虾白斑综合征病毒结构蛋白质组的霰弹枪鉴定封装和核衣壳亚甲基蛋白酶的ITRAQ差异化*

      白斑综合征病毒(WSSV)是一个主要的病原体,导致全世界虾种植的严重死亡率和经济损失。 WSSV的基因组含有305kb双链圆形DNA,其编码181个预测的ORF。基于凝胶的WSSV蛋白质组学研究已经确定了38个结构蛋白。在这项研究中,我们使用使用Maldi-Tof / TOF MS / MS的LC系统的离线耦合应用霰弹枪蛋白质组学作为研究WSSV蛋白质组的互补和综合方法。这种方法导致鉴定45个病毒蛋白;其中13首次报告。发现七种病毒蛋白具有乙酰化N末端。 RT-PCR确认了这13个新鉴定的病毒蛋白的mRNA表达。此外,ITRAQ(相对和绝对量化的等因素标签),用于区分WSSV的包膜蛋白和核衣壳蛋白。基于ITRAQ比率,我们成功地鉴定了23个包络蛋白和六个核衣壳蛋白。我们的结果验证了5种结构蛋白质,具有先前已知的病毒群岛定位。此外,确定另外的12个包膜蛋白和两个核衣壳蛋白的定位。我们证明ITRAQ是高通量病毒蛋白定位测定的有效方法。共使用至少58个结构蛋白组装,其中由霰弹枪蛋白质组学新鉴定的13个蛋白质组装,包括霰弹枪蛋白质组学和由ITRAQ鉴定的蛋白质。确定42个结构蛋白的定位; 33是包膜蛋白,九个是核衣壳蛋白。 WSSV结构蛋白的综合鉴定及其本地化应促进其组装和感染机制的研究。
      虾白斑综合征病毒(WSSV),
      使用的缩写是:WSSV,白斑综合征病毒; 1D,一维; 2D,二维; C.I.,置信区间; HPI,小时营收; IEM,免疫源电子显微镜; ITRAQ,相对和绝对量化的ISObaric标签; SCX,强阳离子交换; S / N,信噪比信号。
      1使用的缩写是:WSSV,白斑综合征病毒; 1D,一维; 2D,二维; C.I.,置信区间; HPI,小时营收; IEM,免疫源电子显微镜; ITRAQ,相对和绝对量化的ISObaric标签; SCX,强阳离子交换; S / N,信噪比信号。
      属于nimaviridae(Whispovirus)家庭,是一种包围的双链DNA病毒(
      • 王C.H.
      • 罗C.F.
      • 列伊J.H.
      • 周C.M。
      • P.Y.呐
      • 周H.Y.
      • 东M.C.
      • 常C.F.
      • 苏M.S.
      • G.H.教堂
      白斑综合征(WSBV)患有杆状病毒的纯化和基因组分析 Penaeus Monodon..
      ,
      • Wongteerasupaya C.
      • 维克斯J.E.
      • SriuRairatana S.
      • 纳什G.L.
      • Akarajamorn A.
      • Boonsaeng V.
      • Panyim S.
      • Tassanakajon A.
      • withyachumnarnkul b.
      • 弗莱格尔T.W.
      一种非闭塞的全身杆状病毒,发生在外胚层和中胚层的细胞中,并在黑虎虾中引起高死亡率 Penaeus Monodon..
      )。它可以在7-10天内牺牲虾的虾在虾中造成高达100%的死亡率,导致虾农业行业的经济损失巨大(
      • 中野H.
      • Koube H.
      • 梅泽S.
      • 桃山K.
      • 平冈M.
      • 井上K.
      • Oseko N.
      培养的Kuruma虾的大规模体重, Penaeus japonicus.,在日本1993年:Epizooricoological调查和感染程度。
      ,
      • 井上K.
      • 山野K.
      • 池田N.
      • 木村T.
      • 中野H.
      • 桃山K.
      • 小林J.
      • 宫岛S.
      Penaeid棒状DNA病毒(PRDV),导致Penaeid急性病毒血症(PAV)。
      )。这种病毒感染了虾和其他淡水和海洋甲壳类动物,包括螃蟹和小龙虾(
      • 罗C.F.
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      • 邱Y.L.
      • 常C.F.
      • 刘K.F.
      • 苏M.S.
      • 王C.H.
      • G.H.教堂
      在培养和捕获的虾,螃蟹和其他节肢动物中检测到白斑综合征相关病毒(WSBV)。
      )。三种来自中国的WSSV分离物的基因组(GenBank™登录号 AF332093),台湾(Genbank登录号 AF440570)和泰国(GenBank登录号 AF369029)已完全测序(
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      鉴定虾白斑综合征病毒的核衣壳蛋白(VP35)基因及其对靶向昆虫细胞核核核的术语表征的特征。
      ,
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      • 黄C.J.
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      • 染料C.F.
      • YüH.T.
      • 王C.H.
      • 罗C.F.
      • G.H.教堂
      虾白斑综合征病毒DNA聚合酶基因的转录分析。
      ,
      • van Hulten M.C.
      • Witteveldt J.
      • 彼得斯S.
      • kloosterboer n。
      • 塔尔基尼R.
      • Fiers M.
      • Sandbrink H.
      • lankhorst r.k.
      • 火车J.M.
      白斑综合征病毒DNA基因组序列。
      ,
      • 杨F.
      • 削减J.
      • 林X.
      • 李Q.
      • 潘D.
      • 张X.
      • 徐X.
      完整的基因组序列的虾白斑底栖病毒。
      )。源自中国的WSSV含有305 kB双链圆形DNA,其包括181个具有50个或更多个氨基酸的推定ORF(
      • 杨F.
      • 削减J.
      • 林X.
      • 李Q.
      • 潘D.
      • 张X.
      • 徐X.
      完整的基因组序列的虾白斑底栖病毒。
      )。这些ORF中的大多数是未知的功能,因为可以在公共数据库中找到任何与已知基因的同源物。
      病毒结构蛋白不仅具有在病毒结构和组件中的关键功能,而且在感染的早期阶段,细胞粘附,信号转导和恢复宿主的迅速展开的抗病毒防御。以前通过使用一维(1D)SDS-PAGE和MALDI-TOF或ESI Q-TOF质谱仪来鉴定来自WSSV的18个结构蛋白(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      )。最近,33 WSSV通过在线LC-ESI Q-TOF质谱仪鉴定了1D SDS-PAGE解决的结构蛋白,增加了这两种蛋白质组学研究所鉴定为38的结构蛋白的数量(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )。我们以前关于新加坡Gouper Iridovirus的研究表明,基于凝胶的方法和基于LC的霰弹枪方法同样有效和互补(
      • 宋W.
      • 林Q.
      • 乔希S·B·
      • 林T.K。
      • 张孝C.L。
      新加坡石斑鱼伊凡司血症的蛋白质组学研究。
      )。通过使用霰弹枪方法检测多种新的病毒蛋白。为了更好地理解WSSV的结构蛋白质组学,捕获蛋白质组学,涉及将总蛋白质的直接消解到复杂的肽混合物,然后通过LC-MS / MS自动鉴定肽。总共,从纯化的WSSV中鉴定了45种病毒结构蛋白,其中预先鉴定了32种蛋白质,并且第一次报告了13种蛋白质。
      确定病毒中结构蛋白的定位对于阐明病毒组装和感染中的作用是重要的。 Western印迹分析和免疫电解电子显微镜(IEM)是两种常规方法来定位病毒蛋白。对于WSSV,IEM已被用于检测13个包络蛋白和一个核衣壳蛋白(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒新颖封套蛋白(VP281)的表征。
      ,
      • 张X.
      • 黄C.
      • 徐X.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒基因的鉴定和定位编码包络蛋白。
      ,
      • 张X.
      • 黄C.
      • 徐X.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒封套蛋白基因(P22)的转录和鉴定。
      ,
      • 张X.
      • 黄C.
      • 唐X.
      • 庄Y.
      • 张孝C.L。
      用2DE-MS鉴定虾白斑综合征病毒(WSSV)的结构蛋白。
      ,
      • 李Q.
      • 陈Y.
      • 杨F.
      鉴定白斑综合征病毒的胶原样蛋白基因。
      ,
      • 李L.
      • 谢X.
      • 杨F.
      编码包膜蛋白VP31的虾白斑综合征病毒基因的鉴定与表征。
      ,
      • 朱Y.
      • 谢X.
      • 杨F.
      虾白斑综合征病毒新型包络蛋白(VP124)基因的转录和鉴定。
      ,
      • 朱Y.B.
      • 李H.Y.
      • 杨F.
      来自虾白斑综合征病毒的包络蛋白(VP39)基因的鉴定。
      ,
      • 谢X.
      • 杨F.
      白斑综合征病毒VP24与VP28相互作用,参与病毒感染。
      ,
      • 李L.
      • 林S.
      • 杨F.
      白斑综合征病毒包膜蛋白(VP110)的表征。
      )。最近,对WSSV的更系统的研究导致了七个包膜蛋白,五个Tegument蛋白和四种核衣壳蛋白的差异分化,并通过MS的两种额外的核衣壳蛋白(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )。迄今为止,已知的结构蛋白质中确定了在病毒中的27个ORF的定位(
      • 陈L.L.
      • 列伊J.H.
      • 黄C.J.
      • 周C.M。
      • 陈S.M.
      • 王C.H.
      • 罗C.F.
      • G.H.教堂
      鉴定虾白斑综合征病毒的核衣壳蛋白(VP35)基因及其对靶向昆虫细胞核核核的术语表征的特征。
      ,
      • 黄R.
      • 谢Y.
      • 张J.
      • 石Z.
      参与白斑综合征病毒感染的新型包络蛋白。
      )。在这项研究中,我们应用了一种互补蛋白质组学方法来检查itraq(相对和绝对量化的等异常量化的病毒虫中结构蛋白的定位。 ITRAQ是一种新开发的基于LC的定量蛋白质组学方法,它可以同时比较多达四种不同的样品(
      • 罗斯P.L。
      • 黄Y.N.
      • Marchese J.N.
      • 威廉姆斯B.
      • 帕克K.
      • Hattan S.
      • Khainovski N.
      • 皮莱S.
      • 戴伊S.
      • 丹尼尔斯S.
      • Purkayastha S.
      • Juhasz P.
      • 马丁S.
      • Bartlet-Jones M.
      • 削减F.
      • 雅各布森A.
      • Pappin D.J.
      使用胺 - 反应性的异常标记试剂在酿酒酵母中的多重蛋白质定量。
      )。已成功应用以衡量细胞器蛋白的富集(
      • 陈修
      • 沃克A.K.
      • Strahler J.R.
      • 西蒙E.S.
      • Tomanicek-Volk S.L.
      • 尼尔森B.B。
      • 赫尔利M.C.
      • 恩斯特S.A.
      • 威廉姆斯J.A.
      • 安卓P.C.
      细胞膜蛋白质组学:胰酶氧颗粒膜的分析。
      )通过使用可切割的ICAT通过同位素标记通过同位素标记定位细胞器蛋白的替代方法(
      • 邓克利T.P.
      • 沃森R.
      • 格里芬J.L.
      • 杜普雷P.
      • 李洁明K.S.
      通过同位素标记(LOPIT)通过细胞器蛋白的定位。
      )和蛋白质相关性分析(
      • 福斯特L.J。
      • 德Hoog C.L。
      • 张Y.
      • 谢X.
      • Mootha V.K.
      • 曼M.
      通过蛋白质相关性分析的哺乳动物细胞器地图。
      )。确定ITRAQ的病毒蛋白定位是基于该原理,即通过报告离子量化沉淀溶解的部分和颗粒级分中的核衣壳蛋白中的富集蛋白质的富集,而它们可以通过其他MS / MS片段离子。使用这种方法,我们确定了23个包膜蛋白和六个核衣壳蛋白,其中第一次报告了12个包膜蛋白和两个核衣壳蛋白。我们的结果表明,ITRAQ是一种强大的蛋白质定位方法,也可以应用于研究其他包膜病毒。更好地了解WSSV结构蛋白和病毒群岛的定位将在病毒组装,其感染途径和抗病毒药物的发现中脱光。

      实验步骤

       WSSV病毒的增殖和分离 -

      在本研究中使用的WSSV起源于WSSV感染 Penaeus chinensis. (中国孤立)。病毒接种物由感染的红爪小龙虾的血淋巴制备, cherax quadricarinatus,如前所述(
      • 吴J.L.
      • 铃木K.
      • 有本M.
      • 西泽T.
      • 室贺K.
      挑战试验白斑综合征病毒的制备 Penaeu japonicus..
      )。离心以1,500×离心后 g 10分钟,用0.45μm过滤器过滤上清液并注入肌肉内注入健康的小龙虾中。 4-6天后,从奄奄一息小鱼提取的血淋巴以2,000×离心 g 10分钟。将上清液层叠在30-60%(w / v)逐步蔗糖梯度的顶部分层,并以53,000×离心 g 在4°C下1小时。收集病毒带,然后与TN缓冲液(20mM Tris-HCl,400mM NaCl,pH 7.4)混合并以53,000×返回 g 在4°C下1小时。用TN缓冲液洗涤所得颗粒以除去蔗糖,然后在TN缓冲液中重悬。纯化的病毒样品用2%磷钨酸负染色,并在透射电子显微镜下检查,检查纯度和数量。

       霰弹枪LC-MALDI MS分析WSSV结构蛋白 -

      病毒蛋白提取,溶液消化和胰蛋白酶肽的LC分离进行了预先描述的方法(
      • 宋W.
      • 林Q.
      • 乔希S·B·
      • 林T.K。
      • 张孝C.L。
      新加坡石斑鱼伊凡司血症的蛋白质组学研究。
      )。使用0.1%SDS,pH 8.5的简要介绍50mm的50mM Tris-HCl,用于从纯化的WSSV病毒中提取蛋白质。用三觉甲基膦膦还原萃取的蛋白质,用碘乙酰胺烷基化,然后用测序级猪胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)消化。使用配备有概率的MALDI斑点装置的终极LC系统(Dionex-LC Packings,Sunnyvale,CA)分离消化的肽混合物。将大约10μg肽混合物捕获0.3×1mm捕集柱(3μmc18 Pepmap,100Å,迪奥塞克-LC包装)和分析柱0.075×150mm的分析柱(3μmc18 Pepmap,100Å,狄俄勒达-LC包装)以0.4μL/ min的流速。移动相A和B分别为2%ACN,0.05%TFA和80%ACN,0.04%TFA。使用的LC梯度在10分钟内为0-20%B,然后在1分钟内超过3小时,60-100%B,并保持在100%B 5分钟。在将MALDI基质溶液(7mg /mLα-氰基-4-羟基氨基氨基酸和130μg/ ml柠檬酸盐中的75%ACN中的柠檬酸盐和130μg/ ml铵中的130μg/ ml铵中的130μg/ ml酸铵混合,然后达到MALDI靶板。
      ABI 4700蛋白质组学分析仪MALDI-TOF / TOF质谱仪(Applied Biosystems,Foster City,CA)用于分析样品。该仪器由4000系列资源管理器3.0控制。对于MS分析,通常累积1,000个副谱。用设置为15的最小信噪比(S / N)检测峰值,并向峰进行峰值。 MS / MS分析使用氮气在1kV的碰撞能量和~9.0×10的碰撞气体压力下进行 −7 托尔。使用基于数据质量的停止条件,将两千到10,000个差点合并每种频谱。使用Savitsky-Golay方法平滑光谱,使用俯冲峰值(全宽半最大)设置为3的点,并且将多项式顺序设置为4.峰被解剖,并且仅具有S /N≥10的峰值挑选。
      GPS Explorer软件版本3.0(应用生物系统)用于使用吉祥物搜索引擎版本2.0(Matrix Science,Boston,MA)来创建和搜索文件以识别病毒蛋白。包含来自三个WSSV分离(2,013个条目)的所有预测ORF的数据库(64,335个条目)以及国际蛋白质指数人类数据库3.16版(www.ebi.ac.uk/ipi/ipihelp.html.,62,322个条目)用于最小化假阳性识别。搜索仅限于胰蛋白肽,允许一种缺失的乳沟。半胱氨酸氨基甲酰化,N-末端乙酰化和焦蛋白(Glu或Gln)和甲硫氨酸氧化被选择为可变修饰。前体误差容差和MS / MS片段误差容差分别设置为60ppm和0.4 da。考虑到蛋白质鉴定只考虑了顶部排名的肽匹配。对于预期值的肽比赛>0.05,手动进一步验证MS / MS光谱。

       WSSV结构蛋白的生物信息分析 -

      为了表征先前未知的WSSV结构蛋白,通过搜索Interpronan实现了同源性分析(
      • Zdobnov e.m.
      • Apweiler R.
      Interprocan-incripature-识别方法的集成平台。
      ,
      • Quevillon E.
      • Silventoinen V.
      • 皮莱S.
      • 哈特N.
      • 穆德N.
      • Apweiler R.
      • 洛佩兹R.
      Interprocan:蛋白质域标识符。
      )。推定的信号序列和跨膜结构域被致密的对准表面预测(
      • Cserzo M.
      • Eisenhaber F.
      • Eisenhaber B.
      • 西蒙I.
      论过滤误跨膜蛋白预测。
      )。 Psort用于将基于瑞士 - PROM数据的细胞中蛋白质细胞定位预测。

       分离总RNA和RT-PCR-

      WSSV感染的小龙虾鳃被大量的RNALATER(Qiagen,Hilden,德国)对待。使用rneasy小酮(qiagen)从这些组织中分离总RNA。为了除去任何残留的DNA,在所述方案描述后用DNA的试剂盒(AMAMION,ASTIN,TX)处理RNA溶液。使用基因特异性引物通过单步RT-PCR试剂盒(QIAGEN)扩增靶基因(QIAGEN)(引物对提供补充数据I)。所有程序根据制造商的指示进行。短暂的cDNA在50℃下逆转45分钟。在95℃下以初始加热步骤开始PCR扩增区段15分钟以激活Hotstartaq DNA聚合酶并同时灭活逆转录酶。在激活DNA聚合酶后,进行PCR扩增反应(将94℃的40个循环为30℃,50℃,30s,72℃,2分钟)。最终延伸步骤在72℃下进行7分钟。 RT-PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶上溶解。将两个ORF(WSV143和WSV161)的基因分成几个短片段(小于1,600bp)以完全覆盖整个编码区域。对于对照,在将逆转录酶失活后加入纯化的RNA以排除基因组DNA污染的可能性。

       病毒包膜蛋白和核衣壳蛋白的分离 -

      Tsai描述了先前验证的分离过程 等。 (
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )被修改采用。用含有20mM Tris-HCl的缓冲液A处理简要纯化的病毒,5mM EDTA-NA2,1%Triton X-100,0.5M NaCl,1倍蛋白酶抑制剂混合物(Roche诊断亚太地区),pH 7.4,4℃,30分钟。然后将病毒分为两个相等的部分。将一部分留出作为总病毒蛋白的对照,而另一部分以200,000×以200,000×离心分离成两种级分,上清液和颗粒 g 在4°C下1小时。将颗粒级分一次用缓冲液A洗涤并再次离心1小时。将沉淀重悬于等体积的缓冲液A中作为包络级分。

       包络和核衣壳分数的蛋白质印迹分析 -

      通过12%SDS-PAGE分解来自每个级分的病毒素相关的蛋白质并加工用于Western印迹分析。在室温下用1×TBST(20mM Tris碱,137mM NaCl,0.1%Tween 20,pH 7.6)中的5%非牛奶封嵌嵌入5%非牛奶,然后进行Western印迹。主要抗体与以下浓度一起使用:兔抗VP28(WSV421)多克隆抗体(1:2,000)和小鼠抗VP24(WSV002)和抗VP466(WSV308)多克隆抗体(1:2,000)。二次抗体,抗兔或抗小鼠辣根过氧化物酶 - 缀合的抗血清稀释1:5,000(GE Healthcare)。根据制造商的方案使用Pierce Supersignal West Picil发光底物(Pierce),并且使用Lumi-薄膜化学发光检测膜(Roche Application Science)可视化蛋白质带。

       ITRAQ标记和二维(2D)LC-MALDI MS,用于确定病毒蛋白定位 -

      使用2D清理试剂盒(GE Healthcare)处理一百个微克总病毒蛋白和等同的包膜和核衣壳部分(分离为100μg总病毒蛋白),并重新悬浮在溶解缓冲液中(0.5M三乙基碳酸氢铵,pH值8.5,含有0.1%SDS)。然后减少样品,并根据ITRAQ试剂盒(Applied Biosystems)的方案阻断半胱氨酸。加入10微升1μg/μL胰蛋白酶(应用生物系统)溶液,并将样品在37℃下消化过夜。将样品真空干燥,用30μl溶解缓冲液重构,并用Itraq标签标记如下:总病毒蛋白,ITRAQ 114试剂;信封分数,ITRAQ 115试剂;和核衣壳馏分,Itraq 116试剂。然后使用强阳离子交换(SCX)柱(Applied Biosystems)合并并纯化标记的样品,并用5%NH洗脱结合的肽 4哦,30%甲醇。
      干燥后,将Itraq标记的肽重悬于20μl5mmkh2PO4 含有5%ACN,pH 3.0的缓冲液,并使用终极双梯度LC系统(Dionex-LC Packings)分离。第一尺寸分离使用0.3×150mm SCX柱(FUS-15-CP,POROS 10S,Dionex-LC填充),移动相A和B为5毫米KH2PO4 缓冲液,pH 3,含有5%ACN和5 mm KH2PO4 缓冲液,pH 3,含有5%ACN和500mM KCl,流速为6μL/ min。具有流动相B的步进梯度(未结合的0-5,5-10,10-15,15-20,20-30,30-40,40-50和50-100%)的洗脱液被替代地捕获两个0.3×1毫米陷阱柱(3μmc18 Pepmap,100Å,脱硫-LC填料,并用0.05%TFA洗涤以除去盐。使用0.2×50mm的反相柱(单片PS-DVB,Dionex-LC填充)使用0.05%TFA作为流动相A和80%ACN作为移动式,用0.2×50mm的反相柱(单片PS-DVB,Dionex-LC填充)进行第二尺寸分离。相B的梯度为0-60%流动相B,15分钟,流速为2.7μL/ min。通过5.4μl/ min的流速将LC级分与MALDI基质溶液通过25-NL混合的T恤(俯卧性科学,橡木港,WA)并用验证发现了192孔MALDI靶板(应用生物系统)微馏分收集器(Dionex-LC Packings)。
      如上所述进行MS分析,并且MS / MS分析设置与霰弹枪分析相同,不同之处在于碰撞气体压力变为〜2×10−6 托尔。对于具有S /N≥100的前体离子,每个光谱合并6,000次射击。对于50至100之间的S / N的前体,获得10,000次射击。峰值处理和检测参数与上述霰弹枪分析的峰值处理和检测参数相同。 GPS Explorer软件3.5版(应用生物系统)使用吉祥物搜索引擎(版本2.1,矩阵科学)用于肽和蛋白质标识和ITRAQ量化。使用的数据库与上述数据库相同,并限制在胰蛋白肽。半胱氨酸甲醇化,N-末端ITRAQ标记和ITRAQ标记的赖氨酸被选择为固定修饰,并选择甲硫氨酸氧化作为可变改性。允许一个缺少的乳沟。前体误差容差和MS / MS片段误差容差分别设定为120ppm和0.4Da。将最大肽等级设定为1,并且将最小离子置位置信区间(C.I.I;%)设定为0.对于具有低离子分数的蛋白质(≤30),手动检查MS / MS光谱。

       WSV432的抗体制备和Western印迹分析

      WSV432的全长基因被PCR扩增并插入含有C末端的修饰的PET载体中6 标签。测序后,将构建体转化为 大肠杆菌 菌株BL21星(DE3)(Invitrogen)和蛋白质在18℃下在异丙基β-D-硫代酰甲酰胺诱导后表达。使用镍 - 亚硝基酰基乙酸柱纯化重组蛋白,并通过MS确认其同一性。抗体由Bam Biotech Co.,Ltd。(福建省厦门,福建省)使用纯化的融合蛋白来制备,以免疫兔子。由Viriv,封套和核衣壳的蛋白质通过SDS-PAGE解析并如上所述进行Western印迹分析。抗WSV432抗体稀释1:1,000。

       通过IEM的VSV432本地化 -

      在室温下用0.1%吐温20处理纯化的病毒30秒。在用0.2M磷酸盐缓冲液洗涤后,去除洗涤剂后,将病毒悬浮液吸收在碳涂覆的镍网上。兔抗WSV432抗体用于识别病毒颗粒中的WSV432,而预先生兔血清并联包括阴性对照。第二抗体是山羊抗兔IgG与15nM金颗粒(电子显微科学,Hatfield,PA)缀合。随后的免疫形状标记根据Leu进行 等。 (
      • 列伊J.H.
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 回历王
      • 王C.H.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      白斑综合征病毒病毒虫的核衣壳中的独特堆叠环由主要结构蛋白VP664形成,该蛋白质蛋白质VP664是有史以来的最大的病毒结构蛋白。
      )。在透射电子显微镜下检查标本。

      结果

       霰弹枪蛋白质组学鉴定病毒虫相关蛋白 -

      通过电子显微镜确认使用蔗糖梯度分离的分离的WSSV病毒粒子的纯度(如图。 1A)。大多数纯化的病毒粒都完整。使用离线LC-MALDI工作流程分析WSSV的结构蛋白质组。总共匹配WSSV ORF的氨基酸序列检测45种病毒蛋白(桌子)。除了WSV198和WSV419外,所有其他鉴定的蛋白质至少包含一个与吉祥物预期值的最高排名的肽匹配<0.05(补充数据II)。将WSV198包含为真实鉴定,因为它具有三个顶级排名的肽,吉祥物评分为26,24和15(补充数据II)。尽管WSV419仅含有一个顶部排名的肽,但是吉祥物得分为28,因此手动检查MS / MS光谱,被认为是可靠的任务。在WSSV(中国孤立)中鉴定了一种蛋白质;然而,预测的ORF只能在台湾(WSSV349)和泰国(ORF144)隔离中找到,而不是在中国孤立中。因此,我们将其命名为WSSv349。尽管通过早期凝胶的方法进行了对WSSV蛋白质组的综合研究,但我们的霰弹枪方法成功地鉴定了WSSV中的另外的13个结构蛋白。通过Interprocan预测了这13个ORF的潜在功能。发现备用功能只能为两种蛋白质分配,因为大多数WSSV ORF都是功能不为人知的。 WSV143与SOX转录因子同源,而WSV161具有与PrichexensN同源的五个序列区域,这代表了富含植物细胞壁蛋白的富含脯氨酸延长的签名。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1电子显微照片呈负染色的WSSV。A,完整的包膜病毒群岛。 B,核衣壳,其显示为堆叠的振铃结构。
      桌子霰弹枪蛋白质组学鉴定WSSV的结构蛋白
      不。名称
      a 基于中国孤立的基因组,除了WSSV349(台湾孤立)。
      加入否。分子mass
      b 预测的分子量。
      PI独特的肽计数总离子分数总离子得分C.I.HPI
      c ORFS开始表达的HPI。 na,不可用。
      TM值
      d TM值,跨膜结构域。
      SP
      e SP,信号肽序列。
      RGD或KGD
      f 潜在的细胞粘附序列。
      替代名称和refs。
      kDa的%
      1wsv002| 17158106238.612132710024TM值SPKGDVP24 (
      • van Hulten M.C.
      • Westenberg M.
      • 祝大家S.D.
      • 火车J.M.
      抗白斑综合征病毒两种主要病毒蛋白基因虾的鉴定。
      )
      2wsv006| 17158110334.323597.08824TM值这项研究
      3wsv010| 17158114114.414899.87112这项研究
      4wsv011| 171581151445.5105861002TM值VP53A(
      • 蔡J.M.
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      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      5wsv021| 17158125239.417410024TM值这项研究
      6wsv035| 171581391086.71448510024TM值RGDVP110(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
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      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      7wsv037| 171581411445.2512010024KGDVP160B(
      • 蔡J.M.
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      • 回历王
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      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      8wsv115| 1715821910861056310024TM值VP53B(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      9wsv131| 17158235534.9213510024这项研究
      10wsv134| 17158238256.24931002这项研究
      11wsv136| 17158240158.928010024TM值这项研究
      12wsv143| 171582472595.2189631002KGD这项研究
      13wsv161| 17158265855.631111002这项研究
      14wsv209| 1715831317462062710024R / KGDVP187(
      • 李H.
      • 朱Y.
      • 谢X.
      • 杨F.
      从虾白斑综合征病毒中鉴定一种新型包络蛋白(VP187)基因。
      )
      15wsv216| 171583201325.82293010024VP124(
      • 朱Y.
      • 谢X.
      • 杨F.
      虾白斑综合征病毒新型包络蛋白(VP124)基因的转录和鉴定。
      )
      16wsv220| 17158324765.523294.882TM值VP674,VP73,VP76(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      ,
      • 黄R.
      • 谢Y.
      • 张J.
      • 石Z.
      参与白斑综合征病毒感染的新型包络蛋白。
      )
      17wsv230| 1715833494.215599.9722这项研究,VP9(
      • 刘Y.
      • 吴J.
      • 宋J.
      • Sivaraman J.
      • 张孝C.L。
      鉴定白斑综合征病毒的新型非结构蛋白VP9:其结构揭示了具有特定金属结合位点的富勒氏蛋白折叠。
      )
      18wsv237| 17158341334.6427110024VP292,VP41A(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      19wsv238| 17158342514.8632110012TM值SPKGDVP51A(
      • 蔡J.M.
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      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
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      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      20wsv242| 17158346345.7841910024VP300,VP41B(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
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      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
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      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      21wsv254| 17158357324.7526710024RGDVP281,VP36B(
      • 黄C.
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      • 徐X.
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      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
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      • 萧H.H.
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      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      ,
      • 黄C.
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      • 林Q.
      • 徐X.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒新颖封套蛋白(VP281)的表征。
      )
      22wsv256| 17158359434.7624410024TM值SPVP384,VP51B(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
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      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      23wsv259| 17158362354.737810024VP38A(
      • 蔡J.M.
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      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      24wsv271| 171583741347.5928710024RGDVP136A(
      • 蔡J.M.
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      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      25wsv284| 17158387114.913998.892TM值SPVP13A(
      • 蔡J.M.
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      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      26wsv289| 171583911756.4218511002VP160A(
      • 蔡J.M.
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      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      27wsv306| 17158408475.4317010024VP39A(
      • 蔡J.M.
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      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      28wsv308| 17158410526.5745810012VP466,VP51C(
      • 黄C.
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      • 徐X.
      • 见Z.
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      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      29wsv311| 17158413229.3991110012TM值VP26 (
      • van Hulten M.C.
      • Westenberg M.
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      • 火车J.M.
      抗白斑综合征病毒两种主要病毒蛋白基因虾的鉴定。
      )
      30wsv321| 17158423139.319110012TM值SPVP13B(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
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      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      31wsv324| 1715842699.331661002这项研究
      32wsv325| 17158427518.7732010012TM值VP60A(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
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      • 萧H.H.
      • 回历王
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      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      33wsv338| 17158440484.7315310024TM值SPVP11 (
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      34wsv339| 17158441325417610024VP39B(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      35wsv340| 17158442306.628410024RGDVP31(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      36wsv360| 171584626646.41651214510024R / KGDVP664(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
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      • 萧H.H.
      • 回历王
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      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      ,
      • 列伊J.H.
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 回历王
      • 王C.H.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      白斑综合征病毒病毒虫的核衣壳中的独特堆叠环由主要结构蛋白VP664形成,该蛋白质蛋白质VP664是有史以来的最大的病毒结构蛋白。
      )
      37wsv386| 1715848878111110024TM值SPVP68,VP12B(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      38wsv414| 17158516134.4332810012TM值VP19 (
      • van Hulten M.C.
      • Reijns M.
      • 朱梅谢上午
      • Zandbergen F.
      • 火车J.M.
      白斑综合征病毒(WSSV)VP19和VP15的鉴定和WSSV主要结构蛋白的糖基化状态。
      )
      39wsv415| 171585176271150610012KGDVP544,VP60B(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      40wsv421| 17158523224.710105410012TM值SPVP28 (
      • van Hulten M.C.
      • Westenberg M.
      • 祝大家S.D.
      • 火车J.M.
      抗白斑综合征病毒两种主要病毒蛋白基因虾的鉴定。
      )
      41wsv432| 17158534125.817310024RGD这项研究
      42wsv442| 17158543896.21271510024VP800,VP95(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      43wssv349| 19481941119.514999.90224TM值这项研究
      44wsv198
      g WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。
      | 17158302316.435099.92224VP32 (
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )
      45wsv419
      g WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。
      | 17158521239.212886.871这项研究
      a 基于中国孤立的基因组,除了WSSV349(台湾孤立)。
      b 预测的分子量。
      c ORFS开始表达的HPI。 na,不可用。
      d TM值,跨膜结构域。
      e SP,信号肽序列。
      f 潜在的细胞粘附序列。
      g WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。

       WSSV蛋白的翻译后修饰 -

      来自MS / MS数据,七种鉴定的蛋白质含有乙酰化N末端(表II 和补充数据III)。 WSV134,WSV198和WSV360在N-末端甲硫氨酸残基上乙酰化。 WSV131,WSV289,WSV414和WSV432在第二氨基酸乙酰化,表明在翻译后除去这些蛋白质的N-末端甲硫氨酸。
      表II霰弹枪蛋白质组学中检测到WSSV结构蛋白中检测到的N-末端乙酰化
      不。名称肽序列START-END观察到的 m/zMrΔ错过Ionscore预计
      试验计算
      1wsv131(m)ssyldllnvaggggggggggandadnetar(r)2–282593.292592.282592.170.110934.80E-081
      2wsv134MEWINQR(T)1–71018.531017.521017.470.050420.0111
      3wsv289(m)sttqtqtierplpgk(n)2–161698.951697.951697.890.050751.90E-061
      4wsv360MDQYPEVR(d)1–81079.511078.51078.480.020420.00681
      5wsv414(m)atttntlpfgr(t)2–121220.661219.651219.620.030663.00E-051
      6wsv432(m)svpeptlfttnr(s)2–131403.761402.751402.710.040735.20E-061
      7wsv198
      a 桌子底部列出了具有最佳肽离子评分≤30的WSSV蛋白。
      小姐LFISPFFR(k)1–101286.641285.631285.65−0.020240.591
      a 桌子底部列出了具有最佳肽离子评分≤30的WSSV蛋白。

       RT-PCR确认基因表达 -

      为了确认那些通过霰弹枪蛋白质组学的新鉴定的病毒蛋白的基因的表达,进行RT-PCR以检测这些ORF的MRNA的存在。我们的结果表明,表达了所有这些基因(Fig. 2)。每个基因的RT-PCR产物的尺寸在补充数据I中提供。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2RT-PCR扩增CDNA的13个新鉴定的WSSV结构蛋白。 对于每种蛋白质, 左车道 是基因组DNA污染控制,以及 右侧车道 是它相应的cDNA产品。所有蛋白质编码序列完全扩增,包括WSV143和WSV161。对于WSV143,扩增了五种RT-PCR产物(WSV143-1至-5)以覆盖整个编码区;虽然对于WSV161,产生了两种RT-PCR产物(WSV161-1和-2)。

       分离WSSV包膜蛋白和核衣壳蛋白 -

      在Triton X-100和0.5M NaCl处理后,将病毒结构蛋白分离成封套和核衣壳馏分(如图。 1B)(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )。在本研究中,我们无法将Tegument蛋白与包膜蛋白质区分开,因此我们将病毒结构蛋白作为包膜蛋白(包括Tegument蛋白)和核衣壳蛋白。使用针对VP28,VP24和VP466的抗体进行蛋白质印迹,以检查病毒蛋白的分离(Fig. 3)。我们的结果证实,VP466是核衣壳蛋白(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )。正如预期的那样,分离后,富含包膜蛋白和核衣壳蛋白在它们各自的级分中富集。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3总蛋白质,包膜蛋白质和核衣壳蛋白的蛋白质印迹分析。 使用的三种抗体分别是抗VP466,-VP28和-VP24。总蛋白质浓度为0.3μg 左图 和12μg的 右图.

       ITRAQ的结构蛋白的定位 -

      使用ITRAQ试剂和2D LC-MALDI MS进行定量蛋白质组学实验,以定位WSSV中的各种结构蛋白。该技术的工作流程将概述 Fig. 4。分离后,分别用Itraq试剂114,115和116标记总病毒蛋白,包围蛋白质和核衣壳蛋白。由于它们通过分离过程的浓缩,我们预期包络蛋白具有高于116/114比率的115/114个比率,而核衣壳蛋白与116/114比率相比较低的115/114比率。 Fig. 5 显示ITRAQ比率的代表性MS / MS光谱来自本研究中确定的包膜蛋白WSV009和核衣壳蛋白WSV289(用于其余的光谱,见补充数据IV)。基于ITRAQ报道器离子比率,我们观察到23个结构蛋白质是包络蛋白,六个是核衣壳蛋白(表III)。这些包括具有最佳离子分数≤30(WSV198,WSV216,WSV230,WSV238,WSV242,WSV256和WSV289)的七种蛋白质。因为这些蛋白质已被自信地鉴定为霰弹枪蛋白质组学研究的病毒结构蛋白,并且匹配的肽是ITRAQ研究中的所有顶部,这些蛋白质分配应该是可靠的。手动检查MS / MS光谱以进一步验证(补充数据IV)。使用ITRAQ方法,我们确认了11个包络蛋白及其先前鉴定的四种核蛋白质,其中VP24和VP26是包络蛋白,而VP466是核衣壳蛋白(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      ,
      • van Hulten M.C.
      • Westenberg M.
      • 祝大家S.D.
      • 火车J.M.
      抗白斑综合征病毒两种主要病毒蛋白基因虾的鉴定。
      )。此外,我们鉴定了另外的12个包膜蛋白和两个核衣壳蛋白,证明了这种方法在研究病毒亚甲蛋白研究中的有效性。在ITRAQ研究中进一步验证了霰弹枪蛋白质组学和23种已知蛋白质的5个新鉴定的结构蛋白。在我们的ITRAQ研究中首次鉴定出一种包膜蛋白WSV295,在我们的ITRAQ研究中首次鉴定为病毒结构蛋白。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4ITRAQ标记工作流程和2D LC-MS,用于在WSSV中定位结构蛋白的定位。 在洗涤剂处理后,将病毒包膜与核衣壳分离。为了定量区分核衣壳蛋白的包膜蛋白,总病毒蛋白,来自包络级分的蛋白质,并分别用胰蛋白酶分别减少半胱氨酸封闭和消化并用胰蛋白酶消化。胰蛋白酶肽分别用114,115和116 ITRAQ试剂标记。然后使用SCX色谱法清洁组合的肽混合物。用反相色谱法通过2D LC耦合SCX进一步分离洗脱液,并用马尔氏菌溶液加入柱流出物,并在马尔迪靶板上发现,后来通过ABI 4700蛋白质组学分析仪MALDI-TOF / TOF质谱仪进行分析。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5信封蛋白WSV009和核衣壳蛋白WSV289的代表性ITRAQ报告器离子光谱。
      表IIIITRAQ鉴定的WSSV封装蛋白质和核衣壳蛋白
      不。名称加入否。独特的肽计数总离子分数总离子得分C.I.平均
      a 平均数。
      iTRAQ ratio ± S.D.
      位置在病毒赛中
      b e,信封; NC,核衣壳。 WSSV中具有先前未知的本地化的结构蛋白质以粗体。
      114分之115114分之116
      %
      1wsv002| 1715810674521000.741±0.1840.219±0.193E
      2wsv006| 1715811021661000.742±0.006.0.075±0.135E
      3wsv009| 1715811321261000.722±0.1820.161±0.093.E
      4wsv011| 1715811561601000.702±0.245.0.280±0.188E
      5wsv021| 1715812526999.9990.674±0.3680.284±0.071.E
      6wsv115| 1715821913898.5910.517±0.049.0.420±0.027E
      7wsv143| 1715824742021000.446±0.252.0.497±0.203NC
      8wsv209| 1715831342301000.635±0.2610.411±0.299E
      9wsv254| 1715835714099.1210.663±0.1230.322±0.073.E
      10wsv259| 171583622821000.656±0.1920.348±0.230.E
      11wsv271| 171583742891000.476±0.0990.582±0.059.NC
      12wsv295| 1715839713596.960.448±0.033.0.379±0.007E
      13wsv306| 1715840815099.9050.933±0.2480.321±0.051.E
      14wsv308| 171584102891000.343±0.1310.517±0.114NC
      15wsv311| 1715841397811000.792±0.259.0.194±0.227E
      16wsv321| 1715842314699.790703±00342±0E
      17wsv325| 1715842725099.920.694±0.1490.208±0.084.E
      18wsv360| 1715846214790461000.365±0.1870.621±0.173NC
      19wsv415| 1715851752221000.406±0.1640.670±0.095.NC
      20wsv421| 1715852378601000.705±0.2430.137±0.206.E
      21wsv442| 1715854363051000.695±0.3140.279±0.496.E
      22wssv349| 1948194115599.970947±00125±0E
      23wsv198
      c WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。
      | 1715830212573.0890783±00141±0E
      24wsv216
      c WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。
      | 1715832013091.910758±00223±0E
      25wsv230
      c WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。
      | 1715833412350.8050.635±0.120.0.294±0.005E
      26wsv238
      c WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。
      | 1715834212988.9610.553±0.1770.442±0.029E
      27wsv242
      c WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。
      | 1715834625899.9850.626±0.1440.179±0.055.E
      28wsv256
      c WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。
      | 1715835912781.2960.532±0.1180.422±0.023E
      29wsv289
      c WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。
      | 1715839111900324±00683±0NC
      a 平均数。
      b e,信封; NC,核衣壳。 WSSV中具有先前未知的本地化的结构蛋白质以粗体。
      c WSSV蛋白质具有最佳的肽离子分数≤30在桌子的底部列出。

       结构蛋白WSV432在WSSV中的表达与定位

      重组WSV432,由霰弹枪蛋白质组学新鉴定的蛋白质表达 大肠杆菌 和 purified (如图。 6A)。 MS分析证实了该蛋白质的同一性(数据未显示)。 Western印迹分析表明该蛋白质存在于病毒包膜上,而不是核衣壳(如图。 6B)。 IEM正在进行,以进一步验证WSSV中WSV432的存在。为了验证病毒颗粒上WSV432的定位,病毒用吐温20处理,以部分分离来自核衣壳的包络。随后的免疫标记表明,金颗粒在信封上局部化但不在裸核衣壳上,而在阴性对照上没有观察到金颗粒(Fig. 7)。结果表明,WSV432是包络蛋白;这与我们的Western印迹结果一致。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6重组WSV432的表达及其在WSSV中定位的蛋白质印迹分析。A, lane 1,分子量(毫米)标记; lane 2lane 3,未诱导和诱导的细菌裂解物。 B,Western印迹分析中VSV432的定位。 Lane 1,总病毒蛋白; lane 2,包络蛋白; lane 3,核衣壳蛋白。使用兔抗WSV432抗体。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7IEM的WSV432在WSV432的本地化。A,WSSV具有免疫偶极标记的抗WSV432抗体。金颗粒被定位于封套,而不是核衣壳。 插页 显示另一个标记的病毒。 B,WSSV具有免疫偶极标记的控制血清。没有发现金标记的颗粒。

      讨论

      在过去的几年中,基于凝胶的技术已经成功地用于研究WSSV蛋白质组,并确定了38个病毒结构蛋白质(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )。为了进一步表征该病毒的蛋白质成分,应用霰弹枪蛋白质组学,这导致我们研究中的45种结构蛋白质,包括之前未鉴定的13种蛋白质。对于这些新发现的蛋白质,通过特异性RT-PCR验证了我们发现的可靠性。令人惊讶的是,WSV230,其在前一项研究中定义为非结构蛋白VP9(WSV230)(
      • 刘Y.
      • 吴J.
      • 宋J.
      • Sivaraman J.
      • 张孝C.L。
      鉴定白斑综合征病毒的新型非结构蛋白VP9:其结构揭示了具有特定金属结合位点的富勒氏蛋白折叠。
      )通过霰弹枪和ITRAQ方法在病毒中检测到。 WSV230是非结构蛋白的假设基于Western印迹和IEM结果。然而,通过基于抗体的方法检测WSV230的无法无法检测到WSV230可能是由于病毒中该蛋白质的低丰度。 Western印迹分析和IEM均证实,由霰弹枪蛋白质组学鉴定的WSV432,而不是1D凝胶MS是一种包络蛋白。此外,该蛋白质含有用于细胞粘附的RGD基序。据报道,RGD之后的苏氨酸残留对其与整合素的互动非常重要(
      • 犁E.F.
      • 哈斯T.A。
      • 张L.
      • 洛夫特斯J.
      • 史密斯J.W.
      配体与整合素结合。
      )。对于WSV432,苏氨酸残基被丝氨酸替换,暗示该蛋白质也可能具有对病毒进入重要的细胞粘附活性。
      据报道,使用DNA微阵列以了解WSSV基因表达调节的WSSV ORF的基因组转录谱(
      • 王H.C.
      • 林A.T.
      • Yii的D.M.
      • 常Y.S.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      白斑综合征病毒基因组的DNA微阵列:在感染虾的鳃中表达的基因。 Mar.Biotechnol。 (.
      ,
      • 马克斯H.
      • Vorst O.
      • van houwelingen上午
      • van Hulten M.C.
      • 火车J.M.
      白斑综合征病毒在体内的基因表达分析。
      ,
      • LAN Y.
      • 徐X.
      • 杨F.
      • 张X.
      DNA微阵列虾白斑综合征病毒(WSSV)基因的转录谱。
      )。对于13个以前未知的蛋白质,这些基因中的五个在2小时后开始表达(HPI),一个开始在12hPI的表达中表达,并且基于DNA微阵列数据的24 HPI在24 HPI开始表达(桌子)(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      ,
      • 王H.C.
      • 林A.T.
      • Yii的D.M.
      • 常Y.S.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      白斑综合征病毒基因组的DNA微阵列:在感染虾的鳃中表达的基因。 Mar.Biotechnol。 (.
      )。
      综述了三种蛋白质组学研究鉴定的55个WSSV结构蛋白质 Fig. 8。应注意,通过基于LC的方法唯一地鉴定了17个蛋白质,通过基于凝胶的方法唯一鉴定,两者均鉴定了28个,确认这两种方法的互补性质。在霰弹枪蛋白质组学鉴定的17个ORF中,通过凝胶基鉴定了四种结构蛋白,包括两个包膜蛋白,包括两个包膜蛋白,VP187(WSV209)和VP124(WSV216)和VP160A(WSV289)的两个核衣壳蛋白在最近的三个出版物中分析MS(
      • 朱Y.
      • 谢X.
      • 杨F.
      虾白斑综合征病毒新型包络蛋白(VP124)基因的转录和鉴定。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      ,
      • 李H.
      • 朱Y.
      • 谢X.
      • 杨F.
      从虾白斑综合征病毒中鉴定一种新型包络蛋白(VP187)基因。
      )。然而,四个结构蛋白,VP1684(WSV001),VP357(WSV129),VP184(WSV303的一部分)和VP448(WSV526)仅由Maldi-TOF肽质量指纹识别鉴定,并且无法通过MS / MS数据,表明这些蛋白质标识的可靠性低,并且需要进一步证据来支持这些发现(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      )。因为只从凝胶中切除可见带,所以可能不包括那些低丰度蛋白的鉴定。因此,基于LC的方法具有鉴定诸如WSV230的低丰度蛋白的优点。此外,还通过LC方法鉴定出几种高碱性蛋白质,例如WSV021(PI 9.35)和WSV324(PI 9.3)。总共在WSSV中鉴定了总共58个结构蛋白质,其中霰弹枪和以前蛋白质组学研究鉴定了55种蛋白质,一种包络蛋白,WSV295,由我们的ITRAQ研究鉴定,以及两个核衣壳蛋白,VP35(WSV493)和VP15(WSV214)以前报道(
      • 陈L.L.
      • 列伊J.H.
      • 黄C.J.
      • 周C.M。
      • 陈S.M.
      • 王C.H.
      • 罗C.F.
      • G.H.教堂
      鉴定虾白斑综合征病毒的核衣壳蛋白(VP35)基因及其对靶向昆虫细胞核核核的术语表征的特征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 萧H.H.
      • 回历王
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      虾白斑综合征病毒三十九结构蛋白的基​​因组和蛋白质组学分析。
      )。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8蛋白质组学研究鉴定的WSSV结构蛋白质概述。 概述了在本研究中确定的WSSV结构蛋白和两个早期的报告。 *,如“讨论”(19,23,40)所述的其他文献中识别的ORF。 下划线 ITRAQ研究也核实了ORF。 **,鉴定了58个结构蛋白,包括这三项研究鉴定的55种蛋白质,ITRAQ鉴定的WSV295和先前报道的VP35和VP15。
      传统的Western印迹分析和IEM已被用于确定病毒蛋白的定位。这些方法需要大量的工作,例如抗体的产生和表征。此外,其中一些结果是有争议的。例如,VP466由IEM作为包络蛋白确定,而Western Blot分析表明它是核衣壳蛋白(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 见Z.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒蛋白蛋白质组学分析及新颖封套蛋白VP466的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )。通过非定量MS分析通过成功分离包膜蛋白和核衣壳蛋白的困难来阻碍WSSV中蛋白质的精确定位。 Western印迹分析可以在核衣壳部分中检测包膜蛋白VP28和VP24的迹线。在本研究中,引入定量MS分析以根据其分布来区分病毒包膜蛋白和核衣壳蛋白并因此定位。正如我们所预期的那样,分别为包膜蛋白和核衣壳蛋白达到两种不同类型的ITRAQ报道离子谱(Fig. 5)。然而,由于包膜级分中存在溶解的核衣壳蛋白,一些ITRAQ比(116/114)的核衣壳蛋白(116/114)仅略高于115/114。这很可能是由于高盐处理期间渗透冲击引起的核衣壳蛋白的部分解离和分离过程(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      ,
      • 杜兰德S.
      • Lightner D.v.
      • 雷德曼R.M.
      • 博纳米J.R.
      白斑综合征Baculovirus(WSSV)的超微结构和形态发生。
      )。作为我们的方法的验证,基于ITRAQ比率的病毒虫中结构蛋白的本地化结果与先前的研究有关,其中包括11个包络蛋白和四种核衣壳蛋白(
      • 朱Y.
      • 谢X.
      • 杨F.
      虾白斑综合征病毒新型包络蛋白(VP124)基因的转录和鉴定。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      ,
      • 李H.
      • 朱Y.
      • 谢X.
      • 杨F.
      从虾白斑综合征病毒中鉴定一种新型包络蛋白(VP187)基因。
      )。新表征蛋白质中的七个含有预测的跨膜结构域,支持其作为包膜蛋白的分类(表IV)。我们的数据表明,即使无法获得无污染物的级分,也可以使用ITRAQ方法准确定位病毒结构蛋白的可行性。区分包膜和核衣壳蛋白没有完全分离的能力代表了病毒结构蛋白的定位中的显着提前。
      表IVWSSV中结构蛋白的定位
      不。名称加入否。TM值
      a TM值,跨膜结构域。
      PSORT
      b n,核; C,细胞质。
      位置在病毒赛中
      c e,信封; T,Tegument; NC,核衣壳。
      本地化方法替代名称和refs。
      小姐
      d 由ITRAQ检测的ITR; 1D,由1D凝胶检测到。
      WB
      e Western印迹。
      IEM
      1wsv001| 17158634TM值NEIEMWSSV-CLP(
      • 李Q.
      • 陈Y.
      • 杨F.
      鉴定白斑综合征病毒的胶原样蛋白基因。
      )
      2wsv002| 17158106TM值CE / T
      f 声称没有西方印迹结果的Tegument蛋白质(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )。
      ITRWB IEMVP24 (
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      3wsv006| 17158110TM值NEITR这项研究
      4wsv009| 17158113CEITR这项研究
      5wsv011| 17158115TM值CEITRWB VP53A(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      6wsv021| 17158125TM值CEITR这项研究
      7wsv035| 17158139TM值NEWB IEMVP110(
      • 李L.
      • 林S.
      • 杨F.
      白斑综合征病毒包膜蛋白(VP110)的表征。
      )
      8wsv037| 17158141NNC1DVP160B(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      9wsv077| 17158181CTWB VP36A(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      10wsv115| 17158219TM值CEITR这项研究
      11wsv143| 17158247NNCITR这项研究
      12wsv198| 17158302CEITR这项研究
      13wsv209| 17158313NEITRWB IEMVP187(
      • 李H.
      • 朱Y.
      • 谢X.
      • 杨F.
      从虾白斑综合征病毒中鉴定一种新型包络蛋白(VP187)基因。
      )
      14wsv214| 17158318NNCWB VP15 (
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      15wsv216| 17158320CEITRWB IEMVP124(
      • 朱Y.
      • 谢X.
      • 杨F.
      虾白斑综合征病毒新型包络蛋白(VP124)基因的转录和鉴定。
      )
      16wsv220| 17158324TM值CEWB VP674,VP73,VP76(
      • 黄R.
      • 谢Y.
      • 张J.
      • 石Z.
      参与白斑综合征病毒感染的新型包络蛋白。
      )
      17wsv230| 17158334CEITR这项研究
      18wsv237| 17158341CEIEMVP292(
      • 张X.
      • 黄C.
      • 唐X.
      • 庄Y.
      • 张孝C.L。
      用2DE-MS鉴定虾白斑综合征病毒(WSSV)的结构蛋白。
      )
      19wsv238| 17158342TM值CEITR这项研究
      20wsv242| 17158346CEITR这项研究
      21wsv254| 17158357CEITRWB IEMVP281,VP36B(
      • 黄C.
      • 张X.
      • 林Q.
      • 徐X.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒新颖封套蛋白(VP281)的表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      22wsv256| 17158359TM值CEITRWB VP51B(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      23wsv259| 17158362NEITRWB VP38A(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      24wsv271| 17158374NNCITR这项研究
      25wsv289| 17158391NNCITR,1DVP160A(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      26wsv295| 17158397NEITR这项研究
      27wsv306| 17158408NE / TITRWB VP39A(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      28wsv308| 17158410NNCITR,1DWB IEMVP466,VP51C(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      29wsv311| 17158413TM值CE / TITRWB IEMVP26 (
      • 张X.
      • 黄C.
      • 徐X.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒封套蛋白基因(P22)的转录和鉴定。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      30wsv321| 17158423TM值NEITR这项研究
      31wsv325| 17158427TM值NEITR这项研究
      32wsv339| 17158441NEWB IEMVP39 (
      • 朱Y.B.
      • 李H.Y.
      • 杨F.
      来自虾白斑综合征病毒的包络蛋白(VP39)基因的鉴定。
      )
      33wsv340| 17158442CEWB IEMVP31 (
      • 李L.
      • 谢X.
      • 杨F.
      编码包膜蛋白VP31的虾白斑综合征病毒基因的鉴定与表征。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      34wsv360| 17158462NNCITR,1DWB IEMVP664(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      ,
      • 列伊J.H.
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 回历王
      • 王C.H.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      白斑综合征病毒病毒虫的核衣壳中的独特堆叠环由主要结构蛋白VP664形成,该蛋白质蛋白质VP664是有史以来的最大的病毒结构蛋白。
      )
      35wsv386| 17158488TM值CEIEMVP68 (
      • 张X.
      • 黄C.
      • 唐X.
      • 庄Y.
      • 张孝C.L。
      用2DE-MS鉴定虾白斑综合征病毒(WSSV)的结构蛋白。
      )
      36wsv414| 17158516TM值CEWB VP19 (
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      ,
      • van Hulten M.C.
      • Westenberg M.
      • 祝大家S.D.
      • 火车J.M.
      抗白斑综合征病毒两种主要病毒蛋白基因虾的鉴定。
      )
      37wsv415| 17158517NNCITR,1DWB VP60B(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      38wsv421| 17158523TM值CEITRWB IEMVP28 (
      • 张X.
      • 黄C.
      • 徐X.
      • 张孝C.L。
      虾白斑综合征病毒基因的鉴定和定位编码包络蛋白。
      ,
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      39wsv432| 17158534NEWB IEM这项研究
      40wsv442| 17158543NE / TITRWB VP95 (
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )
      41wsv493| 17158594NNCWB VP35 (
      • 陈L.L.
      • 列伊J.H.
      • 黄C.J.
      • 周C.M。
      • 陈S.M.
      • 王C.H.
      • 罗C.F.
      • G.H.教堂
      鉴定虾白斑综合征病毒的核衣壳蛋白(VP35)基因及其对靶向昆虫细胞核核核的术语表征的特征。
      )
      42wssv349| 19481941TM值CEITR这项研究
      a TM值,跨膜结构域。
      b n,核; C,细胞质。
      c e,信封; T,Tegument; NC,核衣壳。
      d 由ITRAQ检测的ITR; 1D,由1D凝胶检测到。
      e Western印迹。
      f 声称没有西方印迹结果的Tegument蛋白质(
      • 蔡J.M.
      • 王H.C.
      • 列伊J.H.
      • 回历王
      • 庄Y.
      • 沃克P.J.
      • G.H.教堂
      • 罗C.F.
      鉴定虾白斑综合征病毒病毒素的核衣壳,Tegument和包络蛋白。
      )。
      WSV143和WSV271是两个新鉴定的核蛋白质蛋白。 DNA微阵列数据证明WSV143是一种早期基因,其与其作为转录因子的潜在功能一致(
      • 王H.C.
      • 林A.T.
      • Yii的D.M.
      • 常Y.S.
      • G.H.教堂
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      白斑综合征病毒基因组的DNA微阵列:在感染虾的鳃中表达的基因。 Mar.Biotechnol。 (.
      )。阐明该蛋白质的功能应有助于揭示病毒复制的机制。尽管WSV143和WSV271含有KGD或RGD基序,但是对于细胞粘附,但它们的可能性不太可能具有这样的函数,因为它们在核衣壳中局部地定位。此外,我们还发现所有九核衣壳蛋白被Psort搜索预测靶向核,并且不含任何由致密对准表面预测的跨膜结构域,这意味着大多数核衣壳蛋白需要这两个标准。总结了WSSV结构蛋白的所有已知定位 表IV.
      在目前的调查中,使用霰弹枪和ITRAQ技术实现了WSSV组分的更全面的蛋白质组学分析及病毒群岛的本地化。我们的结果表明,ITRAQ是一种有效的基于MS的方法来区分包膜和核衣壳蛋白。这种方法还应适用于研究其他包膜病毒的蛋白质定位。总之,WSSV由至少58个结构蛋白组成,其中由霰弹枪蛋白质组学鉴定的13个病毒蛋白质,并且在本研究中鉴定的病毒蛋白。在这些结构蛋白中,测定33个包膜蛋白和九核蛋白质的定位,包括12个包膜蛋白和我们的ITRAQ研究鉴定的两个核衣壳蛋白。我们的研究结果可以提供新信息,以研究病毒组装和病毒进入的分子机制。

      致谢

      我们感谢所有新加坡国立大学生物科学系蛋白质和蛋白质组学中心的所有员工,用于提供抗VP24抗体的技术支持和莹庄。

      补充材料

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