电子转移解离质谱的性能特征*

  • 大卫M. Good.
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    威斯康星州麦迪逊大学化学系53706
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  • 马修维拉拉
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    威斯康星州麦迪逊大学化学系53706
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  • Graeme C. Mcalister
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    威斯康星州麦迪逊大学化学系53706
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  • 约书亚J. Coon.
    一致
    应该解决对应的通信:部门。化学与生物分子化学,1101大学大学,威斯康星大学,麦迪逊,WI 53706。电话:608-263-1718;
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    威斯康星州麦迪逊大学化学系53706

    威斯康星州麦迪逊大学生物分子化学系53706
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  • 作者脚注
    *这项工作部分得到了威斯康星大学 - 麦迪逊,热门渔民和国家卫生研究院的支持1R01GM080148(对J. J. C.)。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
    §由国家卫生研究院支持盗窃奖学金(生物技术培训计划授予NIH 5T32GM08349)。
      我们对电子转移解离(ETD)性能进行了大规模的研究,与离子阱碰撞激活的解离(CAD)相比,用于从〜1000至5000Da的肽(n〜4000)。这些数据表明两种方法之间的肽标识中的重叠相对较少(〜12%)。 ETD表现出大于2的所有电荷状态的CAD;然而,无论前体电荷如何,零份碎裂百分比百分比,作为增加前体的函数m/zm/z天花板。最后,我们评估了ETD实验的离子密度(阴离子和阳离子)和反应持续时间的作用。这些数据表明,当离子阱与阴离子试剂填充到其空间电荷限制时,实现了最佳性能。在迄今为止的ETD的最大规模研究中,ETD继续表现出推进蛋白质组学领域的巨大希望,并且对于中小型肽,对离子捕集CAD具有高度互补的。
      电子转移解离(ETD),
      使用的缩写是:ETD,电子转移解离; CAD,碰撞激活解离; PTM,翻译后修改; LTQ,线性四极轴离子阱; eteld,补充激活; AGC,自动化增益控制; CI,化学电离; DTA,数据(文件名扩展名); NCI,负化学电离; gdmhcl,盐酸胍; ET,电子转移。
      1使用的缩写是:ETD,电子转移解离; CAD,碰撞激活解离; PTM,翻译后修改; LTQ,线性四极轴离子阱; eteld,补充激活; AGC,自动化增益控制; CI,化学电离; DTA,数据(文件名扩展名); NCI,负化学电离; gdmhcl,盐酸胍; ET,电子转移。
      一种相对较新的肽/蛋白质碎裂方法,具有推进蛋白质质谱(
      • Coon J.J.
      • Syka J.E.P.
      • Shabanowitz J.
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      肽和蛋白质序列分析的串联质谱。
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      用离子/离子化学推进蛋白质组学。
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      • 狩猎d.f.
      ETD质谱法在蛋白质组学分析中的效用。
      )。与常规技术相比,碰撞激活的解离(CAD),ETD提供了一种更强大的方法,以表征翻译后修饰(PTMS)并询问大肽甚至全蛋白质(
      • Coon J.J.
      • Ueberheide B.
      • Syka J.E.P.
      • Dryhurst D.D.
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      使用顺序离子/离子反应和串联质谱法鉴定蛋白质鉴定。
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      阴离子依赖于离子/离子反应中质子和电子转移之间的分区。
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      通过电子转移解离质谱法分析肽和蛋白质序列分析。
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      通过电子转移离子/离子反应和碰撞诱导的解离互补的N-连接糖肽的互补结构信息。
      )。由于这些属性以及它产生C-和Z型产品的事实,而不是B-AND Y型,许多建议ETD对CAD具有高度互补的。当然,ETD反应通常在离子陷阱质谱仪的范围内进行,其中顺序CAD和ETD实验易于进行。然而,大多数蛋白质组学的实验与在线色谱分离相结合,并且每个肽的分析时间非常明显最小化以增加动态范围(
      • Ferguson P.L.
      • 史密斯r.d.
      质谱分析蛋白质组分析。
      )。因此,为了从给定的实验中提取最多的信息,了解这两个解离技术如何彼此互补的方式是至关重要的。
      由于CAD已被广泛研究了几年,大多数MS蛋白质组学从业者都有良好的方式最佳利用该方法(
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      脯氨酸B气相离子结构研究2 ion.
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      低能量CID肽解离模式的电荷状态和残余物依赖性的统计表征。
      )。例如,胰蛋白酶是基于CAD的串联MS方法的选择的酶。将蛋白质C-末端裂解到Lys或Arg残留物确保所得肽是相对较短的(〜10-15个残基),并且它们不含内部碱性残留物,其可以预防随机骨架质子化,并最终成功测序。然而,许多PTM在CAD条件下特别是不稳定的;事实上,ETD最初是开发的,以实现蛋白质磷酸化的大规模表征(
      • Syka J.E.P.
      • Coon J.J.
      • Schroeder M.J.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      通过电子转移解离质谱法分析肽和蛋白质序列分析。
      )。除了考虑到其PTM表征的价值还是高群种的询问,还有很少的ETD工程。
      最近的几项研究表明ETD对于肽DICES的解离来尤其无效(
      • Pitteri S.J.
      • Chrisman P.A.
      • Hogan J.M.
      • Mcluckey S.A.
      三维四桥离子阱中的电子转移离子/离子反应:双重和三重质子肽的反应 .
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      • Pitteri S.J.
      • Chrisman P.A.
      • Mcluckey S.A.
      双质子化肽的电子传递离子/离子反应:升高的浴气体温度的影响。
      )。最近在我们自己的实验室工作确认了这一点,但也揭示了一些有趣的趋势(
      • Swaney D.L.
      • Mcalister G.C.
      • Wirtala M.
      • Schwartz J.C.
      • Syka J.E.P.
      • Coon J.J.
      双质子肽前体高效电子转移解离的补充活化方法。
      )。例如,无论前体如何 m/z 值,双质子化前体阳离子很少产生互补产品离子对。然而,观察到的C-和Z型产物离子的数量与越来越多的前体线性降低 m/z 适用于所有肽DICACES。通过应用补充碰撞激活步骤(ETCAD)来弥补这个问题(
      • Swaney D.L.
      • Mcalister G.C.
      • Wirtala M.
      • Schwartz J.C.
      • Syka J.E.P.
      • Coon J.J.
      双质子肽前体高效电子转移解离的补充活化方法。
      ),通过先前的激活离子电子捕获解离的报告(
      • 喇叭d.m.
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      激活的离子电子捕获较大(42kDa)蛋白质质谱序列的解离。
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      通过电子捕获解离的气态泛素离子的详细展开和折叠。
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      • 喇叭d.m.
      • Breuker K.
      • 弗兰克A.J.
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      通过电子捕获解离质谱法的气态蛋白离子折叠的动力学中间体。
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      • Tsybin Y.O.
      • 威特M.
      • Baykut G.
      • Kjeldsen F.
      • 哈基森P.
      结合红外多光子解离和电子捕获与傅里叶变换离子回旋谐振质谱法中的中空电子束解离。
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      • Mihalca R.
      • van der burgt y.e.m.
      • McDonnell L.A.
      • Duussma M.
      • Cerjak I.
      • heck a.j.r.
      • heeren r.m.a.
      使用傅里叶变换离子回旋谐振质谱法中的共线和重叠光束组合红外多光子解离和电子捕获解离。
      )。在这里,我们询问前体阳离子是否更高的充电状态(IE。 ≥3)显示ETD碎片的类似趋势,如果是这样,ETCAD是有效的补救措施?为了回答这些问题,我们检查了ETD的表现,用于组复杂混合物的小于中小型未经修饰的肽的表征(IE。 由胰蛋白酶或Lys-C产生的那些。顺序串联MS事件用于在ETD和离子阱CAD碎片之间切换。来自这些数据集,我们确定了两种方法的互补程度和整体性能。通过前体质量,电荷和/或长度分类ETD鉴定的肽,并检查了观察到的碎裂百分比。最后,我们评估了几种ETD参数的作用及其对所得串联质谱的影响,包括阴离子和阳离子群体的大小和反应持续时间。

      实验步骤

       样品制备-

      酵母(“野生型”S288C应变,α配合型,二倍体, Suc2 Mal MEL GAL2 CUP1)在酵母氮气基(Difco)上培养,没有氨基酸和硫酸铵,含有2%葡萄糖。将溶液在30℃下保持并摇动过夜。在〜18小时后,将该溶液转移到Fernbach瓶中,在30℃下摇动〜18h。将所得溶液旋转并用去离子水洗涤,裂解缓冲液(50米m TRIS基地,0.3 m sucrose, 5 mm Na2EDTA,1米m EDTA-free acid, 1 mm PMSF from 100 mm 加入异丙醇原料,用HCl的pH至7.5)。对于裂解,将酵母细胞以1分钟间隔超声处理〜3分钟。使用离心(〜2000和〜100,000×粒化细胞器和膜 g, 分别)。在丙酮沉淀后,可溶性蛋白质在6中重新溶解 m 盐酸胍(GDMHCL)。蛋白质提取物同等等分并用胰蛋白酶(1 m GDMHCL在pH〜8处〜18 H)或Lys-C(0.5 m gdmhcl在pH〜8处~18 h)。 拟南芥 生长植物,如上所述制备全细胞裂解物。如上所述对酵母概述进行胰蛋白酶和Lys-C消化(
      • Swaney D.L.
      • Mcalister G.C.
      • Wirtala M.
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      双质子肽前体高效电子转移解离的补充活化方法。
      )。

       色谱 -

      酵母和 拟南芥 将摘要装载到分开的360×75-μm单片微毛细管预先训练(Lichrosorb Si60,EM分离技术,Gibbstown,NJ)上,并在倒联 - 阶段C中包装18 material (Alltima C18 来自Alltech Associates,Inc.,Deerfield,IL的5-μm珠子)。每个倒阵线都有一个单独的360×50μm微小柱,再次用反向相c包装18 用Teflon®管的对接接头进行材料。这些列具有由其他地方所述的激光拉拔器(Model P-2000,Sutter Instructs Co.,Novato,CA)创建的集成ESI提示(
      • 马丁斯。
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      • 玛托J.A.
      使用纳米HPLC微安微安傅里叶变换离子回旋谐振质谱法分析SubFemtomole MS和MS / MS肽序列分析。
      )。在样品加载(总肽的〜5-10pmol)后,肽是梯度洗脱的(2-H梯度;型号1100,安捷伦技术,PALO ALTO,CA)直接进入ETD的线性离子阱质谱仪(FINNIGAN LTQ ,Thermo Fisher,San Jose,CA)。

       质谱-

      修改Finnigan LTQ以接受与工厂纳米Pray源相对的装置后部的化学电离(CI)源。负CI用于产生氟的根部阴离子,其通过由气相色谱仪和加热的转移线(SRI仪器,托兰氏菌,CA)组成的批入口引入。一旦在CI源中,如前所述通过电子捕获电离荧蒽中性分子(
      • Coon J.J.
      • Syka J.E.P.
      • Schwartz J.C.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      阴离子依赖于离子/离子反应中质子和电子转移之间的分区。
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      • Syka J.E.P.
      • Coon J.J.
      • Schroeder M.J.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      通过电子转移解离质谱法分析肽和蛋白质序列分析。
      )。 LTQ还适于将射频捕获电压施加到线性离子阱的端部镜头。通过在径向(施加到四极杆)中的射频电压和轴向(施加到端透镜)方向上,无需额外的直接电流偏移,相反电荷的离子可以同时捕获在同一空间中(IE。 充电标志无关的诱捕)。首先首先将肽阳离子引入线性捕集器的前部,分离,然后储存,而荧光阴离子通过后部引入捕集器。启用ETD的FINNIGAN LTQ将CI源和LTQ之间的四极性质量滤波器置于选择性地注入氟蒽的根本阴离子(m/z 202)。通过使用集成的自动增益控制(AGC)功能来调节阴离子和阳离子群体。写入数据依赖性采集方法以通过离子捕集CAD和ETD(两个单独的顺序事件)从每个全MS扫描识别,以询问五个最强烈的前体离子。对于CAD,AGC靶标被设定为注射〜40,000个肽阳离子。在a中完成解离 q 值为0.25,能量为35%(归一化碰撞能量),适用于30毫秒(单扫描)。对于ETD,前体阳离子AGC靶标设定为80,000,而价值100,000用于阴离子群。离子/离子反应持续时间固定在80ms。
      结果数据文件用于创建DTA文件,然后通过碎片方法分隔, IE。 CAD或ETD。使用开放质谱搜索算法进行数据库相关性(在国家生物技术信息中心(NCBI),国家健康机构,Bethesda,MD)(
      • geer l.y.
      • 马克S.P.
      • Kowalak J.A.
      • 瓦格纳L.
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      • Maynard D.M.
      • 杨X.Y.
      • shi w.y.
      • 布莱恩特S.H.
      开放质谱搜索算法。
      )。所有搜索都是作为生物和酶特异性的酵母的非冗余文库进行 拟南芥 由NCBI提供。产物离子质量耐受设定为±0.5Da,前体离子质量耐受性为±1.2Da,并且没有充电的前体质量耐受性的缩放。对于随后的手动检测,概率分数的返回匹配分数小于0.01的匹配。检查所有简短列出的序列是否适合贴合性:如果通过所提出的序列无法手动解释主要产品离子,则拒绝鉴定。

      结果

       ETD与离子陷阱CAD的全局比较

      顺序ETD和CAD分析, IE。 以数据依赖性方式进行背对背串联MS事件,以衍生自多种复杂混合物的肽,当它们从反相色谱分离中洗脱时衍生自多种复合混合物。来自这些分析3287个独特的肽(使用连接前进和逆转数据库搜索0.48%假阳性/负速率(
      • eliasj.e.
      • Gygi S.P.
      目标 - 诱饵搜索策略通过质谱法对大规模蛋白质鉴定的置信度提高。
      ))通过使用自动数据库相关算法来识别(打开质谱搜索算法;期望值截止为0.01),并且通过手动检查每次进行单独确认。在物种中比较所有鉴定的肽(例如 与从胰蛋白酶消化中鉴定的那些进行比较从Lys-C消化中鉴定的酵母肽),并且如果存在几匹配,则仅向总数计数一个匹配项。这对于每个生物体仅为每种独特的氨基酸序列保险。在相应的ETD和CAD光谱中鉴定了3287个独特的肽测序,1301和1986;但是,要考虑前体电荷的影响(z),允许对相同氨基酸序列的多种肽鉴定给出,因为衍生自不同的前体电荷状态。这些标准扩展了取样肽的数量(或更准确,唯一前体的数量 m/z 值表征为3866,具有电荷状态和重叠的相对分解 表I. (有关完整列表,请参阅补充数据)。
      表I.通过前体电荷状态和碎片方法对总肽标识(IDS)分类
      前体充电状态通过离子陷阱CAD鉴定的肽通过ETD确定的肽不。重叠ID
      +1500
      +2122466
      +3698946362
      +413032486
      +58596
      +6060
      全部的20651341460
      在这些技术激活后发现的肽中观察到令人惊讶的少量重叠,仅〜12%(Fig. 1)。检查 表I.但是,揭示了一些预期的趋势。首先,我们注意到CAD以双质原料的前体表现最佳,与ETD的六个相比,产生1224个独特的序列。该数字代表了来自CAD光谱的所有识别的近一半。另一方面,ETD,除了以下的每种充电状态下,来自Triply质子化前体的独特序列,并且在每个充电状态下 z = 1或2.使用ETD鉴定了多种更高的电荷肽,但是三个质子化前体构成了大多数(359个肽 z > 4). From 表I.,ETD的无法能够有效解离肽DICACES是可触及的。最近,我们的小组报告了使用ETD来解散双重质子化肽(
      • Swaney D.L.
      • Mcalister G.C.
      • Wirtala M.
      • Schwartz J.C.
      • Syka J.E.P.
      • Coon J.J.
      双质子肽前体高效电子转移解离的补充活化方法。
      )。与离子捕集CAD(用于肽DIGETY)相比,我们发现ETD即使在观察到高碎裂效率的情况下,ETD也很少导致互补产物离子对。然而,从研究的755个肽解毒剂,对前体的强烈依赖 m/z was observed (
      • Swaney D.L.
      • Mcalister G.C.
      • Wirtala M.
      • Schwartz J.C.
      • Syka J.E.P.
      • Coon J.J.
      双质子肽前体高效电子转移解离的补充活化方法。
      )。增加前体 m/z 与百分比碎片和肽序列覆盖率百分比的线性降低相关。对于包括ETD的基于电子的碎片方法,递减百分比碎片化伴随着从直接解离(ETD,形成C-和Z型产物离子)的分配,以减少没有破碎的(非分离)(
      • Pitteri S.J.
      • Chrisman P.A.
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      三维四桥离子阱中的电子转移离子/离子反应:双重和三重质子肽的反应 .
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      构象对泛素电子捕获解离的作用。
      )。在这里,我们询问了电荷3或更高的肽前体阳离子是否存在类似的趋势;而且,如果是的话,前体阳离子的属性导致成功的ETD结果?
      图缩略图GR1.
      Fig. 1在测序的3866个总肽中,从离子捕集CAD和ETD的标识中只有〜12%的重叠。
      检查电荷和前体的影响 m/z, 鉴定的肽的零碎片百分比(如概述 表I.比较CAD和ETD碎片的比较。因此,百分比被定义为观察到的C-和Z型片段离子的数量,用于给定序列,除以理论离子离子数(例如 10-残基肽可产生18个C-和Z型片段离子)。虽然通常用基于电子的碎片方法观察到不观察到,但是将N-末端脯氨酸切割包含为可能的碎片通道(
      • Zubarev R.A.
      • Kelleher N.L.
      • MLEFFERTY F.W.
      电子捕获乘法蛋白阳离子的捕获解离。一个非精通过程。
      )。 Fig. 2 绘制3866个独特的识别前体中的每一个 m/z 值并显示每个观察到的折痕折痕。从这些数据中,我们注意到ETD的引人注目的趋势:颅骨百分比随着前体的增加而导致线性降低 m/z 无论前体电荷如何。有很少有前体的肽 m/z 通过ETD碎片鉴定超过〜850的值,可能是由于缺乏足够数量的C-和Z型产品离子,用于成功的数据库相关性。注意,来自离子陷阱CAD光谱也观察到类似但很多副标题。对于具有至少3个和至少3个电荷的肽前体离子 m/z 高达〜850,ETD高效,诱导百分比较高的碎片值百分比,而不是离子阱CAD。这是显而易见的来自所呈现的数据 Fig. 2 从所有电荷状态的较高的鉴定肽大于2。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2折碎百分比(观察到的片段离子/理论片段离子的数量)高度依赖于前体 m/z,特别是对ETD。 这里绘制的是作为前体的函数的每个鉴定的肽的计算百分比片段化 m/z,碎片方法和充电状态。
      从某种意义上说,上述数据表明存在前体的存在 m/z 成功的ETD活动的天花板。去除或至少提高的步骤,这一天花板将需要良好地理解负责任的前体阳离子特征。数据来自 Fig. 2 只考虑前身 m/z,但我们假设其他前体阳离子属性如肽长度,电荷分布和总质量可能是相关的球员。为了检查这些参数,我们通过长度对独特的ETD鉴定的肽进行分类,并计算每种前体电荷(残留/电荷)的氨基酸残基的比率。 Fig. 3, 小组A.,显示作为具有3,4和5的前体的残留物/电荷的函数绘制的每种肽的替补百分比曲折。 Fig. 3, 面板B-D,单独显示这些充电状态系列。从这些数据来看,我们观察到残留物/充电比率与碎片百分比之间的优异相关性。对于给定的残余物/电荷比,前体电荷几乎没有对ETD结果产生影响。注意,与其他人相比,PentoLy充电系列显示出略有降低的碎片折痕;但是,我们怀疑这是低的文物 m/z 分辨率和有限公司 m/z 质量分析仪的范围,而不是ETD。接下来,我们通过首先通过前体电荷和第二长度分选独特鉴定的肽来检查肽质量的作用。在这里,我们保持肽长度和前体电荷恒定,基本上固定残留物/电荷的比率,以测试重度氨基酸是否存在,例如降低观察到的碎裂百分比。 Fig. 3, 面板E-H,分别显示出11-,14-,16-和18个残基肽的结果。对于给定残留物/电荷比的肽,肽质量与碎裂百分比之间没有相关性;相反,前身之间的关系 m/z 和百分比碎片显示 Fig. 2 质量和氨基酸计数的相关性(IE。 大多数11-残基肽仅在10-30%的质量下变化。从这些数据来看,我们建议残留物/费用的比例是确定成功ETD结果的主要因素。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3残留/电荷比是确定成功ETD结果的主要因素。面板A-D 显示百分比碎片(通过ETD)的降低,因为残留物/电荷的比率对于具有3,4和5的电荷的前体阳离子的比率。虽然碎裂百分比百分比迅速降低,序列覆盖率百分比(骨干键的数量裂解/数量骨干债券)受影响较小(面板E-H)。 面板I-L 表明总质量(用于固定残留物/电荷比)对百分比碎片影响效果较小。这 虚线面板B-H 是引导眼睛。
      上面详述的ETD的假设是前体离子的相对强度不会从一个扫描到下一个扫描基本上改变。每个扫描事件都持续到~350毫秒,远短比平均色谱峰宽度为约20秒;但是,为了确保此假设有效,我们使用ETD或CAD执行了两种附加数据相关分析,其中包含背对背顺序串联MS。 IE。 ETD,然后是ETD或CAD,然后是CAD的酵母胰蛋白酶消化。检查光谱质质量的变化,我们与自己和随机选择的串联MS光谱相关伴侣谱(DOT产品方法, n = 100 for each) (
      • Stein S.E.
      气相色谱/质谱数据光谱萃取和化合物鉴定的集成方法。
      )。利用该算法,在1.0处得分完全相同的光谱,而分数为0.0表示不守恒。由相同前体的分离但是连续扫描产生的光谱的相关评分为CAD的0.87±0.03,ETD为0.92±0.02,表明顺序串联MS事件之间的高度相似性。与列表中的所有其他光谱相比,频谱的平均相关评分除了自身及其伴侣之外,ETD的0.25±0.01,CAD为0.30±0.01。使用学生 t 测试,与除了自身及其伴侣的所有其他外,将连续光谱(合作伙伴)的平均相关评分进行比较。比较导致了 t CAD的值为33.3,ETD的60.0,它们均远远超出可接受空假设的值范围;因此,通过碎片方法的连续分离和相同前体的碎片产生的光谱相似性与碎裂方法产生的统计学显着差异,以及由不同前体的分离产生的那些 m/z 价值观。简而言之,连续的解离事件为ETD和CAD型碎片产生高度相似的产品离子光谱(参见 补充图1 for examples).

       提升ETD前体M / Z限制 -

      我们的观察结果与非共价相互作用降低ECD碎片效率的概念一致(
      • 喇叭d.m.
      • Breuker K.
      • 弗兰克A.J.
      • MLEFFERTY F.W.
      通过电子捕获解离质谱法的气态蛋白离子折叠的动力学中间体。
      )。随着残留物/电荷的比例增加,这种相互作用增加, IE。 低电荷密度均匀诱导更折叠的阳离子结构,即使在骨干键裂解后,也可以通过非共价相互作用保持束缚。一种破坏非共价相互作用的一种方法,从而提高ECD碎片效率,通常具有碰撞或光子,在电子捕获期之前或期间的阳离子前体物种(
      • 喇叭d.m.
      • GE Y.
      • MLEFFERTY F.W.
      激活的离子电子捕获较大(42kDa)蛋白质质谱序列的解离。
      ,
      • Breuker K.
      • 哦,H.B.
      • 喇叭d.m.
      • Cerda B.A.
      • MLEFFERTY F.W.
      通过电子捕获解离的气态泛素离子的详细展开和折叠。
      ,
      • 喇叭d.m.
      • Breuker K.
      • 弗兰克A.J.
      • MLEFFERTY F.W.
      通过电子捕获解离质谱法的气态蛋白离子折叠的动力学中间体。
      )。然而,电子转移反应在压力〜6级的压力下发生,其中通过快速碰撞冷却否定加热的影响或在反应期间的效果。相反,我们最近实现了一种针对温和碰撞激活(ETCAD)的非解离电子转移产品的方法(
      • Swaney D.L.
      • Mcalister G.C.
      • Wirtala M.
      • Schwartz J.C.
      • Syka J.E.P.
      • Coon J.J.
      双质子肽前体高效电子转移解离的补充活化方法。
      )。发现这种方法仅仅将肽DIPTIES的电荷还原ET产物分开,可能是通过扰乱培养的非共价键,高效(〜80%)来转化为C-和Z型产物离子。 ETCAD的自动实施据临近双质子化肽前体的碎片百分比显着增加(n = 755),导致平均百分比序列覆盖率(89%),其具有离子阱CAD(77%)。
      在这里,我们将ETCAD作为提升前体的可能途径 m/z 更高电荷前体阳离子的限制。 Fig. 5, 面板A-C,显示ETD产物离子光谱,由标准肾上腺皮质激素激素肽阳离子分散,分别具有6,5和4的电荷。与绘制的大规模数据集一致 Fig. 2,直接C-和Z型产物离子形成(未标记峰)的程度随着前体的增加而降低 m/z (分别为57,39和26%的碎片)。还注意了非分离产物离子的增加。为了测试我们的假设,我们隔离并轻轻牢固地激活了未加入的双电子传输减少的产品离子([M + 4H] 2+··)二次充电的前体阳离子。 ETCAD导致形成广泛的C-和Z型产物离子,得到65的零碎百分比,增加了+6前体的已经好的ETD性能(Fig. 4, 小组A.)。从这些结果来看,我们得出结论,ETCAD是一种可行的方法,以提高预料3或更高的前体阳离子的ETD碎片效率。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5阳离子和阴离子群体的大小可以基本上影响最佳ETD反应时间。 在这里,我们绘制了通过不同尺寸的阳离子和阴离子群体观察到最大产品离子群的反应持续时间(MS)。随着试剂阴离子的群体增加,达到最大产品离子强度的时间降低;然而,这种趋势在达到离子阱的阴离子存储容量限制时关闭(本实验中的~200,000)。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4ETD离解的24-残基肾上腺皮质激素肽的+6,+5和+ 4个电荷状态(面板A., B, 和 C分别示出了。注意直接碎片化与未降低前体电荷的非分离等的划分。将温和的碰撞活化步骤施加到分离的非分离的ET产物中,[M + 4H]++··,导致C / Z型产品的独家形成(小组D.)。
      对于具有3或更高指控的前体阳离子的自动实施具有一些挑战。例如,会有 z − 1 (z =前体电荷)电荷减少,非解离产品离子以ETCAD激活。当然,具有3或更高的前体阳离子将具有至少两种靶向随访激活。激活多种物种不一定是一个问题;但是,确定非分离的目标 m/z 价值观要求 先验 前体充电状态知识。在低分辨率离子陷阱仪器上,获得此类知识可能需要额外的调查扫描。为了获得最高效率,不应执行单个电荷减少峰的隔离;无需消除直接从电子转移形成的C和Z型产品或丢弃非分离产物物种。通过这些数据,我们已经开始工作以自动实现ETCAD以获取所有充电状态的前体。

       ETD参数评估 -

      电子转移离解导致乘法带电前体阳离子与适当的阴离子试剂的反应,通常在四极离子阱的范围内进行。 ETD的最佳性能强烈依赖于离子群(阳离子和阴离子),前体和试剂分离(在反应之前)和反应持续时间。在这里,我们检查这些变量中的每一个及其对ETD结果的各自影响。
      ETD上的大多数已发表的作品使用负化学电离(NCI)来源用于试剂阴离子一代(
      • Coon J.J.
      • Syka J.E.P.
      • Shabanowitz J.
      • 狩猎d.f.
      肽和蛋白质序列分析的串联质谱。
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      • 好D.M.
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      用离子/离子化学推进蛋白质组学。
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      • Syka J.E.P.
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      ETD质谱法在蛋白质组学分析中的效用。
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      阴离子依赖于离子/离子反应中质子和电子转移之间的分区。
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      )。然而,产生阴离子,关键要求是它们具有高倾向赋予前体阳离子而不是抽象质子。多芳烃,如氟蒽,在这方面表现出良好的性能(
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      电子转移与质子转移在聚脯氨酸肽的气相离子/离子反应中。
      )。例如,在NCI源中形成氟基团阴离子,通常会伴随着背景阴离子的形成,其中许多含有质子转移离子/离子化学。因此,ETD实验的关键步骤是试剂阴离子群的纯化。这里使用的多条计的QLT系统利用四极性质量滤波器来将来自NCI源的选定的阴离子传输到QLT。这种操作可防止低水平阴离子污染物降低具有质子转移侧反应的表观电子转移效率(
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      离子/离子质子转移动力学:对蛋白质混合物电喷雾器分析的影响。
      )。
      扫描时间和占空比是大多数蛋白质组学实验的关键图,特别是在进行与数据依赖性串联MS的在线分离时,需要快速扫描时间来充分样品共同洗脱肽(
      • Aeberberold R.
      基于质谱的蛋白质组学。
      )。理想情况下,ETD反应迅速完成(<50毫秒)并且具有足够的效率,以便不需要光谱平均值。首先,我们评估了离子密度和离子/离子反应持续时间在下游光谱质量和扫描时间的作用。 Fig. 5 显示离子密度(阳离子和阴离子)对ETD反应速率的影响,以进行三重质子化前体阳离子的解离。该图绘制了给定阴离子和阳离子群(由AGC控制的最大产品离子强度的反应持续时间。从公开的离子/离子率模型预期,增加阴离子密度降低所需的反应持续时间(
      • Stephenson J.L.
      • Mcluckey S.A.
      气相中的离子/离子反应:涉及倍增蛋白的质子转移反应。
      )。然而,在实践中,空间电荷效应限制了陷阱的离子容量(
      • Cox K.A.
      • cleven c.d.
      • 厨师r.g.
      在较高分辨率下在四极离子阱中观察到的质量换档和局部空间电荷效应。
      )。这些数据表明,此阈值以A200,000的AGC目标值达到达到;未经调遣时间的明显降低超过此量。三种阳离子AGC靶值中的每一个导致检查阴离子密度的几乎相同的最佳反应持续时间。从这些数据中,我们得出结论,一旦建立了多余的试剂阴离子,阳离子密度的略有变化可以忽略不计(使用大于〜20,000的阳离子AGC目标值不实际;见下文)。接下来,我们认为在更长的阴离子注入时间(高AGC值所需)之间的权衡 相对 所得缩短的反应持续时间。 Fig. 6 显示总离子/离子实验时间(最佳反应时间和阴离子注射时间的和)作为阴离子AGC目标值的函数。在很大程度上由于来自NCI源的高通量的阴离子通量,对反应速率提高的益处大大超过了与更高阴离子AGC目标值相关的阴离子注射周期的略高。注意,离子/离子反应速率高度依赖于前体电荷;在我们的实验室目前正在进行工作以确定所有充电状态的最佳反应时间。无论前体电荷如何,这些数据表明,当离子阱在其阴离子空间充电容量或接近其接近的阴离子空间充电容量时,实现了最佳ETD性能。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6作为阴离子AGC目标值的函数,总离子/离子实验时间(最佳反应持续时间和阴离子注射时间的总和)。 这些数据表明,增加反应速率的益处超过了构建更大的阴离子群所需的略微提高的阴离子注入持续时间。
      QLT中存储(阴离子)的空间电荷限额远高于质量分析(阳离子)(
      • Schwartz J.C.
      • Senko M.W.
      • Syka J.E.P.
      二维四极离子阱质谱仪。
      )。阳离子种群的幅度至关重要:太多将产生空间充电相关的质量偏移,而太少将导致低产品离子强度,并且可能需要光谱平均值(Fig. 7)。 Fig. 7, 面板B-D,显示单扫描ETD串联质谱(DRVyihPFH1)的AGC阳离子靶群分别为5000,80,000和140,000。在低目标值上收集的光谱(Fig. 7, 面板B.)特征在于定义的同位素簇峰值差,需要光谱平均。具有较大目标群体的操作产生了更高质量的单扫描光谱(Fig. 7, 板C.D);然而,空间电荷相关的质量偏移变得明显。 Fig. 7, 小组D.,显示A. 插入 of the c2 生产 m/z 八个不同阳离子AGC目标值的区域。对于我们的工作,我们选择使用AGC目标设置~80,000。这种操作通常产生高质量的单扫描ETD光谱,具有小于0.2的C-和Z型产品离子偏移量 m/z 单位。注意,在进行CAD型碎片时,存在谱质量和空间电荷引起的质量偏移之间的类似权衡;然而,由于ETD由离子/离子反应结果,所以最佳目标值较大(与CAD相比的2-3次),并且高度依赖于反应持续时间和调节的阴离子群。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7显示的是三级质子化肽DRVyiHPFHL的单扫描ETD产物离子质谱,由100ms反应与固定的试剂阴离子(100,000)的反应,具有不同的前体阳离子群(小组A.,5000; 面板B.,80,000; 面板C.,140,000)。 小组D. 显示 m/z C2片段的区域(m/z 289.16)产生不同阳离子前体群(5000-140,000)。注意在5000个前体目标值和较高阳离子群体的空间电荷诱导的质量偏移中定义了不良的同位素簇。

      讨论

      随着多种ETD的商业MS系统的发展,迫使各种蛋白质组学应用的ETD广泛实施。与CAD碎片不同,最佳电子转移反应需要密切关注许多参数。在这些参数中,我们证明阴离子纯度,阳离子和阴离子AGC靶值,以及离子/离子反应持续时间是最关键的。我们还对中小型肽序列分析进行了对ETD性能的大规模研究。这些结果表明离子捕集CAD和ETD(〜12%)之间的肽鉴定中的相对较少的重叠。 ETD表现出大于2的所有电荷状态的CAD;然而,无论前体电荷如何,用ETD碎片观察到碎片百分比的线性降低。我们的数据表明,在每次充电的残留物的百分比和残留物的比例之间存在直接相关性。随着该数量的增加,分子内非共价相互作用的概率可以结合新形成的C / Z型离子对。我们应用了最近开发的补充活化方法(ETCAD)来通过将非分离的等产物离子转化为有用的C-和Z型离子来弥补该问题。自动实施此类方法应消除这种明显的前体 m/z 天花板。在迄今为止的ETD的这种规模研究中,ETD仍然表现出推动蛋白质组学领域的巨大承诺。目前,我们得出结论,ETD至少为CAD提供高度互补的CAD方法,用于肽序列分析。

      致谢

      我们感谢迈克尔Sussman,阿德里安·赫皮曼和Edward Huttlin准备了 拟南芥 复杂的蛋白质混合物和Don Hunt和Dina Bai用于使用扫描分拣软件。最后,我们感谢John Syka和Jae Schwartz乐于助听的讨论。

      补充材料

      参考

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