
      • 加利斯S.
      • 达蒙
      • 布鲁诺
      平行反应监测采用四伞石渣质谱仪:原理和应用。
      )。

       PRM优化Mid51和Altmid51彩易福彩肽肽

      然后在3kDa熔化处理样品中以低灵敏度PRM实验验证所选的彩易福彩肽肽(
      • wisniewski J.R.
      • 邹格曼A.
      • Nagaraj N.
      彩易福彩组分析的通用样品制备方法。
      )。实际上,Altmid51是70个氨基酸的小彩易福彩,低M.W.是必要的,以确保样品制备期间的彩易福彩保留。因为Mid51和Altmid51都是线粒体彩易福彩(

      Samandi,S.,Roy,Av,Delcourt,V.,Lucier,JF,Gagnon,J.,Beaudoin,MC,Vanderre,B.,Breton,MA,Motard,J.,Jacques,JF,Brunelle,M。, Gagnon-Arsenault,I.,Fournier,I.,Ouangraoua,A.,狩猎,DJ,Cohen,AA,Landry,Cr,Scott,MS,Roucou,X.,深度转录组注释使得神秘的小的发现和功能表征能够进行发现和功能表征彩易福彩。 Elife 6,E27860

      ),线粒体从模型转染的细胞中分离出和用含有CDS编码的cDNA转染的细胞和含有含有Altorf编码Altmid51(Refseq转录物NM_019008.4)的CDN的cDNA转染的细胞。在这些线粒体提取物中检测到每个彩易福彩的两个彩易福彩肽肽(补充图。S1)。内源性线粒体Hsp60肽的信号强度表明,嘲弄和转染的线粒体提取物的彩易福彩浓度相似,并且Altmid51和Mid51肽的强度差异在模拟转染和Altmid51 / mid51转染的样品之间的差异不是由线粒体制备的差异产生的。
      作为MID51最强烈地检测到的肽(AISAPTSPTR)钻孔已知的磷化水(Fig. 1B),实施了使用Calf肠道磷酸酶(CIP)的去磷酸化步骤的第二PRM方法(
      • 吴R.
      • 哈斯W.
      • Dephoure N.
      • Huttlin E.L.
      • 翟德
      • Sowa M.E.
      • Gygi S.P.
      一种测量绝对彩易福彩磷酸化化学物质测定的大规模方法。
      )。磷酸化的一小部分磷酸化,因为CIP处理导致AISAPTSPTR的强度增加了20%(补充图S2)。用两种已知的HSP60胰蛋白酶磷酸化肽,VGGTSDVEVNEK和VTDALNATR(磷酸盐)验证了CIP处理的效率分别增加了103和133%的强度。非磷酸化的HSP60肽的强度没有显着变化。 Altmid51肽显然是磷酸化,因为CIP治疗不会显着改变它们的强度(补充图S2)。基于这些结果,我们选择了肽EAVLSLYR和AISAPTSPTR,分别用于ALTMID51和MID51的绝对定量。
      最后,估计了在线粒体和全细胞提取物上的变异系数(CV)的测量来估计不同样品中最敏感的PRM方法的精度。实际上,绝对量化需要低于20%的CV(
      • 加利斯S.
      • 金S.Y.
      • 达蒙 B.
      使用内标触发平行反应监测(IS-PRM)大规模靶向彩易福彩组学。
      )。 CVS系统地低于20%,表明线粒体和全细胞提取物都适合定量(补充图S3)。尽管线粒体提取物中的肽强度较高,但我们决定使用全细胞裂解物以用于Altmid51和Mid51的绝对定量,因为它们的制备不涉及细胞分级,具有可变线粒体恢复的风险。

       Altmid51和Mid51彩易福彩丰富

      两种合成稳定同位素标记的肽,用于绝对量化(Aqua)(
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • STEMMAN O.
      • Kirschner M.W.
      • Gygi S.P.
      通过串联MS从细胞裂解物中绝对定量彩易福彩和磷蛋白。
      ),EAVLSLYR和AISAPTSPTR在胰蛋白酶从HELA细胞消化并分析后刺入彩易福彩样品中 通过 PRM (Fig. 1B)。测量从最多N-末端氨基酸开始的总共5y离子转变,并且两种肽在40 amol - 250 fmol和CV的范围内显示至少一个可量化的转变< 20% (补充图S4)。
      通过将胰蛋白酶掺入胰蛋白酶中的胰蛋白酶中,通过胰蛋白酶掺入消化混合物中进行绝对量化PRM实验(
      • 格柏S.A.
      • 赶紧J.
      • STEMMAN O.
      • Kirschner M.W.
      • Gygi S.P.
      通过串联MS从细胞裂解物中绝对定量彩易福彩和磷蛋白。
      )。用CIP处理脱盐和去磷酸化后,使用高灵敏度PRM方法处理所得肽(
      • 加利斯S.
      • Bourmaud A.
      • 金S.Y.
      • 达蒙 B.
      基于平行反应监测分析的技术考虑。
      )。对于每种肽,对应的天然和Aqua物种的保留时间以及光谱对比角度或比率点产品(
      • WAN K.X.
      • Vidavsky I.
      • 毛利。
      比较类似光谱:从相似性指数到光谱对比度。
      )被控制以确保正确的识别(Fig. 2A, 2B补充图。S6-S12)。因此确定了天然肽的绝对量(补充数据S2)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2ALTMID51和MID51的识别和定量。 A,提取MID51的片段离子转换色谱图([AISAPTSPTR + 2H]2+ → y6+)和altmid51([eavlslyr + 2h]2+ → y4+)Hela细胞中的肽。 B,内源肽(顶部)和稳定同位素的光谱对比度分析标记的合成肽(底部)提取 .

       CRISPR-CAS9-介导的ALTMID51或MID的独立灭活

      因为这是在同一基因中由两个独立ORF编码的大型和小彩易福彩的第一种绝对量化,重要的是表明通过灭活它们各自的编码序列,部分或完全困扰的绝对量。使用RNAI基敲低方法独立于MID51表达的ALTMID51表达的实验调制是不可能的,因为两种彩易福彩通过相同的基因编码,并且两种编码序列都存在于相同的转录物中。这是对同一基因编码的小和大彩易福彩的一般挑战(
      • Delcourt V.
      • Staskevicius A.
      • Salzet M.
      • 四分之一。
      • roucou x.
      由未经爆发的ORF编码的小彩易福彩是彩易福彩组的升高的恒星,确认基因组注释中的缺点和mRNA的当前视觉。
      )。因此,我们实施了一个Casspr-Cas9方法,以独立地防止AltMID51或Mid51的表达(Fig. 3A3B)(
      • ran f.a.
      • HSU P.D.
      • 赖特J.
      • agarwala五。
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      基因组工程使用CRISPR-CAS9系统。
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      • 理查兹米
      • 博纳瓦尔P.
      • Moineau S.
      • 罗梅罗D.A.
      • 霍维特·普
      CRISPR提供了对原核生物中病毒的获得性抵抗。
      )。
      通过测序靶向基因组区域来验证基因组克隆细胞系。 PCR扩增的ALTMID51基因组区域的序列证实了在Cas9切割位点的外显子2的位置的纯合1bp插入A / T的A / T(Fig. 3C)。对于Mid51,PCR扩增的基因组区域的序列电泳图显示出重叠的峰(Fig. 3C),表明在不同等位基因中存在杂合突变。
      ALTMID51通过Western Blotting既完全不可检测)(Fig. 3D)和绝对量化(Fig. 4A,韦尔奇 t 测试 p 值= 0.0013),确认成功编辑AltMID51 ORF(Fig. 3C)。值得注意的是,Altmid51编辑细胞中51的水平显着增加(Fig. 4A,韦尔奇 t 测试 p 值= 0.0006)。虽然在CRISPR-CAS9中期染色的细胞中,Western印迹未检测到mid51(Fig. 3D),PRM分析显示含量为86%(Fig. 4A,韦尔奇 t 测试 p 值= 0.0004),表明未编辑的WT等位基因仍然存在。但是,测序中含MID51编辑的HELA(Fig. 3E)显示没有检测到WT序列,表明来自PRM实验的信号是因为6个核苷酸,因此2个氨基酸,在MID51序列中丧失,给出了含有AQUA MID51肽的截短彩易福彩的非框架序列(Fig. 3E,蓝色酒吧)。总体而言,AltMID51和Mid51的基因组编辑得出了选择用于绝对定量的彩易福彩肽,以及在同一基因中存在两种功能和物理上独立的编码信息。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4绝对量化和化学物质测量。 A,Altmid51和Colon组织中的Altmid51和Mid51的绝对定量(技术三份),HEK 293,HELA和CRISPR-CAS9敲除(生物三份子)。错误栏=标准偏差。 B,化学计量基于ALTMID51和MID51绝对量的测定。 Boxplots代表三个生物学(HEK 293和HELA)或技术(结肠)复制。韦尔奇 t 测试 p < 0.05 (*), < 0.01 (**), < 0.001 (***).

       ALTMID51至mid51的绝对金额和比例

      在HEK 293中进行绝对量化,Hela和结肠组织表明Altmid51是最丰富的彩易福彩产品 伤害1 (Fig. 4A, 补充数据S2)。我们比较了HEK 293,Hela和人结肠组织样本的绝对量的Altmid51和Mid51以确定它们的化学计量关系。化学计量表明,来自最丰富的翻译产品 伤害1 是Altmid51而不是规范中午51蛋白。 ALTMID51至MID51的比例在HEK 293细胞中为2.71,HERA细胞为5.73,人结肠组织中为2.62(Fig. 4B补充图。S13)。这种观察结果与我们对核糖体占用的分析,与从GWIP提取的数据(补充图S14; 补充数据S3)。

      讨论

      除了规范CDSS的翻译之外,核糖体分析和彩易福彩组织概述的概述和彩易福彩组织强烈支持来自Altorfs的替代彩易福彩产品。然而,由相同基因编码的小和大彩易福彩的绝对量化是未知的。在这里,我们表明70氨基酸Altmid51的水平,在外显子中编码的小彩易福彩最初被注释为“非编码” 伤害1/SMCR7L/MiD51 比细胞和人体组织中规范中午彩易福彩的水平高出两到六倍。这项工作说明了小彩易福彩是彩易福彩组的重要贡献者,并且不是因为与大彩易福彩不同,不存在Altorfs和替代彩易福彩,它们不存在。显然,这很可能不是Altorfs的一般特征,并且由相同基因编码的小和大蛋白的表达水平是高度可变的和基因特异性。此外,彩易福彩丰富和功能之间没有相关性,因为AltMID51 / Mid51的比率是>图2并不意味着Altmid51的功能比中午51更大。
      若干生理过程可以解释ALTMID51至MID51的较高比例,包括彩易福彩合成的差异,彩易福彩降解的差异或两者的组合。尽管如此,根据翻译启动的扫描模型,最可能的机制是AltMID51的定位在51中的上游,这将有利于Altmid51翻译。该假设由与之对齐的核糖体分析数据支持 伤害1 与CD相比,表示延长核糖体的密度较高的基因座(
      • 和reev d.e.
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      5'领导者的翻译在抗EIF2抑制的基因中是普遍存在的。
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      Calviello,L.,Mukherjee,N.,Wyler,E.,Zauber,H.,Hirsekorn,A.,Selbach,M.,Landthaler,M.,Obermayer,B.和Ohler,U,。在核糖体分析数据中检测积极翻译的开放阅读框架。 NAT。方法13,165

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      Gwips-viz:ribo-seq基因组浏览器的开发。
      ),表明核糖体有效地翻译ALTMID51。此外,由于砷酸钠诱导的严重应激(
      • 和reev d.e.
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      • 巴兰诺夫P.V.
      5'领导者的翻译在抗EIF2抑制的基因中是普遍存在的。
      )。抗EIF2抑制的基因是通过在正常条件下存在有效翻译的上游ORF和主要CDS翻译的部分抑制,以及响应环境压力的DERELAGESS(

      年轻的S. K.和Wek R.C。,上游开放阅读框架在综合应力响应中差异调节基因特异性翻译。 J. Biol。化学。 R116.

      )。我们的彩易福彩组学数据与生理条件下的MID51翻译中的抑制相同。
      Crispr-Mediated Altmid51和Mid51 KO实验导致了两个重要的观察结果。首先,我们观察到ALTMID51 KO细胞中51表达显着增加(Fig. 4A)。在这些细胞中,在Cas9编辑的ALTMID51编码序列中插入的单个BP(A / T)导致AltMID51 ORF的截短,从210bps到78bps,并平行增加校长距离Altmid51-mid51从98到231。组合较短的上游ORF和更长的校长距离预先显示,以增加下游ORF的重新启动(
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      )。因此,除了其作为新型线粒体裂变因子的编码序列的作用之外(

      Samandi,S.,Roy,Av,Delcourt,V.,Lucier,JF,Gagnon,J.,Beaudoin,MC,Vanderre,B.,Breton,MA,Motard,J.,Jacques,JF,Brunelle,M。, Gagnon-Arsenault,I.,Fournier,I.,Ouangraoua,A.,狩猎,DJ,Cohen,AA,Landry,Cr,Scott,MS,Roucou,X.,深度转录组注释使得神秘的小的发现和功能表征能够进行发现和功能表征彩易福彩。 Elife 6,E27860

      )和一个涉及疏片泡锥生物发生的组装因子(
      • 棕色A.
      • rathore s.
      • Kimanius D.
      • Aibara S.
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      • Rorbach J.
      • Amunts A.
      • Ramakrishnan V.
      组装土生物态中人体线粒体核糖体的结构。
      ),Altmid51 ORF可以用作上游ORF调节MID51的翻译。其次,Mid51 KO细胞仍然在正常水平下表达AltMID51,这表明爆震规范CD不会完全失活 伤害1。该结果显示第一时间灭活带注释的CD可能不一定删除基因。
      几种情况的组合允许小蛋白在最近直到最近才会受到注意。首先,根据当前的人体注释,彩易福彩编码基因具有单一CD,通常是最长的ORF(
      • dinger m.e.
      • 庞克。
      • Mercer T.R.
      • Mattick J.s.
      区分彩易福彩编码和非致rna:挑战和含糊不清。
      )。因此,在特定基因的病理学中寻找生理功能或作用的所有努力总是聚焦在该CD编码的彩易福彩上,或通过替代剪接产生的其变体之一。其次,在没有非规范ORF的注释的情况下,基于MS的MS基彩易福彩组学方法不能常规地检测相应彩易福彩的彩易福彩序列,其依赖于含有规范蛋白序列的当前彩易福彩数据库。第三,广泛使用的彩易福彩印迹技术依赖于特异性抗体,但仅针对规范蛋白升高并商业化。提高新型特异性抗体可能需要时间和几次尝试,从而延迟对小彩易福彩的研究。第四,基于MS的彩易福彩组学的小彩易福彩的检测比大彩易福彩更具挑战性。通常,必须分级彩易福彩组以富含低分子量彩易福彩,并且鉴定通常依赖于单个胰蛋白肽(
      • 马杰。
      • 沃德C.C.
      • Jungreis I.
      • Slavoff S.A.
      • Schwaid A.G.
      • Neveu J.
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      在细胞系和组织中发现人sorf编码的多肽(SEP)。
      ,
      • 马杰。
      • Diedrich J.K.
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      • Donaldson C.
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      • YALES III,J.R.
      • Saghatelian Alan。
      改进小型开放阅读框架编码多肽的识别与分析。
      )。此外,可能在自下而上的彩易福彩组学中,可能没有胰蛋白酶消化物消化的胰蛋白酶消化和肽的遗传彩易福彩。第五,因为它们是短的,小彩易福彩不太可能在大彩易福彩中发现已知的彩易福彩结构域,或显示特定结构。因此,可能存在偏见的感知,即,与生物机制中的大彩易福彩相比,小彩易福彩具有轻微的功能。然而,许多小彩易福彩在原核生物和真核生物中具有基本功能(
      • Delcourt V.
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      由未经爆发的ORF编码的小彩易福彩是彩易福彩组的升高的恒星,确认基因组注释中的缺点和mRNA的当前视觉。
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      • ramamurthi K.S.
      小彩易福彩不能再忽视。
      )。
      altmid51于2013年3月集成到自动注释的Uniprotkb / Trembl数据库(标识符L0R8F8),然后在Altsmcr7L下的名称下进行检测(
      • Vanderperre B.
      • Lucier J.F.
      • Bissonnette C.
      • Motard J.
      • Tremblay G.
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      • WISZTORSKI M.
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      • Boisvert F.M.
      • roucou x.
      直接检测人类中的替代开放阅读框架翻译产品显着扩展了彩易福彩组。
      )。它于2017年3月融入了手动注释的Uniprotkb / Swiss-Prot数据库。就像Altmid51,现在是一个手动注释的双顺反应基因,更新根据最近的突出结果研究的基因组注释是很重要的(
      • Delcourt V.
      • Staskevicius A.
      • Salzet M.
      • 四分之一。
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      由未经爆发的ORF编码的小彩易福彩是彩易福彩组的升高的恒星,确认基因组注释中的缺点和mRNA的当前视觉。
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      Samandi,S.,Roy,Av,Delcourt,V.,Lucier,JF,Gagnon,J.,Beaudoin,MC,Vanderre,B.,Breton,MA,Motard,J.,Jacques,JF,Brunelle,M。, Gagnon-Arsenault,I.,Fournier,I.,Ouangraoua,A.,狩猎,DJ,Cohen,AA,Landry,Cr,Scott,MS,Roucou,X.,深度转录组注释使得神秘的小的发现和功能表征能够进行发现和功能表征彩易福彩。 Elife 6,E27860

      )。实际上,不应根据较大彩易福彩产品的分子活性推断双编码基因的功能。此外,在单个CD的概念框中,不应分析突变对基因功能的影响,因为目前带注释CDS的突变可能影响非甘露解的ORF和最终基因功能(
      • Brunet M.A.
      • Levesque S.A.
      • 狩猎d.j.
      • 科恩A.A.
      • roucou x.
      识别人类基因的多端性质对于了解基因型表型关系至关重要。
      )。最后,我们的结果清楚地证明了基因中的规范CD和离开Altorfs未灭绝的结果并未完全消除该基因的翻译输出。

      数据可用性

      质谱数据可在Pride存储库中使用数据集标识符PXD008147。

      致谢

      我们感谢Michael T. Ryan和Laura Osellame进行建设性交流,特别是在Mid51通过西部污染检测,François-Michel Boisvert进入质谱仪。重组GST是Marie-Line Dubois的慷慨礼物。

      补充材料

      参考

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