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多柔比星诱导的DNA损伤导致核糖瘤蛋白的广泛泛素与蛋白质翻译减少相关的核糖体蛋白质

  • 文森斯A. Halim.
    脚注
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学组,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,3584 Ch Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,3584年Ch Utrecht,荷兰

    荷兰荷兰癌症研究所的细胞生物学和癌症基因组学中心,1066 CX阿姆斯特丹,荷兰
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  • 伊拉亚加西亚桑泰斯特班
    脚注
    隶属关系
    荷兰荷兰癌症研究所的细胞生物学和癌症基因组学中心,1066 CX阿姆斯特丹,荷兰

    巴斯克地区大学(UPV / EHU),Leioa,西班牙大学遗传学,物理人类学和动物生理学系
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  • Daniel O. Harmerdam
    隶属关系
    荷兰荷兰癌症研究所的细胞生物学和癌症基因组学中心,1066 CX阿姆斯特丹,荷兰

    欧洲衰老生物学研究所,大学医学中心格罗宁根,9713 AV格罗宁根,荷兰
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  • 布拉姆van den broek
    隶属关系
    荷兰荷兰癌症研究所的细胞生物学和癌症基因组学中心,1066 CX阿姆斯特丹,荷兰
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  • Albert J.r. Heck.
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学组,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,3584 Ch Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,3584年Ch Utrecht,荷兰
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  • 沙巴兹穆罕默德
    隶属关系
    生物分子质谱和蛋白质组学组,Bijvoet生物分子研究中心和乌得勒支大学制药科学研究所,3584 Ch Utrecht,荷兰

    荷兰蛋白质组学中心,3584年Ch Utrecht,荷兰

    牛津大学生物化学系,牛津大学,英国

    牛津大学化学系化学研究实验室,牛津,英国牛津大学
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  • Renéh。Medema.
    一致
    应该解决对应的通信。
    隶属关系
    荷兰荷兰癌症研究所的细胞生物学和癌症基因组学中心,1066 CX阿姆斯特丹,荷兰
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  • 作者脚注
    ¶¶共享第一作者。
    本文包含补充材料表S1至S7和图3。 S1-S4。
      蛋白质后期改性(PTM)在DNA损伤反应中起着中心作用。特别地,已显示蛋白质磷酸化和ubiquitination在信号级联中是必需的,其与细胞周期进展协调破裂修复。在这里,我们进行了全细胞定量蛋白质组学,以鉴定DNA双链诱导诱导的蛋白质泛括约化的全局变化。总共量化超过9,400个泛素位点,发现响应DNA双链断裂,改变了这些位点的约10%的相对丰度。有趣的是,核心蛋白酶蛋白(包括来自40s以及60s亚基)的大部分核糖瘤菌蛋白蛋白均响应于DNA损伤。同时,我们发现DNA损伤导致核糖体功能的抑制。连同,这些数据将核糖体揭示为DNA损伤反应的主要目标。
      细胞的基因组经常被内部(反应性细胞代谢物)和外部(辐照,紫外线)来源产生的损伤损坏(
      • Bartek J.
      • 卢卡斯J.
      DNA损伤检查点:从启动到恢复或适应。
      ,
      • 杰克逊S.P.
      • Bartek J.
      人体生物学和疾病中的DNA损伤反应。
      ,
      • Sancar A.
      • Lindsey-Boltz L.A.
      • Unstal-Kaçmazk。
      • Linn S.
      哺乳动物DNA修复的分子机制及DNA损伤检查点。
      )。这导致对基因组稳定性的威胁,并有助于癌症发展。为了保护自己免受这种潜在的威胁,细胞配备了强大的监测机制,在传播到后续子细胞之前,检测和修复损坏。该响应被统称为DNA损伤检查点或DNA损伤反应(
      • Bartek J.
      • 卢卡斯J.
      DNA损伤检查点:从启动到恢复或适应。
      ,
      • 杰克逊S.P.
      • Bartek J.
      人体生物学和疾病中的DNA损伤反应。
      ,
      • Sancar A.
      • Lindsey-Boltz L.A.
      • Unstal-Kaçmazk。
      • Linn S.
      哺乳动物DNA修复的分子机制及DNA损伤检查点。
      )。尽管DNA损伤的这些有害影响,但是,几种DNA损伤剂被广泛应用于治疗癌症,因为它们可能导致非可逆检查点骤停或触发细胞死亡,从而抑制癌细胞中的快速增殖。例如,诱导DNA双链断裂的多柔比星是一种常用于诊所的有效抗癌药物。
      执行DNA损伤响应需要损坏检测,并启动信号级联,其通过细胞周期停止进一步进展,同时促进修复。该信令级联主要由后期修改驱动(
      • Ciccia A.
      • elldege s.j.
      DNA损伤反应:用刀具安全。
      ,
      • 哈珀J.W.
      • elldege s.j.
      DNA损伤反应:十年后。
      )。磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶Ataxia-Telanciectasia突变(ATM)和Ataxia-and Rad3-相关(ATR)在发起DNA损伤响应信号传导中起核心作用。 ATM和ATR被募集到DNA损伤的网站,随后磷酸化超过700个基质(
      • 松山S.
      • Ballif B.A.
      • Smogorzewska A.
      • 麦当劳III,E.R.
      • Hurov K.E.
      • 罗杰。
      • bakalarski c.e.
      • 赵Z.
      • Solimini S.
      • Lerenthal Y.
      • Shiloh Y.
      • Gygi S.P.
      • elldege s.j.
      ATM和ATR底物分析显示响应DNA损伤的广泛蛋白质网络。
      )。重要的下游目标ATM和ATR分别是CHK2和CHK1激酶(
      • Sancar A.
      • Lindsey-Boltz L.A.
      • Unstal-Kaçmazk。
      • Linn S.
      哺乳动物DNA修复的分子机制及DNA损伤检查点。
      )。这些效应激酶的磷酸化导致其活化,导致随后的蛋白质磷酸化,这对于DNA损伤检查点的功能是必不可少的,并促进细胞周期停滞(
      • Sancar A.
      • Lindsey-Boltz L.A.
      • Unstal-Kaçmazk。
      • Linn S.
      哺乳动物DNA修复的分子机制及DNA损伤检查点。
      ,
      • 松山S.
      • Ballif B.A.
      • Smogorzewska A.
      • 麦当劳III,E.R.
      • Hurov K.E.
      • 罗杰。
      • bakalarski c.e.
      • 赵Z.
      • Solimini S.
      • Lerenthal Y.
      • Shiloh Y.
      • Gygi S.P.
      • elldege s.j.
      ATM和ATR底物分析显示响应DNA损伤的广泛蛋白质网络。
      ,
      • van Vugt M.A.
      • smits v.a.
      • Klompmaker R.
      • Medema R.H.
      通过DNA损伤抑制POLO样激酶-1以ATM-或ATR依赖性的方式发生。
      )。
      最近的蛋白质组学研究表明,DNA损伤后的泛素灭绝是磷酸化(
      • elia a.e.
      • Boardman A.P.
      • 王D.C.
      • Huttlin E.L.
      • everley r.a.
      • Dephoure N.
      • 周C.
      • Koren I.
      • Gygi S.P.
      • elldege s.j.
      损伤响应DNA中泛素化和乙酰化的定量蛋白质组学阿特拉斯。
      )。很好地确定,响应于双链断裂,泛素介导的信号传导由泛素连接酶RNF8和RNF168引发(
      • Bekker -Jensen S.
      • mailand n。
      泛素和SUMO依赖的信号传导响应对DNA双链断裂。
      ,
      • DOIL C.
      • mailand n。
      • Bekker -Jensen S.
      • 梅纳德
      • Larsen D.H.
      • Pepperkok R.
      • Ellenberg J.
      • 平局S.
      • DUROCHER D.
      • Bartek J.
      • 卢卡斯J.
      • 卢卡斯C.
      RNF168在受损染色体上结合和放大泛素缀合物,以允许累积修复蛋白质。
      ,
      • 杰克逊S.P.
      • DUROCHER D.
      泛素和SUMO对DNA损伤反应的调节。
      ,
      • mailand n。
      • Bekker -Jensen S.
      • 福劳斯H.
      • 梅兰德F.
      • Bartek J.
      • 卢卡斯C.
      • 卢卡斯J.
      RNF8 ubiquitylates DNA双链中的组蛋白突破并促进修复蛋白的组装。
      ,
      • Messick T.E.
      • 格林伯格r.a.
      DNA双股突破的泛素景观。
      )。虽然损伤后,磷酸化事件在整个细胞核中迅速蔓延,但泛素似乎大部分限于断裂场地的附近,更受控(
      • DOIL C.
      • mailand n。
      • Bekker -Jensen S.
      • 梅纳德
      • Larsen D.H.
      • Pepperkok R.
      • Ellenberg J.
      • 平局S.
      • DUROCHER D.
      • Bartek J.
      • 卢卡斯J.
      • 卢卡斯C.
      RNF168在受损染色体上结合和放大泛素缀合物,以允许累积修复蛋白质。
      ,
      • mailand n。
      • Bekker -Jensen S.
      • 福劳斯H.
      • 梅兰德F.
      • Bartek J.
      • 卢卡斯C.
      • 卢卡斯J.
      RNF8 ubiquitylates DNA双链中的组蛋白突破并促进修复蛋白的组装。
      )。蛋白质泛素对于检查点的累积是必不可少的,并且在各种修复途径中起重要作用。过量的蛋白质泛素对维持DNA损伤检查点和DNA修复途径选择有害(
      • mailand n。
      • Bekker -Jensen S.
      • Bartek J.
      • 卢卡斯J.
      通过SCFbetaTRCP破坏Claspin抑制CHK1激活并促进从遗传毒性应激恢复。
      ,
      • amely i.
      • van Vugt M.A.T.M.
      • smits v.a.j.
      • SEMPLE J.I.
      • lemmens b.
      • Perrakis A.
      • Medema R.H.
      • Freire R.
      Polo样激酶-1在检查点恢复期间控制Claspin的蛋白酶体依赖性降解。
      ,
      • Peschiaroli A.
      • Dorrello N.v.
      • Guardavaccaro D.
      • venere M.
      • Halazonetis T.
      • 赫曼N.E.
      • Pagano M.
      ScFbetatrcp介导的Claspin降解调节从DNA复制检查点响应的恢复。
      )。
      有几个报道表明个体核糖体蛋白在DNA损伤反应中发挥作用,最值得注意的是在p53的激活中(
      • lohrum m.a.
      • Ludwig R.L.
      • Kubbutat M.H.
      • Hanlon M.
      • Vousden K.H.
      通过核糖体蛋白L11调节HDM2活性。
      ,
      • Takagi M.
      • absalon m.j.
      • mclure k.g.
      • 卡斯坦M.B.
      核糖体蛋白L26和核仁损伤DNA损伤后P53翻译与诱导调节。
      )但到目前为止,很少有报道与核糖体功能连接DNA损伤反应。已知DNA损害通过破坏募集MRNA至核糖体所需的帽初始复合物来影响mRNA平移(
      • Kumar V.
      • Sabatini D.
      • Pandey P.
      • Gingras A.-​​C.
      • 博马姆人P.K.
      • Kumar M.
      • 元Z.-M.
      • Carmichael G.
      • weichselbaum r.
      • Sonenberg N.
      • kufe d。
      • Kharbanda S.
      C-ABL蛋白 - 酪氨酸激酶对雷帕霉素和FKBP-靶1 /哺乳动物靶标的雷帕霉素和胱盖依赖性的翻译引发。
      ,
      • Paglin S.
      • 李n.y.
      • Nakar C.
      • Fitzgerald M.
      • Plotkin J.
      • Deuel B.
      • Hackett N.
      • McMahill M.
      • Sphicas E.
      • 兰肯N.
      • yahalom J.
      雷帕霉素敏感途径调节辐照MCF-7细胞中的线粒体膜电位,自噬和存活。
      )。此外,已显示DNA损伤剂以影响通过MTOR途径的信号传导,并且结果也是蛋白质翻译。事实上,辐照对翻译的影响比转录更明显(
      • 吕X.
      • de lapeñal.
      • 巴克C.
      • Camphausen K.
      • Tofilon P.J.
      辐射诱导的基因表达的变化涉及招募现有的信使RNA和远离多肌元。
      )。翻译的这些变化至少部分地通过改变MRNA对多元素(
      • 吕X.
      • de lapeñal.
      • 巴克C.
      • Camphausen K.
      • Tofilon P.J.
      辐射诱导的基因表达的变化涉及招募现有的信使RNA和远离多肌元。
      ),但是如何建立它是不知道的。
      真核80s核糖体由四个核糖体RNA(RRNA)和80个核糖体蛋白(RPS)组成(
      • nygårdo.
      • Nilsson L.
      平移动力学,翻译因子,TRNA和核糖体之间的相互作用在真核蛋白质合成中。
      ,
      • de las heras-rubio A.
      • Perucho L.
      • Paciucci R.
      • vilardell J.
      • LLEONART M.E.
      核糖体蛋白作为肿瘤发生中的新型球员。
      ,
      • 罗布尔多S.
      • 偶像r.a.
      • cimmins d.l.
      • Ladenson J.H.
      • 梅森P.J.
      • 贝塞勒M.
      人核糖体蛋白在rRNA和核糖体生产成熟中的作用。
      )。在核仁中的转录后,RRNA分别与核中的RPS和RPL蛋白相关联,分别形成小(40岁)和大(60秒)核糖体亚基(
      • nygårdo.
      • Nilsson L.
      平移动力学,翻译因子,TRNA和核糖体之间的相互作用在真核蛋白质合成中。
      ,
      • de las heras-rubio A.
      • Perucho L.
      • Paciucci R.
      • vilardell J.
      • LLEONART M.E.
      核糖体蛋白作为肿瘤发生中的新型球员。
      ,
      • 罗布尔多S.
      • 偶像r.a.
      • cimmins d.l.
      • Ladenson J.H.
      • 梅森P.J.
      • 贝塞勒M.
      人核糖体蛋白在rRNA和核糖体生产成熟中的作用。
      )。小和大亚基将在细胞质中组装在一起,使成熟的核糖体(或单粒细胞)(
      • nygårdo.
      • Nilsson L.
      平移动力学,翻译因子,TRNA和核糖体之间的相互作用在真核蛋白质合成中。
      ,
      • de las heras-rubio A.
      • Perucho L.
      • Paciucci R.
      • vilardell J.
      • LLEONART M.E.
      核糖体蛋白作为肿瘤发生中的新型球员。
      ,
      • 罗布尔多S.
      • 偶像r.a.
      • cimmins d.l.
      • Ladenson J.H.
      • 梅森P.J.
      • 贝塞勒M.
      人核糖体蛋白在rRNA和核糖体生产成熟中的作用。
      )。重要的是,几种核糖体可以同时转化单个mRNA分子以合成相同的蛋白质,形成所谓的多肌酶(
      • nygårdo.
      • Nilsson L.
      平移动力学,翻译因子,TRNA和核糖体之间的相互作用在真核蛋白质合成中。
      ,
      • de las heras-rubio A.
      • Perucho L.
      • Paciucci R.
      • vilardell J.
      • LLEONART M.E.
      核糖体蛋白作为肿瘤发生中的新型球员。
      )。
      在这项研究中,我们研究了DNA损伤后特定的泛素化事件如何变化,并将核糖体鉴定为DNA损伤检查点的靶标。

      材料和方法

       细胞培养,转染和药物

      U2OS细胞在Dulbecco的改性Eagle的培养基(DMEM)中生长,补充有6%胎牛血清和青霉素/链霉素。胸苷和多柔比星购自(Sigma-Aldrich,St.Louis,Missouri),并使用2.5米m 和 1 μm, 分别。来自(Calbiochem,San Diego,Ca)和ATR抑制剂Ve-821的ATM抑制剂Ku55933(Axon Medchem,Reston,Va)的浓度为10μm 每个。 MG132购自(Merck Millipore,Dark Millipore,Darmstadt,德国),并以5μ使用m。环己酰亚胺是从Sigma购买的,使用50-100μg/ ml。 DUB抑制剂PR-619来自(TEBU-BIO,荷兰),并在浓度为50μ的浓度下使用m。如前所述进行细胞同步和DNA损伤施用(
      • MacůrekL.
      • Lindqvist A.
      • Lim D.
      • Lampson M.A.
      • Klompmaker R.
      • Freire R.
      • Clouin C.
      • 泰勒斯。
      • Yaffe M.B.
      • Medema R.H.
      由极光A激活Polo样激酶-1以促进检查点恢复。
      )并且示意性地概述 Fig. 1A图S3.

       抗体

      用于二甘油残留的肽富集的抗体从(细胞信号传导技术,DANVERS,MA)获得并根据公司的标准方案使用。以下抗体用于免疫荧光和蛋白质印迹实验:抗核磷脂1和抗核仁(ABCAM,剑桥,MA,1,0,000),抗RPL24(Thermo Scientific,Waltham,MA,1:1,000),反RPS27 / 27L(Thermo Scientific,1:200),反RPL26(Bethyl Laboratories,Montgomery,TX,1:1,000),抗RPL27A(Novus,1:1,000),防RPS6(Cell信号技术,1:500 ),抗PS139-H2AX(Millipore,1:1,000)和抗α-微管蛋白(1:5,000,Sigma)。

       新生蛋白质合成分析

      将G2-同步U2OS细胞用PBS洗涤,并在无甲硫氨酸DMEM(Invitrogen,Carlsbad,Ca)中培养30分钟以耗尽细胞内甲硫氨酸储备。然后用多柔比星脉冲处理细胞1小时以诱导双链断裂。冲洗后,将细胞与蛋氨酸类似物一起孵育 l - 2小时 - 唑脱洛胺(AHA; Invitrogen);用翻译抑制剂环己酰亚胺或没有AHA处理细胞作为阴性对照。将细胞固定在3.7%的甲醛中,在PBS中用0.5%Triton X-100渗透并在PBS中使用3%牛血清白蛋白封闭。含有Aha的蛋白质使用咔哒化学反应(点击-Timend技术)用alexa fluor488-alkyne标记。细胞用DAPI染色,以染色细胞核。通过使用在imagej中为此目的开发的宏来测量每个电池的AHA荧光强度来定量每种病症中的新生蛋白质合成的量。

       蔗糖梯度

      在裂解缓冲液中裂解U2OS细胞(20米m Tris-HCl,pH 7.5,10米m MgCl2 ,100米 m KCl,1%NP40)补充有2米m DTT,100μg/ mL环己酰亚胺,无核蛋白酶抑制剂混合物(Roche)和核糖酰基酶抑制剂(40 U / ml,寿命技术)。裂解物在1,300处离心 g 使用SW-41TI转子在36,000rpm的线性蔗糖梯度(7-47%)上分离上清液,在36,000rpm下进行2小时。收集了13个级分,并使用所示的抗体通过蛋白质印迹分析样品。

       蛋白质组学分析细胞裂解物的实验设计及统计合理制备

      U2OS细胞在G2相中同步。随后,施加1-H多柔比星脉冲。除去多柔比星后,将细胞孵育在含有5μ的新鲜培养基中m Mg132 2小时和6小时,随后收获蛋白质组学分析。
      具有Mg132处理的未损坏的细胞是对该实验的控制。本实验的时间尺度呈现在 Fig. 1A。为确保再现性,进行了两个独立的实验。每个实验包含两个时间点及其各自的控制。
      对于ATM / ATR抑制剂实验,用10μm处理G2同步U2OS细胞m 在DNA损伤前,ATM-和ATR抑制剂半小时造成诱导。通过多柔比星的脉冲诱导DNA损伤。除去多柔比星后,将细胞孵育在含有5μ的新鲜培养基中m Mg132为2小时,随后收获细胞以进行蛋白质组学分析。没有ATM和ATR抑制的多柔比星和MG132处理的细胞是对该实验的控制。时间尺度呈现 图S3.
      对于MG132. 相对 DMSO实验,U2OS细胞在G2相中同步,施加1-H多柔比蛋白脉冲。在去除多柔比星后,用5μm的新鲜介质温育细胞m Mg132为2小时,随后收获蛋白质组学分析。

       蛋白质提取,蛋白水解消化和肽纯化

      使用超声波裂解收获的细胞三次,在0.6周期下1分钟,使用50米提取90%振幅和蛋白质m 含有8的碳酸氢铵缓冲液 m 尿素,蛋白酶抑制剂和50μm 脱硫酶抑制剂PR619。对于每个样品,使用5米减少20mg蛋白质并烷基化m DTT and 10 mm 氯乙酰胺分别。随后,用Lys-C(1:50 W / W酶:蛋白质比)消化样品。缓冲液稀释后(2 m 用胰蛋白酶(1:50 w / w酶:蛋白质比)消化样品。然后使用Seppak C8柱纯化肽产物并使用SpeedVac浓缩。最后,将纯化的肽在免疫沉淀缓冲液中重构,以通过用识别二甲基残余物的抗体进行免疫沉淀而进一步富集。作为富集试剂盒的一部分,通过细胞信号传导技术提供免疫沉淀缓冲液。提取,消化和肽纯化有关提取,消化和肽纯化的细节(
      • Boersema P.J.
      • raijmakers r.
      • Lemeer S.
      • 穆罕默德S.
      • Heck A.J.
      多重肽稳定同位素二甲基标记用于定量蛋白质组学。
      ,
      • Gauci S.
      • Helbig A.O.
      • Slijper M.
      • Krijgsveld J.
      • heck a.j.r.
      • 穆罕默德S.
      Lys-N和胰蛋白酶在基于SCX的方法中以精制的SCX方法覆盖磷脂蛋白酶的互补部分。
      )。

       肽富集和MS分析

      在使用聚氨基 - 残留的肽富集之后,使用总共105μl0.15%TFA在后续洗涤后洗脱肽。将二十五微升样品一式三份注入纳米UPLC Proxeon系统(Easy-NLC 1000,Thermo Scientific),耦合到壁图精英质谱仪(Thermo Scientific)。首先将注射的样品捕获在内部包装捕集柱上(ReprosiL-PUR C18-AQ,3μm(Maisch GmbH,Ammerbuch,Ammerbuch,德国)2cm×100μm),然后再用2小时梯度 - 房屋采用分析柱(ZORBAX SB-C18,1.8μm(Agilent Technologies,Baltimory,MD,USA)50cm×50μm),恒定温度为40度。对于Elbitrap Elite,将1.7kV的电压施加到针上。调查扫描被记录,分辨率为60,000。选择20个最强烈的前体用于使用HCD作为激活技术的后续碎片。分析中单独和双重带电离子被排除在外。

       泛素/肽 - 位点鉴定和量化,数据分析和评估

      使用MaxQuant(1.4.0.3)处理原始数据(
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.-范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      )和MS / MS数据针对人类UNIPROT数据库查询(23,630条参赛作品,发布2013_06)。选择胰蛋白酶/ p作为切割特异性,允许两个错过的裂解。将氨基甲酰胺甲基化(C)设定为固定改性,而氧化(M)和甘露出(K)用作可变修饰。肽鉴定基于前体离子的质量偏差高达4.5ppm的搜索,并且允许的片段质量偏差设定为20ppm,用于傅里叶变换质谱(FTMS)和0.5Da用于离子阱质谱(ITMS)。 。使用以下参数进行数据滤波:肽和蛋白质假发现速率设定为1%,将最小肽长度设定为6,并将andromeda最小分数设定为40(
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和 romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      )。 MaxQuant标记定量用于量化泛素肽/位点,峰值区域作为输出。为了分析数据,将处理的样品的峰面积与它们各自的对照进行比较,例如用损坏2小时;没有伤害6小时;没有ATM-/ ATR抑制剂;没有mg132。日志标度2用于按比例呈现该比率。使用相同运行中量化的最低峰值区域进行数据载算。用Perseus评估量化的位点(1.4.0.8版)(
      • Cox J.
      1D和2D注释富集:一种与互补高通量数据相结合定量蛋白质组学的统计方法。
      )。重要的B是Perseus提供的异常测试测试,以计算基于Log强度的比率群体(来自总数据)的比率的重要性。只获得a的泛素网站 p <复制0.01值被认为是改变的网站。巧力分析用于进一步鉴定系统响应于治疗的常见变化。

      结果

       蛋白质泛素的分析响应DNA双链断裂

      为了分析响应DNA损伤的蛋白质泛素的全局变化,将G2-同步U2OS细胞未经处理或用多柔比星的脉冲进行,以诱导双链断裂。在多柔比蛋白冲洗后,在蛋白酶体抑制剂Mg132存在下培养细胞,以防止普适蛋白质的降解,并在以后收获2小时和6小时,以便普遍蛋白质泛素(Fig. 1A)。用胰蛋白酶萃取蛋白质,用胰蛋白酶消化,使用二甲基残留肽抗体富集普遍肽肽(
      • 徐G.
      • Paige J.s.
      • jaffrey s.r.
      泛素残余免疫亲和性分析的全局分析赖氨酸泛素。
      )。随后,通过LC-MS分析肽并使用MaxQuant无标记定量定量(
      • Cox J.
      • 赫姆米。
      • Luber C.A.
      • Paron I.
      • Nagaraj N.
      通过延迟标准化和最大肽比例提取的精确的蛋白质组无标记量化,称为MAXLFQ。
      )( Fig. 1B)。对每个实验进行了两个独立的生物重复。
      如预期的那样,与MG132的处理显着增加了与DMSO处理的对照相比的二甘氨酸肽的丰度(图S1A)并且让我们检测普遍存在的蛋白质,否则在不存在Mg132的情况下将被蛋白酶降解。重要的是,在用多柔比星和MG132治疗后,遍在蛋白缀合物的总水平没有变化(图S1B.),泛素键的类型没有显着改变(图S1C. )。
      总共可以在每个时间点识别超过10,000个泛素网站,在每个生物复制之间的鉴定和量化位点的重叠重叠(Fig. 1C)。在每个时间点定量的网站中的重叠也很高(87%, 图S1D.)。这导致总共超过11,000个独特的泛素网站(表S1)。为了验证我们大规模分析中确定的一些网站,我们在U2OS细胞中表达了他标记的泛素的变体。在裂解后,使用镍带电珠粒,消化的用镍带电荷珠子拉下修饰的蛋白质,并使用泛素残余抗体免疫沉淀泛素肽。我们鉴定了8​​36个独特的泛素化肽,其中469个与我们在我们的大型蛋白质组学中鉴定的肽重叠(表S2Fig. 1D)。因此,在直接泛素残余分离中鉴定了接近他 - ubiquitin标记鉴定的泛素位点的60%(Fig. 1D)。虽然这对我们的大规模泛素分析方法提供了一些验证,但它还表明,与他 - 泛素的下拉相比,在直接泛素残留的下拉中错过了大量的蛋白质泛素,反之亦然。
      作为我们验证的一个例子,显示了高度染色的NPM1蛋白(Fig. 1E)。我们的初始大规模蛋白质组学在NPM1中鉴定了六个泛素 - 位点(K32,K239,K248,K250,K257和K273)。使用他 - ubiquitin蛋白免疫沉淀(IP)以及内源蛋白IP,我们能够在NPM1中独立地验证K239,K248,K257和K273上的泛素。合并,我们的验证实验表明我们大规模的泛素分析方法的稳健性,从而加强了我们的研究结果。

       DNA损伤后蛋白质泛素的变化

      使用无碱残留肽的无标记定量,我们确定了受损和对照样品之间的泛染肽丰富的变化。为了获得蛋白质泛素化的所有变化的概述,我们在考虑强度和比率的情况下对每个单时间点鉴定的所有独特位点进行了考虑的所有特征部位(p <0.01)。该分析为我们提供了来自2小时时间点的1,732个肽的列表(表S3来自6小时的肽(2,319肽)来自6小时的时间点(表S4)强度在多柔比蛋白处理和对照样品之间至少改变重二胶片。我们发现每个历史记录的所有已识别的泛素网站的〜10%都在显着改变(Fig. 2A)。令人欣赏的,并且符合泛素化在DNA复制,重组和修复中的重要作用,我们鉴定了以前所示的许多蛋白质,其响应于DNA损伤,例如BRCA1,FANCD2,FANCI,BLM(FANCD2,FANCI等泛素损伤)调节,pcna,cdc25a,ddb2和组蛋白h2a.x(表S1),支持数据的质量(
      • Tikoo S.
      • Madhavan V.
      • 侯赛因M.
      • 米勒E.S.
      • arora p.
      • Zlatanou A.
      • modi p.
      • Townsend K.
      • 斯图尔特G.S.
      • Sengupta S.
      抑制复制应力时,膨胀型综合节旋光酶的泛素依赖性募集是抑制同源重组。
      ,
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      ,
      • Povlsen L.K.
      • Beli P.
      • 瓦格纳S.A.
      • Poulsen S.L.
      • Sylvestersen K.B.
      • Poulsen J.W.
      • Nielsen M.L.
      • Bekker -Jensen S.
      • mailand n。
      • C.
      全系统对泛力的分析动态揭示了PAF15泛级基质在DNA损伤旁路中的关键作用。
      ,
      • 瓦格纳S.A.
      • Beli P.
      • Weinert B.T.
      • Nielsen M.L.
      • Cox J.
      • C.
      对体内泛素胞间位点的蛋白质整体定量调查显示出广泛的调节作用。
      ,
      • Mertins P.
      • 乔J.W.
      • Patel J.
      • Udeshi N.D.
      • 克劳瑟K.R.
      • MANI D.R.
      • Burgess M.W.
      • Gillette M.A.
      • Jaffe J.D.
      • carr s.a.
      通过连续富集综合翻译后修饰的综合蛋白质组学分析。
      )。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2ubiquitome数据评估。 (A)饼图,显示在每个时间点的量化泛素位点的总数上的多柔比蛋白调节的泛素位点的比例。在多柔枯蛋白处理后至少两倍增加或减少的泛素位点被认为是Doxorubicin调节的。 (B)散点图表示两种独立实验之间的多柔比蛋白调节的泛素位点的LOG2比的相关性。彩色点表示在两种实验中显着受到限制的部位(p <0.01,高于B检验)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1实验设置,蛋白质组学分析和验证。 (A)使用胸苷嵌段在G2中在G2中同步U2OS细胞,然后释放6-H释放。随后,通过1-H多柔比蛋白脉冲诱导DNA损伤。在脉冲后加入Mg132以抑制蛋白酶体降解。 DNA损伤治疗后,收获细胞2小时和6小时,对蛋白质组学分析。产生了两个生物学重复(B)蛋白质组学平台。在收获之后,裂解细胞,用胰蛋白酶消化蛋白质。用泛素残留肽IP富含染料染料肽(二甘醇)肽。用LC-MS分析肽,然后用最大的无标记定量分析。执行三个MS运行并组合每个生物复制。 (C)Venn图显示了在损伤后2-H中鉴定的泛素网站之间的两个生物学重复之间的重叠( 剩下 6-H后损伤后( 正确的 )时间点。 (D)对鉴定的泛素网站的独立验证。 VENN图显示遍在泛素残余肽IP(蓝色)和他 - ubiquitin蛋白IP(红色)鉴定的泛素位点的数量。重叠显示富集方法后鉴定的泛素位点的数量。 (E在二维肽IP,他 - 泛素IP和内源蛋白IP中鉴定在NPM蛋白中鉴定的泛素位点的示意图。
      为了鉴定响应DNA损伤的蛋白质泛素化的最可靠的变化,我们仅提取了在每次单个时间点的独立实验中通过了显着B试验的那些肽。这导致了在独立实验中可重复地调节的461个位点的列表(表S5和S6)。我们鉴定了170次赖氨酸2小时后损坏(81减少和89增加)和6小时此数量增加到291赖氨酸(134次递减和157增加)(Fig. 2B, 表S5和S6)。在比较2小时和6小时时间点时显着调节部位的相对重叠相对较低(5%),这意味着许多泛素化事件是瞬态和可逆的。发现发现蛋白质泛素最可靠的变化列表含有各种各样的DNA损伤相关蛋白质(DNA-PK,NEK2,BRAT1,DDIT4,Nucleophosmin,DNA聚合酶Delta epsilon,Herc2,CHD4,PCNA, BRAP,RAP80,BRCA1,BLM)(表S5和S6)。但更引人注目,我们注意到核糖体和核仁蛋白的非常高比例富集,富集的蛋白质清单,其泛素素治疗(表S5和S6 )。
      为了确认染色体蛋白质清单中核糖体蛋白的过度陈述,我们根据其比率对所有鉴定的泛素网站进行了分类(Fig. 3A)。与所有泛素 - 位点的分类列表相比,泛素化/脱硫酸化或多或少等于(Fig. 3A, 右侧面板),我们观察到在DNA损伤脉冲后突出的核糖体和核仁蛋白突出(Fig. 3A, 左侧面板; 表S5和S6)。此外,还在核糖体蛋白中的几个位点观察蛋白质脱水,表明核糖体蛋白在损伤时的泛素不一定是均匀调节的。在DNA损伤脉冲后2小时和6小时两种不同核糖体蛋白的六种遍核蛋白位点的相对比率的差异进一步支持这一点(Fig. 3B)。接下来,我们使用了巧成合途径分析来证实,实际上,核糖体途径被鉴定为DNA损伤后蛋白质泛素的靶标。通过分别由2小时和6小时时间点进行熟悉途径分析所识别的最高评分网络 Fig. 3C并且引人注目,两者都含有高比例的核糖体蛋白。为了确认DNA损伤检查点的激活导致核糖体蛋白的普遍突出,我们在ATM和ATR抑制剂存在下进行了上述相同的泛素分析(图S2A),分析了蛋白质泛素化的变化。实际上,我们发现核糖体和核仁蛋白的泛素大多依赖于ATM和ATR,因为这些激酶的抑制在很大程度上阻止了DNA损伤后蛋白质泛素的变化(图。S2B.)。这些数据表明,DNA损伤检查点的激活导致核糖体和核仁蛋白泛素化的实质性,ATM / ATR依赖性变化。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3核糖体蛋白ubiquitome数据评估。 (A)显示核糖体蛋白上量化的泛素位点的log2(损伤/对照)比(左侧面板) 相对 所有已识别的蛋白质(右侧面板),在损伤后的6小时内,根据其泛素化/脱水状态进行分类。 (B)核糖体蛋白RPL24,RPL26L1,RPL27A,RPS6和RPS27上的泛素蛋​​白质RPL24,RPL26L1,RPL27A,RPS6和RPS27的LOG2(损伤/对照)比率在损伤后的损伤后的时间点。在蛋白质的名称之后表示泛染性位点。 (C用泛素化位点的相互作用网络,显示出2小时的显着变化( 剩下 6小时( 正确的 )DNA损伤脉冲后。绘制了每个时间点的最高评分网络(根据Ingenuity途径分析)。箭头表示互动,没有箭头的行表示绑定。在蓝色和DNA损伤抗蛋白中突出显示核糖体和核仁蛋白,其在6小时时间点中富集,在橙色中突出显示。
      接下来将我们的结果与两次最近发表的大型泛素研究相比(
      • elia a.e.
      • Boardman A.P.
      • 王D.C.
      • Huttlin E.L.
      • everley r.a.
      • Dephoure N.
      • 周C.
      • Koren I.
      • Gygi S.P.
      • elldege s.j.
      损伤响应DNA中泛素化和乙酰化的定量蛋白质组学阿特拉斯。
      ,
      • 希金斯R.
      • 格兰龙金。
      • 升起
      • Mak R.
      • 韦伯K.
      • Kaiser S.E.
      • Zuzow N.
      • Riviere P.
      • 杨B.
      • FENECH E.
      • 唐X.
      • Lindsay S.A.
      • Christianson J.C.
      • 汉普顿r.Y.
      • Wasserman S.A.
      • 贝内特e.j.
      展开的蛋白质反应触发了40个核糖体蛋白的特异性调节菌液。
      )。我们使用数据集中的2小时时间点,因为这最接近地反映了用于在DTT-和电离 - 辐射处理的细胞中获得数据集的时间点,以分别诱导内质网(ER)和DNA损伤压力( 图S4 表S7)。虽然整体数据集中的重叠较低,但DTT诱导的ER应力也引发了核糖体蛋白的广泛鉴定特异性泛素。进一步的分析表明,在DNA损伤诱导的应激后响应于ER-an以及在损伤诱导的应激后持续许多核糖体蛋白( 图S4 表S7)。例如,我们的分析鉴定了RPS3上的五个泛素位点,所有这些都是响应于ER压力的调控也上调。此外,当比较ER-and DNA损伤诱导的应力时发现rps2和rps20的常见泛素位点,而响应DNA损伤和ER应力,两种蛋白质都遍布两种蛋白质。因此,尽管在不同屏幕的结果中具有非常有限的总体相似性,但核糖体蛋白的普遍似乎是细胞对不同形式的应激形式的常见响应。

       DNA损伤导致通用蛋白翻译的降低

      Nucleoli和核糖体在蛋白质合成中的功能是很好的建立(
      • steitz t.a.
      对动态核糖体机的结构理解。
      )。由于我们发现在DNA损伤后普遍染色了大量的核仁和核糖体蛋白,因此研究DNA损伤对蛋白质合成的影响。因此,我们在DNA损伤后分析了全局新生蛋白质合成的变化。为此,在多柔比蛋白脉冲之后向细胞培养中加入甲硫氨酸氨基酸的模拟,并通过点击 - IT反应测量AHA进入新合成的蛋白质(
      • Dieterich D.C.
      • 链接A.J.
      • Graumann J.
      • Tirrell D.A.
      • 舒曼·尤。
      使用生物正交非甘露酰胺氨基酸标记(Boncat)选择性鉴定哺乳动物细胞中的新合成蛋白质。
      ,
      • Dieterich D.C.
      • 李j.j.
      • 链接A.J.
      • Graumann J.
      • Tirrell D.A.
      • 舒曼·尤。
      新合成蛋白质与生物正交非规范氨基酸标记的标记检测及鉴定。
      )。与DMSO处理的细胞相比,在多柔比蛋白处理细胞中观察到掺入的掺入掺入,表明DNA损伤后的新生蛋白质合成的降低(Fig. 4A4B)。当莫霉素与蛋白酶体抑制剂Mg132组合时,还观察到新生蛋白质合成的这种降低也观察到(图S4A 和 S4B),表明我们观察到核糖体蛋白和蛋白质合成泛素的效果主要由DNA损伤损伤引起。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4DNA损伤会影响核糖体功能。 (A)如上所述,在G2中同步U2OS细胞 (A)在甲硫氨酸耗尽的培养基中用多柔比星进行处理1小时。洗完后,将细胞孵育 l - Azidohomoalanine(AHA)2小时;没有AHA或用环己酰亚胺处理的细胞用作阴性对照。固定细胞并与Alexa Fluor 488炔烃一起孵育,将Aha掺入新生蛋白质;细胞用DAPI染色,以显示细胞核。 γH2AX染色用作DNA断裂形成的标志物。面板显示每个条件的代表共聚焦图像。 (B从六个实验中的一个中,在NO AHA,环己酰亚胺,DMSO和DOXORUBICIN-处理的样品中的单个AHA水平的散射图。通过使用为此目的开发的宏来测量每个电池的AHA荧光强度来定量每种条件中的新生蛋白质合成量。每个条形表示平均值±S.D.从每个条件。使用非参数kruskal-wallis测试测定统计显着性(***p < 0.0001). (C)来自DMSO处理的U2OS细胞的裂解物在蔗糖密度梯度中分离,以分离单体和多元素。通过SDS-PAGE分离十三级分和输入,并用抗RPL10抗体免疫印迹。分数6和11分配为代表性单体和聚集体富集的级分。 (D)用DMSO,多柔比蛋白和令素I的细胞中的裂解物在蔗糖密度梯度中分馏,以分离单体和多元素。通过SDS-PAGE分离每个样品的级分6和11,并用指示的抗体免疫。
      接下来,我们旨在测试全球蛋白质合成的降低是否伴有核糖体活性的变化。蛋白质合成涉及通过核糖体的mRNA链翻译。在活性蛋白质合成期间,几种核糖体同时连接到单个mRNA链,形成所谓的多肌元。当不翻译有效时,多元素再次解散到单体中。单体和多肌质可以在蔗糖梯度上分离,并通过用针对核糖体蛋白的抗体免疫印迹(Fig. 4C)。作为一种对照,我们使用MTOR抑制剂(TORIN I)抑制mRNA翻译,这导致多肌气的清晰损失(Fig. 4D)。类似地,观察到多柔比蛋白处理的细胞中的多肌元的减少(Fig. 4D),表示响应DNA损伤的核糖体活性降低。这些结果表明,蛋白翻译受DNA损伤胁迫的影响。

       DNA损伤影响核糖体蛋白的亚细胞定位

      根据连杆的类型,泛素化可以促进蛋白质降解或改变蛋白质行为。特别是在DNA损伤反应中,已知蛋白质泛素化通过控制蛋白质功能在检查点信号传导和修复中起重要作用。为了研究核糖体蛋白泛素化的后果,首先研究DNA损伤是否会导致核糖体蛋白的降解。我们在多柔比蛋白治疗后在不同时间点收获细胞,并通过市售抗体通过蛋白质印迹分析了几种核糖体蛋白的表达水平。核仁,核磷,RPS6,RPL24和RPL26在整个实验中保持恒定(Fig. 5A)。 RPS27 / 27L的表达似乎在实验过程中增加,而RPL27a的表达随时间减少(Fig. 5A)。通过加入Mg132,不恢复RPL27a表达的还原,表明该减少不是由于增强的蛋白酶体降解(Fig. 5B)。因此,我们可以得出结论,至少在此处分析的核糖体蛋白质,DNA损伤似乎似乎不会诱导增加的蛋白酶体降解。这并不排除泛素化可以诱导一些其他核糖体蛋白质的降解的可能性,这些核糖体蛋白在DNA损伤后发现染色,但至少这表明DNA损伤通常不会降低核糖体蛋白的稳定性。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5核仁和核糖体蛋白响应DNA损伤的表达水平与定位。 (A)DNA损伤后核糖体和核仁蛋白的表达水平。 U2OS细胞在G2中同步并用多柔比星的脉冲处理1小时。在损伤后(HPD)的指定小时数地收获细胞,用指定的抗体分析几种蛋白质的表达。微管蛋白和PONCEAU S用作装载对照。同时在 ( A ) 和 ( C),用作DNA损伤的γH2ax作为标记物。 (B)与(A)但在破坏性侮辱后包含MG132。 (C)DNA损伤后核糖体和核仁蛋白的细胞定位。 U2OS细胞在G2中同步,在多柔比蛋白脉冲后固定2小时,并使用免疫荧光用指示的抗体染色。细胞用DAPI染色,以显示细胞核。
      已经显示通过DNA损伤产生的核磁应力促进核仁和核磷素从核聚核分的迁移到核状,因此如果泛素化以类似的方式影响其它核糖体蛋白的亚细胞定位。如预期的那样,我们发现核仁和核磷素两种核苷酸与核仁分散给核聚核桃,响应于多柔比星的处理( Fig. 5C)。除了核仁含量和核心毒素之外,在多柔比星的脉冲后,rPL26和RPS27 / 27L都分散在核仁(Fig. 5C),但在核质中累积的RPS27 / 27L,在细胞质中发现RPS26(Fig. 5C)。对于RPS6,RPL24和RPL27A,观察到亚细胞定位的明显差异,但这些后一种核糖体蛋白没有在未处理细胞中的核仁中积聚( Fig. 5C)。这些数据表明,在多柔比蛋白蛋白后观察到核糖瘤菌蛋白的增强泛素化与核仁应激和核仁的破坏。根据我们的数据,如果泛素化涉及核仁破坏的发作,我们不能区分,或者它因这种破坏而发生。然而,在损坏损伤后2小时,我们发现核糖体蛋白泛滥的透明增加的事实可能与核仁本身破坏中的作用相容。

      讨论

      在此处描述的研究中,我们响应于多柔比蛋白诱导的DNA损伤,我们患有蛋白质泛素的全球变化。在先前的研究中,使用电离辐射诱导DNA损伤,分析了DNA损伤信号传导早期阶段的蛋白质泛素(
      • elia a.e.
      • Boardman A.P.
      • 王D.C.
      • Huttlin E.L.
      • everley r.a.
      • Dephoure N.
      • 周C.
      • Koren I.
      • Gygi S.P.
      • elldege s.j.
      损伤响应DNA中泛素化和乙酰化的定量蛋白质组学阿特拉斯。
      )。反过来,我们的研究侧重于泛素化的分析,不仅在早期时间点,而且在多柔比蛋白诱导的DNA损伤后的相对晚期时间点。每项研究中使用的不同实验方法突出了我们工作的互补性,并解释了它们之间的有限重叠(图S3 )。
      类似于蛋白质泛素化的其他研究,我们使用蛋白酶体抑制剂Mg132来增加在其降解之前检索泛素化位点的机会(
      • elia a.e.
      • Boardman A.P.
      • 王D.C.
      • Huttlin E.L.
      • everley r.a.
      • Dephoure N.
      • 周C.
      • Koren I.
      • Gygi S.P.
      • elldege s.j.
      损伤响应DNA中泛素化和乙酰化的定量蛋白质组学阿特拉斯。
      )。这具有潜在的警告,即添加MG132也可能导致无泛素池的耗尽,从而限制非染色泛素。因此,重要的是要在抑制泛素依赖性蛋白质降解和游离泛素的可用性之间进行平衡。这可以通过在短时间内施加相对低的Mg132浓度来实现,类似于本研究中使用的条件和其他先前作品(
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      ,
      • 瓦格纳S.A.
      • Beli P.
      • Weinert B.T.
      • Nielsen M.L.
      • Cox J.
      • C.
      对体内泛素胞间位点的蛋白质整体定量调查显示出广泛的调节作用。
      ,
      • Udeshi N.D.
      • MANI D.R.
      • Eisenhaure T.
      • Mertins P.
      • Jaffe J.D.
      • 克劳瑟K.R.
      • Hacohen N.
      • carr s.a.
      蛋白酶体和脱硫酶抑制后蛋白质泛素体内变化的定量方法。
      )。重要的是,我们能够表明MG132本身并没有严重改变DNA损伤诱导的泛素化( 图。S1 )。此外,每个实验(〜9,000)中鉴定的大量泛素化位点表明,无泛素池没有过度损害。此外,检测在蛋白质中的众所周知的单体化位点,例如FANCD2和FANCI(K561和K523,(见 表S3和S4)表明我们的MG132治疗并未严重损害Nongegradative泛素位点的鉴定。另一方面,重要的是要注意,在胰蛋白酶消化后,基于肽上的Diglycil残留的Diglycil遗物富集和鉴定。因此,我们不能排除在数据集中的含有C末端DIGLYCIL图案的一些其他泛素样分子的存在(
      • 金W.
      • 贝内特e.j.
      • Huttlin E.L.
      • 郭阿。
      • 可能A.
      • Sowa M.E.
      • RAD R.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      • 哈珀J.W.
      • Gygi S.P.
      泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
      ,
      • 棕色J.S.
      • Lukashchuk N.
      • Sczaniecka-Clift M.
      • 布里顿S.
      • Le Sa​​ge C.
      • CALSOU P.
      • Beli P.
      • Galanty Y.
      • 杰克逊S.P.
      Neddylation从DNA损伤部位促进泛醌,释放Ku。
      )。这些包括Neddylated蛋白质,先前已经报道了其在DNA损伤反应中的作用(
      • 棕色J.S.
      • Lukashchuk N.
      • Sczaniecka-Clift M.
      • 布里顿S.
      • Le Sa​​ge C.
      • CALSOU P.
      • Beli P.
      • Galanty Y.
      • 杰克逊S.P.
      Neddylation从DNA损伤部位促进泛醌,释放Ku。
      )。此外,在蛋白质组水平的情况下,没有分析,我们不能解决蛋白质表达变化对观察到泛素化水平的变化的贡献。
      我们发现,在6小时后,在Doxorubicin治疗后,蛋白质在DNA复制,重组和修复中具有功能,基本上是普遍的。网络分析还表明,响应DNA损伤,遍布一大群核糖体和核仁蛋白。由于核糖体的主要功能是合成蛋白质,我们假设DNA损伤诱导的信号传导可以抑制正在进行的蛋白翻译,如前所述在其他类型的DNA损伤如γ-辐照或紫外线(
      • Guerra-Rebollo M.
      • Mateo F.
      • 弗兰克·克。
      • Huen M.S.Y.
      • Lopitz-Otsoa F.
      • Rodriguez M.S.
      • 计划五。
      • 汤姆森下午
      RNF8和BRCA1响应DNA损伤的核核OIT。
      ,
      • Powley I.R.
      • Kondrashov A.
      • 年轻的L.A.
      • Dobbyn H.C.
      • 山K.
      • cannell i.g.
      • Stoneley M.
      • 孔Y.-w.
      • Cotes J.A.
      • 史密斯G.C.
      • 韦克R.
      • Hayes C.
      • Gant T.W.
      • Spriggs K.A.
      • 蒲式耳M.
      • 威利斯A.E.
      UVB辐射后的翻译重编程由PKCS DNA-介导,允许选择性募集对编码DNA修复酶的MRNA的多变。
      )由于产生新的蛋白质的不能有助于通过细胞周期预防进一步的进展,从而允许更多时间来修复损坏(
      • Mazumder A.
      • Pesudo L.Q.
      • MCREE S.
      • 沐浴M.
      • Samson L.D.
      用于蛋白质丰度和定位的基因组单细胞级筛网响应DNA损伤而变化 S. Cerevisiae..
      )。事实上,我们发现DNA损伤导致蛋白质合成的快速抑制。
      但DNA损伤控制蛋白质合成如何? DNA损伤可以通过MTOR信号通路影响蛋白质翻译的启动(
      • Braunstein S.
      • 巴杜拉M.L.
      • XI Q.
      • Formenti S.C.
      • 施耐德r.j.
      电离辐射调节蛋白质合成。
      ,
      • TEE A.R.
      • 骄傲的C.G.
      DNA损伤剂导致与MTOR信号传导相关的平移调节剂的失活。
      ,
      • Ruvinsky I.
      • Meyuhas O.
      核糖体蛋白S6磷酸化:从蛋白质合成到细胞尺寸。
      ),但控制蛋白质合成响应DNA损伤的额外机制可能非常好。最近,希金斯 等等。 提出的40s核糖体蛋白的特异性调节性泛素作为一种新的机制,以响应于细胞应激,特别是在电离辐射或DTT处理之后(
      • elia a.e.
      • Boardman A.P.
      • 王D.C.
      • Huttlin E.L.
      • everley r.a.
      • Dephoure N.
      • 周C.
      • Koren I.
      • Gygi S.P.
      • elldege s.j.
      损伤响应DNA中泛素化和乙酰化的定量蛋白质组学阿特拉斯。
      ,
      • 希金斯R.
      • 格兰龙金。
      • 升起
      • Mak R.
      • 韦伯K.
      • Kaiser S.E.
      • Zuzow N.
      • Riviere P.
      • 杨B.
      • FENECH E.
      • 唐X.
      • Lindsay S.A.
      • Christianson J.C.
      • 汉普顿r.Y.
      • Wasserman S.A.
      • 贝内特e.j.
      展开的蛋白质反应触发了40个核糖体蛋白的特异性调节菌液。
      )。类似于这些研究,我们还发现多柔比蛋白处理后的核糖体蛋白的广泛泛素化,其中几有几种与本前早期研究中鉴定的蛋白质相同(RPS2,RPS3,RPS20)(图S3表S7)。此外,我们已经鉴定了核糖体蛋白质上的许多其他位点,这些蛋白质蛋白蛋白蛋白蛋白染色,并且也可能影响核糖体活性。或者,DNA损伤可能会影响核糖体生物发生,并以这种方式抑制更全面的时尚蛋白翻译。实际上,我们观察到多柔比蛋白治疗后的澄清核仁应激反应,作为核仁和核酸的核磷素。最近显示核仁胁迫期间的核磷素易位,以便在分钟内发生S-谷胱甘肽,可以促进p53的活化(
      • 杨克。
      • 王米
      • 赵玉。
      • 太阳X.
      • 杨Y.
      • 李X.
      • 周A.
      • 楚H.
      • 周H.
      • 徐J.
      • 吴米
      • 杨杰。
      • 易J.
      核磷脂核仁胁迫感应的氧化还原机制。
      )。我们在损伤之后在核磁分散在核心下降时,在损伤之后进行蛋白质泛素的测量。因此,如果泛素化在来自核仁的核糖体蛋白易位中起作用的作用,则需要进一步的实验来解决,或者如果它是分散的影响。
      推测核糖体蛋白的泛素参与蛋白翻译的抑制作用是诱人的诱人,以响应于多柔比星治疗。鉴于大量的泛素化事件,为此提供直接证据将具有挑战性,因为每个事件可能会促进它。尽管如此,仔细检查所选数量的泛素化站点可能是非常有信息的。例如,RPS6是40S亚基的组件,并在两个核糖体亚基之间的界面处定位。它与mRNA,TRNA和起始因子相互作用(
      • nygårdo.
      • Nilsson L.
      平移动力学,翻译因子,TRNA和核糖体之间的相互作用在真核蛋白质合成中。
      ,
      • Ruvinsky I.
      • Meyuhas O.
      核糖体蛋白S6磷酸化:从蛋白质合成到细胞尺寸。
      ),表明它位于蛋白质翻译期间的重要界面。因此,对RPS6泛素化的深入分析,与它们对蛋白翻译的影响相结合,可能会产生有趣的见解。此外,核糖体蛋白也可以在控制蛋白翻译方面具有高度选择性。例如,RPL26可以通过与P53 mRNA相互作用来具体控制P53平移(
      • Takagi M.
      • absalon m.j.
      • mclure k.g.
      • 卡斯坦M.B.
      核糖体蛋白L26和核仁损伤DNA损伤后P53翻译与诱导调节。
      )。同时,据报道,P53据报道,用DNA损伤剂依托皂苷治疗后诱导RPS27L的表达(
      • 他h.
      • 太阳y.
      核糖体蛋白S27L是调节细胞凋亡的直接P53靶。
      ),与我们响应于多柔比星的观察到类似的增加(Fig. 5A )。
      在诱导DNA损伤后,我们在2小时和6小时内发现核糖体蛋白的广泛泛素化。有趣的是,Elia和同事报告在损伤后早期时间点染色核糖胺蛋白泛滥的显着变化(
      • elia a.e.
      • Boardman A.P.
      • 王D.C.
      • Huttlin E.L.
      • everley r.a.
      • Dephoure N.
      • 周C.
      • Koren I.
      • Gygi S.P.
      • elldege s.j.
      损伤响应DNA中泛素化和乙酰化的定量蛋白质组学阿特拉斯。
      )。因此,核糖体蛋白泛素可能是中期DNA损伤反应的一部分。因此,研究核糖体蛋白在从DNA损伤引起的逮捕期间恢复过程中的作用将是有趣的。在这方面,有趣的是要注意,我们发现几种核糖体蛋白的耗尽导致G2逮捕(未显示的数据)恢复的显着降低。类似地,RPS27L的耗尽导致DNA损伤检查点的缺陷,导致DNA损伤诱导的P53对细胞循环停止对细胞凋亡的反应的转变(
      • 李杰。
      • 谭杰。
      • 庄L.
      • Banerjee B.
      • 杨X.
      • Chau J.F.L.
      • 手M.P.
      • 李b.
      • 俞Q.
      核糖体蛋白S27样,响应于遗留毒性应激的细胞命运的P53-诱导调节剂。
      )。核糖体蛋白或其泛素化如何影响恢复尚不清楚。最近,已经鉴定了具有非功能性RRNA衰变的作用的E3连接酶复合物及其相关的蛋白质MMS1p,以前作为参与DNA修复的因素(
      • 富士岛K.
      • Kitabatake M.
      • Sakata T.
      • Miyata A.
      • ohno m.
      泛素在无功能RRNA的间隙中的作用。
      )。几项研究具有将核糖体蛋白连接到P53的活化,通过与P53 mRNA结合或通过结合其泛素连接酶MDM2来控制其丰度(
      • lohrum m.a.
      • Ludwig R.L.
      • Kubbutat M.H.
      • Hanlon M.
      • Vousden K.H.
      通过核糖体蛋白L11调节HDM2活性。
      ,
      • 戴米斯。
      • 曾S.X.
      • jin y。
      • 太阳x.-x.
      • 大卫兰。
      • lu h.
      核糖体蛋白L23通过抑制MDM2函数响应于核糖体扰动而是不抑制核糖体扰动而活化P53。
      ,
      • Kurki S.
      • Peltonen K.
      • Latonen L.
      • Kiviharju T.M.
      • ojala下午
      • 温顺D.
      • Laiho M.
      核菌蛋白NPM与HDM2相互作用并保护肿瘤抑制蛋白P53免受HDM2介导的降解。
      ,
      • 华纳J.R.
      • McIntosh K.B.
      核糖体蛋白的外蛋白酶官能团是多常见的蛋白质。
      )。鉴于P53在G2中控制细胞周期重新进入的关键作用(
      • krenning l.
      • Feringa F.M.
      • shaltiel i.a.
      • van den berg J.
      • Medema R.H.
      G2相中P53的瞬态激活足以诱导衰老。
      ,
      • Lindqvist A.
      • de bruijn m.
      • Macurek L.
      • BRAS A.
      • 孟加达A.
      • Bruinsma W.
      • voets O.
      • 克兰伦堡O.
      • Medema R.H.
      WIP1通过抵消P53依赖性转录抑制来赋予G2检查点恢复能力。
      )这些额外核糖体功能可能是重要的。
      总之,我们的蛋白质组学研究提供了响应DNA损伤而发生的有用的蛋白质泛素化事件。我们的集合进一步扩展了以前发表的数据集,并在用多柔比星处理后,在早期和晚期时间点提供蛋白质泛素的第一个全局分析。此外,我们的研究突出了DNA损伤对核糖体蛋白泛素的广泛影响,以及其对蛋白质合成的影响。虽然我们想解开可以将这些事件联系起来的分子细节,但我们和他人发现的大量泛素化事件代表着巨大的挑战。尽管如此,核糖体的许多亚基的事实在应力响应期间受到强烈意味着核糖体功能的紧密控制对于对压力的细胞反应至关重要。

      数据可用性

      这些实验的所有原始文件和注释光谱都可以在骄傲上提供(//www.ebi.ac.uk/pride/archive;项目ID PXD004445)。

      致谢

      这项工作由荷兰科学研究组织(NWO ZONMW 912100651至R.H.M.,S.M.和V.A.H.)提供全体拨款。 I.G.S.得到了从巴斯克乡村政府(西班牙)的博士后奖学金支持。我们感谢Christian Frese和Teck Yew低富有成效的讨论。我们还感谢Teck Yew Low用于将原始文件和注释的光谱提交到骄傲。我们感谢Braffio Loayza-Puch与蔗糖梯度的技术帮助。

      补充材料

      参考

        • Bartek J.
        • 卢卡斯J.
        DNA损伤检查点:从启动到恢复或适应。
        Curr。拍摄。细胞生物。 2007; 19: 238-245
        • 杰克逊S.P.
        • Bartek J.
        人体生物学和疾病中的DNA损伤反应。
        自然。 2009; 461: 1071-1078
        • Sancar A.
        • Lindsey-Boltz L.A.
        • Unstal-Kaçmazk。
        • Linn S.
        哺乳动物DNA修复的分子机制及DNA损伤检查点。
        安努。 Rev. Biochem。 2004; 73: 39-85
        • Ciccia A.
        • elldege s.j.
        DNA损伤反应:用刀具安全。
        摩尔。细胞。 2010; 40: 179-204
        • 哈珀J.W.
        • elldege s.j.
        DNA损伤反应:十年后。
        摩尔。细胞。 2007; 28: 739-745
        • 松山S.
        • Ballif B.A.
        • Smogorzewska A.
        • 麦当劳III,E.R.
        • Hurov K.E.
        • 罗杰。
        • bakalarski c.e.
        • 赵Z.
        • Solimini S.
        • Lerenthal Y.
        • Shiloh Y.
        • Gygi S.P.
        • elldege s.j.
        ATM和ATR底物分析显示响应DNA损伤的广泛蛋白质网络。
        科学。 2007; 316: 1160-1166
        • van Vugt M.A.
        • smits v.a.
        • Klompmaker R.
        • Medema R.H.
        通过DNA损伤抑制POLO样激酶-1以ATM-或ATR依赖性的方式发生。
        BIOL。 J.Chem。 2001; 276: 41656-41660
        • elia a.e.
        • Boardman A.P.
        • 王D.C.
        • Huttlin E.L.
        • everley r.a.
        • Dephoure N.
        • 周C.
        • Koren I.
        • Gygi S.P.
        • elldege s.j.
        损伤响应DNA中泛素化和乙酰化的定量蛋白质组学阿特拉斯。
        摩尔。细胞。 2015; 59: 867-881
        • Bekker -Jensen S.
        • mailand n。
        泛素和SUMO依赖的信号传导响应对DNA双链断裂。
        吧。费用。 2011; 585: 2914-2919
        • DOIL C.
        • mailand n。
        • Bekker -Jensen S.
        • 梅纳德
        • Larsen D.H.
        • Pepperkok R.
        • Ellenberg J.
        • 平局S.
        • DUROCHER D.
        • Bartek J.
        • 卢卡斯J.
        • 卢卡斯C.
        RNF168在受损染色体上结合和放大泛素缀合物,以允许累积修复蛋白质。
        细胞。 2009; 136: 435-446
        • 杰克逊S.P.
        • DUROCHER D.
        泛素和SUMO对DNA损伤反应的调节。
        摩尔。细胞。 2013; 49: 795-807
        • mailand n。
        • Bekker -Jensen S.
        • 福劳斯H.
        • 梅兰德F.
        • Bartek J.
        • 卢卡斯C.
        • 卢卡斯J.
        RNF8 ubiquitylates DNA双链中的组蛋白突破并促进修复蛋白的组装。
        细胞。 2007; 131: 887-900
        • Messick T.E.
        • 格林伯格r.a.
        DNA双股突破的泛素景观。
        细胞生物。 j。 2009; 187: 319-326
        • mailand n。
        • Bekker -Jensen S.
        • Bartek J.
        • 卢卡斯J.
        通过SCFbetaTRCP破坏Claspin抑制CHK1激活并促进从遗传毒性应激恢复。
        摩尔。细胞。 2006; 23: 307-318
        • amely i.
        • van Vugt M.A.T.M.
        • smits v.a.j.
        • SEMPLE J.I.
        • lemmens b.
        • Perrakis A.
        • Medema R.H.
        • Freire R.
        Polo样激酶-1在检查点恢复期间控制Claspin的蛋白酶体依赖性降解。
        Curr。 BIOL。 2006; 16: 1950-1955
        • Peschiaroli A.
        • Dorrello N.v.
        • Guardavaccaro D.
        • venere M.
        • Halazonetis T.
        • 赫曼N.E.
        • Pagano M.
        ScFbetatrcp介导的Claspin降解调节从DNA复制检查点响应的恢复。
        摩尔。细胞。 2006; 23: 319-329
        • lohrum m.a.
        • Ludwig R.L.
        • Kubbutat M.H.
        • Hanlon M.
        • Vousden K.H.
        通过核糖体蛋白L11调节HDM2活性。
        癌细胞。 2003; 3: 577-587
        • Takagi M.
        • absalon m.j.
        • mclure k.g.
        • 卡斯坦M.B.
        核糖体蛋白L26和核仁损伤DNA损伤后P53翻译与诱导调节。
        细胞。 2005; 123: 49-63
        • Kumar V.
        • Sabatini D.
        • Pandey P.
        • Gingras A.-​​C.
        • 博马姆人P.K.
        • Kumar M.
        • 元Z.-M.
        • Carmichael G.
        • weichselbaum r.
        • Sonenberg N.
        • kufe d。
        • Kharbanda S.
        C-ABL蛋白 - 酪氨酸激酶对雷帕霉素和FKBP-靶1 /哺乳动物靶标的雷帕霉素和胱盖依赖性的翻译引发。
        BIOL。 J.Chem。 2000; 275: 10779-10787
        • Paglin S.
        • 李n.y.
        • Nakar C.
        • Fitzgerald M.
        • Plotkin J.
        • Deuel B.
        • Hackett N.
        • McMahill M.
        • Sphicas E.
        • 兰肯N.
        • yahalom J.
        雷帕霉素敏感途径调节辐照MCF-7细胞中的线粒体膜电位,自噬和存活。
        癌症res。 2005; 65: 11061-11070
        • 吕X.
        • de lapeñal.
        • 巴克C.
        • Camphausen K.
        • Tofilon P.J.
        辐射诱导的基因表达的变化涉及招募现有的信使RNA和远离多肌元。
        癌症res。 2006; 66: 1052-1061
        • nygårdo.
        • Nilsson L.
        平移动力学,翻译因子,TRNA和核糖体之间的相互作用在真核蛋白质合成中。
        欧元。 J. Biochem。 1990; 191: 1-17
        • de las heras-rubio A.
        • Perucho L.
        • Paciucci R.
        • vilardell J.
        • LLEONART M.E.
        核糖体蛋白作为肿瘤发生中的新型球员。
        癌症转移Rev. 2014; 33: 115-141
        • 罗布尔多S.
        • 偶像r.a.
        • cimmins d.l.
        • Ladenson J.H.
        • 梅森P.J.
        • 贝塞勒M.
        人核糖体蛋白在rRNA和核糖体生产成熟中的作用。
        RNA。 2008; 14: 1918-1929
        • MacůrekL.
        • Lindqvist A.
        • Lim D.
        • Lampson M.A.
        • Klompmaker R.
        • Freire R.
        • Clouin C.
        • 泰勒斯。
        • Yaffe M.B.
        • Medema R.H.
        由极光A激活Polo样激酶-1以促进检查点恢复。
        自然。 2008; 455: 119-123
        • Boersema P.J.
        • raijmakers r.
        • Lemeer S.
        • 穆罕默德S.
        • Heck A.J.
        多重肽稳定同位素二甲基标记用于定量蛋白质组学。
        NAT。 protoc。 2009; 4: 484-494
        • Gauci S.
        • Helbig A.O.
        • Slijper M.
        • Krijgsveld J.
        • heck a.j.r.
        • 穆罕默德S.
        Lys-N和胰蛋白酶在基于SCX的方法中以精制的SCX方法覆盖磷脂蛋白酶的互补部分。
        肛门。化学。 2009; 81: 4493-4501
        • Cox J.
        MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.-范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
        NAT。 Biotechnol。 2008; 26: 1367-1372
        • Cox J.
        • Neuhauser N.
        • Michalski A.
        • 施泰米r.a.
        • 奥尔森J.V.
        和 romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 1794-1805
        • Cox J.
        1D和2D注释富集:一种与互补高通量数据相结合定量蛋白质组学的统计方法。
        BMC生物信息学。 2012; 16: S12
        • 徐G.
        • Paige J.s.
        • jaffrey s.r.
        泛素残余免疫亲和性分析的全局分析赖氨酸泛素。
        NAT。 Biotechnol。 2010; 28: 868-873
        • Cox J.
        • 赫姆米。
        • Luber C.A.
        • Paron I.
        • Nagaraj N.
        通过延迟标准化和最大肽比例提取的精确的蛋白质组无标记量化,称为MAXLFQ。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2014; 13: 2513-2526
        • Tikoo S.
        • Madhavan V.
        • 侯赛因M.
        • 米勒E.S.
        • arora p.
        • Zlatanou A.
        • modi p.
        • Townsend K.
        • 斯图尔特G.S.
        • Sengupta S.
        抑制复制应力时,膨胀型综合节旋光酶的泛素依赖性募集是抑制同源重组。
        Embo J. 2013; 32: 1778-1792
        • 金W.
        • 贝内特e.j.
        • Huttlin E.L.
        • 郭阿。
        • 可能A.
        • Sowa M.E.
        • RAD R.
        • 赶紧J.
        • 梳理M.J.
        • 哈珀J.W.
        • Gygi S.P.
        泛素改性蛋白质组的系统和定量评估。
        摩尔。细胞。 2011; 44: 325-340
        • Povlsen L.K.
        • Beli P.
        • 瓦格纳S.A.
        • Poulsen S.L.
        • Sylvestersen K.B.
        • Poulsen J.W.
        • Nielsen M.L.
        • Bekker -Jensen S.
        • mailand n。
        • C.
        全系统对泛力的分析动态揭示了PAF15泛级基质在DNA损伤旁路中的关键作用。
        NAT。细胞生物。 2012; 14: 1089-1098
        • 瓦格纳S.A.
        • Beli P.
        • Weinert B.T.
        • Nielsen M.L.
        • Cox J.
        • C.
        对体内泛素胞间位点的蛋白质整体定量调查显示出广泛的调节作用。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2011; 10M111.013284
        • Mertins P.
        • 乔J.W.
        • Patel J.
        • Udeshi N.D.
        • 克劳瑟K.R.
        • MANI D.R.
        • Burgess M.W.
        • Gillette M.A.
        • Jaffe J.D.
        • carr s.a.
        通过连续富集综合翻译后修饰的综合蛋白质组学分析。
        NAT。方法。 2013; 10: 634-637
        • 希金斯R.
        • 格兰龙金。
        • 升起
        • Mak R.
        • 韦伯K.
        • Kaiser S.E.
        • Zuzow N.
        • Riviere P.
        • 杨B.
        • FENECH E.
        • 唐X.
        • Lindsay S.A.
        • Christianson J.C.
        • 汉普顿r.Y.
        • Wasserman S.A.
        • 贝内特e.j.
        展开的蛋白质反应触发了40个核糖体蛋白的特异性调节菌液。
        摩尔。细胞。 2015; 59: 35-49
        • steitz t.a.
        对动态核糖体机的结构理解。
        NAT Rev. Mol。细胞生物。 2008; 9: 242-253
        • Dieterich D.C.
        • 链接A.J.
        • Graumann J.
        • Tirrell D.A.
        • 舒曼·尤。
        使用生物正交非甘露酰胺氨基酸标记(Boncat)选择性鉴定哺乳动物细胞中的新合成蛋白质。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2006; 103: 9482-9487
        • Dieterich D.C.
        • 李j.j.
        • 链接A.J.
        • Graumann J.
        • Tirrell D.A.
        • 舒曼·尤。
        新合成蛋白质与生物正交非规范氨基酸标记的标记检测及鉴定。
        NAT。 protoc。 2007; 2: 532-540
        • Udeshi N.D.
        • MANI D.R.
        • Eisenhaure T.
        • Mertins P.
        • Jaffe J.D.
        • 克劳瑟K.R.
        • Hacohen N.
        • carr s.a.
        蛋白酶体和脱硫酶抑制后蛋白质泛素体内变化的定量方法。
        摩尔。细胞。蛋白质组学。 2012; 11: 148-159
        • 棕色J.S.
        • Lukashchuk N.
        • Sczaniecka-Clift M.
        • 布里顿S.
        • Le Sa​​ge C.
        • CALSOU P.
        • Beli P.
        • Galanty Y.
        • 杰克逊S.P.
        Neddylation从DNA损伤部位促进泛醌,释放Ku。
        细胞代表。 2015; 11: 704-714
        • Guerra-Rebollo M.
        • Mateo F.
        • 弗兰克·克。
        • Huen M.S.Y.
        • Lopitz-Otsoa F.
        • Rodriguez M.S.
        • 计划五。
        • 汤姆森下午
        RNF8和BRCA1响应DNA损伤的核核OIT。
        Exp。细胞res。 2012; 318: 2365-2376
        • Powley I.R.
        • Kondrashov A.
        • 年轻的L.A.
        • Dobbyn H.C.
        • 山K.
        • cannell i.g.
        • Stoneley M.
        • 孔Y.-w.
        • Cotes J.A.
        • 史密斯G.C.
        • 韦克R.
        • Hayes C.
        • Gant T.W.
        • Spriggs K.A.
        • 蒲式耳M.
        • 威利斯A.E.
        UVB辐射后的翻译重编程由PKCS DNA-介导,允许选择性募集对编码DNA修复酶的MRNA的多变。
        基因开发。 2009; 23: 1207-1220
        • Mazumder A.
        • Pesudo L.Q.
        • MCREE S.
        • 沐浴M.
        • Samson L.D.
        用于蛋白质丰度和定位的基因组单细胞级筛网响应DNA损伤而变化 S. Cerevisiae..
        核酸RES。 2013; 41: 9310-9324
        • Braunstein S.
        • 巴杜拉M.L.
        • XI Q.
        • Formenti S.C.
        • 施耐德r.j.
        电离辐射调节蛋白质合成。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2009; 29: 5645-5656
        • TEE A.R.
        • 骄傲的C.G.
        DNA损伤剂导致与MTOR信号传导相关的平移调节剂的失活。
        oncogene。 2000; 19: 3021-3031
        • Ruvinsky I.
        • Meyuhas O.
        核糖体蛋白S6磷酸化:从蛋白质合成到细胞尺寸。
        趋势生物化学。 SCI。 2006; 31: 342-348
        • 杨克。
        • 王米
        • 赵玉。
        • 太阳X.
        • 杨Y.
        • 李X.
        • 周A.
        • 楚H.
        • 周H.
        • 徐J.
        • 吴米
        • 杨杰。
        • 易J.
        核磷脂核仁胁迫感应的氧化还原机制。
        NAT。安排。 2016; 7: 13599
        • 他h.
        • 太阳y.
        核糖体蛋白S27L是调节细胞凋亡的直接P53靶。
        oncogene。 2007; 26: 2707-2716
        • 李杰。
        • 谭杰。
        • 庄L.
        • Banerjee B.
        • 杨X.
        • Chau J.F.L.
        • 手M.P.
        • 李b.
        • 俞Q.
        核糖体蛋白S27样,响应于遗留毒性应激的细胞命运的P53-诱导调节剂。
        癌症res。 2007; 67: 11317-11326
        • 富士岛K.
        • Kitabatake M.
        • Sakata T.
        • Miyata A.
        • ohno m.
        泛素在无功能RRNA的间隙中的作用。
        基因开发。 2009; 23: 963-974
        • 戴米斯。
        • 曾S.X.
        • jin y。
        • 太阳x.-x.
        • 大卫兰。
        • lu h.
        核糖体蛋白L23通过抑制MDM2函数响应于核糖体扰动而是不抑制核糖体扰动而活化P53。
        摩尔。细胞。 BIOL。 2004; 24: 7654-7668
        • Kurki S.
        • Peltonen K.
        • Latonen L.
        • Kiviharju T.M.
        • ojala下午
        • 温顺D.
        • Laiho M.
        核菌蛋白NPM与HDM2相互作用并保护肿瘤抑制蛋白P53免受HDM2介导的降解。
        癌细胞。 2004; 5: 465-475
        • 华纳J.R.
        • McIntosh K.B.
        核糖体蛋白的外蛋白酶官能团是多常见的蛋白质。
        摩尔。细胞。 2009; 34: 3-11
        • krenning l.
        • Feringa F.M.
        • shaltiel i.a.
        • van den berg J.
        • Medema R.H.
        G2相中P53的瞬态激活足以诱导衰老。
        摩尔。细胞。 2014; 55: 59-72
        • Lindqvist A.
        • de bruijn m.
        • Macurek L.
        • BRAS A.
        • 孟加达A.
        • Bruinsma W.
        • voets O.
        • 克兰伦堡O.
        • Medema R.H.
        WIP1通过抵消P53依赖性转录抑制来赋予G2检查点恢复能力。
        Embo J. 2009; 28: 3196-3206