FLT3野生型和突变激酶底物偏好的高通量鉴定及应用于敏感的设计 体外 激酶测定基材*[S]

  • Minervo Perez.
    隶属关系
    明尼苏达大学,生物化学系,分子生物学和生物物理学系,Minneapolis,Minneapolis,MinneaTa 55455;

    普渡大学,医药化学和分子药理学系,201人大学街,西拉斐特,印第安纳州47907;
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  • John Blankenhorn.
    隶属关系
    明尼苏达大学,生物化学系,分子生物学和生物物理学系,Minneapolis,Minneapolis,MinneaTa 55455;
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  • 凯文J. Murray.
    隶属关系
    明尼苏达大学,兽医人口医学系,319 15th Avenue South East,Minneapolis,明尼苏达州55455
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  • Laurie L. Parker.
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    明尼苏达大学,生物化学系,分子生物学和生物物理学系,Minneapolis,Minneapolis,MinneaTa 55455;
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了国家癌症研究所,创新分子分析技术(IMAT)的支持,以及减少癌症健康差异分集训练分支的中心:R01CA182543,R33CA183671和R01CA182543-S1。
    [S] 本文含有补充材料。
      急性髓性白血病(AML)是一种侵略性的疾病,其特征是血液和骨髓中未成熟的髓细胞异常增加。 FLT3受体酪氨酸激酶在血液缺陷中发挥积分作用,并且AML诊断的三分之一具有FLT3中的功能性突变,其中Juxtamembrane结构域内部串联复制(ITD)和激酶结构域D835Y变体最常见。已知几种FLT3基材或磷酸化位点,限制了进入FLT3的洞察力'S基板偏好并使测定设计特别具有挑战性。我们应用了体外细胞裂解物消解的磷酸化(适应与磷蛋白蛋白酶(Kalip)技术的激酶测定和类似方法)用于三种FLT3变体的底物的高通量鉴定(野生型,ITD突变体和D835Y突变体)。将所鉴定的底物序列掺入作为Kinatest-ID底物偏好分析和测定显影管道的输入,便于通过所有三种FLT3激酶变体有效磷酸化的几种肽基材的设计。这些基材可用于测定以鉴定新的FLT3抑制剂,克服耐药突变以改善FLT3阳性AML处理。

      图形概要

      急性髓性白血病(AML)
      使用的缩写是:
      aml.
      急性髓性白血病
      RTK.
      受体酪氨酸激酶
      内部串联重复
      TKD.
      酪氨酸激酶结构域
      WT.
      野生型
      TKI.
      酪氨酸激酶抑制剂
      kalip.
      激酶测定链接磷蛋白酶
      FBS.
      胎牛血清
      PBS.
      磷酸盐缓冲溶液
      ACN.
      乙腈
      DTT.
      dithiothreitol.
      TFA.
      三氟乙酸
      HLB.
      亲水性 - 亲脂性平衡
      TRIS-HCL
      Tris(羟甲基)氨基甲烷盐酸甲烷
      EDTA.
      乙二胺四乙酸
      F A
      甲酸
      FDR.
      假发现率
      MCC.
      Matthews相关系数
      AA.
      氨基酸
      DMF.
      二甲基甲酰胺
      DMSO
      二甲基亚砜
      PDGFRβ.
      血小板衍生的生长因子β
      alk.
      Anpluplastic白血病激酶
      BTK.
      Bruton的酪氨酸激酶
      拖把
      4-吗啉过丙磺酸
      BSA.
      牛血清白蛋白
      HEPES.
      4-(2-羟乙基)-1-哌啶醇磺酸
      TBS.
      TRIS缓冲盐水
      AR.
      Amplex Red.
      2H
      两个小时
      16H
      16个小时
      SDV.
      标准偏差值
      PPM.
      位置概率矩阵
      SSM.
      站点选择性矩阵
      博士
      剂量反应。
      1使用的缩写是:aml.
      急性髓性白血病
      RTK.
      受体酪氨酸激酶
      内部串联重复
      TKD.
      酪氨酸激酶结构域
      WT.
      野生型
      TKI.
      酪氨酸激酶抑制剂
      kalip.
      激酶测定链接磷蛋白酶
      FBS.
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      PBS.
      磷酸盐缓冲溶液
      ACN.
      乙腈
      DTT.
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      TFA.
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      HLB.
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      TRIS-HCL
      Tris(羟甲基)氨基甲烷盐酸甲烷
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      乙二胺四乙酸
      F A
      甲酸
      FDR.
      假发现率
      MCC.
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      AA.
      氨基酸
      DMF.
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      二甲基亚砜
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      血小板衍生的生长因子β
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      拖把
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      牛血清白蛋白
      HEPES.
      4-(2-羟乙基)-1-哌啶醇磺酸
      TBS.
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      AR.
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      2H
      两个小时
      16H
      16个小时
      SDV.
      标准偏差值
      PPM.
      位置概率矩阵
      SSM.
      站点选择性矩阵
      博士
      剂量反应。
      是一种具有不同遗传景观的侵略性癌症。 FLT3基因对受体酪氨酸激酶(FLT3)进行调节,调节血液缺陷和对其信号传导途径的扰动似乎促进了AML疾病进展。事实上,FLT3涉及AML复发的主要因素(
      • 莱克姆。
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      在AML中针对FLT3激活的未来。
      )。 35%的AML病例对FLT3具有突变,导致激酶是组成型活性的(
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      FLT3在血产病恶性肿瘤中的作用。
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      流式细胞术分析细胞周期。
      )最常见于Juxtamembrane结构域和激酶结构域(
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      FLT3在血产病恶性肿瘤中的作用。
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      在人血液性恶性肿瘤中FLT3激活环中D835的激活突变。
      )。当一段重复(头到尾部)时发生内部串联复制(FLT3-ITD)或第一酪氨酸激酶结构域(TKD),导致蛋白质中的抑制区域丧失(
      • Yoshimoto G.
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      FLT3-ITD.上调MCL-1,促进通过FLT3-ITD的STAT5激活促进急性髓性白血病干细胞的存活。
      )。第二常见突变是在TKD中取代天冬氨酸835至酪氨酸残基(D835Y)的替代物。 ITD和TKD突变体均可激活和二聚体与野生型FLT3(
      • Kiyoi H.
      • ohno R.
      • UEDA R.
      • 锡达赫
      • 天啊
      七聚晶域内串联复制的组成型激活机制。
      )。这些突变对FLT3信号传导的影响尚不清楚,但与WT相比,一种可能性是突变体FLT3-TKD和FLT3-ITD活化替代的信号通路,或者激活标准FLT3路径。 FLT3的突变与差的长期预后(
      • 剑r.
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      靶向急性髓性白血病中的FMS样酪氨酸激酶3。
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      FLT3 -ITD的定量片段分析效果鉴定较差的预后组,具有高突变等位基因负担或长度率。
      )虽然FLT3突变的患者达到类似野生型FLT3的初始疾病缓解,但它们具有增加的复发风险(
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      FLT3在血产病恶性肿瘤中的作用。
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      FLT3 D835突变赋予II型FLT3抑制剂的差异性。
      )。 体外 研究表明,FLT3-ITD突变突变体的细胞系对胞嘧啶阿拉伯糖苷(主要AML治疗)耐药(
      • 剑r.
      • 弗里曼C.
      • 吉尔斯F.
      靶向急性髓性白血病中的FMS样酪氨酸激酶3。
      )。这些发现促使使用组合方法来包括AML疗法,包括FLT3酪氨酸激酶抑制剂(TKI),其经常是最初的成功,但通常导致FLT3抑制剂抗性和随后的疾病复发。
      目前用于抑制FLT3的目前的FDA批准的TKI专门用于靶向FLT3(
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      作为白血病患者对靶向治疗的抗性的二次突变。
      )。 Sorafenib是II型Pan-TKI,其FDA批准用于组合方法的AML化疗,但在FLT3变体中没有响应酪氨酸激酶结构域突变(
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      急性髓细胞白血病中的基因突变:对文献的综述。
      )。开发FLT3突变体特异性TKI的努力导致II型TKI Quizartinib的发现,其可以抑制FLT3-ITD突变体,目前正在进行AML的III期临床试验(
      • Larrosa-Garcia M.
      • Baer M.R.
      FLT3抑制剂在急性髓性白血病:现状和未来方向。
      )。然而,Quizartinib对FLT3-TKD点突变没有活动,因此这些突变是Quizartinib单疗法抵抗的主要模式(
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      AC220是用于治疗急性髓性白血病(AML)的FLT3的独特效率和选择性抑制剂。
      )。 Quizartinib还对血小板衍生的生长因子受体(PDGFR)和C-kit激酶​​具有有效的活性,并产生副作用,这些副作用可能与他们在接受FLT3 TKI方案的患者中的抑制作用(
      • Galanis A.
      • 马蹄
      • Rajkhowa T.
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      Crenolanib是FLT3的有效抑制剂,其活性对抗抵抗抵抗点突变体。
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      )。 Crenolanib,设计用于针对PDGFR的α和β同种型的TKI,已经证明了针对广泛的FLT3突变的活性(
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      在AML中针对FLT3激活的未来。
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      Crenolanib对抗耐药FLT3-ITD 2阳性急性髓性白血病的模型是活性的。
      )。与Quizartinib不同,Crenolanib不抑制C-kit(主激酶在安全的等离子体浓度下抑制C-kit(主要是Quizartinib的不希望的副作用),并且在驾驶员FLT3突变的复发患者中正在进行II期临床试验(NCT01657682)(
      • Galanis A.
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      Crenolanib是FLT3的有效抑制剂,其活性对抗抵抗抵抗点突变体。
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      • Shah N.P.
      Crenolanib是一种选择性I型PAN-FLT3抑制剂。
      )。然而,最近的报道表明,FLT3的激酶结构域内的次要点突变可以降低Crenolanib的临床疗效,表明它只是在临床环境中发现的抗癌症抗性抗突变的时间问题(
      • Galanis A.
      • 马蹄
      • Rajkhowa T.
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      Crenolanib是FLT3的有效抑制剂,其活性对抗抵抗抵抗点突变体。
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      Crenolanib是一种选择性I型PAN-FLT3抑制剂。
      )。
      aml.的复杂异常景观降低了单一FLT3 TKI的可能性是AML的可行单疗法。虽然Crenolanib是一个很有前途的TKI,但新抑制剂的有效发展将需要比目前可用的更好的测定,特别需要有效筛选抑制剂对靶突变形式的可适应性策略(
      • Larrosa-Garcia M.
      • Baer M.R.
      FLT3抑制剂在急性髓性白血病:现状和未来方向。
      )。由于关于FLT3基板偏好的很少,因此在设计FLT3活性测定时,很少有可用的选择。目前的活性试验受低效磷酸化活性的限制,并且尚未表征突变体变体的磷酸化。在该稿件中,我们描述了用于FLT3和两个临床 - 显着的突变体变体的几种新型和有效的肽底物(ITD和D835Y突变体)的开发。我们改编了“与磷蛋白蛋白酶联系的激酶测定”(Kalip)(

      Xue,L.,Wang,WH,Iliuk,A.,Hu,L.,Galan,JA,Yu,S.,Hans,M.,Geahlen,RL和Tao,WA,与磷蛋白酶有关的敏感激酶测定,用于识别直接激酶基材。 PROC NATL ACAD SCI。 109,5615-5620。

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      • 马丁VA Alicie下班
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      基于金属离子官能化可溶性纳米聚合物的激酶依赖性酪氨酸磷蛋白深入分析。
      )通过与其他先前报道的方法类似的方式进行策略(来自TAO实验室)以进行FLT3优选的肽衬底基序的高通量测定(例如 Kettenbach. 等等。 来自格柏集团)(
      • Kettenbach. A.N.
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      • 格柏S.A.
      质谱法快速测定多线性激酶衬底基序。
      )。在这些方法中,将细胞裂解物消化剥离内源性磷酸化,并在作为肽的假酶反应中用于通过富集和质谱法鉴定磷酸化序列来确定激酶底物偏好(理想的高通量分析许多基材同时而不需要放射性或其他标记)(
      • Meyer N.O.
      • o'donoghue a.j.
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      • Lubner J.m.
      • Balsbaugh J.L.
      • 教堂。
      • Chou m.f.
      • 施瓦茨D.
      使用蛋白质组肽文库(Propel)方法表征蛋白激酶底物特异性。
      )。然后,我们使用所识别的底物偏好来理性地设计一种含有关键序列特征的候选肽的面板,预测的是通过FLT3激酶变体的磷酸化有利,遵循我们先前报道的基材开发管线Kinatest-ID(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      )。我们证明,这些底物能够为所有三种形式的FLT3筛选抑制剂筛选。这些肽可以在许多不同类型的药物发现设置中使用,以更快和有效地筛选和验证FLT3抑制。

      材料和方法

       细胞培养和内源性肽样品制剂

      KG-1细胞(ATCC)维持在补充10%热灭活胎牛血清(FBS)的IMDM培养基(GIBCO)中,在5%CO中的1%青霉素/链霉素2 在37°C时。用30mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤KG-1细胞5次。然后将细胞以1,500rpm沉淀5分钟并用含有8的缓冲液裂解 m 尿素,0.1 m 碳酸氢铵pH8.5,20%乙腈(ACN),20米m 二硫醇(DTT)和1×Pierce磷酸酶抑制剂片剂(Roche)pH 8.0。将裂解的细胞在冰上温育15分钟,然后进行探针超声处理以剪切DNA。裂解物用40米进行处理m 碘乙酰胺并在室温下孵育60分钟。然后将样品以15,000rpm离心30分钟以除去细胞碎片。将尿素浓度稀释至1.5 m using 50 mm 碳酸氢铵缓冲液(pH8.0)和样品以1:50胰蛋白酶(热型胰蛋白酶蛋白(热型)的比例设置胰蛋白酶消化,并在37℃下孵育过夜。通过在水中加入10%三氟乙酸(TFA)来淬灭胰蛋白酶消化以降低3以下的pH。随后,使用亲水性 - 亲脂平衡共聚物(HLB)反相盒(水)脱盐,使胰蛋白酶消化物脱落,并真空干燥。

       碱性磷酸酶治疗

      在含有50μm的碱性磷酸酶去磷酸化缓冲液中重构样品m Tris(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl),0.1米m 乙二胺四乙酸(EDTA)在pH8.5时。向每个样品中加入碱性磷酸酶(6u,Roche),然后在37℃下孵育90分钟。通过将样品在75℃下孵育15分钟来淬灭反应(Fig. 1)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1细胞裂解物中的体外磷酸化,富集和鉴定底物肽。 为了鉴定比以前可获得的更多数量的FLT3激酶基质,我们将KG-1细胞裂解物与胰蛋白酶消化进行(步骤1)。然后用碱性磷酸酶处理胰蛋白酶消化(步骤2a)。随后,将样品分成两个相等的部分(步骤2b) 体外 重组FLT3处理(FLT3-WT,FLT3-D835Y和FLT3-ITD)。将样品富含多种聚酰磁珠(步骤3),并在嵌合融合质谱仪上分析等分试样(步骤4)。质谱仪文件上传到Galaxy-P蛋白质组学管道,用于文件转换和蛋白质页夹数据库搜索(步骤5)。

       Kalip重组FLT3激酶测定

      重组激酶购自EMD Millipore(WT,PN:PV3182; FLT3-D835Y,PN:PV3967; FLT3-ITD,PN:PV6190)。将样品短暂地涡旋并等来分为两个相等的部分。在含50μm的激酶反应缓冲液中重构肽样品m Tris HCl,pH 7.5,10米m MgCl2, 1 mm DTT, 1 mm Na3vo.4 和 2 mm 腺苷5'-三磷酸(ATP)。最后加入激酶(或对照)最后加入每个样品,并在37℃下孵育16小时(16小时)。 FLT3-WT处理含有另外的两小时(2H)时间点。通过使用30微米颗粒尺寸和30毫克吸附剂的Oasis HLB 1CC盒柱(水)使TFA浓度和脱盐,通过将TFA浓度和脱盐脱落来淬灭反应。

       多元富集

      磷酸富集富集根据制造商的说明进行(Tymora Analytical,West Lafayette,In)(

      Xue,L.,Wang,WH,Iliuk,A.,Hu,L.,Galan,JA,Yu,S.,Hans,M.,Geahlen,RL和Tao,WA,与磷蛋白酶有关的敏感激酶测定,用于识别直接激酶基材。 PROC NATL ACAD SCI。 109,5615-5620。

      ,
      • iliuk a.b.
      • 马丁VA Alicie下班
      • geahlen r.l.
      • 陶w.a.
      基于金属离子官能化可溶性纳米聚合物的激酶依赖性酪氨酸磷蛋白深入分析。
      )。富集试剂盒由四种组分组成:(1)加载缓冲液,(2)多种磁珠,(3)洗涤缓冲液1和2,和(4)洗脱缓冲液。简而言之,将干燥的肽重新悬浮在加载缓冲液中,加入到混合物中加入100μl的聚捕珠。将磷酸肽 - 多种混合物在700rpm混合30分钟。随后,将混合物简单地离心并置于磁架上以除去未磷酸化的肽溶液。用洗涤缓冲液1洗涤珠子两次,并以700rpm摇动5分钟。将磷酸肽 - 多种聚酯置于磁台上,直至通过磁体固定珠子,弃去上清液;使用洗涤缓冲液2重复该方法。使用300μl洗脱缓冲液从捕获珠粒洗脱磷酸肽,然后真空干燥。

       LC-MS / MS数据采集

      在25μl质谱载荷缓冲液中重构样品(98/2 / 0.5%; H.2O / ACN /甲酸(FA))并以15,000rpm离心30分钟。将20μL等分试样转移到低结合安全锁定微管(EPPendorf)中。将2.5μL等分试样加载在热型易纳米LC 1000系统上。使用100μm内直径的Picotip发射器柱进行反相序列的HPLC肽分离,其内部的内部填充,具有1.9μmC18的Reprosil-pur吸附剂。流动相由乙腈(溶剂B)中的超纯水(溶剂A)和0.1%甲酸中的0.1%甲酸组成。样品在线性梯度(2-30%溶剂B; 60分钟)上运行,流速为200nl / min,进入高分辨率玻璃纤维融合型纤维质谱仪,使用数据相关模式以60,000的分辨率进行扫描操作范围为300-1500. m/z。在每轮前体检测后,使用高碰撞解离(HCD)在前12个最丰富的离子上触发MS / MS实验。质量分析仪参数在两个和七个充电状态之间设置,动态排除时间为15秒。

       数据分析

       磷肽鉴定

      搜索orbitrap Fusion Mass Spectra文件,用于从Uniprot.org下载的审查的人工UNIPROT数据库的合并版本(2/27/2017; 20,202条目)和CRAP数据库(普通实验室污染物;从(thegpm.org/crap下载/)2017年2月27日)在Galaxy-P管道内使用ProtoNPilot 5.0蛋白质组搜索引擎中的Paragon算法,以创建不同的肽报告(来自蛋白质Pilot 5.0的输出报告)(
      • afgan e。
      • 贝克D.
      • van den Beek M.
      • Blankenberg D.
      • Bouvier D.
      • èechm。
      • 谢尔顿J.
      • Clement D.
      • Coraor N.
      • Eberhard C.
      • Grüningb.
      • Guerler A.
      • 希尔曼 - 杰克逊J.
      • von kuster g.
      • Rasche E.
      • Soranzo N.
      • Turaga N.
      • 泰勒J.
      • Nekrutenko A.
      • Goecks J.
      无障碍,可重复和协作生物医学分析的银河系平台:2016年更新。
      ,
      • Boekel J.
      • Kumar P.
      • 东方C.
      • esler m.
      • Mehta S.
      • Eschenlauer A.c.
      • 赫格曼A.D.
      • jagtap p.d.
      • 格里芬T.J.
      使用Galaxy的多OMIC数据分析。
      ,
      • Shilov I.v.
      • Seymour S.L.
      • Patel A.A.
      • Loboda A.
      • 唐W.H.
      • Keating S.P.
      • 猎人C.L.
      • Nuwaysir L.M.
      • Schaeffer D.A.
      Paragon算法是使用序列温度值和特征概率的下一代搜索引擎来识别来自串联质谱的肽。
      )。将肽前体质量容差设定为0.02Da,并且MS / MS耐受设定为0.1Da。蛋白质组学数据库搜索参数包括胰蛋白酶消化,尿素变性,磷酸化强调,碘乙酰胺固定修饰对半胱氨酸残基,以及可变生物修饰。针对每个单独的搜索激活虚假发现率(FDR)分析。蛋白质pilot 5.0使用反向数据库作为诱饵来计算每个独立搜索的错误发现率(fdr)(
      • 唐W.H.
      • Shilov I.v.
      • Seymour S.L.
      从诱饵数据库搜索确定局部错误发现率的非线性拟合方法。
      )我们将全球1%的FDR分数设置为截止阈值。

       数据处理和Kinatest-ID基板候选预测

       简化LC-MS数据的数据处理作为Kinatest-ID算法基板设计的输入

      开发了一系列新颖的脚本来准备和分析Kalip的结果,以设计Kinatest-ID平台中的潜在基板。这些步骤和脚本在补充方法中更详细地描述,并在支持信息文件“Kinatestsop.docx”中提供了按顺序运行每个脚本的详细说明。从蛋白质单滴蛋白蛋白质肽报告中提取和重新改进磷酸肽序列,我们创造了从蛋白质活蛋白5.0(SCIEX)不同的肽报告产出文件中提取的KINAMINE程序和GUI,其含有磷酸化的酪氨酸残基(1 %FDR),并创建“基板”和“基板背景频率(SBF)”文件,其包含观察到的基板序列和UNIPROT(UNIPROT.ORG)登录号,并计算出碱序列的蛋白质的所有氨基酸的表示分别识别出来。我们创建了“共度和差异finder.r”脚本,以识别由所有FLT3激酶变体共享的“基板”和SBF文件的磷酸肽,并生成“共享-16h”基板和SBF文件。我们从SBF列表中提取了UniProt登录号,并使用它们从UniProt网站下载仅为这些蛋白质序列包含条目的UNIPROT网站,并使用“Fastatocsv”脚本将其转换为.csv格式。我们创建了“负motif finder.r”脚本来提取(和 在Silico. 胰蛋白酶消化)任何“背景”蛋白质中的所有酪氨酸居中序列,并将它们与底物列表(Kinamine输出)进行比较,以返回在磷蛋白质数据中未观察到的序列作为“非基板的最佳估计。 “

       Kinatest-ID简化了R中的处理

      使用基板,基板背景频率,非基板图案和筛选器.CSV,编写脚本“Kinatest-R part1.r”和“Kinatest-R part2.r”以复制先前描述的Kinatest-ID工作簿的功能(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      ),包括确定特定氨基酸的过度和表示(所述 标准偏差表/位置评分矩阵)和/或侧链化学性质( 站点选择性矩阵)特定位置相对于酪氨酸来定义优选的基板基序,将该基序的置换置换为它们给定位置在其给定位置的所有可能组合的列表中(发电机)和对靶向激酶的位置评分矩阵模型的那些序列的评分以及其他脱靶激酶的面板的序列(筛选器)。这些脚本最终创建了用户名为的三个.csv输出文件,并分别包含以下信息(所有与原始发布的Kinatest-ID实现的步骤和组件一致)(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      ):1)标准偏差和AA百分比; 2)站点选择性矩阵,内源性概率矩阵(EPM)(给出了通过由给定输入数据集定义的位置评分矩阵模型计算给定序列的分数的评分函数),归一化分数和MCC表征桌子; 3)使用筛选器比较根据最低“偏离靶”激酶分数的预测底物列表。有关这些函数的详细信息,请参阅以前发布的Kinatest-ID描述(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      )。

       肽合成和纯化

      使用4-甲基甲苯基丁胺盐酸盐树脂(虹膜Biotech GmbH),使用蛋白质技术Symphonyx合成剂合成肽。标准的FMOC保护氨基酸(AA)偶联在95米存在下发生m HCTU(虹膜Biotech GmbH)和200米m 在两个20分钟的耦合循环上,N-甲基丙酮(陀螺蛋白技术; S-1L-NMM)。 FMOC脱保护发生在二甲基甲酰胺(DMF,IRIS Biotech GmbH)中存在20%哌啶(DMF,虹膜Biotech GmbH;)超过两个5分钟的循环。肽纯化为>通过制备C18反相HPLC(Agilent 1200系列)95%纯度超过5-25%乙腈/ 0.1%TFA和水/ 0.1%TFA梯度,并使用HPLC-MS(Agilent 6300 MSD)表征。将肽底物溶解在含有5%二甲基亚砜(DMSO)的PBS溶液中。使用280nm波长的吸光度测量用于使用Beer-Lambert Law确定肽浓度,使用Innovagen的肽性能计算器计算肽消光系数(//pepcalc.com/)。

       体外激酶测定

      从SignalChem(FLT3,FLT3-D835Y,FLT3-ITD,桅杆/干细胞生长因子受体试剂盒,血小板衍生生长因子受体β(PDGFRβ),气塑性白血病激酶(ALK),原癌基因酪氨酸 - 蛋白激酶SRC,酪氨酸蛋白激酶Lyn和Bruton的酪氨酸激酶(BTK))。激酶稀释至〜20 nm 在激酶稀释缓冲液中(20米m 4-吗啉过丙磺酸(MOP)pH 7.5,1米m EDTA,0.01%Brij-35,5%甘油,0.1%β-巯基乙醇和1mg / mL牛血清白蛋白(BSA)。重组激酶(20 n m)在含有25米的反应缓冲液中预孵育15分钟m 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烯磺酸(HEPES)pH 7.5,10米m MgCl2,100μ.m ATP, 3 mm DTT, 3 μm NaVO3 在37°C和5%DMSO。通过将肽基质添加至37.5μ来开始测定反应m 反应浓度为30μl体积。通过用30米组合1:1淬灭样品等分试样(10μl)m EDTA在2和60分钟的时间点(或TKI剂量响应测定的30分钟时间点)。

       磷酸化的渐芬荧光检测

      将淬火等分试样在Tris缓冲盐水中的96孔链霉蛋白涂覆的板(125pmol结合能力,热化学)中温育(25米m TRIS-HCL and 150 mm NaCl)0.05%Tween 20(TBS-T)含有5%w / v脱脂乳的1小时
      • Lipchik上午
      • Killins R.L.
      • geahlen r.l.
      • Parker L.L.
      基于肽的生物传感器测定以检测细胞内Syk激酶活化和抑制作用。
      )。随后,用TBS-T洗涤每个孔,并与抗磷脂蛋白酶小鼠单克隆抗体4G10(毫升,1:10,000在TBS-T中稀释)温育。孵育后,用TBS-T洗涤孔并与辣根过氧化物酶 - 共轭兔抗小鼠免疫球蛋白二次抗体(ABCAM,1:15,000稀释TBS-T)温育1H。井被洗涤(TBS-T和50米m 磷酸钠缓冲液,然后用Amplex Red(Invitrogen,Carlsbad,Ca)反应缓冲液(0.5米m AR, 20 mm H2O2 和磷酸钠缓冲液)30分钟。在Neo2微孔板读取器(Biotek,Winooski,Vt)上拍摄荧光测量,激发波长为530nm,发射波长为590nm。 IC.50 通过将数据拟合到下面的等式的数据来计算值,是抑制最大限度 代表曲线的较低高原,而抑制则 涉及上原平台,X表示抑制剂浓度,并且曲线的陡度被设定为负面的标准山坡。
      y=inhibition最大限度+(inhibitioninhibition最大限度)1+(X/IC50)


       实验设计与统计理由

      对胰蛋白酶消化“文库”制剂进行两次独立的重复进行,每次将其进行FLT3激酶变体酶(补充图。S1)。将原始质谱仪文件的文件转换为MGF格式,将得到的六个激酶处理的文件每FLT3变体组合成一个蛋白质蛋白5.0蛋白质识别搜索。如上所述处理这些蛋白质组数据库搜索结果(Kinamine和R数据格式脚本)以生成Kinatest-ID输入列表(Fig. 1 第5步和 Fig. 3)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3FLT3-WT.,FLT3-D835Y和FLT3-ITD的位置偏好,基序和衬底候选迷你库。 A,在三个FLT3变体(WT,D835Y和ITD)的单个磷蛋白质数据集中观察每个位置(-4至+4相对于磷酸酪氨酸)的每个氨基酸的表示和在所有三个数据集中共享的序列(共享)。绿色=超代表的,白色=中性,红色=代表不足。 B,表总结了位置偏好(>1标准偏差从平均值的平均值中使用的Kinatest-R部分2.R的“发生器”刀具部分,用于合理设计候选衬底序列的置换。通过颜色标度示出在各个位置处的给定氨基酸的表示以供参考。 C,选择,合成的候选基板的序列和对每个数据集的各个评分模型(共享和单独变体)的相应评分模型进行控制和分数
      Dixon的Q测试具有0.05的α值和Q值设定为5%的探测试验,以鉴定抑制剂剂量反应测定中的实验异常值。通过棱镜软件(GraphPad,La Jolla,CA)绘制的仅荧光测量值(DMSO)控制信号被标准化为仅用于车辆(DMSO)控制信号,并配合到上述非线性方程。与a的精确平方和正方形 p 进行0.05的值以识别报告的IC的差异50 针对FLT3激酶变体的每个TKI曲线。

      结果

       体外激酶反应以鉴定用Kinatest-ID管道输入/分析的底物

      类似于Kalip方法(

      Xue,L.,Wang,WH,Iliuk,A.,Hu,L.,Galan,JA,Yu,S.,Hans,M.,Geahlen,RL和Tao,WA,与磷蛋白酶有关的敏感激酶测定,用于识别直接激酶基材。 PROC NATL ACAD SCI。 109,5615-5620。

      ) 和别的 (
      • Kettenbach. A.N.
      • 王T.
      • Faherty B.K.
      • Madden D.R.
      • Knapp S.
      • Bailey-Kellogg C.
      • 格柏S.A.
      质谱法快速测定多线性激酶衬底基序。
      ,
      • Hutti J.E.
      • jarrell e.t.
      • 常J.D.
      • Abbott D.W.
      • Storz P.
      • TOKER A.
      • 坎特利L.C.
      • 土耳其人B.E.
      一种确定蛋白激酶磷酸化特异性的快速方法。
      ),我们使用胰蛋白酶消化的细胞裂解物作为非随机化肽“文库”,以确定FLT3激酶底物偏好。简而言之,将AML KG-1细胞生长为对数相,用尿素裂解缓冲液裂解并如上所述用胰蛋白酶消化。在胰蛋白酶消化后,用碱性磷酸酶处理肽以除去酪氨酸的内源性磷酸化。然后将磷酸酶处理的消化分为并平行处理的等分试样:用激酶反应混合物处理,但没有激酶(“FLT3-”),以及每个版本的激酶的激酶反应(重组FLT3-WT,D835Y或ITD激酶分别,“FLT3 +”)(Fig. 1)。如原始Kalip协议中所述,对激酶反应进行16小时(WT,D835Y和ITD)(

      Xue,L.,Wang,WH,Iliuk,A.,Hu,L.,Galan,JA,Yu,S.,Hans,M.,Geahlen,RL和Tao,WA,与磷蛋白酶有关的敏感激酶测定,用于识别直接激酶基材。 PROC NATL ACAD SCI。 109,5615-5620。

      )。在激酶处理之后,使用可溶性多元蛋白树枝状聚合物富集磷肽(

      Xue,L.,Wang,WH,Iliuk,A.,Hu,L.,Galan,JA,Yu,S.,Hans,M.,Geahlen,RL和Tao,WA,与磷蛋白酶有关的敏感激酶测定,用于识别直接激酶基材。 PROC NATL ACAD SCI。 109,5615-5620。

      ,
      • iliuk a.b.
      • 马丁VA Alicie下班
      • geahlen r.l.
      • 陶w.a.
      基于金属离子官能化可溶性纳米聚合物的激酶依赖性酪氨酸磷蛋白深入分析。
      ,
      • 薛L.
      • 王P.
      • CAO P.
      • 朱俊克。
      • 陶w.a.
      使用稳定同位素标记激酶测定连接磷蛋白酶鉴定ERK1直接衬底的鉴定。
      )并分析在侧面融合质谱仪上。使用Galaxyp平台上的蛋白质Pilot 5.0软件进行序列和磷酸化位点鉴定(http://galaxyp.msi.umn)。
      总体而言,我们识别出FLT3的底物超过10倍,两个突变体变体比我们在先前的出版物中使用Kinatest-ID进行评估的两个突变体变体,其中基板编号从~15到~170的范围内(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      )。利用相对严格的识别质量截止1%的假发现率(FDR),我们观察到从激酶反应的1559次磷酸化肽与WT FLT3处理,2010来自FLT3-D835Y突变体,344来自FLT3-ITD突变体。其中,每次反应都有244个共同(Fig. 1)。 FLT3-D835Y突变稳定激酶结构域内的活化环,导致稳定,组成型活性激酶(
      • Yamamoto Y.
      在人血液性恶性肿瘤中FLT3激活环中D835的激活突变。
      ,
      • 史密斯C.C.
      • 关联。
      • Stecula A.
      • 萨利A.
      • Shah N.P.
      FLT3 D835突变赋予II型FLT3抑制剂的差异性。
      ),其可能解释在该反应中观察到的磷酸肽的数量较高。 FLT3-ITD突变体是一种内型基因序列复制,用于编码连接juxtamembrane和酪氨酸激酶结构域的氨基酸区段。虽然这些Kalip实验中使用的激酶的WT和D835Y版本仅包含他的标签(如供应商所述),但ITD突变体也用GST标记标记。由于其相对于WT和D835Y变体的较大分子量,因此在Kalip反应中使用该激酶的较少,这可能考虑用于该变体的较低数量的基材。尽管如此,与先前实施的文献报告的底物和磷蛋白质数据库的手工策序相比(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      ),即使对于ITD突变体,我们的方法也鉴定了比以前更多的磷酸肽序列,这可以用作Kinatest-ID管道的输入。
      我们使用来自每个激酶反应的衬底序列的完整列表(“WT-16H,”D835Y-16H,“或”ITD-16H“数据集),或者从所有三个中识别的244个常见的底物序列FLT3变体的反应(“共享-16h”数据集),作为Kinatest-ID中的初始位置评分矩阵(PSM)分析的单独输入。使用数据处理和分析工具,kinamine和共性和差异查找器和Kinatest-R部分1.r脚本从磷蛋白蛋白质数据输出中提取共享衬底序列.R脚本(Fig. 2),在补充方法部分中描述,从每个数据集产生氨基酸偏好图案的PSM(Fig. 3)。我们观察到微妙,但可能在功能上微不足道,氨基酸的差异相对于每个不同FLT3变体的磷酸化酪氨酸在磷酸化酪氨酸上过度,并且在+ 4上差异。通常,对于所有变体,酸性氨基酸均持倍增,并且碱性氨基酸低于磷酸酪氨酸的N-末端,而疏水性氨基酸和谷氨酰胺/天冬酰胺略微超过磷蛋白酶的C末端。鉴于WT和突变体变体的PSM之间缺乏显着差异,我们专注于所有三种激酶变体的常见观察到的底物,以便在FLT3活性测定中的底物中使用新型肽的设计。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2概念概述我们的Kalip数据处理和格式化Kinatest-ID的格式化开发FLT3人造基材。 在Galaxy-P蛋白质组学管道中转化和肽/蛋白质ID后,KINAMINE数据格式化工具提取了含有磷酸化酪氨酸残基(PY)的自信鉴定的(1%FDR)序列,将序列与感兴趣的酪氨酸中央对齐(“对齐的基材列表”)并用随附的蛋白质'氨基酸组成文件(“潜艇。背景频率”提取Uniprot登录号。这 阴性图案发现者 脚本使用Uniprot登录号来生成在磷酸肽数据集中未观察到的含有含酪氨酸的潜在胰蛋白肽的列表。脚本Kinatest-R part1.r和-part2.r处理了那些输入文件以识别基板偏好,并生成作为潜在FLT3基板的排名候选序列列表。然后,Kinatest-R part2.r将输入基板和非基板列表分别分为两个附加文件。在从FLT3激酶反应的磷酸肽数据进行这种工作流程后,合成并验证了所选择的候选序列 体外 针对FLT3激酶变体。然后测定候选序列 体外 针对激酶的小组来确定靶靶激酶活性。 在Silico./预测步骤以白色/绿色说明。合成肽和表征FLT3活性和特异性的经验步骤以浅蓝色描绘。

       基于Kinatest-ID的新颖设计 FLT3 Artege SUbstels Pep.潮汐 (FAStides)

      然后,我们使用了“共享-16h”数据集,并采用了Kinatest-ID方法的下一步来设计一组候选序列,用于合成和生物化学测试。该过程使用了Kinatest-ID“生成器”工具(通过Kinatest-R部分2.R脚本)来创建序列列表,该序列包括通过至少两个标准偏差与平均值至少有两个标准偏差以占据各个位置的氨基酸的所有序列(Fig. 3A3B)。一种警告是,虽然在-1和+1到磷酸酪氨酸的过度呈现酪氨酸,但是我们选择将其从偏好图中排除在偏好的基板设计中,因为可以最终引入的测定信号中的潜在模糊性。在设计的基板中具有多于一种可磷酸化残留物。另外,将F作为+1(尽管具有相对低的表示)作为疏水性替代物作为更高度代表的I和V的替代,以试图提供更好的特异性,因为这两个氨基酸的高频率该位置在图案中的其他酪氨酸激酶。然后通过针对WT FLT3,两个突变体变体和其他激酶的面板进行抵抗PSM的所得19,201序列的所得19,201序列的置换。
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
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      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      ),使用Kinatest-ID“筛选器”工具(Fig. 2)。总结了序列及其对PSM的分数 Fig. 3C 虽然他们的“脱靶”激酶PSM分数总结在 Fig. 5G。我们选择了一组序列,对FLT3进行了良好,但对于其他激酶(序列A,D,G和H)而得分差。因为FLT3的最高评分序列也在筛选面板中的其他几个其他脱靶激酶均得很好,所以我们选择了另一组序列(序列B,C,E和F),以具有获得高效的可能性更高(但是可能不是FLT3特异性)衬底。此外,我们合成了两种控制序列(表I.以前据报道的是由FLT3(ABLTEDE和FLT3氧化物)磷酸化(
      • böhmerf.d.
      • Uecker A.
      用于FLT3受体酪氨酸激酶的底物肽。
      ,
      • Warkentin A.A.
      • Lopez M.S.
      • Lasater E.A.
      • 关联。
      • 他是b.l.
      • 梁A .Y.
      • 史密斯C.C.
      • Shah N.P.
      • Shokat K.m.
      由于合成致命毒性为FLT3靶向急性髓性白血病疗法而克服骨髓抑制。
      )。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5在FLT3特异性的有限测试中,将聚焦的肽文库测定为激酶。 A-F.,对于每个激酶分别显示每种肽(行)的每种肽(行)的磷酸化水平,每个激酶分别示出,颜色尺度归一化到该激酶的ELISA检测的最小/最大RFU值。行1-8中所示的快速候选数据,参考肽数据在第9行中显示为激酶活性的阳性对照。 G,每个快速候选的PMS分数和用于从文献策料基板输入列表中内置于Kinatest-ID筛选器工具中的13个激酶(列)的两个参考肽(行)。分数由从低(白色)到高(橙色)的颜色量表表示。 H,从筛选器工具中的“偏离目标”活动预测,指示预测的激酶数量以容许给定序列作为基板。
      表格1TKI. IC.50 VALUES (pm)±S.E.
      TKI.FLT3-WT.FLT3-ITD.FLT3-D835Y.
      SEQ。 E.SEQ。 FSEQ。 E.SEQ。 FSEQ。 E.SEQ。 F
      索拉非尼8.7±3.513±11.780±300.550±81.1,800±300.3,200±940.
      Quizartinib.8.6±1.332±20.190±110266±49.NA.4,700±870.
      Crenolanib.13±3.81.3±0.9245±14.52±8.915±1.432±7.9

       在FLT3激酶变体基材的情况下快速序列的体外验证

      我们通过候选序列通过 体外 激酶测定使用抗磷酸酪氨酸抗体4G10在化学荧光酶联免疫吸附试验(ELISA)中作为读出以检测肽磷酸化,样品等分试样在2和60分钟中淬灭。 Fig. 4A 表明,由FLT3-WT,D835Y和ITD最有效地磷酸化的序列含有DXDXYXNXN基序。 Fig. 4A 表明S在位置耐受耐受-3(而N和H耐受较低),在位置-1处耐受N和D,并且F是位置+ 1的优选氨基酸,而A不良好耐受。在位置+3处含有F,P或T残基的序列被所有FLT3激酶磷酸化。对照肽(FL-ABLTEDE和FLT3偶联)对所有数据集(Fig. 3C)和与FLT3激酶变体的短曲序列平行测定。先前报道的衬底FLT3偶联(
      • böhmerf.d.
      • Uecker A.
      用于FLT3受体酪氨酸激酶的底物肽。
      )对我们的模型较差,并且在我们的测定中是一个差的FLT3基板(Fig. 4A)。 abltiate,先前报道的flt3衬底(
      • Warkentin A.A.
      • Lopez M.S.
      • Lasater E.A.
      • 关联。
      • 他是b.l.
      • 梁A .Y.
      • 史密斯C.C.
      • Shah N.P.
      • Shokat K.m.
      由于合成致命毒性为FLT3靶向急性髓性白血病疗法而克服骨髓抑制。
      ),适度地对抗共享-16H数据集模型进行得分,并以适度为基板进行。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4FLT3激酶变体活性测定和评分模型相关性。 A,FLT3(WT,D835Y和ITD) 体外 激酶测定结果候选序列(A,B,C,D,E,F,G和H)。每个FLT3变体(柱WT,D835Y,ITD)与每种肽(行)反应,在2和60分钟(亚柱)中取出等分试样。 RFU从ELISA检测表明的磷酸化水平,通过颜色刻度(绿色=高磷酸化,白色=低/无磷酸化)。 B,效果 体外 Kalip激酶测定培养时间对候选序列的Kinatest-ID评分。针对在WT 2H或16H Kalip激酶反应中观察到的所有磷酸肽的模型(列)的位置评分模型分数(柱)分别或仅在(WT重叠)中观察到的所有磷酸肽。从红色(低pms分数)到绿色的颜色刻度(高pms得分)。 C,Spearman的非参数相关测试来测量Kinatest-ID评分系统之间的相关性和 体外 活动试验结果。 r值以粗体显示在上面 p 在括号中表示的值。色标表示高(绿色)Spearman R值的低(红色)。

       评估基板输入数据集之间的关系并产生PSM模型分数与生物化学测定

      快速序列A,B,D,E,F和G通常具有比C和H更高的PSM谱,并且在测定中的比C和H更有效地磷酸化。在所有基质中,FLT3氧化物参考肽在测定中非常差异,在测定中非常差,并且具有适度刻度的FL-ABLTEDE相对于测定中的最佳短缺序列中适度地磷酸化。对于较长的Kalip激酶反应(16小时),每个变体的生化测定结果在60分钟和WT-16H数据设定衍生的PSM分数之间发现最强的相关性(Fig. 3C)。快速序列与D835Y-16H PSM型号的最低序列相位,其包含最大的基材列表(2010年基材),并且它们的得分分别与WT,D835Y和ITD变体的测定结果较低。这最有可能归因于该PSM的输入数据集的较大尺寸的组合,并且基于与其他两个变体共享的数据的所选择的数据,而不是用于导出的整个数据集的所选子集这个PSM模型。使用具有最小基板列表(共享-16h和ITD-16h)的PSM模型的快速序列接收了更高的分数,这也主要是用于设计空间的较小数据集中的所有或几乎所有序列的伪影。第一名。然而,这些评分与生物化学测定结果较小,这也可能从较小的数据集伪影或其他一些影响来自那些数据集的预测模型的准确性的尚未识别的因素产生。

       评估衬底基序预测体外激酶处理的时间长度

      我们还研究了KALIP-KINATEST-ID工艺以鉴定可用于酶测定的有效底物的能力的激酶处理步骤中的反应时间的影响。我们使用FLT3-WT激酶进行了两小时的激酶反应,并如上所述加工数据(以下称为WT-2H),以确定Kalip激酶治疗时间是否受到影响1)给定的偏好图案的特征数据集和2)其用于后续基板设计的实用性。我们鉴定了来自2HKALIP FLT3-WT激酶处理的888个磷酸肽(相对于如上所述的16-H处理的1559)。我们将“WT-2H”与“WT-16H”的基材列表进行比较,并发现两者的559个序列。这些序列称为“WT - 重叠”基板和背景频率列表,所示的序列可能已经迅速且稳健地磷酸化(Fig. 4B)。将相应的SDV值与来自WT-2H和WT-16H实验的每个衬底列表进行比较,如图所示 补充图S3.
      总的来说,由SDV表表示的每个位置处的偏好相似(补充图S3)然而,从两小时孵育中的WT-2H数据中的微妙差异导致得分模型,其似乎更准确地反映了在生物化学实验中观察到的WT激酶的基材磷酸化效率,相对于衍生自WT的模型-16h数据集。将来自WT-2H,WT-16H和WT重叠数据集的PSM分数与八个快速和两种对照肽的测定结果进行比较(Fig. 4A)。 Spearman相关性显示在 Fig. 4C。与WT-16H一样,通过WT-2H和WT - 重叠数据集产生60分钟的测定信号非常高度相关,对于WT-2H而言,对于WT-Rodalap和Wt 16h,显得稍微稍强。这可能表明较短的Kalip激酶治疗时间更好地确定更有效(IE。 快速地)磷酸化底物,并且较长的处理可以“稀释”底物偏好基序与较低效率的序列。

       速度表征快速FLT3特异性

      虽然 体外 使用这里鉴定的新肽的重组激酶测定不需要精致的特异性,因为它们通常使用纯化的激酶,我们希望使用小型其他激酶的小面板对这些肽的“脱靶”磷酸化进行有限的评估:套件, PDGFRβ,ALK,SRC,LYR和BTK。试剂盒和PDGFRβ是尚未鉴定底物偏好基质的激酶,然而,它们在与FLT3相同的激酶家族中,并基于对其他激酶的观察(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      ),可能磷酸化与FLT3相同的外壳。基于先前发布的PSM评分型号(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      )(从手动衬底列表策施导出而不是Kalip方法),预测SRC磷酸酯序列B,C,E和F,而Lyn预计磷酸盐序列A和C. BTK预计不会磷酸化任何速度序列。另外,我们的面板包括受体酪氨酸激酶Alk,我们以前观察到磷酸化与SRC磷酸化的那些相似的序列(
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      用于促进淋巴瘤激酶(ALK)活性的时间分辨的发光生物传感器测定。
      )。为了确保每种重组激酶有效,我们进行了 体外 具有几种参考肽的激酶测定,其先前已经表征在我们的实验室用于面板中的激酶。我们之前报道的U5(DeayaTVA)的“通用”酪氨酸激酶底物(
      • Shilov I.v.
      • Seymour S.L.
      • Patel A.A.
      • Loboda A.
      • 唐W.H.
      • Keating S.P.
      • 猎人C.L.
      • Nuwaysir L.M.
      • Schaeffer D.A.
      Paragon算法是使用序列温度值和特征概率的下一代搜索引擎来识别来自串联质谱的肽。
      )作为试剂盒,PDGFRβ和BTK的参考肽,以及我们先前报道的ALK基材(Alastid()
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      用于促进淋巴瘤激酶(ALK)活性的时间分辨的发光生物传感器测定。
      ,
      • Marholz L.J.
      • zeringo n.a.
      • 娄H.J.
      • 土耳其人B.E.
      • Parker L.L.
      在硅设计和通用酪氨酸激酶肽基材的体外表征。
      )用于alk(Fig. 5A5F)。 sfipicide-a(dediyeeld)(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      )用作SRC和Lyn激酶的参考肽。简而言之,激酶用激酶反应混合物预孵育 体外 通过添加底物肽引发反应。如上所述,在2和60分钟的时间点淬灭样品。使用先前描述的基于ELISA的测定法测量磷酸化(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      ,
      • Lipchik上午
      • Killins R.L.
      • geahlen r.l.
      • Parker L.L.
      基于肽的生物传感器测定以检测细胞内Syk激酶活化和抑制作用。
      )结果显示在 Fig. 5.
      总的来说,该面板中最小目标磷酸化的序列是短款-A,其通过C-kit和PDGFR适度磷酸化β (FLT3家族成员)和LYX在60分钟后,但不是面板中的其他物品,并且仅通过C-kit和SRC在60分钟后磷酸化到相对低位的较低程度(Fig. 5A5E)。通过更多脱靶激酶通过60分钟的更多脱靶激酶磷酸化的FaSTIDE-B,-D -F和-F为SRC和LYN的FASTIPE-C是鲁棒衬底。另一方面,PDGFRβ和BTK在60分钟的培养中没有磷酸化任何人造序列。偏离目标 体外 激酶测定结果主要是与筛选器预测完全一致,这并不令人惊讶,因为筛选器受到其交叉引用算法中的PSM模型的限制 - 主警告是筛选器中的PSM模型都来自于此开发了Kinatest-ID包(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      )没有Kalip磷蛋白组数据作为输入。未来的目标是使用新生成的Kalip数据更新当前激酶PSM,以及从更多Kinases添加数据以改善交叉引用深度。

       通过超细磷酸化检测FLT3激酶变体抑制作用

      为了证明如何使用FLT3人造基材来监测TKI疗效,我们用Sorafenib,Quizartinib和Crenolanib进行FLT3-WT,FLT3-D835Y和FLT3-ITD的剂量 - 反应(DR)测定,这是一项已经表征的三个TKIS三种FLT3变体(
      • 威廉姆斯A.B.
      • Nguyen B.
      • Li L.
      • 棕色P.
      • Levis M.
      • Leahy D.
      • 小D.
      FLT3 / ITD的突变赋予多种酪氨酸激酶抑制剂的抗性。
      ,
      • Galanis A.
      • 马蹄
      • Rajkhowa T.
      • Ramachandran A.
      • 小D.
      • Cortes J.
      • Levis M.
      Crenolanib是FLT3的有效抑制剂,其活性对抗抵抗抵抗点突变体。
      ,
      • 史密斯C.C.
      • Lasater E.A.
      • 林K.C.
      • 王Q.
      • McCreery M.Q.
      • 斯图尔特W.K.
      • 达蒙L.E.
      • perl a.e.
      • 耶稣基金。
      • Sugita M.
      • Carroll M.
      • Kogan S.C.
      • Kuriyan J.
      • Shah N.P.
      Crenolanib是一种选择性I型PAN-FLT3抑制剂。
      ,
      • Liegel J.
      • Courville E.
      • Sachs Z.
      • Ustun C.
      Sorafenib在FLT3 / ITD阳性急性髓性白血病中移植后复发的使用:成熟诱导和细胞毒性作用。
      )。选择FASTIPE-E和FASTIDE-F作为博士测定,因为它们通过所有三种FLT3激酶变体的有效磷酸化并在并行实验中使用。将每个FLT3激酶变体预孵育在激酶反应混合物(含ATP)中,相应的TKI(0.00001至100nm)在37℃下15分钟,不含底物,通过添加基材来引发激酶反应(37.5μm)。如上所述,在30分钟后淬火反应,并使用ELISA分析孔。收集荧光值(相对荧光单元,RFU)并标准化为含有载体对照(DMSO)的孔的值。通常,两个基材都表现出剂量 - 反应曲线和IC50 与给定抑制剂对每个FLT3变体的预期相一致的值,其中一个值得注意的例外(下面进一步描述)(Fig. 6, 表I.)。所有三种抑制剂都易于抑制了WT FLT3(用IC50 ~1-30 p中的值m 范围)。所有三种抑制剂的ITD突变体的效力降低了(IC50 ~40-800 p之间的值m),Crenolanib比另外两个更有效。 D835Y突变体的剂量反应曲线也与索拉非尼和Crenolanib的预期相比,索拉非尼显着不如反对WT(〜200-250倍的IC)的有效性 50),而Crenolanib保持pm - 僵局50。另一方面,对于Quizartinib,与快速-F相比,使用快速-2进行的测定对剂量响应曲线不同。 Quizartinib是II型抑制剂,已知与激酶的无活性的“DFG-OUT”构象结合。 FLT3的位置835处的疏水突变被认为是赋予Quizartinib的抵抗力,因为侧链对激酶结构域中的DFG环路的结构和动态的影响,具有额外的空间堆积不激活的稳定性构象(

      史密斯,CC,Paguirigan,A。,杰谢克,GR,林,KC,Massi,E.,Tarver,T.,Chin,CS,Asthana,S.,Olshen,A.,Travers,KJ,Wang,S。, Levis,MJ,Perl,AE,Radich,JP和Shah,NP,通过单细胞分析显示出急性髓性白血病中Quizartinib的异质性抗性。血液,130,48-58。

      ,
      • Zorn J.A.
      • 王Q.
      • 富士胡尔省E.
      • Barros T.
      • Kuriyan J.
      FLT3激酶域的晶体结构与抑制剂Quizartinib结合(AC220)。
      )。 D835Y突变体的FASTIDE-E Quizartinib剂量响应结果与该模型一致,即使在高达100n的浓度下也没有显着的抑制作用m (>比IC高10,000倍50 对于quizartinib对阵wt flt3)。但是,使用快速-f作为基板,在同一IC中观察到抑制50 范围为Sorafenib。这表明衬底相互作用可能影响抑制剂结合稳定性,也许通过在DFG-IN / -OUT动态中发挥作用。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6通过临床相关的酪氨酸激酶抑制剂(TKI)监测FLT3激酶活性和抑制作用。 使用两个基质,快速-e(A, C, E)和FASTIDE-F(B, D, F)在增加TKI浓度(Sorafenib,Quizartinib和Crenolanib)的情况下。数据显示对载体控制的每个抑制剂的RFU值(DMSO;代表6个独立反应)并绘制为百分比对照。我知道了50 根据将数据拟合到GraphPad Prism中的固定斜率(三个参数)曲线计算值。数据点/误差条表示平均值±S.E.

      讨论

      aml.的耐药性是贫困5年生存和临床缓解率的主要因素。靶向FLT3阳性AML患者的治疗已经有希望的结果,但抑制剂抗性对临床疗效有害。 FLT3仍然是AML中可行的药物靶标(
      • Warkentin A.A.
      • Lopez M.S.
      • Lasater E.A.
      • 关联。
      • 他是b.l.
      • 梁A .Y.
      • 史密斯C.C.
      • Shah N.P.
      • Shokat K.m.
      由于合成致命毒性为FLT3靶向急性髓性白血病疗法而克服骨髓抑制。
      ,
      • Anastassiadis T.
      • Deacon S.W.
      • Devarajan K.
      • 马蹄
      • 彼得森J.R.
      激酶催化活性的综合测定揭示了激酶抑制剂选择性的特征。
      但是,治疗中使用的目前的TKI是FLT3特异性甚至一旦开发,突破药物结合的突变的快速出现将是一个持续的挑战(
      • 摩尔人。
      • Faisal A.
      • Gonzalez de Castro D.
      • BAVETSIS V.
      • 太阳C.
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      FLT3急性髓性白血病的抑制剂:综述它们的疗效和抵抗机制。
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      • kwong y.l.
      FLT3抑制作用:急性髓鞘白血病中的移动和不断发展的靶标。
      )。这突出了具有可用作工具的有效测定的重要性,以识别靶向FLT3和突变体变体的特定和选择性TKI。在这项工作中,我们加上了 体外 在细胞裂解物中的激酶反应用Kinatest-ID管道进行设计,合成和验证序列的面板,以检测具有众所周知的基材的激酶的活性。我们的方法创建了一种新型肽面板,可用于激酶测定并提供比先前报道的底物更高的磷酸化效率。这些发现表明了Kalip和Kinatest-ID管道的流线型组合如何用于识别新型人工激酶基材。
      原始的Kinatest-ID管道(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      )依赖于文学验证的序列,包括来自蛋白质组学数据库和位置扫描肽库(PSPL)测定的一些,作为基质的输入。通过进一步的文献检查手动策划每种序列(寻找上游激酶证据的核化 例如 测试不可磷酸化的A / F突变)。这严重限制了可以包括在“真正的正”输入列表中的基板的数量,这可能导致最佳基板序列的准确预测。虽然这足以为几个激酶进行有效的底物,但对于它们的目标显示合理的选择性(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      ),如果给定的激酶没有足够的已知基材或PSPL测定数据,则不是最佳的 - 并且进一步不可用,并且根本无法制造任何预测。使用细胞裂解物消化作为FLT3激酶变体基板的高通量鉴定的肽库,使得数量大大增加 善意 可用于构建位置评分模型的基板序列。
      从这些大型经验检测的基底序列数据组开发的改进的位置评分矩阵模型使能为FLT3的优选的氨基酸基序预测,然后用于设计若干潜在的新型衬底肽。来自位置评分矩阵模型的得分与新型衬底的相对生化行为相关,特别是当当在短的激酶孵育时间(2小时后,输入数据集包含被观察到被观察为磷酸化的序列(2小时,这是更接近反应时间尺度的序列用于实践中的生物化学测定)。这表明即使内源性衍生的胰蛋白酶肽文库有些相对于随机/无偏异合成文库偏偏偏差(
      • Meyer N.O.
      • o'donoghue a.j.
      • Schulze-Gahmen U.
      • Ravalin M.
      • 苔藓。
      • 冬季M.B.
      • knudsen下午
      • Craik C.S.
      通过质谱法谱分析激酶作为揭示定量衬底基序的方法。
      )(给定由其基因组起源施加的序列约束),它们仍然能够提供足够的序列多样性以使得能够发现数百至数千个基材,并准确地显示给定激酶的基材偏好。它还表明虽然在蛋白质水平进行反应(
      • Lubner J.m.
      • Balsbaugh J.L.
      • 教堂。
      • Chou m.f.
      • 施瓦茨D.
      使用蛋白质组肽文库(Propel)方法表征蛋白激酶底物特异性。
      )对于开发用于鉴定内源蛋白质基质的预测模型可能更好,在肽水平下进行基质偏好分析 体外 足以设计肽探针。
      有趣的是,我们观察到富于特征的TKI Quizartinib对FLT3 D835Y突变体的基质依赖性抑制。这表明在筛选测定中使用的特定基材可能偏向对抑制剂是否是或不符合给定酶的解释。这突出了基材在抑制剂测定中的重要性,并表明扩大可用药物发现工具可用的有效基材的范围是有益的。工作正在进行中,确定这是否特定于FLT3 D835Y突变体,或者是激酶的更通用问题。其他后续步骤将扩展此方法的应用于先前内置的Kinatest-ID“筛选器”面板(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
      • 崔W.
      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      ),为了提高“脱靶”激酶的位置评分矩阵模型的准确性,并在基板设计过程中实现更好的选择性预测。虽然原始的先前发布的筛选面板足够精确,但是能够提供预先过滤大量潜在序列列表的实用能力,以便更可管理的数量,显然选择性预测受相同因素的限制(输入数据集的全面性)作为偏好预测。在此持续努力应用Kalip适应方法在此报告给更多的激酶,也应促进这方面的改进。
      总之,在这项工作中,我们展示了生成大数据集的效用 善意 基板信息,使用蛋白水解消解衍生自细胞蛋白的相对便宜且易于产生的肽伪“文库”,用于定义基底偏好图谱和评分模型,其能够设计用于激酶酶的有效肽底物。该策略能够发现多种底物,其中一些可能影响酶的相互作用,并影响关于抑制剂功效的结论。我们还预期该过程可以应用于孤儿激酶,因为已知几乎没有什么,首先识别衬底序列 体外 蛋白水解肽文库激酶反应,然后通过预测这些数据的偏好图谱。这些图案可用于设计,合成和验证人造基材,这可以帮助化学生物学和药物发现努力,以识别新颖和有效的抑制剂,以研究其生物学和/或成为治疗潜水。此外,该工作流程可能是普遍而明的任何酶驱动疾病,底物偏好数据可以从蛋白水解或合成制备的肽文库中确定(
      • IVRY S.L.
      • Meyer N.O.
      • 冬季M.B.
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      • Craik C.S.
      翻译后修饰酶的全局底物特异性分析。
      )并用于设计用于测定的新型基材。这将大大提高我们最初在我们的第一个Kinatest-ID报告中实施的新型基材探测设计过程的泛化(
      • Lipchik上午
      • 佩雷斯米
      • 博尔顿S.
      • dumrongprochanhan五。
      • Ouellette S.B.
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      • Parker L.L.
      Kinatest-ID:一种用于开发依赖性铽敏化激酶测定的管道。
      ),扩大药物发现测定的范围。

      数据可用性

      质谱蛋白质组学数据已经沉积在Proteomexchange联盟(http://proteomecentral.proteomexchange.org)通过自豪的合作伙伴存储库(
      • VizcaínoJ.A.
      • CôtéR.G.
      • Csordas A.
      • 戴安斯J.A.
      • Fabregat A.
      • 抚养金。
      • 怜悯J.
      • alpi E.
      • Birim M.
      • Contell J.
      • o'kelly g.
      • SchoEnegger A.
      • Ovelleiro D.
      • Pérez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • ríosd.
      • 王R.
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      蛋白质组学标识(骄傲)数据库和相关工具:2013年的状态。
      )数据集标识符PXD011478。

      致谢

      感谢W. Andy Tao博士(生物化学系,普渡大学)有用的讨论和见解,同时调整与磷蛋白质技术相关的激酶测定。我们感谢明尼苏达大学的质谱和蛋白质组学中心,以获得数据采集和分析。我们感谢Anton B. Iliuk博士(Tymora Analytica,West Lafayette,In)为实现Movalac磷酸富集试剂盒的支持和见解。

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