从Wip1磷酸酶 - 敲除小鼠中睾丸的整合蛋白质组学和磷蛋白蛋白质分析:洞察力降低生育的机制**[S]

  • 莹汇威
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    中国农业科学院动物科学研究所动物营养国家重点实验室,北京100193
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  • 钱高
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  • 彭霞牛
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  • kui xu.
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  • 义庆秋
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  • 宾源王
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  • 玉莲亩
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  • Kui Li.
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  • 作者脚注
    *本研究得到了中国国家自然科学基金(31330074,31572378),是中国农业科学院农业科技创新计划(ASTIP-IAS05),以及中国农业科学研究项目(2015CB943101),中国中央政府基础科学研究业务专项基金(2016年WF-YB-4)。
    [S] 本文含有补充材料。
    ¶ 这些作者同等贡献这项工作。
      缺乏野生型P53诱导的磷酸酶1(WIP1)的小鼠显示出较小的睾丸,体育率和精子发生缺陷在圆形和伸长的 - 精子阶段的较小睾丸中的丧失缺陷。然而,这些异常的分子机制仍然尚不清楚。在这里,我们检查了睾丸的蛋白质组和磷酸磷蛋白酶组WIP1. - 使用定量蛋白质组学方法的Knockout小鼠。从总共6872个蛋白质和4280个磷酸化位点,与野生型小鼠相比,发现58个蛋白质和159个磷酸化位点进行差异调节。途径富集分析表明,这些调节的蛋白质和磷酸水主要涉及粘附/狭窄的结,细胞凋亡,炎症反应,精子发生,精子运动和细胞骨骼组装和解聚。WIP1. - Knockout小鼠表现出结合相关蛋白(Occludin,Zo-1和N-Cadherin)的表达减少,并且血液睾丸屏障的完整性受损。此外,WIP1缺乏与睾丸中升高的细胞因子和细胞细胞凋亡有关。这些结果表明,促炎细胞因子可以通过降低结合相关蛋白的表达来损害血液睾丸屏障动力学,这可能导致体育率和精子发生缺陷。集体,这些发现有助于解释由此引起的低生殖功能WIP1.删除并为我们对男性不孕症的原因的理解提供新的见解。

      图形概要

      精子发生包括哺乳动物睾丸中的有丝分裂,减数分裂和精子发生的复杂过程(
      • 郭X.
      • 孙沉
      • zhengrong xia.
      • 瑞张
      • 平张
      • 春钊
      • 君兴
      • 凌辰
      • 温辰
      • 林林
      • 冉惠
      • Bing Su.
      • Zuomin Zhou
      • 沙J.
      小鼠精子发生蛋白质的蛋白质组学分析。
      )。保持不同类型的细胞 - 细胞连接的完整性对于血液睾丸屏障(BTB)的生殖细胞运动是至关重要的
      使用的缩写是:
      BTB.
      血液睾丸屏障
      WIP1.
      野生型P53诱导的磷酸酶1
      WT.
      野生型
      ko.
      昏死
      Tunel.
      末端脱氧核苷酸转移酶内骨贴贴标签
      itraq.
      用于相对和绝对量化的等离标签
      DEPS.
      差异表达蛋白质
      基因本体论
      ke
      Kyoto基因和基因组的百科全书
      IPA.
      聪明的途径分析
      细绳
      搜索工具,用于检索交互基因
      FDR.
      假发现率
      PLSC.
      磷酸化水平显着变化。
      1使用的缩写是:BTB.
      血液睾丸屏障
      WIP1.
      野生型P53诱导的磷酸酶1
      WT.
      野生型
      ko.
      昏死
      Tunel.
      末端脱氧核苷酸转移酶内骨贴贴标签
      itraq.
      用于相对和绝对量化的等离标签
      DEPS.
      差异表达蛋白质
      基因本体论
      ke
      Kyoto基因和基因组的百科全书
      IPA.
      聪明的途径分析
      细绳
      搜索工具,用于检索交互基因
      FDR.
      假发现率
      PLSC.
      磷酸化水平显着变化。
      (
      • 姚p.l.
      • 林Y.C.
      • 里士堡J.H.
      通过MMP2介导的单酸酯诱导的单酸酯诱导的啮齿动物睾丸上皮中的结络合物破坏。
      )。 BTB通过相邻的Sertoli细胞之间的紧密连接形成,将血管上皮层分成不同的基础和adleminal隔室(
      • 骑克。
      • 暹粒H.
      • Richterich P.
      • Brehm R.
      正常和隐睾马管状发育期间马血睾丸屏障的表征。
      )。 BTB通过不同类型的结统称,包括Claudins和基于瘤瘤的紧密结,基于Cadherin的粘附结,以及基于Connexin的间隙连接,所有这些结合素与彼此紧密的结构和功能接触(
      • 小柱子下午
      • Byers S.W.
      血液睾丸屏障和Sertoli细胞连接:结构考虑因素。
      ,
      • Wong e.w.p.
      • MRUK D.D.
      • 程C.Y.
      生物学和调节骨质专业化,睾丸中的非典型粘附结类型。
      )。 BTB的主要功能是提供适当的微环境(结构支持和营养)来发展生殖细胞并赋予顶级基础极性,从系统性循环中螯合自身的菌根生殖细胞,防止自身免疫识别,并排除潜在的细胞毒性物质(
      • MRUK D.D.
      • 程C.Y.
      Sertoli-sertoli和Sertoli-Germ细胞相互作用及其在精子发生过程中生殖细胞运动的重要性。
      ,
      • 黄色。
      • MRUK D.D.
      • 程C.Y.
      生物学和调节骨质专业化,睾丸中的非典型粘附结类型。
      )。此外,先前的研究报告说,细胞因子介导的结蛋白的下调导致BTB完整性受损(
      • lui w.y.
      • 李明。
      激素和细胞因子调节睾丸中细胞结动力学的分子机制。
      )。在没有免疫学和“栅栏”功能的情况下,精子发生也可能被破坏,导致雄性化学或不孕症(
      • 邱L.
      • 张X.
      • 张Y.
      • 顾J.
      • 陈米
      • 张Z.
      • 王X.
      • 王S.L.
      Sertoli细胞是全氟辛烷磺酸盐诱导的雄性小鼠的繁殖功能障碍的潜在靶标。
      ,
      • 程C.Y.
      • MRUK D.D.
      血液睾丸障碍及其对男性避孕的影响。
      )。
      野生型(WT)P53诱导的磷酸酶1(WIP1)是Mg2+/ Mn.2+ PP2C系列的依赖性丝氨酸/苏氨酸磷酸酶,其涉及调节几种应激诱导和DNA损伤诱导的信号网络。编码人类WIP1的基因, PPM1D,在睾丸中高度表达(
      • 崔J.
      • Nannenga B.
      • demidov o.n.
      • BulaGin D.v.
      • Cooney A.
      • 布雷顿C.
      • 张Y.
      • mbawuike i.n.
      • 布拉德利A.
      • Appella E.
      • denthower l.a.
      缺乏野生型P53诱导的磷酸酶基因(WIP1)的小鼠表现出繁殖器官,免疫功能和细胞周期控制中的缺陷。
      )。 WIP1磷酸酶最初研究为肿瘤发生的有效调节剂(
      • 巴士M.C.
      • 雷克马
      • 李杰。
      • 甘地K.
      • Schniederjan M.J.
      • kool m.
      • 诺斯科特P.A.
      • Pfister s.m.
      • 泰勒M.D.
      • Castellino R.C.
      WIP1癌基因促进进展和侵袭侵袭性Medulloblastoma变体的侵袭。
      ,
      • Emelyanov A.
      • BulaGin D.v.
      WIP1. phosphatase in breast cancer.
      ),出现的证据表明了作用 WIP1. 在多种生理过程和病理生理病症中,例如细胞稳态(
      • 公园H.K.
      • Panneerselvam J.
      • dudimah f.d.
      • 董G.
      • 塞巴斯蒂安S.
      • 张继夫
      • Fei P.
      WIP1. contributes to cell homeostasis maintained by the steady-state level of Wtp53.
      ),中性粒细胞迁移和炎症(
      • 太阳B.
      • 胡X.
      • 刘G.
      • 徐Y.
      • 杨T.
      • 施J.
      • 杨F.
      • 李H.
      • 张L.
      • 赵玉。
      磷酸酶WIP1负调节中性粒细胞迁移和炎症。
      ),B细胞发育(
      • 易W.
      • 胡X.
      • 陈祖
      • 刘L.
      • 田Y.
      • 陈H.
      • Cong Y.S.
      • 杨F.
      • 张L.
      • 鲁道夫K.L.
      • 张Z.
      • 赵玉。
      • 朱Z.
      磷酸酶WIP1以p53依赖性方式控制抗原独立的B细胞显影。
      ),骨髓间充质干细胞和巨噬细胞迁移(
      • 唐y.
      • 刘L.
      • 盛M.
      • 熊K.
      • 黄兰
      • 高Q.
      • 魏J.
      • 吴T.
      • 杨科。
      • 刘H.
      • mu y.
      • 李克。
      WIP1. knockout inhibits the proliferation and enhances the migration of bone marrow mesenchymal stem cells.
      ,
      • 唐y.
      • 潘B.
      • 周X.
      • 熊K.
      • 高Q.
      • 黄兰
      • 夏Y.
      • 沉M.
      • 杨科。
      • 刘H.
      • 谭t.
      • 马杰。
      • 徐X.
      • mu y.
      • 李克。
      WIP1.-dependent modulation of macrophage migration and phagocytosis.
      ),自噬,肥胖和动脉粥样硬化(
      • Le Guezennec X.
      • Brichkina A.
      • 黄玉..
      • Kostromina E.
      • 汉W.
      • BulaGin D.v.
      WIP1.-dependent regulation of autophagy, obesity, and atherosclerosis.
      )。而且, WIP1.-昏死 (WIP1.-ko)小鼠呈现雄性生殖器官的缺陷和损伤的精子发生,最终导致生育率降低(
      • 崔J.
      • Nannenga B.
      • demidov o.n.
      • BulaGin D.v.
      • Cooney A.
      • 布雷顿C.
      • 张Y.
      • mbawuike i.n.
      • 布拉德利A.
      • Appella E.
      • denthower l.a.
      缺乏野生型P53诱导的磷酸酶基因(WIP1)的小鼠表现出繁殖器官,免疫功能和细胞周期控制中的缺陷。
      ,
      • Filipponi D.
      • Muller J.
      • Emelyanov A.
      • BulaGin D.v.
      WIP1. controls global heterochromatin silencing via ATM/BRCA1-dependent DNA methylation.
      )。 filipponi. 等等。 证实,由受损的异铬胺损伤引起的Ataxia Telanciectasia-突变(ATM)激酶的激活部分导致睾丸缺陷(
      • Filipponi D.
      • Muller J.
      • Emelyanov A.
      • BulaGin D.v.
      WIP1. controls global heterochromatin silencing via ATM/BRCA1-dependent DNA methylation.
      )。
      在本研究中,我们证明了这一点 WIP1. - 在圆形和伸长的 - 精子阶段显示过射击的小鼠和精子发生缺陷。我们进一步研究了负责的分子机制 WIP1. - 使用蛋白质组学方法来研究差异表达的睾丸蛋白和蛋白质在野生型和卵形之间含有差异磷酸化位点的蛋白质组学方法进行研究 WIP1. - 小鼠。综合蛋白质组学和磷蛋白组学分析表明,BTB的完整性受损可部分地对精子发生和生育能力的缺陷负责 WIP1. - 小鼠。这些调查结果进一步了解对依据的机制 WIP1. 在精子发生和生育率中,为未来的男性生育率提供了一种新的视角。

      实验步骤

       小鼠和育种测定

      WIP1. - / - (WIP1-KO)和 WIP1.+ / + (WIP1.-wt)由公共卫生部的人类疾病比较医学重点实验室讨论小鼠(北京,中国)(
      • 崔J.
      • Nannenga B.
      • demidov o.n.
      • BulaGin D.v.
      • Cooney A.
      • 布雷顿C.
      • 张Y.
      • mbawuike i.n.
      • 布拉德利A.
      • Appella E.
      • denthower l.a.
      缺乏野生型P53诱导的磷酸酶基因(WIP1)的小鼠表现出繁殖器官,免疫功能和细胞周期控制中的缺陷。
      )。 WIP1.+/- 通过交配产生小鼠。我们研究中使用的所有CD1雌性小鼠都是从重要的河流实验室动物科技有限公司(中国北京)购买。聚合酶链反应(PCR)基因分型引物 WIP1.+ / +WIP1. - / - 如下: WIP1.+ / + 向前:5'-gacagtcctgtgccaaatgct-3'和反向5'-ggtgacttgattggtggtgtgtaga-3'; WIP1. - / - 前进:5'-gcagggctgtttgtggtgct-3'和反向5'-gcatgctccagactgcctt-3'。将所有小鼠繁殖并保持在无病原体条件下,具有12小时光/暗循环。所有动物程序都被中国农业科学院动物科学研究所的动物护理和使用委员会批准。
      繁殖,10周龄 WIP1.+ / +, WIP1.+/-, 和 WIP1. - / - 雄性小鼠用野生类型的8周龄CD1女性饲养。每天监测分组插头,并将堵塞的女性移至单独的笼子进行监测以监测怀孕。未在2周内未怀孕的女性被取代。交配超过3个月,记录妊娠结果和可行的幼崽。如果堵塞的女性小鼠在第22天的第22天没有产生任何幼仔,则证实不怀孕。允许雄性小鼠休息2天,之后将另一个雌性放入此笼中进行交配。如上所述,每个雄性小鼠用于四个育种循环(
      • 陈问:
      • 彭H.
      • 雷L.
      • 张Y.
      • 匡H.
      • Cao Y.
      • shi Q.x.
      • 马T.
      • 段E.
      Aquaporin3是一种精子水通道,对于诊所的精子Osmoadaptation和迁移是必不可少的。
      )。

       组织学,免疫染色和末端脱氧核苷酸转移酶内切末端标记(TUNEL)

      对于组织学检查,将睾丸和附睾除去小鼠,在磷酸盐缓冲的盐水(PBS)中洗涤两次,并用Bouin的溶液(Sigma-Aldrich,Darmstadt,德国)在4℃下过夜,以渐进浓度的醇脱水,并嵌入石蜡蜡中。将石蜡切片(5μm)切割,然后用苏木精 - 曙红染色以进行形态学评价。根据标准技术,还通过透射电子显微镜检查附睾组织。对于免疫染色,将脱碱化和再水化载体与沸腾0.1孵育 m 抗原检索柠檬酸钠(pH6.0)10分钟,并用各自的抗体染色:兔抗小鼠VASA同源物(MVH)(ABCAM,剑桥,英国),山羊抗protamine 2(PRM2)(Santa Cruz Biotechnology,Danvers ,ma),兔抗Wilms肿瘤(wt1)(abcam),兔抗β-catenin(abcam),兔抗闭塞素(abcam),兔抗n-cadherin(abcam),和兔抗zona occludens -1(ZO-1)(小区信令技术)。使用脱蜡和再水化的石蜡切片(5μM)通过TUNEL测定评估凋亡细胞。使用原位细胞死亡检测试剂盒,POD(Roche,Basel,瑞士),遵循制造商的协议,检测Tunel阳性细胞。凋亡细胞染色棕色,正常细胞染色蓝紫。通过在五个视野/幻灯片中随机计数调节细胞凋亡细胞(每个组, n = 4重复;每次重复, n = 3载玻片)在×400放大率的荧光显微镜下。所有图像都在荧光显微镜(BX51,Olympus,Tokyo,Japan)下进行。

       RNA提取和实时PCR

      在Trizol试剂中收获睾丸(每50-100mg睾丸1ml试剂; Invitrogen™,Rockford,IL)。根据制造商的说明,使用RNA提取工具包(天根,北京,中国)提取RNA,使用纳米100微量分光光度计(中国杭州),确定其浓度和纯度。使用逆转录试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Rockford,IL)合成第一链cDNA。使用Sybr选择主混合(应用生物系统)和给出的引物进行实时PCR进行ABI Prism 7500设备(应用生物系统,福斯特城市,加利福尼亚州)和 补充表S1。使用来自每组不同小鼠的八个样品。对于各个睾丸的每个样品,量化量是三份制备的。使用与β-肌动蛋白mRNA的对比CT法(ΔΔCT)分析mRNA表达作为内部对照。

       BTB. Integrity Assay

      如前所述确定BTB的完整性(
      • 小X.
      • MRUK D.D.
      • 唐e.i.
      • 马拉瓦尔·
      • Mok K.W.
      • 李恩
      • 黄C.K.
      • 李明。
      • Snapper S.B.
      • Shilo B.Z.
      • Schejter e.d.
      • 程C.Y.
      血液睾丸屏障的结构完整性需要N-WARP。
      )。对于每只小鼠,100μl10mg/ ml荧光素异硫氰酸酯(FITC) - 将缀合的葡聚糖(Sigma-Aldrich)注入尾部。从每组的八只雄性小鼠在大约30分钟后被安乐死,并立即删除并嵌入了OCT(Sakura Finetek,Torrance,CA)。使用低温恒温器切片体切割冷冻切片(约7μm),并在荧光显微镜(Olympus)下检查。

       组织裂解,蛋白质提取,消化,标记和肽分级

      将冷冻睾丸样品研磨并在10mL缓冲液中裂解(2 m 硫脲,8 m 尿素,0.1%的乳清,一种片剂的蛋白酶抑制剂(完全迷你EDTA混合物,Roche应用科学,印第安纳波利斯,In)和一种片剂的磷酸酶抑制剂混合物(Phosstop,Roche Application Science)),随后通过Tissuelyser LT均匀化(Qiagen,Duesseldorf,德国)(设置:3×60s; 50振荡/ s),钢球。在4℃下以12,000rpm以12,000rpm离心10分钟,清除匀浆。收集上清液,并通过BSA蛋白作为标准的BSA蛋白质量化蛋白质浓度。详细地,裂解缓冲液中的蛋白质在50米中降低m DTT在56℃下为1小时,随后在黑暗中烷基化,5米m 碘乙酰胺在室温下30分钟。对于随后用胰蛋白酶消化,将溶液用25米稀释m 加入碳酸氢铵(pH8.5)和胰蛋白酶(1:50,w / w)并进行消化6小时,第二胰蛋白酶消化在37℃下进行过夜。在胰蛋白酶消化后,5%的肽用于全蛋白质组分析,其余的95%用于磷酸富集和进一步的磷酸肽分析。据制造商的说明,对于蛋白质组分析,用8-Plex肌肉标签的每个组分标记为相对和绝对量化(ITRAQ)试剂盒(AB Sciex,Foster City,CA)。详细地,选择了两个ITRAQ标签,119和121(来自三个KO和三种KO和三种WT睾丸组织的汇集提取物)作为参考混合物。标签113,114,115,116,117和118用于两个技术复制实验中的三个KO和三种WT睾丸组织的相对丰度。标签119/121用于评估系统误差。标签119和121是来自所有睾丸组织的合并提取物的技术。因此,它们的理论LOG2变换比率(LOG2(标签119/121))应该为0.实验,平均log2变换比为0,标准偏差(S.D.)为0.126。最终,使用平均值+ 2SD(1.283)和平均值(0.779)来决定折叠变化阈值。另外,为了鉴定更多的蛋白质,使用RIGOL施加反相色谱法 l-3000系统(北京资格科技有限公司,北京,中国)分离混合肽。将肽混合物在100μl的流动相A(DDH中2%乙腈中重构)重构2o,pH10)并在装载到柱上以14,000rpm以14,000rpm离心20分钟(Durashell-C18,4.6×250mm,5μm,100,agela)。加载后,通过逐步注射流动相B(DDH中98%乙腈,以700μL/ min的流速洗脱肽。2o,ph 10)。通过测量214nm的吸光度来收集10个级分。用C18柱(水,Milford,MA)脱盐,并在液相色谱串联质谱(LC-MS / MS)之前真空干燥。

       磷酸富集

      使用磷肽富集试剂盒(Pierce,Thermo Fisher Scientific)进行磷肽富集。简而言之,将来自每个样品的干燥肽溶解在150μl结合缓冲液中。 TIO.2 用洗涤缓冲液洗涤珠子两次,并将总共1mg胰蛋白酶肽溶液与适当的量孵育(胰蛋白肽:TiO2 = 1:1, w/w) of TiO2 通过在室温下在室温下弯曲30分钟的珠子。通过短暂离心收集磷酸肽结合的珠子,用500μL洗涤缓冲液洗涤两次,并转移到将1.5ml离心管顶部的C18垂悬(Thermo Fisher Scientific)上。离心酸盖以完全除去洗涤缓冲液,并用洗脱缓冲液从树脂中收集磷肽。将洗脱液干燥并在-80℃下储存直至进一步的LC-MS / MS分析。

       基于Q-辐射质谱法的LC-MS / MS分析

      使用Q-辐射的质谱仪分析肽混合物,配有Easy-NLC 1000系统(Thermo Fisher Scientific)。将干燥的肽和磷酸肽重构为20μl0.1%的甲酸,装载在易喷雾柱上(12cm×75μm,3μmC18树脂(Maisch Gmbh,Ammerbuch,Ammerbuch,Ammerbuch,Ammerbuch,Ammerbuch,Germand)的甲酸中的甲酸。辐射女士(Thermo Fisher Scientific)。使用100%DDH洗脱肽和磷酸肽混合物2O,0.1%甲酸(缓冲液A)和100%乙腈,0.1%甲酸(缓冲B)在113分钟的梯度下,流速为300nl / min(8-30%缓冲液B,77min,30- 50%缓冲液B对于10分钟,50-95%缓冲液B 15分钟,最后5%缓冲液B 11分钟)。用MS测量扫描(Prother Fishific)对洗脱的肽和磷酸肽进行分析m/z 范围400-1800)(70,000分辨率,3×106 AGC目标和20毫秒最大离子时间)和MS / MS光谱(17,500分辨率,高能量碰撞解离,2m/z 隔离窗口,27个归一化碰撞能量,2×105 AGC,100毫秒最大离子时间,30秒动态排除和顶部20)。

       质谱数据分析

      基于UniProt Mouse蛋白数据库(Uniprot 2016_05_28; 16,793序列)与目标诱饵和污染物数据库搜索策略相结合的Andromeda作为搜索引擎处理的原始质谱文件。对于蛋白质组分析,数据库搜索的参数设定如下:完全胰蛋白酶特异性;最大的两个错过裂缝; N-末端和赖氨酸残基的Itraq 8-Plex标签和半胱氨酸(Cys)残基的氨基甲酰甲酰化物质被指定为固定改性;离子质量耐受由Andromeda(20ppm。首次搜索,4.5 ppm。主要搜索);允许蛋氨酸和蛋白质N-末端乙酰化的氧化作为可变改性(
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Cox J.
      基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
      )。对于磷脂体,用初始最大质量偏差为6ppm和20ppm的前体和片段离子的初始质量偏差,静态大气转变为Cys,氧化动态质量转变(Met),N-乙酰化和磷酸(丝氨酸) T(苏氨酸)Y(酪氨酸),两个最大遗漏的裂解,三个最大修改位点,以及A,B和Y离子的分配。选择具有全酶特异性的胰蛋白酶,并且仅选择具有最小长度为6个氨基酸的肽。磷酸化位点的最小最小值得分为40.通过用反向氨基酸序列搜索数据库来评估假发现率。我们最多需要1%的FDR鉴定蛋白质,肽和磷酸化位点。
      对于蛋白质组分析,考虑至少一种独特的肽用于鉴定和定量蛋白质(
      • Corradini E.
      • Vallur R.
      • raijmakers l.m.
      • Feil S.
      • Feil R.
      • Heck A.J.
      • Spolten A.
      循环鸟氨酸单磷酸(CGMP)依赖性蛋白激酶敲除小鼠的循环(磷酸)蛋白质组的改变。
      ,
      • Zanivan S.
      • 喵喵啊
      • Behrendt K.
      • Schoof.
      • Neilson L.J.
      • Cox J.
      • 汤。
      • Kalna G.
      • van Ree J.H.
      • van deursen准。
      • Trempus C.S.
      • Machesky L.M.
      • 林德林
      • Wickstrom S.A.
      • Fassler R.
      在体内硅胶基蛋白质组学中揭示了小鼠皮肤致癌术期间的磷脂蛋白酶体变化。
      ,
      • 黄鹤
      • Larsen M.R.
      • Palmisano G.
      • 戴J.
      • Lametsch R.
      24小时后猪肌的定量磷蛋白蛋白酶分析。
      )。定量分析对测量的报告者强度的log2值进行,并且数据基于使用Perseus软件(1.5.5版)基于中位数标准化。一个两个样本 t 在Perseus 1.5.5软件中进行测试。蛋白质 p values <0.05且折叠变化比≥1.283或≤0.779被认为是差异表达的蛋白质(DEPS)。对于磷脂蛋白酶组分析,通过计算其强度值,在磷脂蛋白水平进行定量。使用Perseus软件(1.5.5版)完成了进一步的数据处理。磷蛋白酶数据是LOM2转化的,并且应用以下过滤步骤:仅属于I类磷酸化位点的磷酸盐(定位概率>0.75和得分差异>5)。另外,磷酸化位点在四重复内的最大一定量化值定量。数据被标准化为每个样本的中值,并且丢失的值被从每个样品的正态分布汲取的随机数替换。敲除组和野生型组之间的磷酸水的变化由两个样本确定 t 试验 p <0.05和至少1.5倍的差异(
      • 黄鹤
      • 哈尔彼得伦米
      • ibanez-vea m.
      • Lassen P.S.
      • Larsen M.R.
      • Palmisano G.
      使用半胱氨酸特异性膦酸盐适应性标签(Cyspat)与二氧化钛(TiO 2)色谱相结合同时富集半胱氨酸肽和磷酸肽。
      )。用于测量β-catenin的磷酸化状态以验证磷酸磷蛋白调控的磷酸化状态。

       功能分析

      鉴定的DEP和含有差异磷酸化位点的蛋白质使用该基因本体(GO)联盟(http://www.geneontology.org)基因和基因组(KEGG)数据库的京都百科全书(http://www.kegg.jp)。为了理解这些DEPS和蛋白质,含有差异磷酸化位点的出版文献,使用熟鳃途径分析(IPA)确定与功能和生物途径相关的相互作用(http://www.ingenuity.com)。随后使用搜索工具进行含有差异磷酸化位点的所有相关微分蛋白和蛋白质之间的相互作用进行分析,用于检索相互作用基因/蛋白(串)10.5数据库(http://string-db.org)。

       Western Blotting.

      在十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶上运行睾丸裂解物,并根据标准技术进行免疫印迹。使用的主要抗体如下:兔抗β-catenin,兔抗N-cadherin,兔抗闭塞蛋白,兔抗bcl-2,兔抗bcl-2,兔抗bax,兔抗胱糖酶-3,兔抗肾素酶,兔抗前列腺素D合酶(PTGDS)和兔抗MYD88(所有ABCAM);小鼠抗WIP1,小鼠抗caspase-9,兔抗白细胞介素(IL)-1β,兔抗肿瘤坏死因子(TNF)-α,兔抗ZO-1,兔抗β-肌动蛋白和兔抗p-β-catenin(QRRT-SP-MGGTQ,磷酸-S552(所有细胞信号传导技术);兔子抗spink2(寿命,盐湖城,UT)。每种样品的免疫印迹至少重复三次KO和WT小鼠分别。通过基于Tanon-5200化学发光成像系统(Tanon,Shanghai,China)计算具有凝胶图像系统1D软件(V4.2)的净光密度值来量化可视化带。

       实验设计与统计理由

      十周龄男性wt和 WIP1.牺牲了C57BL / 6背景的KO小鼠,解剖完整的睾丸,用液氮冷冻,并在-80℃下储存直至使用。由于蛋白质组,两组8-Plex Itraq实验是作为技术复制进行的。每个8-Plex Itraq实验包含三个独立的生物重复 WIP1.-wt,三个独立的生物复制 WIP1.-KO,以及汇集样品的两种技术复制作为参考。用磷脂蛋白质,四个独立的生物实验(总共四个 WIP1.-wt和 WIP1.-KO Testis组织样本)没有进行技术复制。在使用Perseus软件(1.5.5版本)分析数据时,复制的结果将组合。
      使用GraphPad Prism(6)统计软件(GraphPad软件; SAN Diego,CA)分析数据,结果呈现为平均值±S.E. (S.E.)至少有三个单独的实验,如果没有另有规定,与双尾未配对的学生相比 t 在这之间进行测试 WIP1.-ko和 WIP1.-wt组。意义程度表示为***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05, p >0.05不显着(ns)。

      结果

       WIP1的敲除导致小鼠的生育率降低

      基于通常高表达的 WIP1. 在睾丸和精子(
      • 崔J.
      • Nannenga B.
      • demidov o.n.
      • BulaGin D.v.
      • Cooney A.
      • 布雷顿C.
      • 张Y.
      • mbawuike i.n.
      • 布拉德利A.
      • Appella E.
      • denthower l.a.
      缺乏野生型P53诱导的磷酸酶基因(WIP1)的小鼠表现出繁殖器官,免疫功能和细胞周期控制中的缺陷。
      ,
      • Filipponi D.
      • Muller J.
      • Emelyanov A.
      • BulaGin D.v.
      WIP1. controls global heterochromatin silencing via ATM/BRCA1-dependent DNA methylation.
      ),我们监测了生育能力 WIP1. - 通过交配不同的男性小鼠 WIP1. 基因型与WT CD1女性。妊娠率(84.31%) 相对 97.73%或97.50%, p <0.001)和平均垃圾尺寸(11.21±0.65 相对 12.70±0.35或12.44±0.39, p <0.05)显着降低 WIP1.-KO男性与WT或杂合的男性相比(表I.)。
      表I.不同WIP1男性的生育数据与WT女性交配
      小鼠基因型男性小鼠的数量交配女性的数量插入女性数量妊娠率(垃圾部分/交配)平均垃圾尺寸
      男性女性
      + / ++ / +11444497.73%(43/44)12.70±0.35(546/43)
      +/-+ / +10404097.50%(39/40)12.44±0.39(467/39)
      - / - + / +15605184.31%
      *** p < 0.001, WIP1. - / - vs. WIP1.+ / + 或者 WIP1.+/-.
      (43/51)
      11.21±0.65
      * p < 0.05, and
      (482/43)
      呈现的错误显示在S.E.中。
      * p < 0.05, and
      *** p < 0.001, WIP1. - / - vs. WIP1.+ / + 或者 WIP1.+/-.
      根据先前的观察结果,睾丸尺寸的总检测显示睾丸重量减少26% WIP1.-ko与wt男性相比(Fig. 1A, 1B)。 WIP1.-KO睾丸在组织学部分中显示出异常架构,许多小管缺乏晚期生殖细胞类型(Fig. 1C广告;绿色箭头)。我们还调查了受影响的精子发生的阶段 WIP1. 通过免疫染色缺失。与组织学部分一致,PRM2的表达(在精子中特异性表达)显着降低 WIP1.-KO男性与对照男性相比(Fig. 1CE-F;绿色箭头)。然而,原始生殖细胞中没有MVH蛋白质水平的异常 WIP1.-ko和wt男性(Fig. 1CG-H)。此外,附睾成本和曹达 WIP1.-KO男性常常表现出异常小管,没有精子(Fig. 1DI-L,O-P;绿色箭头)。此外,附睾透射电子显微镜(Fig. 1DM-N)验证了精子计数明显减少 WIP1.-KO与WT小鼠相比。患有的 WIP1.因此,可以归因于由空睾丸和附睾中的缺陷产生的减少数量的精子。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1WIP1. deficiency disrupts spermatids development in the testis and reduces sperm count in the epididymis in mice. A,10周龄的整体睾丸大小 WIP1.-ko和wt老鼠。 B,从成年小鼠收获的睾丸的重量减少了 WIP1.-ko小鼠。 10周龄睾丸的组织学分析 WIP1.-ko和wt老鼠(C,a-b)低放大率(×10)和(C,C-D)高倍率(×20)。来自10周龄WT的睾丸部分的免疫组化图像 WIP1.-ko小鼠染色(C,E-F)抗PRM2抗体和(C,G-H)抗MVH抗体。苏木精 - eosin(h&e)从10周龄WT和10周龄的Caput附睾的切片 WIP1.-ko鼠标睾丸(D,i-j)低放大率(×10)和(D,K-L)高放大率(×20)。 (D,M-N)10周龄WT和10周龄RevidyMides的传输电子显微照片 WIP1.-ko小鼠。 (D,o-p)h&从10周龄WT和10周的Cauda附睾e-Sectia的切片 WIP1.-ko小鼠。数据表示为平均值±S.E. **p <0.01。秤条:50μm(C广告, CG-H, DI-L, DO-P); 20μm(CE-F, Dm-n)。

       一体化全蛋白质组和磷脂蛋白酶谱鉴定细胞粘附/紧密结途径

      我们使用定量蛋白质组学方法来分析WT和KO小鼠睾丸之间的全球蛋白质表达谱和磷酸化事件。解剖后,将睾丸组织作为示意性描述的 Fig. 2A 在实验程序中。总共鉴定了1614个蛋白质的6872个蛋白质和4280个磷酸化位点(补充表S2和S3, <1%fdr)。 4280磷酸化位点由3711磷酸化丝氨酸(PS),546磷酸化苏氨酸(Pt)和23个磷酸化酪氨酸(PY)残基组成(Fig. 2D)。其中,上调54个蛋白质上的23℃和60个磷酸水,并在90蛋白上进行35℃和99个磷酸锶,下调 WIP1. null睾丸,与 p 重要的值(Fig. 2B, 2C, 补充表S2和S3)。此外,我们将特定磷酸肽的磷脂蛋白酶组数据与蛋白质组学研究的相关蛋白表达数据进行了比较补充表S7)。共有1431个鉴定的蛋白质在磷蛋白酶组和蛋白质组分析数据之间重叠。其中,对于大多数差分调节的磷酸化位点,相应的蛋白质表达差异从蛋白质组分析数据中没有显着。在58 deps中,也仅鉴定为差异调节的磷酸蛋白(补充表S7)。进入受管制的生物学功能的见解 WIP1. 淘汰进展,我们通过富集与生物过程,分子功能和细胞成分进行富集,表征了DEPS和PLSC磷蛋白酶(补充表S4)。致富集分析表明,涵盖大部分差异表达术语的三类主要与粘附/紧密的连接,精子发生,凋亡过程,免疫反应和微管/细胞骨架组织有关(Fig. 3A3C, 表二, 表III)。 Kegg途径浓缩分析表明,大多数DEP与免疫应答,氨基酸代谢和紧密交界有关,类似于GO术语富集(表二, 表III, 补充图。S1补充表S5)。这些PLSC磷酸磷蛋白的Kegg途径分析显示紧密的结和粘附结作为最主要的途径,涉及七种相关的磷蛋白(ZO-1(TJP1),Zonab(YBX3),Xonab(CGN),帕拉科蛋白(CGNL1),Symplekin(Sympk ),β-​​连环蛋白(CTNNB1)和WASP(WASL)(Fig. 3D, Fig. 4B, 表二, 补充图S2, 和 补充表S6)。提供胚细胞 - Sertoli细胞结信号通路 Fig. 4A。在这条路中, WIP1. 缺乏可能诱导β-连环蛋白磷酸化和胚芽细胞和血清细胞之间破碎的粘附结的调节,最终导致肌动蛋白部署,BTB破坏和生殖细胞迁移。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2全蛋白质组和磷脂蛋白酶体分析 WIP1. - 缩义小鼠睾丸。 A,蛋白质组和磷脂蛋白分析示意图。解剖后,睾丸来自wt和 WIP1.-ko小鼠在8中裂开 m 尿素和用胰蛋白酶消化。用Itraq-8plex直接标记肽或使用TiO富集2 在质谱前珠粒分析。然后定量,定量和功能分析蛋白质组学和磷蛋白酶数据。 B,所有生物复制中量化蛋白质的火山曲线(在统计分析后显示出显着下调和上调的蛋白质)以绿色和红色报告)。 C,在TIO后所有生物学复制的量化磷酸酯的火山曲线2 富集(在统计分析后显示出显着下调和上调的磷酸水)以绿色和红色报告。 D,鉴定磷酸化位点中磷酸化丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸残基的分布。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3综合分析 WIP1. - 缺点蛋白质组和磷脂蛋白酶鉴定细胞粘附/紧密结途径。 A-C.,通过基因本体(GO)数据库功能富集DEPS和PLSC磷蛋白。 A,生物过程分析; B,分子函数分析; C,细胞分量分析。红色和蓝色柱分别代表蛋白质组和磷酸蛋白酶。 D,泡沫图描述了Plsc磷蛋白在分类的Kegg路径中的分布。泡尺寸表示所涉及的PLSC磷蛋白的数量。从绿色到红色的渐变表示减少 p 价值(越来越重要)。
      表二参与细胞粘附/紧密结途径的蛋白质和磷蛋白显示WIP1-KO小鼠的改变表达
      加入号码蛋白质描述磷酸化位点p value折叠变化ko.WT.
      (ko / wt)S.D.S.D.
      Q91Z83肌球蛋白-7(肌球蛋白重链7)0.0271.6440.3580.061
      Q02248Catenin Beta-1s(552)0.0210.5800.5320.137
      P39447紧密结蛋白ZO-1s(617)0.0186.9950.4900.032
      P23242间隙结合α-1蛋白s(306)0.0060.4180.0970.019
      Q62523Zyxin.s(336)0.0490.3800.2280.046
      Q91YD9神经Wiskott-Aldrich综合征蛋白质Y(253)0.0020.4360.0300.038
      Q9WTQ5A-kinase锚蛋白12T(635)0.0160.1050.0230.559
      Q9WTQ5A-kinase锚蛋白12S(733)0.01823.1341.7970.073
      P40124腺苷酸环酶相关蛋白1S (34)7.58E-06.0.1090.0240.036
      Q61165钠/氢气交换器1S(790)0.0130.2700.7630.116
      P14602热休克蛋白β-1(HSPB1)S (86)0.0390.3870.2520.092
      P14602热休克蛋白β-1(HSPB1)S (15)3.84E-07.0.5520.3490.870
      P17095高迁移率组蛋白HMG-I / HMG-Y.S (36)0.0330.4140.2110.008
      Q8K4L3Supervillins(857)0.0480.4850.1570.045
      Q8K4L3Supervillins(220)0.0020.5920.0220.165
      Q8K4L3SupervillinS(227)0.0020.5920.0220.165
      Q61235Beta-2- Syntrophins(373)0.0430.4870.1010.060
      O70318带4.1样蛋白2s(379)0.0050.4890.0430.044
      Q80X82Symplekin.S(1256)4.03E-06.0.5560.1130.172
      Q8BRT1夹子关联蛋白2S(376)0.0183.8900.1960.048
      Q99KG5脂解刺激脂蛋白受体S(407)0.0020.3020.1180.108
      P59242春林S(149)0.0440.4130.2900.084
      Q6AW69春林样蛋白1s(284)0.0260.5110.0980.046
      Q9JKB3Y盒结合蛋白3S (2)0.0253.4220.1620.916
      图缩略图GR4.
      Fig. 4IPA.和KEGG数据库在不存在的情况下PLSC磷蛋白的功能注释 WIP1.. A,预计一些PLSC磷酸蛋白参与生殖细胞 - 血清细胞结途径 WIP1. - 通过IPA进行缩写。 B,这些PLSC磷酸磷蛋白的KEGG途径分析显示出紧密的结作为最主要的途径,涉及五种相关的磷蛋白(ZO-1(TJP1),Zonab(YBX3),曲蛋白(CGN),阳光蛋白(CGNL1)和Symplekin(Sympk)。
      我们应用了全面的生物信息学分析,以评估这些DEPS和PLSC磷蛋白的综合功能和过程。与这些蛋白质和磷蛋白有关的重要功能和过程,其在IPA中涉及到由20个蛋白质和58个磷酸蛋白组成的网络中,所述蛋白质和58种磷蛋白蛋白,参与细胞粘附/紧密结,细胞凋亡,炎症反应,精子发生,精子运动和细胞骨骼组装和部署(补充图S3A)。此外,已知蛋白质在复杂网络中执行多个功能,因此通过搜索使用串数据库(补充图。S3B)。连合在一起,Go和Kegg术语富集和IPA分析一致表明DEPS和PLSC磷酸蛋白参与了细胞粘附/紧密结过程。

       WIP1的敲除损害与结合相关的蛋白质表达和BTB完整性

      表III蛋白质和磷蛋白组参与炎症反应途径,WIP1-KO小鼠的变化水平
      加入号码蛋白质描述磷酸化位点p value折叠变化ko.WT.
      (ko / wt)S.D.S.D.
      Q9DAC0趋化因子样子超家长成员2b0.0090.7140.1420.106
      P28654德坦汀0.0091.3430.1570.012
      P22366骨髓分化初级反应蛋白MYD880.0171.5510.2440.138
      P01878IGα链C地区0.0071.4470.1730.048
      P01872IGU Chain C地区0.0161.4550.2210.077
      P01863IG Gamma-2A链C地区7.44E-05.1.9080.0480.083
      Q80V62FANCONI贫血组D2蛋白质同源物(FACD2)0.0441.2910.1890.112
      Q6NS57丝裂原激活蛋白激酶结合蛋白1s(1252)0.0042.3590.0480.059
      Q9JKB3Y盒结合蛋白3S (2)0.0253.4220.1620.916
      Q923E4NAD依赖性蛋白质脱乙酰酶Sirtuin-1s(532)6.41E-05.0.1670.0350.189
      Q62523Zyxin.s(336)0.0490.3800.2280.046
      P23242间隙结合α-1蛋白(Connexin-43)s(306)0.0060.4180.0970.019
      Q91YD9神经Wiskott-Aldrich综合征蛋白质Y(253)0.0020.4360.0300.038
      P14602热休克蛋白β-1(HSPB1)S (86)0.0390.3870.2520.092
      P14602热休克蛋白β-1(HSPB1)S (15)3.84E-07.0.5520.3490.870
      Q6NZM9组蛋白脱乙酰酶4(HD4)S(629)0.0190.5240.1210.070
      Q9D0J8癌素素.S (2)0.0350.4510.2020.165
      图缩略图GR5.
      Fig. 5WIP1. deficiency disrupts the expression of junction-associated proteins and the integrity of BTB. (A,a-d)从10周龄WT和10周的睾丸切片的免疫荧光图像 WIP1.-KO小鼠用抗WT1和抗β-连环蛋白体染色。 (A,E-J)结合相关蛋白的免疫反应性(Occludin,N-Cadherin,ZO-1)在半成管中改变 WIP1. - 小鼠。闭塞素(红色箭头; e-f),n-cadherin(红色箭头; g-h)和zo-1(红色箭头; i-j)的分布在wt和的血管上皮上 WIP1.-ko小鼠(n =每组4个)用DAPI归备。秤条:50μm(a-b); 20μm(C-j)。 B,WT和相关组分的相对mRNA表达水平 WIP1.-KO鼠标睾丸。 C,WT和WT和相关组分的相对蛋白表达水平 WIP1.-KO鼠标睾丸。 β-肌动蛋白用作加载控制。 D,量化的相对带强度比 C. E., 体内 功能性测定(FITC标记的葡聚糖示踪剂)以确定WT和的BTB完整性 WIP1.-KO鼠标睾丸。在从WT小鼠的睾丸部分中,FITC绿色荧光仅在间隙空间和基底隔室中可见,而在睾丸部分中 WIP1.-KO小鼠,在间隙空间和基底室中观察到FITC绿色荧光,以及在半成因小管的内腔中。秤条:50μm。数据表示为平均值±S.E. *p < 0.05, **p <0.01,ns:不可思议。

       WIP1的敲除增加了细胞因子水平和睾丸细胞凋亡

      几项研究表明,通过诱导结关节相关蛋白的下调,增加的细胞因子表达被破坏了BTB完整性(
      • 姚p.l.
      • 林Y.C.
      • 里士堡J.H.
      通过MMP2介导的单酸酯诱导的单酸酯诱导的啮齿动物睾丸上皮中的结络合物破坏。
      ,
      • 李马。
      • 夏W.
      • MRUK D.D.
      • 王C.Q.
      • 闫H.H.
      • SIU M.K.
      • lui w.y.
      • 李明。
      • 程C.Y.
      肿瘤坏死因子{alpha}可逆地破坏血液睾丸屏障并损害成年大鼠睾丸的血管上皮内的血液胚细胞粘附。
      )。基于OMICS分析的结果,我们表明细胞因子和趋化因子的表达水平,包括TNF-α,IL-1α,IL-1β,CCL2(MCP-1),CCL3(MIP-1α),CXCL2(MIP- 2α)和CXCL5显着增加 WIP1.-KO鼠标睾丸(Fig. 6一种- 6C),而鼠巨噬细胞标记物F4-80也显着增强,与趋化因子的表达增加相关(Fig. 6一种- 6C)。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6WIP1.-deficient mice exhibit elevated cytokine levels and germ cell apoptosis in testis. A,WT和趋化因子的相对mRNA表达水平和趋化因子 WIP1.-KO鼠标睾丸。 B,WT和鼠巨噬细胞标志物(F4-80)的相对蛋白表达水平(F4-80) WIP1.-KO鼠标睾丸。 β-肌动蛋白用作加载控制。 C,量化的相对带强度比 B. D.,WT和TUNEL阳性细胞 WIP1.-KO鼠标睾丸部分出现棕色(红色箭头)。 E,基于平均值±S.E的每小管的凋亡细胞的平均数目。对于每组的四只动物。 F,WT和凋亡相关组分的相对蛋白表达水平 WIP1.-KO鼠标睾丸。 β-肌动蛋白用作加载控制。 G通过频带强度的密度扫描来计算Bcl-2 / Bax,Caspase-3 / actin和Caspase-9 / actin的量化相对带强度比。数据表示为平均值±S.E. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001。秤条:50μm。
      如上所述, WIP1.-KO睾丸证明了BTB完整性的破坏以及增加细胞因子和趋化因子的表达,表明生殖细胞凋亡(
      • 姚p.l.
      • 林Y.C.
      • 里士堡J.H.
      TNFα-介导的精子发生的破坏因啮齿动物中的Sertoli细胞损伤是由MMP2部分调节的。
      ,
      • 侯W.G.
      • 赵杰。
      • 李Z.
      • 李W.
      • 李T.
      • Xiong L.Z.
      • 张Y.Q.
      电磁脉冲辐照对小鼠血液睾丸屏障的影响。
      )。因此,我们审查了枯竭 WIP1. 使用TUNEL测定引发睾丸生殖细胞凋亡。在WT小鼠睾丸中检测到几种凋亡胚细胞,但这些明显升高 WIP1.-ko睾丸(Fig. 6D;红色箭头)。 WIP1. - 缺点睾丸显示出显着增加(5.30倍, p <0.001)与WT睾丸相比,在半法小管中的凋亡胚细胞的平均数量(Fig. 6E)。我们确认了效果 WIP1. 免疫印迹凋亡途径中的关键蛋白质和酶的枯竭。 WIP1.-KO小鼠睾丸显着降低了Bcl-2的表达水平,升高的Bax,Caspase-3和Caspase-9(Fig. 6F)。显示Bcl-2 / bax,caspase-3 / actin和caspase-9 / actin比率 Fig. 6G。这些结果表明,BTB完整性诱导的生殖细胞凋亡和睾丸中的精子损失的破坏,最终导致生育率降低。

       通过Western印迹验证DEPS和PLSC磷酸蛋白

      通过蛋白质印迹和一种PLSC磷蛋白的蛋白质印迹验证了定量蛋白质组学和磷蛋白质的准确性,包括MyD88,PTGDS,Spink2,肾素酶和Pβ-Catenin(S552),其与炎症反应,精子发生,精子运动有关和细胞粘附。 Western印迹结果符合蛋白质组学和磷蛋白蛋白质结果,从而验证OMICS数据的可靠性(Fig. 7)。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7蛋白质和PLSC磷蛋白差异表达的确认。 A,WT和WT中的MYD88,PTGDS,SPINK2和肾素酶的表达水平 WIP1.-KO小鼠通过蛋白质印迹确认。 β-肌动蛋白用作加载控制。 B,量化的相对带强度比 A. C.,WT和磷酸化β-catenin的表达水平 WIP1.-KO小鼠通过蛋白质印迹确认。 β-肌动蛋白用作加载控制。 D通过密度扫描带强度的致密度扫描计算β-catenin / actin和p-β-catenin(S552)/β-catenin的量化相对带强度比。数据表示为平均值±S.E. *p < 0.05, **p <0.01,ns:不可思议。

      讨论

      WIP1. has been studied extensively in relation to multiple aspects of tumorigenesis, stress response, DNA damage response, and inflammatory response, as well as cellular homeostasis, cell development and migration, obesity, and atherosclerosis. Two of the most apparent phenotypes of WIP1. - 缺血小鼠包括睾丸发育,精子发生和生育的缺陷(
      • 崔J.
      • Nannenga B.
      • demidov o.n.
      • BulaGin D.v.
      • Cooney A.
      • 布雷顿C.
      • 张Y.
      • mbawuike i.n.
      • 布拉德利A.
      • Appella E.
      • denthower l.a.
      缺乏野生型P53诱导的磷酸酶基因(WIP1)的小鼠表现出繁殖器官,免疫功能和细胞周期控制中的缺陷。
      ,
      • Filipponi D.
      • Muller J.
      • Emelyanov A.
      • BulaGin D.v.
      WIP1. controls global heterochromatin silencing via ATM/BRCA1-dependent DNA methylation.
      )。 WIP1. - 菲律物的生育率深刻地降低,可能与睾丸的异常结构有关,以及睾丸中的精子的缺眠。而且,我们确认了 WIP1.-KO小鼠在附睾中具有显着减少的成熟精子数。因此,我们得出结论,WIP1在雄性生殖结构的发展中起着不可或缺的作用。
      虽然Filipponi. 等等。 报道说睾丸缺陷 WIP1. - 由于损坏的异铬胺激活ATM(
      • Filipponi D.
      • Muller J.
      • Emelyanov A.
      • BulaGin D.v.
      WIP1. controls global heterochromatin silencing via ATM/BRCA1-dependent DNA methylation.
      ),蛋白质水平没有广泛检查效果。因此,我们进行了蛋白质组学和磷蛋白组学分析,以阐明了精子发生和生育缺陷的分子机制 WIP1. - 鉴定的小鼠,并鉴定了58··58··58··58℃,其中磷蛋白蛋白蛋白,其中20和58,其中据报道潜在地参与细胞粘附/紧密结,细胞凋亡,炎症反应,精子发生,精子运动和细胞骨骼组装和解聚的过程。此外,我们使用串数据库预测这些DEPS和PLSC磷蛋白之间的相互作用网络,并研究了它们的功能和角色 WIP1. 通过执行Go和Kegg途径浓缩分析来淘汰进展。 DEPS和PLSC磷酸磷蛋白的整合GO分析显示出主要涉及粘附/狭窄的连接,凋亡过程,免疫应答,精子发生和微管/细胞骨架组织的蛋白质的显着富集。根据Kegg途径富集分析,大多数DEP与免疫应答,氨基酸代谢和紧密结合有关。描述紧密交界处和粘附结的Kegg途径是PLSC磷蛋白的两种最富集的两种 WIP1.-KO与WT小鼠相比,包括七种相关蛋白质,(ZO-1(TJP1),Zonab(YBX3),Xonulin(CGN),帕拉科蛋白(CGNL1),Symplekin(Sympk),β-连环蛋白(CTNNB1)和WASP( WASL)。通过IPA的PLSC磷蛋白的进一步分析鉴定了生殖细胞 - Sertoli细胞结信号通路 WIP1. - 缺货验证。因此,我们推测β-连环蛋白的磷酸化水平可能用作精子发生和生育率所需的粘附结的中央调节因子。张 等等。 据报道,β-catenin的精子特异性缺失导致精子计数显着降低,胚芽细胞凋亡和生育受损,并将其归因于β-catenin在血液细胞之间的粘附结和伸长的精子之间的作用(
      • chang y.f.
      • Lee-Chang J.s.
      • Harris K.Y.
      • Sinha-Hikim A.P.
      • Rao M.K.
      Beta-catenin在减数后男性生殖细胞分化中的作用。
      )。 WNT信号传导通过Wnt配体激活并增加β-catenin蛋白稳定性(
      • 聪明的H.
      • nusse r.
      wnt / beta-catenin信号传导和疾病。
      ),已显示对睾丸发育和精子发生是重要的(
      • goleestaneh n。
      • Beauchamp E.
      • 堕落的S.
      • Kokkinaki M.
      • uren A.
      • 迪姆米
      WNT信号传导促进精牙龈茎/祖细胞的增殖和茎干调节。
      )。因此,P-β-catenin(S552)的下调可能影响生殖细胞和血清细胞之间的WNT活性和粘附结,最终导致精子发生缺陷和BTB中断。这个假设是由CHO部分验证的 等等。谁发现WIP1通过直接去磷酸化NLK和增加β-catenin-TCF / LEF1相互作用来增强WNT响应(
      • Cho S.J.
      • Cha B.S.
      • kwon O.S.
      • LIM J.
      • 胫骨
      • 韩D.W.
      • Ishitani T.
      • JHO E.H.
      • fornace a.j.
      • Cha H.J.
      WIP1. directly dephosphorylates NLK and increases Wnt activity during germ cell development.
      )。因此,整合整个蛋白质组和磷脂蛋白酶谱揭示了精子发生和生育缺陷 WIP1. - 缺少小鼠可以与细胞粘附/紧密结过程有关。
      基于OMICS数据,我们探讨了紧密交界处的分布和表达水平,粘附结(顶端异质专业化)蛋白和BTB完整性 WIP1. - 缺货验证。 WIP1. 缺乏症在睾丸中的紧密结合相关蛋白(封闭素和ZO-1)和顶端异质专用蛋白(N-Cadherin)的表达和免疫反应性降低,MRNA表达类似的降低。粘附的连接复合物,例如异质型专业化,促进细胞相互作用,这对血液细胞和生殖细胞之间的粘附和信号均关键(
      • MRUK D.D.
      • 程C.Y.
      在睾丸中突出的细胞间相互作用。
      )。以前的研究表明,血清细胞 - 胚细胞粘附结经受广泛的重组,以促进生殖细胞成熟和精子(
      • MRUK D.D.
      • 程C.Y.
      在睾丸中突出的细胞间相互作用。
      ,
      • 闫H.H.
      • MRUK D.D.
      • 黄色。
      • 李明。
      • 程C.Y.
      睾丸中的自分泌轴,其在精子发生期间协调精子和血液睾丸屏障重组。
      )。细长/细长的精子通过顶端异质专用粘附到Sertoli细胞,睾丸特异性致癌肌动蛋白的细胞连接(
      • 格罗夫B.D.
      • Vogl A.W.
      Sertoli细胞异质专业:一种肌动蛋白相关的粘合结合件α.
      )。最近的研究表明,在顶端异质专业化的血清细胞 - 精细化粘附的破坏导致BTB基底异质专业/紧密连接的功能受损(
      • 闫H.H.
      • 程C.Y.
      层粘连蛋白α3与β3和γ3链形成复合物,其用作成年大鼠睾丸的顶端异质专业中α6β1-整联蛋白的配体。
      )。这表明由于由于缺点而破坏顶端异质专业/紧密交界处 WIP1. 缺失可能导致与减少生育潜力相关的病理条件下的精乳酸脱落和寡聚菌。紧密结和异质专业化蛋白的生产和分布与功能性BTB的组装紧密相关(
      • 黄色。
      • MRUK D.D.
      • 程C.Y.
      生物学和调节骨质专业化,睾丸中的非典型粘附结类型。
      )。根据这些结果,我们试图确定BTB是否受到损害 WIP1. - 使用FITC-DEXTRAN示踪剂进行缺陷,并显示BTB变得效率低,并且无法防止物质的扩散到半成小管的内腔中。 BTB的破坏可导致低疗法发生和后续化学或不孕症(
      • 邱L.
      • 张X.
      • 张Y.
      • 顾J.
      • 陈米
      • 张Z.
      • 王X.
      • 王S.L.
      Sertoli细胞是全氟辛烷磺酸盐诱导的雄性小鼠的繁殖功能障碍的潜在靶标。
      )。总的来说,目前的结果表明 WIP1. 缺乏可能损害正常的BTB结构和功能,通过损害粘附/紧密的连接,导致精菌丧失和体育活动。
      负责阻断细胞粘附和BTB的机制仍不清楚。鉴于我们的结果,我们检测到一些细胞因子和趋化因子的表达水平,并显示TNF-α,IL-1α,CCL2(MCP-1),CCL3(MIP-1α),CXCL5和CXCL2的mRNA水平(MIP-2α)均显着增加 WIP1.-KO与WT小鼠睾丸相比,而TNF-α和IL-1β的蛋白质水平也升高。细胞因子介导的结蛋白的下调增加了BTB渗透性(
      • lui w.y.
      • 李明。
      激素和细胞因子调节睾丸中细胞结动力学的分子机制。
      )。米歇尔 等等。 据报道,TNF-α抑制了闭塞素,ZO-1和N-cadherin的稳态蛋白水平,导致BTB动力学的破坏(
      • 李马。
      • 夏W.
      • MRUK D.D.
      • 王C.Q.
      • 闫H.H.
      • SIU M.K.
      • lui w.y.
      • 李明。
      • 程C.Y.
      肿瘤坏死因子{alpha}可逆地破坏血液睾丸屏障并损害成年大鼠睾丸的血管上皮内的血液胚细胞粘附。
      )。因此,TNF-α可以作为结动力学的关键调节因子,并参与血清细胞胚细胞粘附的损害。 CCL2(MCP-1),CCL3(MIP-1α),CXCL2(MIP-2α)和CXCL5不仅募集巨噬细胞,而且还促进组织植物巨噬细胞增殖并增加炎症反应(
      • 王X.X.
      • y
      • 刁F.
      • 王Q.
      • 你D.
      • 江C.
      • 徐恩
      • 陈W.B.
      • 赖斯。
      • 姜S.
      • 苗X.L.
      • 冯J.
      • 陶W.W.
      • 赵楠。
      • 姚b.
      • Xu Z.P.
      • 太阳h.x.
      • 李准。
      • 沙J.H.
      • 黄X.X.
      • 施Q.H.
      • 唐H.
      • 高X.
      • 李C.J.
      在儿童腮腺炎感染引起的血清细胞中改变的蛋白质戊烯化与成年不孕症相关。
      )。 WIP1. 缺乏显着提高了睾丸中F4-80的蛋白质表达,这可以通过增加趋化因子的表达来实现。 BTB完整性的破坏可能导致生殖细胞凋亡,而TNF-α也可以触发生殖细胞凋亡(
      • 姚p.l.
      • 林Y.C.
      • 里士堡J.H.
      TNFα-介导的精子发生的破坏因啮齿动物中的Sertoli细胞损伤是由MMP2部分调节的。
      ,
      • 侯W.G.
      • 赵杰。
      • 李Z.
      • 李W.
      • 李T.
      • Xiong L.Z.
      • 张Y.Q.
      电磁脉冲辐照对小鼠血液睾丸屏障的影响。
      )。死亡信号触发了BCL-2家族(例如 Bax和Bcl-2)或可以直接诱导线粒体膜渗透性的增加,激活半胱氨酸蛋白酶,最终导致细胞凋亡(
      • 赵杰。
      • 翟尔。
      • 刘Z.
      • 吴S.
      • 徐L.
      瘦素水平和氧化应激有助于肥胖诱导的小鼠睾丸组织中的低睾酮。
      )。我们的数据显示 WIP1. 耗尽诱导明显的细胞凋亡形态变化和增加的TUNEL阳性细胞,以及增强CASPASE-9,CASPASE-3和促凋亡BAX的蛋白质水平,同时降低睾丸中的抗凋亡BCL-2水平。促炎细胞因子可能与睾丸生殖细胞凋亡和受损的BTB动力学有关,两者都有助于化学性和精子发生缺陷 WIP1. - 男性。
      总之,敲门 WIP1. 导致圆形和细长精子阶段的生育率和精子发生缺陷降低。综合蛋白质组学和磷蛋白质分析表明,DEPS和PLSC磷酸磷蛋白主要参与细胞粘附/紧密结,细胞凋亡,炎症反应,精子发生和细胞骨骼组装和解聚。基于OMICS结果的验证,我们提出了BTB完整性和BTB相关的结蛋白的变化可以代表一个负责低雄性生殖功能的途径 WIP1. - 小鼠(Fig. 8)。
      图缩略图GR8.
      Fig. 8拟合机制的原理图模型,负责诱导的体育率和精子发生缺陷 WIP1. deficiency. 促炎细胞因子通过降低结合相关蛋白的表达(Occludin,Zo-1,N-Cadherin(S552))来损害BTB和顶端异质专业化动力学,其效果可以部分地对Spermatid脱落和寡核苷酸和贫血性 WIP1. - 小鼠。

      数据可用性

      质谱蛋白质组学数据已经沉积在Proteomexchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过具有数据集标识符PXD009220的自豪伙伴存储库。项目名称:WIP1-POLPOTOUT小鼠的睾丸综合蛋白质组学和磷肝蛋白谱分析:洞察力减少生育能力;项目加入:PXD009220。

      致谢

      我们感谢北京大学基本医学学院Bing Pan博士,提供出色的技术支持,并编辑本手稿的草案的英文文本。

      补充材料

      参考

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