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Notch活化通过调节心内膜沉肠促进阀门形成* [S]

  • Rebeca Torrosa-Carrión
    隶属关系
    ‡心血管发育和疾病实验室中的细胞传导,Centro Nacional de Investigaciones Cardooculares Carlos III(CNIC),MelchorFernándezAlmagro3,28029马德里,西班牙

    §CentrodeInvestigaciónBiomédicaen Red En Enfermedades心狗狗(Cibercv),28029马德里,西班牙
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  • Luis Luna-zurita
    隶属关系
    ‡心血管发育和疾病实验室中的细胞传导,Centro Nacional de Investigaciones Cardooculares Carlos III(CNIC),MelchorFernándezAlmagro3,28029马德里,西班牙

    §CentrodeInvestigaciónBiomédicaen Red En Enfermedades心狗狗(Cibercv),28029马德里,西班牙
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  • FernandoGarcía-marqués
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    ▍斯坦福大学放射学,斯坦福大学,CA 94305
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  • Gaetano d'Amato.
    隶属关系
    ‡心血管发育和疾病实验室中的细胞传导,Centro Nacional de Investigaciones Cardooculares Carlos III(CNIC),MelchorFernándezAlmagro3,28029马德里,西班牙

    ‖生物学,斯坦福大学,斯坦福大学,CA 94305
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  • Rebecapiñeiro-sabarss
    隶属关系
    ‡心血管发育和疾病实验室中的细胞传导,Centro Nacional de Investigaciones Cardooculares Carlos III(CNIC),MelchorFernándezAlmagro3,28029马德里,西班牙

    §CentrodeInvestigaciónBiomédicaen Red En Enfermedades心狗狗(Cibercv),28029马德里,西班牙
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  • ElenaBonzón-Kulichenko
    隶属关系
    §CentrodeInvestigaciónBiomédicaen Red En Enfermedades心狗狗(Cibercv),28029马德里,西班牙

    **心血管彩易福彩组学实验室,Centro Nacional de Investigaciones Cardiovances Carlos III(CNIC),MelchorFernándezAlmagro3,28029马德里,西班牙
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  • jesúsvázquez.
    隶属关系
    §CentrodeInvestigaciónBiomédicaen Red En Enfermedades心狗狗(Cibercv),28029马德里,西班牙

    **心血管彩易福彩组学实验室,Centro Nacional de Investigaciones Cardiovances Carlos III(CNIC),MelchorFernándezAlmagro3,28029马德里,西班牙
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  • JoséLuisde la Pompa
    一致
    应该解决对应的通信。电话:+34 620 936633;
    隶属关系
    ‡心血管发育和疾病实验室中的细胞传导,Centro Nacional de Investigaciones Cardooculares Carlos III(CNIC),MelchorFernándezAlmagro3,28029马德里,西班牙

    §CentrodeInvestigaciónBiomédicaen Red En Enfermedades心狗狗(Cibercv),28029马德里,西班牙
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  • 作者脚注
    1 使用的缩写为:AVCatrio心室canalBMP2bone形态发生蛋白2ECMextracellular matrixEMTepithelial - 间充质transitionERGets相关geneFASPfilter辅助样品preparationHCDhigher能量碰撞dissociationHUVEChuman脐静脉内皮基因cellsKEGGkyoto百科全书和genomesLC-MS proteomicsLiquid色谱质谱proteomicsMECCmouse胚胎心内膜cellsPCAprincipal部件analysisTGFβ2transforming生长因子β 2wsppppppppppppppppppppp,肽和彩易福彩。
    * RTC由基金会La Caixa Phd奖学金(REF LCF / BQ / ES15 / 10360023)支持。 L.L.-Z.由Ramóny cajal博士后合同(Ref:Ryc-2016-20917)支持。 J.L.D.L.P.由Grants Saf2016-78370-R,CB16 / 11/00399(CIBER CV)和RD16 / 0011/0021(Tercel)提供资金来自Ministerio de Cenencia,Innovaciónyenvencentades(MCNU),并从FundaciónBBVA获得赠款(参考。:Bio14_298)和FundaciónLaMaratóVV3(参考:20153431)。 JV由Ministerio de Ciencia,Innovaciónyenveryhidads(MCNU)和Carlos III South-Of Health-Fondo DeInvestigaciónSanitaria(Grant Proteored-Prb3-680-P)(Ciber CV)提供支持IPT17 / 0019-ISCIII-SGEFI / ERDF),FundaciónLaMaratóTV3(参考文献122 / C / 2015)和“La Caixa”银行基金会(项目代码HR17-00247)。本出版物的成本部分得到了来自ERDF的资金。 CNIC由Invenaciónyenverysidads(MCNU)和Pro CINC Foundation提供支持的CNIC,是Severo Ochoa卓越中心(Sev-2015-0505)。提交人声明他们没有利益冲突。
    [S] 本文包含补充材料表S1-S7和图3. S1-S5。
      心内膜是一种专门的内皮,其内部表面排行。小鼠和斑马鱼的功能性研究已经确定,内心膜是用于开发心脏结构的有效信号的源,包括心脏瓣膜和腔室。这里,我们通过操纵小鼠胚胎内膜细胞(MEEC)中的Notch活性,然后用基于质谱的彩易福彩组学的彩易福彩组学来表征凹口依赖性内伤性秘酐。我们分解了不同的可溶性因子,其分泌不仅应对陷波激活,而且表明鉴别配体特异性,表明配体特异性输入可以调节分泌的彩易福彩的表达,这些彩易福彩涉及不同的心脏发育过程中涉及的分泌彩易福彩的表达。 Notch信号激活与转化生长因子-β2(TGFβ2) - 中等统计和递送参与局灶性粘附和细胞外基质(ECM)沉积和重塑的转化沉淀和重塑。相比之下,缺口抑制伴随着可以调节细胞迁移的特定信号素的上调。沉淀蛋白表达数据显示与胚胎内心膜细胞中RNA表达的基因分析良好相关。附加特征是原位小鼠胚胎中的杂交揭示了各种缺口候选效应基因的表达(TGF.β2,loxl2,ptx3,timp3,fbln2, 和 DC. n)在心脏瓣膜内心和/或间充质。验证这些结果,有条件的小鼠DLL4. 或者 jag1.功能损失突变显示出类似于在彩易福彩水平观察到的基因表达改变体外。这些结果提供了Notch依赖性内膜内膜肠综合体的第一个描述,并将Meec作为一种工具,用于测定对各种刺激的内心膜膜沉淀反应以及该系统用于药物筛选的潜在使用。

      图形概要

      信号相互作用在脊椎动物发育的各个阶段至关重要,从心脏中胚层规范和通过心脏管形成和循环迁移到心脏瓣膜和腔室的发育,形态发生和成熟。早期的心脏管由外上皮心肌形成和由细胞外基质,心脏果冻分离的内心内膜层形成。这两种细胞层之间的电感信号对于开发专用心脏结构,例如阀门和腔室是至关重要的。
      在形成心脏瓣膜期间,心肌衍生的BMP2(
      使用的缩写是:
      AVC
      Atrio-心室管道
      BMP2
      骨形态发生蛋白2
      ECM.
      细胞外基质
      emt.
      上皮间充质转换
      尔格
      ETS相关基因
      抚慰
      过滤辅助样品制备
      HCD.
      更高能源的碰撞解离
      hu
      人脐静脉内皮细胞
      ke
      Kyoto基因和基因组的百科全书
      LC-MS彩易福彩组学
      液相色谱质谱彩易福彩组学
      MECC.
      小鼠胚胎内膜细胞
      PCA.
      主要成分分析
      TGFβ2
      转化生长因子β2
      WSPP.
      加权光谱,肽和彩易福彩。
      ,
      • Rivera-Feliciano J.
      • Tabin C.J.
      BMP2指示心脏祖细胞形成心脏瓣膜诱导场。
      )和心内膜衍生的陷波信号(
      • Del Monte G.
      • Grego-Bessa J.
      • Gonzalez-Rajal A.
      • Bolos V.
      • de la pompa J.L.
      监测Notch1在开发中的活动:反馈监管循环的证据。
      ),活跃在儿核性管道(AVC)区域的前瞻性瓣膜区域中,在音乐会上诱导AVC心内膜细胞的上皮 - 间充质转换(EMT)(
      • Luna-zurita L.
      • PRADOS B.
      • Grego-Bessa J.
      • LuxánG.
      • Del Monte G.
      • Benguría
      • 亚当斯r.h.
      • Pérez-Pomares J.M.
      • de la pompa J.L.
      依赖依赖性间充质基因计划和BMP2驱动细胞侵袭性的整合调节小鼠心脏瓣膜形成。
      ,
      • Papoutsi T.
      • Luna-zurita L.
      • PRADOS B.
      • Zaffran S.
      • de la pompa J.L.
      BMP2和NOTCH配合塑造胚胎内膜。
      )。转化的间充质细胞丧失细胞 - 细胞结,迁移,并殖民化AVC心脏果冻以形成心内膜垫,后来将突出到心脏管中并用作原始心脏瓣膜。后来,这些间充质细胞通过冷凝和伸长伸长并重新啮合,产生精致的瓣膜小叶和成熟心脏的隔膜(
      • Hinton R.B.
      • yutzey K.E.
      心阀结构与开发与疾病的功能。
      )。
      缺口是一系列保守的单通跨膜受体,其被δ(DLL1,DLL3和DLL4)和锯齿状/锯齿(JAG1和JAG2)家族的膜结合配体激活。配体 - 受体相互作用导致受体中的一系列蛋白水解处理事件,最终导致凹口细胞内结构域的产生,其易于细胞核,与预先存在的转录复合物结合以调节靶基因表达(
      • Kopan R.
      • Ilagan M.X.
      规范缺口信号通路:展开激活机制。
      )。 Notch在哺乳动物心脏开发的许多角色包括心脏命运规范(
      • rones m.s.
      • Mclaughlin K.A.
      • raffin m.
      • Mercola M.
      锯齿和缺口通过抑制心肌细胞来指定心脏场中的细胞序列。
      ),心脏管图案化,心脏结构的形态发生;此外,Notch信号传递改变导致人类心脏病(
      • MacGrogan D.
      • 咀嚼J.
      • de la pompa J.L.
      心脏发育,疾病和再生中的凹口和相互作用信号通路。
      )。心脏中缺口功能的一个关键特征是它对邻近组织产生非细胞自主效应。这是通过对心肌模式对心肌图案化的影响的影响,推测可能是因为在心肌上作用的心内膜信号所需的凹口(
      • Luna-zurita L.
      • PRADOS B.
      • Grego-Bessa J.
      • LuxánG.
      • Del Monte G.
      • Benguría
      • 亚当斯r.h.
      • Pérez-Pomares J.M.
      • de la pompa J.L.
      依赖依赖性间充质基因计划和BMP2驱动细胞侵袭性的整合调节小鼠心脏瓣膜形成。
      ,
      • D'Amato G.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Martínez-Poveda B.
      • Torroja C.
      • 沃尔特W.
      • Bochter M.S.
      • Benedito R.
      • 科尔斯。
      • 马丁内斯F.
      • hadjantonakis a. -k。
      • Uemura A.
      • jiménez-borreguero l.j.
      • de la pompa J.L.
      序贯缺口激活调节心室发育。
      ,
      • Grego-Bessa J.
      • Luna-zurita L.
      • Del Monte G.
      • Bolos V.
      • 梅尔加P.
      • Arandilla A.
      • Garratt A.N.
      • 臧H.
      • Mukouyama Y.S.
      • 陈H.
      • 寿寿。
      • Ballestar E.
      • Esteller M.
      • Rojas A.
      • Perez-Pomares J.M.
      • de la pompa J.L.
      Notch信号传导对于心室发育至关重要。
      ,
      • LuxánG.
      • Casanova J.C.
      • Martínez-Poveda B.
      • PRADOS B.
      • D'Amato G.
      • MacGrogan D.
      • Gonzalez-Rajal A.
      • 多巴罗D.
      • Torroja C.
      • 马丁内斯F.
      • Izquierdo-Garcia J.L.
      • Fernández-Friera L.
      • Sabater-molina M.
      • kong y.y。
      • Pizarro G.
      • Ibañezb.
      • MEDRANO C.
      • 加西亚帕维亚P.
      • Gimeno J.R.
      • Monserrat L.
      • jiménez-borreguero l.j.
      • de la pompa J.L.
      陷波途径调节剂MIB1中的突变导致左心室不符号心肌病。
      ,
      • MacGrogan D.
      • D'Amato G.
      • 特拉维萨诺S.
      • Martinez-Poveda B.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Papoutsi T.
      • s
      • 布v.
      • Gomez-del Arco P.
      • GómezManuelJ.
      • 周B.
      • 雷东多胡安米
      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      )。候选信号分子已被缺口或函数增益模型的基因表达谱鉴定(
      • Luna-zurita L.
      • PRADOS B.
      • Grego-Bessa J.
      • LuxánG.
      • Del Monte G.
      • Benguría
      • 亚当斯r.h.
      • Pérez-Pomares J.M.
      • de la pompa J.L.
      依赖依赖性间充质基因计划和BMP2驱动细胞侵袭性的整合调节小鼠心脏瓣膜形成。
      ,
      • D'Amato G.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Martínez-Poveda B.
      • Torroja C.
      • 沃尔特W.
      • Bochter M.S.
      • Benedito R.
      • 科尔斯。
      • 马丁内斯F.
      • hadjantonakis a. -k。
      • Uemura A.
      • jiménez-borreguero l.j.
      • de la pompa J.L.
      序贯缺口激活调节心室发育。
      ,
      • LuxánG.
      • Casanova J.C.
      • Martínez-Poveda B.
      • PRADOS B.
      • D'Amato G.
      • MacGrogan D.
      • Gonzalez-Rajal A.
      • 多巴罗D.
      • Torroja C.
      • 马丁内斯F.
      • Izquierdo-Garcia J.L.
      • Fernández-Friera L.
      • Sabater-molina M.
      • kong y.y。
      • Pizarro G.
      • Ibañezb.
      • MEDRANO C.
      • 加西亚帕维亚P.
      • Gimeno J.R.
      • Monserrat L.
      • jiménez-borreguero l.j.
      • de la pompa J.L.
      陷波途径调节剂MIB1中的突变导致左心室不符号心肌病。
      ,
      • MacGrogan D.
      • D'Amato G.
      • 特拉维萨诺S.
      • Martinez-Poveda B.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Papoutsi T.
      • s
      • 布v.
      • Gomez-del Arco P.
      • GómezManuelJ.
      • 周B.
      • 雷东多胡安米
      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      )但到目前为止,缺乏适用于涉及心脏发育的分泌内膜彩易福彩的彩易福彩组学鉴定的实验模型。
      在这里,我们使用小鼠胚胎内膜细胞(Meec)作为一个 体外 系统识别缺口依赖性胚胎内膜肠肠。在缺口抑制剂的存在或不存在的情况下,用重组DLL4和JAG1刺激MEEC,并且经条件培养基的多重定量彩易福彩组学分析鉴定的彩易福彩,其分泌响应于NOTCH信号操纵。该分析确定了875个分泌因子,其中129个在陷波操纵后表现出显着的表达变化;此外,我们通过与MEEC的QRT-PCR和RNA分析结果进行比较验证了彩易福彩表达数据。 Notch活化直接与细胞外基质(ECM)重塑和结构蛋白(TGFβ2和胶原蛋白)的分泌增加相关,并与参与细胞迁移/趋化性的分子和彩易福彩改性酶的分子相反。具体地,DLL4-Notch信号传导对EMT,细胞骨架信令和细胞 - 细胞/细胞基质触点显示出主要贡献,而JAG1-Notch信号传导揭示了ECM沉积的更大累积。验证 原位 杂交揭示了野生型小鼠胚胎中所选候选分子的特异性瓣膜内膜和间本表达及其在陷波突变体中改变的表达。这些发现与在促进EMT和细胞迁移时对DLL4-Notch1信号传导的早期作用以及JAG1-NOTCH1在瓣膜间充质增殖和重塑中的调节中的后续作用(
      • MacGrogan D.
      • D'Amato G.
      • 特拉维萨诺S.
      • Martinez-Poveda B.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Papoutsi T.
      • s
      • 布v.
      • Gomez-del Arco P.
      • GómezManuelJ.
      • 周B.
      • 雷东多胡安米
      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      )。这些结果肯定了Meec的价值作为强大的 体外 用于研究心内膜沉淀的模型,识别潜在涉及心脏瓣膜发育和疾病的新因素。

      实验步骤

       Meec的隔离和永生化

      如上所述获得并使MEEC保持(
      • D'Amato G.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Martínez-Poveda B.
      • Torroja C.
      • 沃尔特W.
      • Bochter M.S.
      • Benedito R.
      • 科尔斯。
      • 马丁内斯F.
      • hadjantonakis a. -k。
      • Uemura A.
      • jiménez-borreguero l.j.
      • de la pompa J.L.
      序贯缺口激活调节心室发育。
      )。

       细胞培养

      Meec培养了0.1‰明胶涂层的10厘米菜肴,并在Dulbecco的改良鹰的培养基(DMEM)(DMEM)(DMEM)保持,补充有10‰胎牛血清(FBS)和1‰青霉素/链霉素。人脐静脉内皮细胞从LONZA购买,并在内皮细胞生长培养基-2(EGM-2)中培养0.1‰明胶涂覆的10厘米菜肴,用补充剂(LONZA)和1‰青霉素/链霉素。从用1ml注射器柱塞分解的E9.5胚胎中获得小鼠胚胎成纤维细胞,并用高葡萄糖和高葡萄糖铺在DMEM中 l-glutamine(Gibco),15‰FBS,1米m 丙酮酸钠(Sigma-Aldrich),0.1米m β-巯基乙醇(Sigma-Aldrich)和1‰青霉素/氨苄青霉素。将所有细胞系在37℃下在含有5°CO的潮湿气氛中孵育2.

       钙离子载体治疗

      Meec培养0.1‰明胶涂层玻璃盖玻片暴露于1μm 在固定之前,A23187在37℃下钙离子载体(#C5149 Sigma-Aldrich)或DMSO(载体)(Sigma-Aldrich)6小时。

       免疫细胞化学

      在0.1‰明胶涂覆的玻璃盖玻片上培养的汇合细胞在室温下在4°甲醚醛中固定在4℃下列10分钟。将Meec与初级抗体在室温下孵育1小时,然后用荧光染料缀合的二抗孵育1小时。本研究中使用的抗体如下:抗ERG(ABCAM EPR3863,1:100); Alexa Fluor-488缀合的山羊抗兔IgG(H + L)(Thermofisher A-11034,1:200);抗NFATC1(7A6;烯烯ALX-804-022-R100,1:100);和山羊抗小鼠IgG(H + L)Alexa Fluor-488缀合物(Thermofisher A-11029,1:100)。 Alexa Fluor-488-缀合的Imcectin GS-IB4来自 Griffonia Simplicifolia (在固定前,在室温下在室温下孵育4分钟的温泉炉I32450,100)。荧光素异硫氰酸酯标记的阴蛋白(Sigma-Aldrich P5282 1:200)用于标记肌动蛋白长丝。用尼康A1R共聚焦荧光显微镜和奥林巴斯BX51荧光显微镜获得图像。

       基于Matrigel的管形成测定

      在4℃下涂覆24孔板的每个孔,在4℃下涂有300μl生长因子还原基质胶(Bd Biosciences 354230),并使Matrigel在37℃下聚合30分钟。 Meec用VEGF治疗(R.&D Systems 293-VE,20 ng / ml)为1周,5×104 或者 7.5 × 104 在DMEM中加入每孔的细胞,并在37℃下温育6小时。用尼康Eclipse TS100倒置显微镜观察管状结构,并使用尼康数字视线DS-2MBWC相机拍摄。每一份测试每个条件。

       用重组配体诱导肌肉

      重组Notch配体DLL4-His(r&D Systems 1389-D4-050)和JAG1-FC(r&D Systems 599-JG-100)附着在10厘米的菜肴中,如(
      • Benedito R.
      • 罗卡C.
      • SörensenI.
      • 亚当斯S.
      • Gossler A.
      • Fruttiger M.
      • 亚当斯r.h.
      凹口配体DLL4和Jagged1对血管生成具有相反的影响。
      )。在补充10‰FBS的DMEM中播种Meec(2.9×106个细胞/板),并用20μ处理m γ-分泌酶抑制剂RO4929097(SELLECK CHEMICALS S1575):在37℃下抑制切口信号传导或DMSO(载体)24小时。用PBS洗涤细胞两次,并根据适当的RO4929097或DMSO一起孵育另外14小时。每种条件都一式三份进行。

       定量RT-PCR

      使用直ZOL RNA MiniPREP试剂盒(Zymo Research)提取来自Meec的Meec刺激的RNA。使用高容量逆转录试剂盒(Applied Biosystems)合成cDNA,每次反应1μg总RNA。使用POWER SYBR进行定量PCR TM值 绿色大师混合(应用生物系统4367659),具有7900HT的快速实时PCR系统(应用生物系统)。使用相对表达使用 GAPDH. 或者 β- 作为管家基因。鼠标KICQSTART. TM值 本研究中使用的引物序列(Sigma-Aldrich)列于 表S8。在每个生物三份进行三种技术实验。数据显示为平均值±S.D.差异被认为是统计学意义的 p <0.05(双尾学生 t test).

       条件媒体的集合

      通过温和抽吸收集来自汇合血清饥饿的MEEC的条件培养基,并以1200rpm离心5分钟以除去细胞碎片。将透明的上清液在液氮中冷冻,然后在-80℃下储存直至彩易福彩组学分析。

       实验设计与统计理由

      在DMSO(车辆)或RO4929097的存在下,用DLL4或JAG1刺激MEEC,只有DMSO代表控制条件(Fig. 1A)。来自这五种实验条件的条件培养基在两个独立的串联质量标签(TMT)10-Plex实验中以生物三份酸盐分析了生物三种试验条件(图S2A)。使用一个TMT来研究DLL4的刺激,另一个TMT学习jag1的刺激。每个TMT含有3个控制(在DMSO中,在TMT实验中都是相同的); 3个样品,具有相应的凹口配体; 3个样品,具有相应的凹口配体和RO4929097;所有15个样品的共同池被用作内部控制( 图S2A)。每个病症的三个生物学复制表现出可重复的变化,并聚集在一起成相同的组(例如,参见, Fig. 2A)。 TMT记者强度的定量信息从频谱级别集成(表S1),对肽水平,然后基于加权光谱,肽和彩易福彩(WSPP)统计模型(
      • Navarro P.
      • Trevisan-Herraz M.
      • Bonzon-Kulichenko E.
      • Nuñeze.
      • Martínez-Acedo P.
      • Perez-Hernándezd。
      • 豪尔赫I.
      • Mesa R.
      • Calvo E.
      • Carrascal M.
      • HernáezM.L.
      • 加西亚F.
      • Barcena J.A.
      • Ashman K.
      • abian J.
      • 吉尔C.
      • 雷东多。
      • vázquezJ.
      稳定同位素标记定量彩易福彩组学的一般统计框架。
      ,
      • Martínez-Acedo P.
      • Nuñeze.
      • gómezf.j.
      • 莫雷诺M.
      • 拉莫斯E.
      • izquierdo-álvarezA.
      • miró-casase。
      • Mesa R.
      • Rodriguez P.
      • Martinez-Ruiz A.
      • DORADO D.G.
      • 拉马斯斯。
      • vázquezJ.
      一种新的动态硫醇氧化还原彩易福彩的全局分析策略。
      )使用通用集成算法(
      • García-marquésf.
      • Trevisan-Herraz M.
      • Martínez-MartínezS.
      • Camafeita E.
      • 豪尔赫I.
      • Lopez J.A.
      • Méndez-Barbero N.
      • Méndez-Ferrer S.
      • del pozo m.a.
      • Ibáñezb.
      • Andrésv.
      • Sánchez-马德里F.
      • 雷东多。
      • Bonzon-Kulichenko E.
      • vázquezJ.
      一种新的系统 - 生物学算法,用于使用定量彩易福彩组学分析协调彩易福彩反应的研究。
      )。简而言之,每个样品 r, 价值 XQPS. = log2 AI. /C 计算出来,在哪里 AI. 是相应样本的TMT记者的强度 i 在MS / MS频谱中 s 来自肽 p 和彩易福彩 q, 和C 是来自内部控制的TMT记者的强度。每种肽的log2比( XQP. )计算为其光谱的加权平均值,彩易福彩值( XQ. )其肽的加权平均值,盛大的意思( X )计算为所有彩易福彩值的加权平均值(
      • Navarro P.
      • Trevisan-Herraz M.
      • Bonzon-Kulichenko E.
      • Nuñeze.
      • Martínez-Acedo P.
      • Perez-Hernándezd。
      • 豪尔赫I.
      • Mesa R.
      • Calvo E.
      • Carrascal M.
      • HernáezM.L.
      • 加西亚F.
      • Barcena J.A.
      • Ashman K.
      • abian J.
      • 吉尔C.
      • 雷东多。
      • vázquezJ.
      稳定同位素标记定量彩易福彩组学的一般统计框架。
      )。光谱,肽和彩易福彩的统计重量( WQPS. , WQP. , 和 WQ. 分别)和三个级别中的每一个的差异(σS2 ,σ. P2, 和σQ2分别计算(
      • Navarro P.
      • Trevisan-Herraz M.
      • Bonzon-Kulichenko E.
      • Nuñeze.
      • Martínez-Acedo P.
      • Perez-Hernándezd。
      • 豪尔赫I.
      • Mesa R.
      • Calvo E.
      • Carrascal M.
      • HernáezM.L.
      • 加西亚F.
      • Barcena J.A.
      • Ashman K.
      • abian J.
      • 吉尔C.
      • 雷东多。
      • vázquezJ.
      稳定同位素标记定量彩易福彩组学的一般统计框架。
      )。彩易福彩丰度变化以标准化单位表示( ZQ. )。来自Sanxot包的内置例程(
      • Trevisan-Herraz M.
      • 袋子N.
      • Garcia-Marques F.
      • Rodriguez J.M.
      • 豪尔赫I.
      • Ezkurdia I.
      • Bonzon-Kulichenko E.
      • Vazquez J.
      Sanxot:用于高通量彩易福彩组学实验的定量分析的模块化和多功能包。
      )被用来证实 z_q 来自每个样本的变量遵循严格的正常n(0,1)分布,如WSPP模型所预期的(
      • García-marquésf.
      • Trevisan-Herraz M.
      • Martínez-MartínezS.
      • Camafeita E.
      • 豪尔赫I.
      • Lopez J.A.
      • Méndez-Barbero N.
      • Méndez-Ferrer S.
      • del pozo m.a.
      • Ibáñezb.
      • Andrésv.
      • Sánchez-马德里F.
      • 雷东多。
      • Bonzon-Kulichenko E.
      • vázquezJ.
      一种新的系统 - 生物学算法,用于使用定量彩易福彩组学分析协调彩易福彩反应的研究。
      )。通过申请学生来检测不同样本的显着彩易福彩丰度变化 t 测试到 ZQ. 数据和差异被认为是统计学意义的 p < 0.05.
      图缩略图GR1.
      Fig. 1通过谱分析心内膜衍生的秘密 体外 MEEC中凹口途径的调节。 (A)Meec彩易福彩组分析的实验设计。用重组凹口配体DLL4-HIS10(绿色)或JAG1-HIGG1FC与载体(DMSO)或γ分泌酶抑制剂RO4929097(RO)组合刺激MEEC。在治疗期结束时,收集细胞用于QRT-PCR分析,并通过LC-MS / MS分析条件培养基中的彩易福彩含量。 (B, C)QRT-PCR分析规范缺口靶基因 Hey1, Hey2, he , 和 Nrarp. 在DLL4刺激的Meec(B)和Jag1刺激的Meec(C)。数据是每个样品的三份测量的手段,并作为平均值呈现为平均值±S.D. (学生们 t test; *p < 0.05; **p < 0.01, ***p < 0.005). (D“用David,TMHMM,SignalP和秘密服务器进行顺序生物信息学分析的工作流程以识别分泌彩易福彩。圆圈显示每组的彩易福彩数量;橙色表明分泌彩易福彩。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2全球陷波相关的分泌概况。 (A)129个分泌因子的分层聚类,显示出显着丰富的变化(t 测试, p <0.05)在陷波激活的比较中 相对 抑制或陷波激活 相对 控制加抑制的组合。虚线标志着四个集群的描绘;黄色簇(1,3)显示出在陷波激活时增加丰富;紫色簇(2,4)显示陷波激活时的丰富程度降低。 (B, C)表显示GO术语和Kegg途径的富含彩易福彩的富集分析(B)或过度折扣(C)响应陷波激活。彩色盒子显示每个群集对中的分泌因子的名称。

       LC-MS彩易福彩组学

      在37℃下在37℃下消化条件培养基的彩易福彩在过滤辅助样品制备过滤器,在40:1蛋白:胰蛋白酶(W / W)比例为50米的胰蛋白酶(W / W)比例m 碳酸氢铵,pH 8.8。用C18绿洲盒(Waters Corporation,Milford,MA,USA)脱盐,使用50‰乙腈(v / v)作为洗脱液,并真空干燥。肽是在制造商的指示之后标记的TMT。将来自每个TMT实验的标记的肽汇集,通过混合阳离子交换色谱(Oasis HLB-MCX柱),脱盐和使用Proxean Easy纳米流HPLC系统(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Bremen)进行分析为六个级分通过纳米电子涂布离子源(Thermo Fisher Scientific)到Orbitrap Fusion质谱仪(Thermo Fisher Scientific)。基于C18的反相分离与2cm捕集柱和50cm分析柱(Easy Column,Thermo Fisher Scientific)一起使用,连续乙腈梯度组成,由0-30°A为180分钟,50-90 △B持续3分钟(A = 0.1‰甲酸; B = 90℃乙腈,0.1℃甲酸),流速为200 nL / min。以数据相关方式获取质谱,使用前15个方法在MS和MS / MS之间自动切换。壁图分析仪中的MS光谱位于400-1500的质量范围内 m / z. 和120,000分辨率。在35 eV的归一化碰撞能量下进行较高能量的碰撞解离碎片,并且在侧面的30,000个分辨率下分析MS / MS光谱。
      所有搜索都是用彩易福彩组发现(1.4,Thermo Fishific)使用续集(Thermo Fisher Scientific)对鼠标(2015年12月; 16,747条目)的Uniprot数据库进行序列发现(Thermo Fisher Scientific)进行所有搜索,并用CRAP数据库中添加116个序列,其中包含了最常见的实验室蛋白污染物(全球彩易福彩组机器)。对于数据库搜索,参数选择如下:胰蛋白酶消化,具有两个最大未遗漏的切割位点,2Da的前体质量容差,片段质量耐受30ppm。将甲硫氨酸氧化(+15.994915)设定为可变改性。 +229.162932Da的赖氨酸和肽N-末端改性,以及+ 57.021464Da的半胱氨酸氨基甲酰化,设定为固定修饰。还搜索相同的MS / MS谱集合,而不是由同一目标数据库构造的反转数据库。使用概率比法进行MS / MS数据的肽鉴定(
      • Martínez-bartolomés。
      • Navarro P.
      • Martín-Maroto F.
      • López-Ferrer D.
      • Ramos-FernándezA.
      • Villar M.
      • García-ruiz J.P.
      • vázquezJ.
      平均得分分布的特性:概率比例方法。
      )。使用精制方法计算肽鉴定的假发现速率(
      • Navarro P.
      • vázquezJ.
      一种通过诱饵数据库计算肽识别的假发现率的精制方法。
      ,
      • Bonzon-Kulichenko E.
      • Garcia-Marques F.
      • Trevisan-Herraz M.
      • vázquezJ.
      通过高精度质谱评估肽鉴定:与使用窄质量前体窗相关的问题。
      )1‰假发现率被用作肽识别标准。每个肽仅被分配给彩易福彩组发现算法提出的最佳彩易福彩。整组鉴定的肽和彩易福彩显示在 表S1.

       分泌蛋白的生物信息滤波

      彩易福彩分泌的计算预测如下(
      • Bonzon-Kulichenko E.
      • 马丁内斯 - 马丁内斯斯。
      • Trevisan-Herraz M.
      • Navarro P.
      • 雷东多。
      • Vazquez J.
      活性Jurkat T细胞动态沉淀的定量深入分析。
      )并显示在 Fig. 1D表S2。简而言之,从所有鉴定的彩易福彩处以虚假发现率<1‰,构建了符合以下三个标准中的至少一种的潜在分泌彩易福彩的列表:(
      • Lu M.F.
      • Schwartz R.J.
      • 马丁J.F.
      BMP2对于心脏垫层上皮 - 间充质转换和心肌图案至关重要。
      )通过David V.6.7网站为细胞外注释的彩易福彩用于基因本体(GO)本地化; (
      • Rivera-Feliciano J.
      • Tabin C.J.
      BMP2指示心脏祖细胞形成心脏瓣膜诱导场。
      )来自未履行标准的彩易福彩清单(
      • Lu M.F.
      • Schwartz R.J.
      • 马丁J.F.
      BMP2对于心脏垫层上皮 - 间充质转换和心肌图案至关重要。
      ),含有TMHMM V.2.0服务器预测的两个以上的跨膜螺旋的彩易福彩(
      • Krogh A.
      • 拉斯森B.
      • von heijne g.
      • Sonnhammer e.l.l.
      用隐马尔可夫模型预测跨膜蛋白拓扑:应用于COHEN的完全基因组。
      )和根据信号V.4.1服务器的信号肽。这些被称为潜在途径的潜在分泌; (
      • Del Monte G.
      • Grego-Bessa J.
      • Gonzalez-Rajal A.
      • Bolos V.
      • de la pompa J.L.
      监测Notch1在开发中的活动:反馈监管循环的证据。
      )彩易福彩不符合(
      • Rivera-Feliciano J.
      • Tabin C.J.
      BMP2指示心脏祖细胞形成心脏瓣膜诱导场。
      )秘密v.2.0得分>0.5。类别中的彩易福彩(
      • Rivera-Feliciano J.
      • Tabin C.J.
      BMP2指示心脏祖细胞形成心脏瓣膜诱导场。
      )被归类为通过古典途径分泌的潜在分泌;类别中的彩易福彩(
      • Del Monte G.
      • Grego-Bessa J.
      • Gonzalez-Rajal A.
      • Bolos V.
      • de la pompa J.L.
      监测Notch1在开发中的活动:反馈监管循环的证据。
      )被分类为潜在的非分类途径(
      • Bendtsen J.D.
      • Jensen L.J.
      • Blom N.
      • von heijne g.
      • 布鲁纳克斯。
      基于特征的非古典和无铅彩易福彩分泌的预测。
      )。为了防止分泌标准之间的重叠,彩易福彩仅在一个类别下列出。

       数据表示

      使用Clustvis进行主成分分析(//biit.cs.ut.ee/clustvis/ )(
      • Metsalu T.
      • vilo J.
      CLUSTVIS:使用主成分分析和Heatmap可视化多变量数据的群集的Web工具。
      )在DLL4和JAG1特定数据集共用的690个分泌的彩易福彩上。在植物中产生热量。使用Python自定义脚本使用Matplotlib库表示Volcano图,手动添加彩易福彩名称。

       Go和Kegg途径浓缩分析

      GO和京都基因百科全书(KEGG)差异分泌的彩易福彩的富集分析在新精英中进行(www.genmapp.org/go_elite/; 1.2.5,ensmart77plus数据库版本)(
      • Zambon A.c.
      • GAJ S.
      • 何我。
      • 汉斯普尔K.
      • Vranizan K.
      • Evelo C.T.
      • Conklin B.R.
      • pico a.r.
      • Salomonis N.
      Go-Elite:用于途径和本体的灵活解决方案。
      )允许的 p 价值截止 p <0.05。除了网络分析之外,我们使用两种混合物中鉴定的690种彩易福彩的组蛋白,除了网络分析,在其中我们使用了缺口依赖性内膜内容(129种差异分泌的彩易福彩)。代表的条形图 z - 通过GraphPad Prism 7产生每个类别(生物过程,细胞组分,分子函数和KEGG途径)中的术语的值。

       彩易福彩组学数据的网络分析

      129差异分泌的彩易福彩显示全局陷波途径激活/禁止后的差分调节,用作字符串11.0数据库的输入节点数据(http://string-db.org/ )(
      • Szklarczyk D.
      • Franceschini A.
      • 蜡厂
      • Forslund K.
      • Heller D.
      • Huerta-Cepas J.
      • Simonovic M.
      • 罗斯A.
      • Santos A.
      • Tsafou K.P.
      • Kuhn M.
      • Bork P.
      • Jensen L.J.
      • von mering c.
      字符串v10:彩易福彩 - 彩易福彩相互作用网络,整合在生命之树上。
      )。获得更严格的互动, 作者 字符串中的选项被排除在外,所考虑的最低所需交互得分为0.7(高度置信)。然后使用Cytoskape 3.7.1(www.cytoscape.org/ )(
      • Shannon P.
      • Markiel A.
      • ozier O.
      • Baliga N.S.
      • 王J.T.
      • Ramage D.
      • amin n.
      • Schwikowski B.
      • IDEKER T.
      Cytoscape:用于生物分子交互网络的集成模型的软件环境。
      ),通过应用预使用强制定向布局设置进行全局分析。使用作为背景的背景测定预测网络的重要性,两种混合物中鉴定的一组690蛋白。

       组织加工和原位杂交(ISH)

      将胚胎固定在4℃下在4℃下4℃过夜。胚胎比E10.5大于e10.5是在标准方案后嵌入的石蜡。 ish和全挂 ish. 如上所述进行(
      • Kanzler B.
      • kuschert s.j.
      • 刘Y.H.
      • Mallo M.
      Hoxa-2限制了软骨结构结构域并在鳃区域的开发过程中抑制骨形成。
      ,
      • Pompa de la JL
      • 韦克姆A.
      • Correia K.m.
      • Samper E.
      • 棕色S.
      • 阿吉利拉r.j.
      • Nakano T.
      • Honjo T.
      • MAK T.W.
      • rossant J.
      • Conlon R.A.
      哺乳动物神经发生中缺口信号通路的保护。
      )。将根据要求提供探针的详细信息。

       小鼠菌株和基因分型

      动物研究由CNIC动物实验伦理委员会和马德里社区批准(参考文献118/15)。所有动物程序符合欧盟指令2010 / 63EU和2007/526 / EC的建议,关于保护用于实验性和其他科学目的的动物,在法律法律规定的2005年12月12日下的西班牙法律中强制执行。本研究中使用的小鼠菌株是 TIE2-CRE. (
      • Kisanuki Y.Y.
      • 锤子r.e.
      • Miyazaki J.
      • 威廉姆斯S.C.
      • Richardson J.A.
      • yanagisawa m.
      TIE2-CRE转基因小鼠:体内内皮细胞谱系分析的新模型。
      ), NKX2.5-CRE. (
      • 斯坦利尤。
      • BIBEN C.
      • Elefanty A.
      • Barnett L.
      • Koentgen F.
      • robb l。
      • 哈维r.p.
      高效的CRE介导的心血管血管细胞中的缺失赋予Homeobox基因NKX2-5的3'UTR-IRES-CRE等位基因。
      ), DLL4.flox (
      • Koch U.
      • Fiorini E.
      • Benedito R.
      • Besseyrias V.
      • Schuster-Gossler K.
      • 皮埃尔米
      • Manley N.R.
      • Duarte A.
      • 麦当劳H.R.
      • Radtke F.
      三角洲4是胸腺T细胞谱系承诺期间Notch1的必需的非冗余配体。
      ), 和 jag1.flox (
      • Mancini S.J.
      • Mantei N.
      • Dumortier A.
      • Suter U.
      • 麦当劳H.R.
      • Radtke F.
      jagged1依赖性缺口信号传导可分配造血干细胞自我更新和分化。
      )。已经发表了基因分型细节 DLL4.flox;Tie2-Cre (10), 和Jag1Flox; NKX2.5-CRE (13).

      结果

       Meec显示胚胎内膜的特征

      为了调查缺口依赖的内膜秘密,我们使用了先前产生的Meec线(
      • D'Amato G.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Martínez-Poveda B.
      • Torroja C.
      • 沃尔特W.
      • Bochter M.S.
      • Benedito R.
      • 科尔斯。
      • 马丁内斯F.
      • hadjantonakis a. -k。
      • Uemura A.
      • jiménez-borreguero l.j.
      • de la pompa J.L.
      序贯缺口激活调节心室发育。
      )。形态学检查揭示了一种类似于人脐静脉内皮细胞的鹅卵石状的形态,对比小鼠胚胎成纤维细胞的细长形状(图S1A)。 MEEC显示阳性染色,内皮表面标记物脱离蛋白B4(
      • 巫术A.E.
      • Nakashima K.
      • 夏天r.g.
      • Toni N.
      • d'amour k.a.
      • 谎言D.C.
      • Gage F.H.
      细胞融合无关的神经干细胞与内皮谱系的分化。
      )( 图S1B.)在细胞核中用于免疫检测器(
      • McLaughlin F.
      • Ludbrook V.J.
      • kola i.
      • 坎贝尔C.J.
      • 兰迪上午
      人类ICAM-2启动子肿瘤坏死因子(TNF) - (α)响应元素的表征。
      )( 图S1C.)。内膜标记物NFATC1在细胞质中弥漫性表达(图S1D.)加入CA后易于骨髓2+ ionophore (
      • Clipstone N.A.
      • Crabtree G.R.
      钙素鉴定作为T淋巴细胞活化中的关键信号酶。
      )( 图S1E.)。我们测试了VEGF预处理MEEC在减少生长因子MITIGEL上的内皮管形成测定中的血管生成行为(
      • Decicco-Skinner K.L.
      • 亨利G.H.
      • Cataisson C.
      • Tabib T.
      • Gwilliam J.C.
      • Watson N.J.
      • 牛磺丝
      • Falkenburg L.
      • o'neill r.c..
      • Morin A.
      • 最美J.S.
      内皮细胞管形成测定用于血管生成的体外研究。
      )。响应于6小时的血管生成刺激,Meec对齐和形成Matrigel内的毛细管状结构,并且在更高的初始播种密度后,管网更广泛(图。 S1F.S1G)。这些结果表明MEEC保留胚胎内膜细胞的性质,因此是合适的 体外 系统在其中操纵心内膜缺口信令。

       分析缺口依赖性内膜肠综合体

      为了实现配体特异性缺口信号传导或抑制,我们用固定化的重组DLL4或Jag1配体刺激Meec(
      • Benedito R.
      • 罗卡C.
      • SörensenI.
      • 亚当斯S.
      • Gossler A.
      • Fruttiger M.
      • 亚当斯r.h.
      凹口配体DLL4和Jagged1对血管生成具有相反的影响。
      )在DMSO(载体)或γ分泌酶抑制剂RO4929097(RO)存在下(Fig. 1A)。这使我们可以在激活和抑制条件下比较配体特异性缺口依赖性秘密。通过缺口靶基因的QRT-PCR确认凹口激活和废除 Hey1, Hey2, he , 和 Nrarp. (
      • 拉马尔E.
      • Deblandre G.
      • Wettstein D.
      • Gawantka V.
      • Pollet N.
      • niehrs c.
      • Kintner C.
      nrarp是陷波信号通路的新细胞内部分量。
      ,
      • ISO T.
      • KEDES L.
      • 哈曼y。
      HES和HER​​P系列:陷波信号通路的多重效应器。
      ,
      • Fischer A.
      • 舒马赫恩。
      • 迈尔M.
      • Sendtner M.
      • 戈斯勒M.
      胚胎血管发育需要凹口靶基因2 Hey1和Hey2。
      )( 图。 1B1C )。
      通过彩易福彩消化分析来自每个实验条件的无血清调节培养基,然后通过LC-MS / MS进行多重异常标记和分析(图S2A,参见“实验程序”),导致在所有实验条件下鉴定来自非冗余彩易福彩的肽(Fig. 1D表S1)。基于分泌蛋白之间共享的特征,通过严格的计算分析来过滤它们,以选择可能被活细胞作为可溶性彩易福彩导出的那些。 875候选者的最终名单定义了内心膜内秘密(Fig. 1D表S2)。沉淀反应的主要成分分析显示,基于治疗的分离为三簇:配体驱动的陷波激活,缺口抑制和不敏感(对照)( 图。S2B.)。治疗三次含量显示出总叠加,只有三个异常值包含在以下统计分析中。
      总共,我们在MEEC中实现了一种有意义的刺激和抑制Notch信号传导,允许选择代表缺口依赖性内心膜内容的潜在分泌的彩易福彩。

       Notch信号传导调节生长因子和细胞外基质组分分泌物

      为了研究Notch活化在心内膜沉肠瘤组合物中的总体效果,我们专注于JAG1和DLL4刺激后鉴定的690个分泌蛋白(总量的78.6‰)(图。S2C表S3A)。在该组中,我们只选择分泌的彩易福彩显示出显着变化(p <0.05)全球陷波激活或抑制后(表S3B.)。为此,我们比较了陷波激活(DLL4和JAG1-DMSO组合) 相对 Notch抑制(DLL4和JAG1-RO合并)和缺口激活 相对 对照(DMSO)和NOTCH抑制合并(图。 S3A.S3B)。选择在至少一种比较中显示差异分泌的彩易福彩(n = 129)。通过分泌模式进行这些常见蛋白的分层聚类产生了四个主要群体(Fig. 2A),对应于彩易福彩抑制后的彩易福彩(簇1和4)后彩易福彩复苏或过度分泌; Fig. 2A)在陷波激活后(簇2和3)后,彩易福彩过度复古或过度。 Fig. 2A )。
      为了更好地了解这些响应彩易福彩的功能,我们对基于Hypersecretion(集群1和3的群体的两个主要秘密谱进行了富集分析。 Fig. 2A)和低钠(群集2和4; Fig. 2A)在陷波激活期间。分析表明,第一组(59个彩易福彩)具有显着的ECM重塑和相关术语的重述,其中ECM的几种组分(TGFβ2,CTGF,FBLN2,FN1和各种胶原蛋白)和重塑酶(包括溶酶 - 氧化酶 - 和金属蛋白酶抑制剂-TIMP1和TIMP3-)(Fig. 2B表S5A)。相比之下,第二组(70蛋白)显示出富含泛素 - 缀合酶(NEDD4,UBE2K和UBE2V1),氨基肽(NPEPP,Pepd,XPNPep1)和金属蛋白酶(ADAM10,Adamts5, AEBP1)(Fig. 2C表S5A)。通过Kegg途径分析获得了类似的结果,进一步支持陷波刺激促进促进帕拉克毒素信号的分泌,促进了“ECM受体相互作用”,“癌症”,“和”TGFβ信号传导“和”TGFβ信号传导“所涉及的帕拉卡碱信号的分泌与细胞迁移和侵袭性密切相关,并且引导/趋化信号的分泌减少,如Semaphorins(图。 2B2C )。
      为了鉴定上述功能的彩易福彩 - 彩易福彩相互作用,通过将129个差异表达的彩易福彩与字符串v11数据库(
      • Zambon A.c.
      • GAJ S.
      • 何我。
      • 汉斯普尔K.
      • Vranizan K.
      • Evelo C.T.
      • Conklin B.R.
      • pico a.r.
      • Salomonis N.
      Go-Elite:用于途径和本体的灵活解决方案。
      )( 表S6A)。我们预测了一个统计上有重要的网络,其中包含了由229个边缘连接的78个节点(39个过度分泌和39个低声折叠),代表物理或功能相互作用(Fig. 3A表S6B.)。我们确定了两个包含最密集的节点的主要簇(由虚线封闭 Fig. 3A)其中39个节点中的29个与Hypersecred蛋白相对应。其中,最互连的彩易福彩是结构蛋白(胶原蛋白)和ECM重塑因子(粗体名称 Fig. 3A)。这些彩易福彩以最代表性的GO术语和KEGG途径出现,与细胞外基质,胶原组织,对刺激,ECM-受体相互作用和局灶性粘附的反应相对应。另一个节点大多是复苏彩易福彩,形成了较差的网络。有趣的是,我们发现RAB7水平的增加,内脲溶血性贩运中的一个关键调节器,表明凹口也可能通过释放包装成囊泡的信号来介绍与邻近的细胞串扰(
      • WANLANDHAM P.A.
      • Ceresa B.P.
      RAB7调节多重人体生物发生下游的晚期内吞贩和货物封存。
      )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3Notch相关的分泌概况的互动组。 (A)Notch依赖性蛋白酶,显示78个节点(至少一个比较中的差异分泌的彩易福彩:缺口激活 相对 抑制或缺口激活 相对 控制加抑制的组合。节点通过229边(物理或功能交互)连接。边缘的紫色梯度反映了它们的相互作用程度(从高到低)。虚线描绘了那些形成最密集连接的簇的节点。红色和蓝色分别在陷波激活时表明分泌更高,分泌较低。粗体名称代表ECM重塑蛋白。
      总体而言,我们的分析表明,Notch介导在心内膜沉淀调节的TGFβ信号传导,局灶性粘附和ECM形成中的剖腹症信号,以调节心脏发育过程中的细胞运动。

       DLL4和JAG1配体决定了一种独特的秘密组成

      在心脏瓣膜开发期间,DLL4和JAG1顺序起作用以激活陷波信令。早期内压性DLL4-NOTCH活动驱动其导致阀门原始的EMT。后来,JAG1-NOTCH信号传导对瓣膜间充质细胞增殖的调节至关重要(
      • MacGrogan D.
      • D'Amato G.
      • 特拉维萨诺S.
      • Martinez-Poveda B.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Papoutsi T.
      • s
      • 布v.
      • Gomez-del Arco P.
      • GómezManuelJ.
      • 周B.
      • 雷东多胡安米
      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      )。为了确定DLL4和JAG1在MEEC中引发不同的彩易福彩分泌反应,我们将在与JAG1和DLL4刺激后获得的秘密数据相比,使用与前一节中的相同的统计分析。 JAG1介导的刺激改变了82个蛋白的分泌,而DLL4改变了113个彩易福彩的分泌(Fig. 4A表S4A.S4B)。在JAG1和DLL4刺激的MEEC中,仅改变了24种彩易福彩。因此,差异分泌的彩易福彩中的70-80是配体特异性的。为了可视化彩易福彩丰度的变化,我们执行了JAG1和DLL4依赖的秘密的分层聚类(图。 4.B4D)。 Hypersecretion(与对照和RO情况相比)是Jag1依赖性秘密中的主要效果;相比之下,随着DLL4刺激,主要效果是低软质。有趣的是,JAG1-和DLL4刺激的MEEC中的24个分泌蛋白中的大多数分泌的彩易福彩与配体(簇1和3中)相似响应 Fig. 4D表S4C. )。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4DLL4和JAG1引起了不同的分泌型材。 (A)显示差异分泌彩易福彩重叠的Venn图(t 测试, p <0.05)在至少一个比较分析中(缺口激活 相对 抑制或缺口激活 相对 控制加抑制的组合),具有JAG1特异性和DLL4特定信号分别的信号。 ( B-D. )炎热地图显示 z-core-romanicized折叠的彩易福彩逐渐分泌的彩易福彩响应于JAG1的信令(B),dll4(C),或通过两个配体(D),至少一个比较。在 D,彩易福彩名称与每一行一起给出,虚线基于其分泌行为区分三个主要集群。 (E)Heatmap显示Go-Elite服务器生成的丰富的GO条款和Kegg途径的Hypersecreted(黄色虚线 BC)和乳腺蛋白(紫色虚线)响应于JAG1(橙色)和DLL4(绿色)刺激的刺激。颜色比例代表 z - 学龄儿数。彩色框显示每个群集中分泌因子的名称。
      为了将特定功能与每个配体相关联,我们专注于配体激活后显示主要彩易福彩水平改变的簇(虚线盒子 图。 4.B4C)。我们区分彩易福彩鉴定为Hypersecreted(黄色破折号 图。 4.B4C)在JAG1或DLL4特定秘密中的HypOsecreted(紫色虚盒)。对这些簇的GO和KEGG路径分析显示出与每个配体相关的不同的生物学功能(Fig. 4E表S5B.)。在DLL4激活后减少分泌的彩易福彩(Fig. 4C)属于GO术语“葡萄糖代谢过程”,“细胞成分拆卸,”和“血液循环调节”,而过度分泌彩易福彩与“细胞 - 细胞结组织”(DSP,JUP)有关,“细胞器组织”有关。或“细胞发育”(TGFβ2)。相比之下,jag1特异性彩易福彩中最丰富的术语(Fig. 4B)“血小板衍生的生长因子结合”,“软骨和血管发育的调节”和“胶原蛋白原纤维组织”(胶原蛋白),而乳糜蛋白蛋白涉及“信号蛋白受体结合”(Semaphorin)(Fig. 4E表S5B.)。因此,DLL4似乎影响彩易福彩的分泌在细胞代谢,细胞粘附和细胞骨骼动力学中发挥作用,而JAG1导致ECM结构和信号苷的变化。这些结果表明,用DLL4和JAG1刺激引发了MEEC中的不同秘密反应,可能反映了在心脏瓣膜开发期间这些配体中出现的不同角色。

       Notch驱动的基因表达与彩易福彩分泌相关

      为了验证沉核数据,我们检查了在MEEC中的肿瘤刺激或抑制后是否伴有mRNA表达的类似变化。因此,我们分析了QRT-PCR代表最丰富的GO类别的Notch响应蛋白的表达(Fig. 5A)。在比较陷波激活时编码彩易福彩的基因的情况下 相对 缺口抑制,我们发现JAG1增强了转录 Fn1, TGF.β2,COL4A1, 和 CTGF. ,与ECM重塑和EMT相关的分子,以及ECM重塑酶 Timp1, TIMP3,MMP2., 和Loxl2,而DLL4刺激上调 TGF.β2Timp3 (Fig. 5A)。同意秘密数据(Fig. 5B),所有这些基因在RO存在下都在下调(Fig. 5A)。获得相反的结果 Sdc4, Ptx3, Sema3a, 和Sema3e,这在Notch Authation上强烈上调(Fig. 5A)。此外,我们将具有来自MEEC的可用转录组数据与24小时的可用转录组数据进行比较了24小时(Luna-Zurita,准备MS)。在彩易福彩水平或两者含有转录物或彩易福彩水平的分泌彩易福彩之间具有显着差异的分泌彩易福彩之间的比较图。 S4A.S4B表S7A.)。尽管分泌和表达之间的相关性相对较差,但当比较至少在一个级别(r jag1和0.2953 r 对于DLL4的= 0.1749),我们发现当我们专注于差异分泌并在陷波途径激活后表达的彩易福彩(r 用于JAG1的0.6965和 r DLL4 = 0.6685; 图。 S4A.S4B表S7A.)。我们秘书数据中鉴定的一些最具功能相关的彩易福彩是在转录水平上反映的丰度变化的彩易福彩中(表S7B.S7C)。这是对特性/上调因子TGFβ2,FN1,COL1A1,COL5A1,COL6A1和COL6A2以及过次分枝/下调因子SEMA3A,SEMA3C,SEMA3D,SEMA3E,SDC4和PTX3(Fig. 5C表S7D.)。这些结果表明,缺陷依赖性彩易福彩分泌和mRNA表达水平之间的正相关性,并且强烈表明陷波信号通过转录调节改变彩易福彩分泌。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5候选人的mRNA级验证候选人的分泌因子。 (A)Meec Etherate表达的候选Notch-Chrenceactive效应器选择QRT-PCR: Fn1, TGF.β2,TIMP1,TIMP3,LOXL2,CTGF,COL4A1,MMP2,SEMA3E,SDC4,PTX3, 和Sema3a。 数据是每个样品的三份措施的方法,并显示为平均值±S.D. (学生们 t test *p < 0.05; **p < 0.01, ***p < 0.005). (B)显示平均值的热图 z用于基因表达分析的差异分泌蛋白的常规折叠变化。虚线根据其分泌行为区分两个主要集群。 (C)描绘其转录水平(通过RNA-SEQ分析测量)的Meec衍生蛋白的动画片反映了秘密中发现的相同彩易福彩丰富变化,其中JAG1和DLL4特定的信号分别考虑。在缺口激活期间,向上指“上调”和下调“下调”。

       在体内验证缺口依赖性内心膜内秘密候选人

      在心脏瓣膜开发期间,缺口驱动导致阀门原律植物的EMT(
      • Timmerman L.A.
      • Grego-Bessa J.
      • Raya A.
      • Bertran E.
      • Pérez-Pomares J.M.
      • DíezJ.
      • 阿兰达S.
      • Palomo S.
      • McCormick F.
      • Izpisúa-belmonte J.C.
      • de la pompa J.L.
      缺口促进心脏发育和致癌转化期间的上皮性 - 间充质转变。
      )及以后调节间充质增殖和分化以产生成人阀门(
      • MacGrogan D.
      • D'Amato G.
      • 特拉维萨诺S.
      • Martinez-Poveda B.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Papoutsi T.
      • s
      • 布v.
      • Gomez-del Arco P.
      • GómezManuelJ.
      • 周B.
      • 雷东多胡安米
      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      ,
      • jain r.
      • Engleka K.A.
      • rentschler s.l.
      • Manderfield L.J.
      • Li L.
      • 元L.
      • 爱普斯坦J.A.
      心脏神经嵴策划小鼠半轴阀的重塑和功能成熟。
      ,
      • jain r.
      • rentschler s.
      • 爱普斯坦J.A.
      凹口和心脏流出道发育。
      )。这两种过程都需要精致调节ECM生产和成熟。
      鉴于ECM相关蛋白对MEEC Notch依赖性秘密的突出贡献(Fig. 2B; 表S5),我们检查了所选ECM相关分子的转录表达的开发小鼠瓣膜。基于转录组和彩易福彩组学对陷波激活的反应(图。 5.A5B),我们选择了 TGF.β2, Loxl2, Ptx3, Timp3, Fbln2, DCN. 为了 体内 验证。 TGFβ2是TGFβ系列的成员,可通过EMT促进心内膜垫层形成(
      • Potts J.D.
      • Runyan R.B.
      通过转化生长因子β可以部分地介导胚胎心脏中的上皮 - 间充质细胞转化。
      ,
      • 男孩A.。
      • Ayerinskas I.I.
      • Vincent E.B.
      • 麦金尼L.A.
      • 周D.L.
      • Runyan R.B.
      TGFβ2和TGFβ3在胚胎心脏上皮 - 间充质细胞转化中具有分离和顺序的活性。
      )。 LOXL2是一种酶,其负责ECM组分的共价交联(
      • 月亮H.-J.
      • 芬尼J.
      • ronnebaum t.
      • Mure M.
      人溶酶氧化酶样2。
      )。 PTX3是一种细胞因子,涉及分解癌细胞转化为上皮的细胞因子(
      • ronca r.
      • Di Salle E.
      • Giacomini A.
      • Leali D.
      • Alessi P.
      • Coltrini D.
      • 拉维利C.
      • Matarazzo S.
      • Ribatti D.
      • vermi w.
      • Presta M.
      长五花素-3抑制黑色素瘤细胞中的上皮 - 间充质转变。
      )。 TIMP3是基质金属蛋白酶的主要抑制剂(
      • Qureshi H.Y.
      • 西尔维斯特J.
      • el mabrouk m.
      • Zafarullah M.
      TGF-β诱导的软骨细胞中金属蛋白酶酶-3基因组织抑制剂的表达由细胞外信号调节激酶途径和SP1转录因子介导。
      )。 FBLN2是糖蛋白,其在基质稳定中起到核心作用(
      • De Vega S.
      • Iwamoto T.
      • 山田Y.
      纤维素:矩阵结构和组织功能中的多个角色。
      )。最后,DCN是一种与胶原蛋白相互作用的彩易福彩酚,并使TGFβ在结缔组织中提供结构支架(
      • Horiguchi M.
      • OTA M.
      • rifkin d.b.
      转化生长因子-β函数的基质控制。
      )。 ish揭示了这些基因的表达,除了 DCN. (数据未示出),在E10.5小鼠心脏的流出道(OFT)和房室内管(AVC)区域(图S5A)。与上一份报告一致(
      • 男孩A.。
      • Ayerinskas I.I.
      • Vincent E.B.
      • 麦金尼L.A.
      • 周D.L.
      • Runyan R.B.
      TGFβ2和TGFβ3在胚胎心脏上皮 - 间充质细胞转化中具有分离和顺序的活性。
      ), TGF.β2 在AVC和Endocardardium和Mesencary和Myocardium中表达(图S5A)。然而, Loxl2, Ptx3, Timp3, 和Fbln2 被限制在内膜内腔和垫子间充质(图S5A)。在E15.5,AVC外心膜垫具有上限(二尖瓣和三尖瓣)和半轴瓣膜(主动脉和肺部)的垫子。 Loxl2, Ptx3, Timp3, Fbln2, 和 DCN. 在室内腔室和房室间阀的间充质和阀门(图S5B.)。这些结果表明,所选择的MEEC沉肠基因是在经历发育过程的心脏组织中表达,其中ECM发挥至关重要的作用,例如阀体形态发生。
      我们接下来评估是否缺口途径灭活 体内 触发在MEEC中观察到的相同基因表达变化。在E9.5,DLL4对于AVC中的EMT和心内膜垫形成是必不可少的(
      • MacGrogan D.
      • D'Amato G.
      • 特拉维萨诺S.
      • Martinez-Poveda B.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Papoutsi T.
      • s
      • 布v.
      • Gomez-del Arco P.
      • GómezManuelJ.
      • 周B.
      • 雷东多胡安米
      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      )。我们有条件地灭活了 DLL4. 通过横穿轴承的小鼠在显影内皮和心内膜下 DLL4.flox allele (
      • Koch U.
      • Fiorini E.
      • Benedito R.
      • Besseyrias V.
      • Schuster-Gossler K.
      • 皮埃尔米
      • Manley N.R.
      • Duarte A.
      • 麦当劳H.R.
      • Radtke F.
      三角洲4是胸腺T细胞谱系承诺期间Notch1的必需的非冗余配体。
      )与司机线 TIE2-CRE. (
      • Kisanuki Y.Y.
      • 锤子r.e.
      • Miyazaki J.
      • 威廉姆斯S.C.
      • Richardson J.A.
      • yanagisawa m.
      TIE2-CRE转基因小鼠:体内内皮细胞谱系分析的新模型。
      )。 E9.5的全部安装ISH分析 DLL4.flox;TIE2-CRE. 突变心脏显示出严重减少的表达 TGF.β2 在AVC区(内膜内容和心肌)(图。 6.A6B ), 的 Loxl2 在AVC心内膜(图。 6.C6D)和 Fbln2 在AVC心内膜和间充质(图。 6.E6F)。相比之下,表达 Ptx3, DCN. , 和Timp3 不受影响(数据未显示)。这些发现与表明这一点的报道一致 TGF.β2 是早期瓣膜开发期间的陷波靶(
      • Luna-zurita L.
      • PRADOS B.
      • Grego-Bessa J.
      • LuxánG.
      • Del Monte G.
      • Benguría
      • 亚当斯r.h.
      • Pérez-Pomares J.M.
      • de la pompa J.L.
      依赖依赖性间充质基因计划和BMP2驱动细胞侵袭性的整合调节小鼠心脏瓣膜形成。
      )并识别 Fbln2Loxl2 作为缺口下游的潜在新型EMT调解器。 JAG1调节间充质增殖和瓣膜形态发生过程中的分化(
      • MacGrogan D.
      • D'Amato G.
      • 特拉维萨诺S.
      • Martinez-Poveda B.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Papoutsi T.
      • s
      • 布v.
      • Gomez-del Arco P.
      • GómezManuelJ.
      • 周B.
      • 雷东多胡安米
      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      )。消融 jag1. 整个心肌和内膜内腔室和其间充质衍生物,导致瓣膜缺血性(
      • MacGrogan D.
      • D'Amato G.
      • 特拉维萨诺S.
      • Martinez-Poveda B.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Papoutsi T.
      • s
      • 布v.
      • Gomez-del Arco P.
      • GómezManuelJ.
      • 周B.
      • 雷东多胡安米
      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      ),我们培育 jag1.flox mice (
      • Mancini S.J.
      • Mantei N.
      • Dumortier A.
      • Suter U.
      • 麦当劳H.R.
      • Radtke F.
      jagged1依赖性缺口信号传导可分配造血干细胞自我更新和分化。
      )用心脏特异性 NKX2.5-CRE. driver line (
      • 斯坦利尤。
      • BIBEN C.
      • Elefanty A.
      • Barnett L.
      • Koentgen F.
      • robb l。
      • 哈维r.p.
      高效的CRE介导的心血管血管细胞中的缺失赋予Homeobox基因NKX2-5的3'UTR-IRES-CRE等位基因。
      )。 ISH分析显示增加了瓣膜细胞 jag1.flox;Nkx2.5-Cre E14.5的突变体胚胎伴随着改变的表达 Loxl2 (图。 6.G6H “), Fbln2 (图。 6.I6J“), 和 Ptx3 (图。 6.K6L“)。然而, TGF.β2, Timp3, 和 DCN. 保持不变(数据未显示)。同意秘密数据(Fig. 4D表S4C. ), Loxl2Fbln2 mRNA减少了 jag1.flox;Nkx2.5-Cre mutant valves (图。 6.G6J“), 然而 Ptx3 was up-regulated (图。 6.K6L“)。此发现与秘密数据一致(表S4)并表明增加之间的正相关性 Ptx3 转录和JAG1-NOTCH信号封闭后过度未成熟的间充质的存在(
      • MacGrogan D.
      • D'Amato G.
      • 特拉维萨诺S.
      • Martinez-Poveda B.
      • LuxánG.
      • Del Monte-Nieto G.
      • Papoutsi T.
      • s
      • 布v.
      • Gomez-del Arco P.
      • GómezManuelJ.
      • 周B.
      • 雷东多胡安米
      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      )。总之,我们的结果验证了MEEC作为一个强大的 体外 内压细胞信号的模型,支持潜力 体外 系统识别载体形态发生的分子。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6 体内 验证 TGF.β2,loxl2,fbln2, 和Ptx3 作为缺口途径小鼠突变体中的凹口靶基因。 ( A-F. )在E9.5 WT和E9.5和HART中的全部安装ISH分析 DLL4.flox;Tie2-Cre 胚胎,显示心脏的一般观点。 TGF.β2 AVC心肌中的表达(A)在突变体中丢失(B,星号)。 Loxl2 AVC内切管中的表达(C,箭头)在突变体中减少(D,星号)。 Fbln2 AVC心内膜和间充质细胞中的表达(E,箭头)在突变体中显着下降(F,星号)。 ( G-L. “)在E14.5 WT和Heart Sections中的ISH分析 jag1.flox;Nkx2.5-Cre 胚胎。表达式 Loxl2 ( G-H. “) 和 Fbln2 ( I-J. “)在内膜内容和间充质细胞中较低,突变体室内瓣膜,而 Ptx3 在间充质细胞中上调( K-L. “)。盒装区域在右侧的面板上放大('tricuspid阀门;二尖瓣)。秤条:100μm。 A(Atria),AVC(房地盆),IVS(间隔),LV(左心室),MV(二尖瓣),电视(三尖瓣)。

      讨论

      我们已经生成了一个 体外 通过微量的心脏组织来规避彩易福彩组学研究对早期心脏发育彩易福彩组学研究的严重限制。使用MEEC,我们能够识别第一次依赖于缺口的胚胎内膜内容。 MEEC具有内皮细胞和功能特征(分离性B4染色和ERG表达),显示鹅卵石外观和形成Matrigel中的毛细管状结构的能力。此外,Meec表达了典型的心内膜标记(NFATC1),表明它们是合适的 体外 实验系统在其中测定彩易福彩分泌术对彩易福彩分泌的影响,以及未来对心内膜细胞生物学的研究。
      我们用重组配体DLL4或JAG1刺激MEC,在这些设置中展示了在RO存在下的NOTCH途径激活及其抑制,并在这些设置中检查QRT-PCR的靶基因表达。来自不同实验条件的调节培养基的定量彩易福彩组学分析鉴定的彩易福彩,其分泌响应陷波操纵。为了分析彩易福彩组数据,我们组合了先进的定量统计模型(
      • Navarro P.
      • Trevisan-Herraz M.
      • Bonzon-Kulichenko E.
      • Nuñeze.
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      • Bonzon-Kulichenko E.
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      一种新的系统 - 生物学算法,用于使用定量彩易福彩组学分析协调彩易福彩反应的研究。
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      • Trevisan-Herraz M.
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      Sanxot:用于高通量彩易福彩组学实验的定量分析的模块化和多功能包。
      )通过各种基于Web的接口,识别875个分泌因子,其中129个接受了陷波操纵后显着表达的变化。凹口激活直接相关,随着ECM重塑和结构蛋白(TGFβ2,胶原蛋白)的分泌增加,并与引导信号(透光素)和彩易福彩改性酶的分泌相反。这些结果与南部,ECM动态和血管外发育中的缺口,ECM动态和信号素之间的心血管开发关系一致(
      • Del Monte-Nieto G.
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      • adam a.a.s.
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      Epstein,J.A.,A.Aghajanian,H.和Singh,M.,K。(2015)血管内发育中的信号素信号传导。细胞代谢21,163-173,

      )通过彩易福彩分泌表示额外的调节水平。所鉴定的秘密谱是配体特异性的。 DLL4-Notch信号传导主要刺激了TGFβ2,细胞间隙蛋白和细胞骨骼蛋白的产生,表明EMT,细胞 - 细胞/细胞 - 基质粘附和细胞骨架信号传导的参与。相比之下,JAG1-Notch信号传导促使较高水平的胶原蛋白相关彩易福彩,表明对EMT和ECM沉积的主要贡献。这些调查结果同意在促进EMT和细胞迁移时对DLL4-Notch1信号传导的早期作用 相对 JAG1-NOTCH1在瓣膜间充质增殖和重塑的调节中的后来作用(
      • MacGrogan D.
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      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      )。
      Meec综述实验中鉴定的所选差异分泌的彩易福彩的QRT-PCR验证揭示了mRNA和彩易福彩分泌动力学之间的标记对应。通过从DLL4和JAG1刺激的MEEC分析RNA-SEQ数据来确认mRNA和彩易福彩分泌动力学之间的这种相关性,强烈表明彩易福彩递送受到缺陷依赖性转录调节的影响。进一步验证了NOTCH ecrictome在EMT和ECM动态的参与 体内 分析所选潜在的缺陷响应基因(TGF.β2, Loxl2, Ptx3, Timp3, Fbln2, DCN. )在早期(E10.5)和重塑(E15.5)心脏瓣膜中表达。有趣的是, TGF.β2 之前被描述为分泌的凹口效应器(
      • Luna-zurita L.
      • PRADOS B.
      • Grego-Bessa J.
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      依赖依赖性间充质基因计划和BMP2驱动细胞侵袭性的整合调节小鼠心脏瓣膜形成。
      )介导EMT启动(
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      转化生长因子β在心脏发育中上皮 - 间充质转换中的韧带特异性函数。
      )。因此,在Meec execticle中检测该细胞因子不仅突出了我们方法的敏感性,而且还表明了彩易福彩组数据集的适当性,用于探索缺口下游的EMT信号级联。在早期阶段, Loxl2, Ptx3, Timp3,Fbln2 仅限于构成AVC垫和OFT的内膜内容和间充质细胞,而 TGF.β2 也与以前的出版物一致(
      • 迪克森米。
      • Slager H.g.
      • 达菲E.
      • 木乃伊C.L.
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      早期小鼠胚胎中TGFβ2的RNA和彩易福彩定位表明涉及心脏病发育。
      )。后来发展, DCN. 并且其余候选人也在房室和半不孤立的阀门传单中表达。这些结果表明这些因素有助于瓣膜开发,并且可以根据心内膜内部和间充质的差异时空定位发挥明显的作用。通过分析它们的表达来确认缺口信号传导与这些旁静脉因子之间的关系 DLL4.jag1. 靶向突变体。 TGF.β2, Loxl2, 和Fbln2 转录物在E9.5中下调 DLL4.flox;Tie2-Cre 突变心脏,其中EMT受损(
      • MacGrogan D.
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      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      )。类似的减少 TGF.β2 表达先前报道 RBPJ. κ和 Notch1 mutants (
      • Timmerman L.A.
      • Grego-Bessa J.
      • Raya A.
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      • de la pompa J.L.
      缺口促进心脏发育和致癌转化期间的上皮性 - 间充质转变。
      )。这些发现表明,Notch1活性可以触发来自心内膜的LOX12和FBLN2信号的转录和随后释放以启动和维持EMT。而且, Loxl2Fbln2 表达减少了 Ptx3 E14.5的房地盆阀中表达增加 jag1.flox;Nkx2.5-Cre 小鼠突变体,显示增气阀和缺陷的重塑(
      • MacGrogan D.
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      • Gomez-del Arco P.
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      • 周B.
      • 雷东多胡安米
      • jiménez-borreguero luis J.
      • de la PompaJoséL。
      序贯配体依赖性缺口信号传导激活调节瓣膜原始形成和形态发生。
      )。这些基因表达改变了秘密中观察到的并联的那些,并表明ECM分子表达的不平衡可能受损瓣膜组织和重塑。
      因此,我们已经确定了三种潜在的秘密标记,其中凹口可以自主地贡献到EMT:LOXL2,FBLN2和PTX3。 LOX12是溶酶氧化酶系列的成员,其在ECM通过胶原和弹性蛋白的交联在ECM重塑中发挥着重要作用(
      • 金Y.-M。
      • Kim E.-C.
      • Kim Y.
      将人溶氧酶样2彩易福彩用作玻璃蛋白和弹性蛋白的胺氧化酶。
      )并参与EMT驾驶员蜗牛的后期调节(
      • Peinado H.
      • del carmen iglesias-de la Cruz M.
      • olmeda d。
      • Csiszar K.
      • Fong K.S.K.
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      • Nieto M.A.
      • Cano A.
      • Portillo F.
      蜗牛氧化酶样2酶在蜗牛调节和肿瘤进展中的分子作用。
      )。 FBLN2是一种基质糖蛋白,其在基质稳定化中起核心作用,其作为分子间扣环作用,并促进胶原蛋白IV,纤连蛋白和其他ECM分子的Supra分子组件(
      • 贝尔德B.N.
      • Schliekelman M.J.
      • ahn y.-h。
      • 陈Y.
      • roybal J.D.
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      • Wistuba I.I.
      • 汉尚三
      • Kurie J.m.
      Fibulin-2是肺腺癌恶性进展的驱动力。
      )。在心脏中,FBLN2由心内膜垫组织产生(
      • 张H.Y.
      • CHU M.-L.
      • 潘t.-c.
      • Sasaki T.
      • Timpl R.
      • Ekblom P.
      细胞外基质蛋白纤维蛋白-2在胚胎内心膜膜垫组织中表达,是成人心脏中瓣膜的突出成分。
      )已经建议保持心脏瓣膜的机械性能(
      • Tsuda T.
      • 王H.
      • Timpl R.
      • CHU M.-L.
      FIBULIN-2表达标记在发育心脏瓣膜,主动脉弓容器和冠状动物中转化的间充质细胞。
      )。 PTX3是佛罗州家族的成员,参与控制肿瘤发育,影响人黑素瘤细胞中的细胞增殖和EMT 体外 (
      • ronca r.
      • Di Salle E.
      • Giacomini A.
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      • Ribatti D.
      • vermi w.
      • Presta M.
      长五花素-3抑制黑色素瘤细胞中的上皮 - 间充质转变。
      )。 HPTX3过表达导致较早期间充质标记的下调 SNAIL1SNAIL2,并联 e-cadherin. 上调,表明PTX3过表达通过将其间充质表型逆转到上皮细胞型来抑制黑色素瘤细胞中的EMT(
      • ronca r.
      • Di Salle E.
      • Giacomini A.
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      • vermi w.
      • Presta M.
      长五花素-3抑制黑色素瘤细胞中的上皮 - 间充质转变。
      )。值得注意的是,PTX3是对心脏垫和阀门的最受限制定位的分泌因子。
      总之,我们的结果验证了MEEC作为一个强大的 体外 内膜沉淀研究的模型。 Notch信号传导的操纵揭示了DLL4和JAG1诱导的Xciscomes,并确定了几种分泌的因子,其在垫层形成期间表达的转录物和瓣膜重塑,并且在陷波突变小鼠中改变。这些因素的功能分析将提供对这些信号的协调方式以及它们的中断可能有助于先天性瓣膜缺陷和疾病的洞察。

      数据可用性

      数据集(RAW文件,彩易福彩数据库,搜索参数和结果)可用于PeptiDATLAS存储库中,可以通过以下方式下载 http://www.peptideatlas.org/ 使用DataSet标识符Pass01354。

      致谢

      我们感谢C.MartíGómez-aldaraví与图形表示和术语编辑的批判性阅读,以及英语编辑的S. Bartlett。

      补充材料

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