血清抗体和急性期蛋白的一种强大而多功能的自动化糖类技术:卵巢癌案例研究*[S]

  • róisíno'flaherty.
    一致
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    Nibrt Glycoscience集团,国家生物切除研究与培训研究所,FoSters Avenue,Mount Merion,Blackrock,Dublin 4,爱尔兰,A94x099
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  • Mohankumar Muniyappa.
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    Nibrt Glycoscience集团,国家生物切除研究与培训研究所,FoSters Avenue,Mount Merion,Blackrock,Dublin 4,爱尔兰,A94x099
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  • 伊恩沃尔斯
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    BioProcessing Technology Institute,科学,科技和研究机构(Astar),20 Biopolis Way,#06-01 Centros,新加坡138668,新加坡
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  • 亨宁斯特塞克曼
    脚注
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    Nibrt Glycoscience集团,国家生物切除研究与培训研究所,FoSters Avenue,Mount Merion,Blackrock,Dublin 4,爱尔兰,A94x099
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  • Mark Hilliard.
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    Nibrt Glycoscience集团,国家生物切除研究与培训研究所,FoSters Avenue,Mount Merion,Blackrock,Dublin 4,爱尔兰,A94x099
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  • Richard Hutson.
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    癌症研究英国LEEDS,圣詹姆斯大学医院临床中心,LEEDS LS9 7TF,英国
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  • Radka Saldova.
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    Nibrt Glycoscience集团,国家生物切除研究与培训研究所,FoSters Avenue,Mount Merion,Blackrock,Dublin 4,爱尔兰,A94x099

    Ucd医学院,大学学院,都柏林,都柏林,都柏林4,Ireland
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  • Pauline M. Rudd.
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    Nibrt Glycoscience集团,国家生物切除研究与培训研究所,FoSters Avenue,Mount Merion,Blackrock,Dublin 4,爱尔兰,A94x099
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  • 作者脚注
    *欧盟FP7课程高甘草和甘草(278535,259869)支持这项工作。 R.S.确认科学基金会爱尔兰的资助,在拨款号13 / SIRG / 2164下进行了科学基金会启动调查员研究补助金(SFI SIRG)。 I.W.承认高凝素核糖的资助:在拨款号1335G00086下。
    [S] 本文包含补充数据和表格。
    **当前地址:Abbvie Inc.1,Discovery Chemistry和Technologies,1 North Waukegan Road,North Chicago,IL 60064,美国。
      基因组,转录组,代谢物,脂质体和蛋白质组的直接关联揭示了互联的细胞途径的系统。单个糖蛋白在疾病背景下的确切作用尚未阐明。在朝向个性化药物的举动中,了解疾病发病机制,以及伴随其的性状,阶段,表型和分子特征是至关重要的,作为整个系统的破坏。为此,我们在自动化平台上开发了一种创新技术,“Glycoseqcap”,它结合了 N使用单一人血清来源来自六个糖蛋白的糖化数据。具体而言,我们多用并优化了六种纯化的糖蛋白,免疫球蛋白G(IgG),免疫球蛋白M(IgM),免疫球蛋白A(IgA),转移素(TRF),HPT)和α-1-抗胰蛋白酶的连续连续捕获和糖分分析(A1At),来自50μl人血清。我们在迄今为止的人类血清的单一来源中提供对单个糖蛋白的最全面而深入的聚糖分析。为了在疾病模型的背景下证明技术应用,我们在卵巢癌队列中进行了试点研究(n = 34)使用鉴别和分类分析来鉴定异常的糖基化。在我们的样本队列中,我们对目前使用的生物标志物进行了改善的选择性和特异性,用于卵巢癌,CA125,用于早期卵巢癌。该技术将建立一种新的最先进的策略,用于表征单个血清糖蛋白作为诊断和监测工具,这代表了理解疾病期间发生的变化的重要步骤。

      图形概要

      糖基化是最常见的和复杂的翻译后改性和糖动态,正确地被认为是当前的前沿。超过1%的人类基因组代码的〜300个功能糖原,已知在人体中存在(
      • Taniguchi N.
      从糖血管学到系统糖血管学:通过联盟的日本科学家国际网络。
      )。翻译后修改(PTM)
      使用的缩写是:
      PTMS.
      翻译后修改
      IgG.
      免疫球蛋白G.
      TRF.
      转铁素
      A1AT
      alpha1antitrypsin.
      Haptoglobin.
      IEF.
      等电聚焦
      IgM.
      免疫球蛋白M.
      IGA.
      免疫球蛋白A.
      ra.
      类风湿关节炎
      NP.
      正常相
      CSC.
      恒定和约束。
      1使用的缩写是:PTMS.
      翻译后修改
      IgG.
      免疫球蛋白G.
      TRF.
      转铁素
      A1AT
      alpha1antitrypsin.
      Haptoglobin.
      IEF.
      等电聚焦
      IgM.
      免疫球蛋白M.
      IGA.
      免疫球蛋白A.
      ra.
      类风湿关节炎
      NP.
      正常相
      CSC.
      恒定和约束。
      蛋白质是蛋白质生物合成的关键事件,糖基化是最重要的一种。它反映了个体人的基因组,以及对细胞途径的许多其他影响。实际上,糖蛋白质可以被认为是赋予基因产物功能的基因组的最终读数。一系列人类遗传障碍,包括糖基化的先天性疾病(
      • 巴特勒姆
      • Quelhas D.
      • 克里德利A.J.
      • Carchon H.
      • hebestreit h.f.
      • Hibbert r.g.
      • Vilarinho L.
      • TELE E.
      • Matthijs G.
      • Schollen E.
      • argibay p.
      • 哈维D.J.
      • DWEK R.A.
      • jaeken J.
      • rudd下午
      详细的糖基化患者血清糖蛋白的血清糖蛋白分析表明了特异性缺陷的聚糖加工步骤,并提供了对发病机制的洞察力。
      ,
      • Grunewald S.
      • Matthijs G.
      • jaeken J.
      先天性糖基化疾病:综述。
      ),糖尿病型糖尿病(
      • thanabalasingham g。
      • 霍夫曼J.E.
      • Kattla J.J.
      • Novokmet M.
      • 鲁丹一世。
      • Gloyn A.L.
      • 海沃德C.
      • Adamczyk B.
      • Reynolds r.m.
      • Muzinic A.
      • Hassanali N.
      • Bennett A.J.
      • 埃斯法迪A.
      • Polasek O.
      • 莫格拉尔S.A.
      • Redzic I.
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      • Zgaga L.
      • KOLCIC I.
      • 汉森T.
      • Gasperikova D.
      • Tjora E.
      • Strachan M.W.
      • 尼尔森T.
      • 斯坦尼克J.
      • klimes i.
      • Pedersen O.B.
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      • Gyllensten U.
      • Gornik O..
      • 威尔逊J.F.
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      • 麦卡锡米。
      • rudd下午
      • 欧文K.R.
      • Lauc G.
      • 赖特A.F.
      HNF1A中的突变导致血浆甘油谱的显着改变。
      ),半乳糖血症(
      • Colhoun H.O.
      • Teaccy E.P.
      • Macmahon M.
      • rudd下午
      • Fitzgibbon M.
      • O'Flaherty R.
      • 步骤K.M.
      验证适用于古典半乳糖瘤的自动化UPLCIGG N-GLYCAN分析方法。
      )肌营养不良(
      • 冻结H.H.
      • EKLUND E.A.
      • NG B.G.
      • Patterson M.C.
      人糖基化病症的神经系统方面。
      )已直接连接到或显示涉及错误的糖基化。癌症相关的异常基因调节还导致甘草结构的改变,并在血清Glycome和特异性血清糖蛋白中进行了很好地研究(
      • Saldova R.
      • struwe w.b.
      • Wynne K.
      • ELIA G.
      • 达菲M.J.
      • rudd下午
      探索血清CA125的糖基化。
      ,
      • Sarrats A.
      • Saldova R.
      • PLA E.
      • 埃斯特堡。
      • 哈维D.J.
      • struwe w.b.
      • De Llorens R.
      • rudd下午
      • peracaula R.
      肝脏癌症肝癌和慢性胰腺炎中肝急性期蛋白的糖基化。
      ,
      • PINHO S.S.
      • reis c.a.
      癌症中的糖基化:机制和临床意义。
      )。此外,慢性炎症性疾病显示出改变的糖基化(
      • 马里诺克。
      • Saldova R.
      • Adamczyk B.
      • rudd下午
      血清N-糖基化轮廓的变化:诊断功能的功能意义和潜力。
      )。
      免疫球蛋白G(IgG) N - 使用液相色谱和质谱法的特征良好,(
      • Stockmann H.
      • 杜克里..
      • Millan Martin S.
      • rudd下午
      超高吞吐量,基于超滤的N-Glycomics平台,用于超型液相色谱(超(3))。
      ,
      • O'Flaherty R.
      • Trboojevic-akmacic i.
      • 格雷维尔G.
      • rudd下午
      • Lauc G.
      生物制剂的甜蜜点:生物治疗性糖蛋白表征的最新进展。
      ,
      • Lauc G.
      • 凉亭M.
      • 鲁丹一世。
      • 坎贝尔H.
      疾病机制:人n-glycome。
      ) 但 N已经研究了其他糖蛋白的糖基化分析到较小程度。例如, N - 在我们的实验室中进行了急性期蛋白,例如转铁蛋白(TRF),Alpha-1-Antikrypsin(A1AT)和HPT)的糖基化分析(
      • Sarrats A.
      • Saldova R.
      • PLA E.
      • 埃斯特堡。
      • 哈维D.J.
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      肝脏癌症肝癌和慢性胰腺炎中肝急性期蛋白的糖基化。
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      • 麦卡锡C.
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      • Bergin D.A.
      • Carroll T.P.
      • 凯恩·j.
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      • Clynes M.
      • rudd下午
      • Reeves E.P.
      • mcelvaney n.g.
      从α-1抗真菌素缺乏个体增加突变α-1抗核蛋白的N-聚糖的外臂和核心岩藻糖残基。
      )使用诸如等电聚焦(IEF)或2D-凝胶电泳的复杂方法进行糖蛋白分离。此外, N - 血清免疫球蛋白M(IgM)的糖化化(
      • 阿诺德J.N.
      • Wormald M.R.
      • suter d.m.
      • radcliffe c.m.
      • 哈维D.J.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      • SIM R.B.
      人血清IgM糖基化:鉴定可与人甘露结合凝集素结合的糖果实。
      )和免疫球蛋白A(IgA)(
      • Mattu T.S.
      • 请求r.j.
      • 威利斯A.c.
      • 克里安米
      • Wormald M.R.
      • lellouch a.c.
      • rudd下午
      • Woof J.M.
      • DWEK R.A.
      人血清IgA1,Fab和Fc区的糖基化和结构及N-糖基化对Fcalpha受体相互作用的作用。
      以前使用的特征在于使用正常相高性能液相色谱(NP-HPLC)十年前仅具有鉴定的聚糖比例,当时的技术限制。最近,IgA位点特异性糖基化(N- 和 O在妊娠期间,使用基质辅助激光/解吸电离傅里叶变换离子回旋谐振(MALDI-FTICR)质谱(
      • 邦德A.
      • 尼古拉斯。
      • Jansen B.C.
      • Stavenhagen K.
      • 空白D.
      • Kammeijer G.S.
      • Kozak R.P.
      • Fernandes D.L.
      • Hensbergen P.J.
      • Hazes J.M.
      • van der burgt y.e.
      • Dolhain R.J.
      • Wuhrer M.
      纵向监测免疫球蛋白妊娠期间的糖基化通过同时进行N-和O-糖肽的MARDI-FTICR-MS分析。
      )。注意,该团队另外发布 N-Glycan分析并可以识别专业 N-glycans未在特征IgA1中识别 N - 庚二肽级分。因此,血清IgA的详细结构表征 N-glycome分析仍有待开展。在单独的研究中,在卵巢癌患者的血清中研究了免疫球蛋白(IgG,IgM和IgA)的蛋白质特异性差动糖基化(
      • Ruhaak L.R.
      • 金库克。
      • stroble c.
      • 泰勒S.L.
      • 洪问:
      • 米亚塔托斯。
      • lebrilla c.b.
      • LieSerowitz G.
      卵巢癌患者血清中免疫球蛋白的蛋白质特异性差异糖基化。
      )在三重四极杆质谱仪上使用多反应监测。该技术呈现出类似的局限性与整体结构阐释相似 N-glycome,但高度揭示,由此作者假设在总血清Glycome型材内,其在很大程度上由最高丰度蛋白(例如抗体IgG,IgM和IgA或急性期蛋白TRF,HPT,A1AT)中的主导地位蛋白质和位点特异性的糖基化曲线可能会在卵巢癌相关的聚糖的糖基化合物中进一步了解蛋白质特异性改变,以及卵巢癌的更具体的生物标志物而不是当前工具(
      • Ruhaak L.R.
      • 金库克。
      • stroble c.
      • 泰勒S.L.
      • 洪问:
      • 米亚塔托斯。
      • lebrilla c.b.
      • LieSerowitz G.
      卵巢癌患者血清中免疫球蛋白的蛋白质特异性差异糖基化。
      )。
      虽然样品纯化和靶向糖蛋白富集(
      • 朱R.
      • Zacharias L.
      • 树木陈列。
      • 彭W.
      • Mechref Y.
      糖蛋白富集分析技术:优点和缺点。
      ),越来越需要开发更强大,一致,灵敏的方法,这些方法可以自动化和应用于个性化医学方法。为了解决这种需求,我们通过连续提取-IgG,IgM,IgA,TRF,HPT和A1AT进行了优化和自动化六种丰富的单个糖蛋白来捕获和糖基因六种丰富的单个糖蛋白。我们对此进行了详细的分析 N使用50μl合并的正常人血清(NHS)来自这六种糖蛋白的糖。然后,我们将这种技术应用于卵巢癌患者队列,由7例健康对照,6个临界和21例转移性卵巢癌患者组成,并测试其潜力用作卵巢癌检测的诊断工具。本研究是我们先前报道的样品制备和色谱技术的后续适用于甘草分析(
      • Stockmann H.
      • 杜克里..
      • Millan Martin S.
      • rudd下午
      超高吞吐量,基于超滤的N-Glycomics平台,用于超型液相色谱(超(3))。
      ,
      • Stockmann H.
      • Adamczyk B.
      • Hayes J.
      • rudd下午
      自动化,高通量IgG-抗体甘草醛处理平台。
      ,
      • Stockmann H.
      • O'Flaherty R.
      • Adamczyk B.
      • Saldova R.
      • rudd下午
      自动化,高通量血清甘草化平台。
      )和生物标志物发现。

      实验步骤

       血清样本

      如前所述使用正常的人血清(NHS)样品(
      • Stockmann H.
      • Adamczyk B.
      • Hayes J.
      • rudd下午
      自动化,高通量IgG-抗体甘草醛处理平台。
      )。将汇集来自健康雄性和雌性血液供体的人类成人血清样品,并用作糖蛋白的源泉,用于随后的聚糖分析(由U.K.输血服务提供)。来自7名健康女性的血清样本(以下,称为正常)和27名卵巢癌患者被归类为转移性(n = 21)或边界(n = 6)用于Glycoseqcap技术(补充表S9)道德批准和获取知情同意之后。在允许血液凝结30-60分钟后,通过在2000×以2000×离心获得血清 g 10分钟并储存在-80°C直至分析。

       化学品和试剂

      所有化学试剂和溶剂均购自Merck Kgaa(德国达姆施塔特)。预包装蛋白G(Pth93-20-02)300μl尖塔从山麦(San Jose,CA)获得。白蛋白(猫191297005),IgM(Cat#289005),TRF(Cat#191306005)和A1AT(Cat#191287005)亲和力基质树脂是从Thermofisher捕获(Waltham,MA)捕获的TM值 和HPT(猫#291.2950.05)从BAC BV获得,捕获选择。从NEB(IPSWICH,MA)中获得外糖苷酶和PNGASE F酶:PNGASE F(P0709L),牛肾形腺苷酸酶(BKF,P0748S)和其他外糖苷酶 关节杆菌尿嘧啶. Sialidase(ABS,PZGK80090),牛睾丸半乳糖苷酶(BTG,PZGKX-5013), N - 从Europa获得的乙酰己氨基氨基氨基氨基酶(GUH,PZGK80050)和杰克豆甘露糖苷酶(JBM,GKX-5003)(Prozyme,Hayward,CA)。固体支持的超链肼(Cat#11809410)和FERMENSAPARTULER预染色的蛋白梯(猫#11832124)是从Thermofer Scientific获得的。使用以下板;1μm96孔(Pall acroprep apput 350,Vwr(Radnor,Pa)518-0026),96孔2 ml收集板(x50微孔板,Fisher,11511963),96孔测定(Greiner ,450μl,cruinn(都柏林,爱尔兰)731-1372),384孔超滤(acroprep,10kda,pall 5077),384孔PCR(Fisher,Armadillo Ab-2384 / O,橙色,30μl,VWR 732 1578 )和384孔储存/收集(康宁,240μlVWr736 0202 3347)。将试剂放在12孔试剂槽中的机器人平台上(VWR 732-1390)。在Hamilton机器人球体液体处理平台上制备样品。该仪器配备了八个软件控制的移液器,真空歧管和自动加热器振动器。分析样品在水处理H级UPLC仪器上进行分析。以下工作流程是在Hamilton Robotics Venus One软件上的机器人程序实现。

       定制植物糖蛋白亲和基质树脂尖塔制备

      通过Phynexus Inc.通过Life Technologies捕获,每种特异性抗蛋白质和抗糖蛋白基质填充在phynexus Inc.中,每种白蛋白,IgG,IgM,IgA,TRF和A1AT亲和基质树脂。TM值 从BAC BV购买的HPT在300μl汉密尔顿尖端中单独包装。

       phytip糖蛋白亲和纯化

      在下列序列中捕获来自50μl全血清样品的糖蛋白:使用自定义Phytips的96孔格式,在自动液体处理站(Hamilton Starlet)上的白蛋白,TRF,IgG,IgM,IgA,HPT和A1AT(Fig. 1)。在该方法中,植物平均平衡,捕获,洗涤和洗脱是指通过树脂床循环溶液,以固定数量的展望,并在限定的流速处被称为循环的分配步骤。在顺序时尚白蛋白中,糖蛋白从血清或从前一糖蛋白的血清捕获。例如,在TRF的情况下,白蛋白耗尽的血清用于亲和层析。在IgG亲和力的情况下,在IgG纯化之前,血清耗尽了白蛋白和TRF。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1糖蛋白的多路复用自动连续捕获 N-glycoproTofiling。 96孔格式机器人平台(A),在Phynexus phytip填充的特异性抗糖蛋白捕获树脂(B),选择糖蛋白的连续捕获1.TRF,2.gg,3.igm,4.iga,5.hpt,6.a1at(C),使用Phynexus phytips,从合并的人血清中分离六种选定的糖蛋白的多路复用自动捕获的分离。泳道1:蛋白质标记,泳道2:TRF标准,泳道3:结合TRF,泳道4:绑定IgG,泳道5:结合IgM,泳道6:结合IgA,泳道7:A1AT标准,车道8:结合A1AT,泳道9 :HPT标准,泳道10:绑定HPT。用箭头标记的蛋白质带是白蛋白蛋白质的痕量(非糖基化)(D),自动糖蛋白样品制剂,PNGASEF释放和氨基喹啉氨基甲酸酯(AQC)标记 N-glycans(E)最后超高效液相色谱(UPLC)分离和聚糖结构分析(F)。
      使用预平衡的植物(每孔200μl,0.1,0.1 m 磷酸钠缓冲液,0.15 m NaCl,pH 7.4,3循环,5μl/ s)。在96孔收集板中的白蛋白/糖蛋白在96孔收集板中洗涤三次,每个含有结合缓冲液(每孔混合体积为170μl,0.1 m 磷酸钠缓冲液,0.15 m NaCl,pH 7.4,6循环,5μl/ s),然后用洗涤缓冲液处理(每孔混合体积170μl,1%NaCl + 1g / L南3,4个循环,5μl/ s)。白蛋白/糖蛋白被洗脱(每孔80μl,0.2 m 甘氨酸-HCl缓冲液,pH 2.5,3循环,4μl/ s)分为三种Greiner板。中和缓冲液(每孔10μl,1 m 将Tris-HCl缓冲液,pH9.0)加入到两个Greiner平板中,将样品合并在一起,用于两个Greiner平板(每孔180μl所得溶液,平均浓度0.22,0.90,0.85,0.12,0.81和0.79mg / ml对于IgG,IgM,IgA,TRF,HPT和A1AT)。

       1D SDS-PAGE

      将亲和力纯化的糖蛋白减少并在SDS-PAGE凝胶上加载并在Xcell Surelock™迷你细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中分离为90V,使用运行缓冲液在120V下分离。在凝胶的每个泳道中加载5μg总蛋白质。一旦电泳分离完成,通过用Coomassie蓝色染色溶液染色,蛋白质被染色,然后用多样性去离子水的变化脱离(Fig. 1)。

       自动化糖蛋白变性和N-聚糖释放

      如前所述(
      • Stockmann H.
      • 杜克里..
      • Millan Martin S.
      • rudd下午
      超高速输出,基于超滤蛋白的N-Glycoocics平台,用于超空气液相色谱法(超(3))。
      ), 简要地 N - 使用从100个显然健康的男性和女性成年血液供体(U.Cup输送服务)的汇集血清样品进行甘露糖分析。使用填充在phynexus phytips中的相应的亲和树脂(寿命),抗体IgG,IgA,IgM和急性期蛋白TRF,HPT和A1AT纯化在植物中,如前所述(在上述部分中)。在自动平台上,将糖蛋白样品分配到两个384孔超滤板(最大载荷:60μg蛋白,10kDA)中。通过离心进行超滤(3700× g,30分钟,室温)或真空歧管(>25 in hg真空,30min)。变性缓冲液(每孔25μl,100米 m 碳酸氢钠,50米m 将0.1%十二烷基硫酸钠(SDS))分配到2×384孔超滤板中。在室温下孵育10min后,将样品混合10次(混合体积:15μL,流速:10μl/ s)并转移至384孔PCR板(Thermofer Serian)。将板在95℃下置于机器人孵育室10分钟。将板从培养箱中除去并平衡至室温10分钟。 1 m 将碘乙酰胺(IAA),10μL分配到超滤板的每个孔中,并将样品(25μL)转移回384孔PCR板。将样品混合5次(混合体积20μl,流速,10μl/ s)。在室温下孵育10分钟后,将超滤板堆叠在240μl收集板(康宁块)上并离心(3700× g30分钟,室温)和上清液被除去。接下来,10μl25米m 将双碳酸钠溶液分配到每个孔中,并离子过滤板被离心(3700× g30分钟,室温)和上清液被除去。
      脱糖基化混合物,12μl(0.4μlpngasef(2.5u / ml),25米m 将碳酸氢钠)分配到每个孔中,然后用盖子覆盖板,并在机器人轨道振荡器上孵育(摇动轨道:2 mm,振动速度:700rpm,温度:38℃,孵育时间:30分钟)。将超滤板堆叠在30μL/孔PCR板(Armadillo)上并离心(3700× G, 10分钟,室温)。最后,10μl25 m 将碳酸氢钠溶液分配到超滤板的每个孔中(仍堆叠在PCR板上),将组件离心(3700× g,10分钟,室温)。发布 N随后荧光标记PCR板中的糖粉。对于聚糖标记,将5μl聚糖样品(PCR板)转移至95μL康宁嵌段,并加入11.6μLAQC(3mg / ml MeCN)。将三个将该粗混合物的混合物注入UPLC系统。或者,在PNGase F释放之后,可以冷冻聚糖并且在-20℃下稳定以稍后标记。

       超高效液相色谱(UPLC)

      如前所述(
      • Stockmann H.
      • 杜克里..
      • Millan Martin S.
      • rudd下午
      超高速输出,基于超滤蛋白的N-Glycoocics平台,用于超空气液相色谱法(超(3))。
      ),简要介绍AQC衍生的分离 N-glycans是通过UPLC对荧光检测进行的荧光检测,在授权3软件(Waters,Milford,MA)控制下由二元溶剂管理器,样本管理器和荧光检测器组成的水域Acquity UPLC H级仪器。使用50米的水分乙烯桥面杂交(BEN)甘油柱(150×2.1mm I.D.,1.7μm颗粒)进行HILIC分离。m 作为溶剂B,甲酸铵(pH4.4)作为溶剂A和MECN作为溶剂B.柱子配合在线0.2μm过滤器。在16.5分钟内使用70-53%MCN 0.56mL / min的线性梯度进行分离 N-glycan分离。在始终使用70%v / v Mecn中制备的3μl的注射体积。在注射前在5℃下保持样品,分离温度为40℃。 FLD激发/发射波长分别为λex= 245nm和λem= 395nm。使用外部标准的水解和2-AB标记的葡萄糖低聚物进行校准该系统,以制造葡聚糖梯,如前所述(
      • Stockmann H.
      • 杜克里..
      • Millan Martin S.
      • rudd下午
      超高吞吐量,基于超滤的N-Glycomics平台,用于超型液相色谱(超(3))。
      )。第五阶多项式分布曲线装配到葡聚糖梯形图中,以从保留时间(使用来自水域的Empower软件)分配血糖单元(GU)值)。

       液相色谱 - 质谱(LC-MS)

      在线耦合荧光(FLR) - 使用具有Acquity®UplC(Waters Corporation,Milford,MA)和BEN Glycan柱(2.1×150mm,1.7μm粒径)的水域XEVO G2 QTOF进行荧光谱图检测。对于MS采集数据,仪器以正灵敏度模式运行,具有3kV的毛细管电压。离子源块和氮化溶剂化气体温度分别设定在120℃和350℃。将脱溶化气体设定为800升/小时的流速。锥形电压保持在40V。获得了聚糖的全扫描数据 m/z 300〜2000的范围。数据收集和处理由MassLynx 4.1软件控制。荧光探测器设置如下:λ熟透:245nm,λmension:395nm;数据速率为10pt /秒,PMT增益= 20.样品注射体积为10μL(75%MECN)。流速为0.400ml / min(除非指定),柱温保持在60°C;溶剂A为50米m 甲酸铵(pH4.4)和溶剂B是MECN。使用60分钟的线性梯度,如下:25-46%A持续35分钟,46-80%A持续8分钟(0.2ml / min的流速),27分钟为80-25%。为避免污染系统,将流量送至首次1.2分钟后浪费55分钟。

       超糖酶消化

      AQC标记为 N根据文献程序,用来自健康人血清纯化的糖蛋白(IgG,IgM,IgA,TRF,HPT和A1At)的糖粉用外糖苷酶处理(
      • O'Flaherty R.
      • 哈林森上午
      • Hanley P.J.
      • Takon C.H.
      • Fadda E.
      • rudd下午
      氨基喹啉荧光标记阻碍了通过牛肾α-L-岩藻糖苷酶(BKF)抑制N-聚糖核心α(1-6)岩藻糖的高效除去。
      )。酶ABS(关节杆菌尿嘧啶. Sialidase),BTG(牛睾丸β-半乳糖苷酶),GUH(β-N - (1-2,3,4,6)乙酰葡糖氨基氨基氨基酶,BKF(牛肾α-氰化酶)和JBM(α1-2,3,6甘醇酶J,Jack Bean):1,2,2,4,和每次消化使用4μl各自分别用于产生0.5,1,8,3200和60u / ml的最终浓度。所有消化均在最终体积为10μl,50米 m Naoac pH 5.5 24 H-96 H。

       计算程序

      统计分析:使用A ANOVA的Tukey诚信显着差异(HSD)测试比较患者年龄,更年期状态,LOGCA125,患者与对照之间的C反应蛋白水平(CRP),蛋白质滴度和甘草峰面积。峰面积是组成数据(呈现为曲线图下的总面积的百分比),因此发生恒定总和约束(CSC)。 CSC表示单个变量不会独立变化,违反执行标准统计分析的共同假设。通过执行所有峰值区域(PACKI)/(100-PEAKI),在所有峰面积上(
      • Aitchison J.
      )。计算 p 值通过创建线性回归模型(Ancova)来控制数据的年龄混淆。使用Benjamini-Hochberg程序进行多种测试的校正,具有10%的假阳性率。

       缺少值

      有一个人失去的年龄,更年期状态,CA125,CRP和蛋白质状态。一个人缺少更年期的状态。使用缺少缺失属性的k最近邻接方法省略少量缺失值。这是一个可接受的过程,当丢失值的数量很小时(
      • Crookston N.L.
      • 芬利A.O.
      yaimpute:knn归属的r包。
      )。

       分类模型

      为了将个体分类为正常的,没有隐藏层的临界或转移性神经网络,具有年龄,更年期状态,logca125,CRP,蛋白质和聚糖峰相对丰富的组合培训。执行针对所有二进制分类的一个(例如 普通的 相对 边界+转移性)。为了测试模型的性能,用于优化参数(火车集)的数据分开,并进行了10倍的交叉验证(训练的90%和10%以测试的数据重复10次) 。通过接收器操作特征(ROC)曲线(AUC),灵敏度(SEN)和特异性(SPE)下的面积计算歧视力。

       聚类

      使用变量峰面积,年龄,LOGCA125,CRP,蛋白质滴度和更年期状态进行主成分分析(PCA)。对于糖类简档的分层聚类,GP%区域被归一化到[0,1]的范围内,并且使用病房算法建立了集群的层次结构(
      • Blashfield R.K.
      簇分析的混合模型试验 - 4个附注分层方法的精度。
      )。 Spearman相关性用于计算GP,年龄,LOGCA125,CRP和蛋白质滴度之间的相似性。因此,相关变量在聚类产生的次静脉内闭合在一起。

      结果和讨论

       糖糖qcap自动化的N-Glycan分析平台使用单个血清糖蛋白的连续捕获

      我们开发了一项称为“Glycoseqcap”的技术,涉及串行捕获和随后的 N - 来自人血清的个体糖蛋白的糖过细胞。六种丰富的血清糖蛋白(免疫球蛋白,IgG,IgM,IgA和急性期蛋白,转移素(TRF),α-1-抗胰蛋白酶(A1AT),哈达氟胺(HPT))的多路复用自动串联捕获 N从机器人平台上使用96孔格式进行优化 - 谷糖释放来自合并的人血清(Fig. 1)。特异性抗糖蛋白捕获树脂(含有针对特定糖蛋白的抗体)填充在一系列植物phytips中,并且每种血清样品在顺序阶TRF,IgG,IgM,IgA,HPT和A1AT中依次通过每种树脂。纯化的蛋白质,>然后由1D-SDS页面确定的98%纯度,然后进行PNGASEF释放,超滤和氨基喹啉氨基甲酸酯(AQC)荧光标记 N - 使用先前发布的协议使用Hamilton Starlet机器人系统的Glycan池(Fig. 1)(
      • Stockmann H.
      • 杜克里..
      • Millan Martin S.
      • rudd下午
      超高吞吐量,基于超滤的N-Glycomics平台,用于超型液相色谱(超(3))。
      )。将这些池进行亲水性超高效液相色谱(HILIC-UPLC),然后根据我们实验室的既定程序进行超糖糖苷酶阵列聚糖分析(
      • O'Flaherty R.
      • 哈林森上午
      • Hanley P.J.
      • Takon C.H.
      • Fadda E.
      • rudd下午
      氨基喹啉荧光标记阻碍了通过牛肾α-L-岩藻糖苷酶(BKF)抑制N-聚糖核心α(1-6)岩藻糖的高效除去。
      )。用于荧光标记的UPLC色谱图释放 N亲和力纯化的糖蛋白(IgG,IgM,IgA,TRF,HPT和A1AT)的亲和纯化糖苷和相应的释放 N来自总人血清的糖粉(
      • Stockmann H.
      • O'Flaherty R.
      • Adamczyk B.
      • Saldova R.
      • rudd下午
      自动化,高通量血清甘草化平台。
      )呈现给主要的注释 N-glycans(Fig. 2)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2UPLC-HILIC-FLD色谱图标记的AQC N从人体血清释放的亲和力纯化糖蛋白IgG,IgM和IgA,TRF,HPT,A1AT和2-AB标记的庚烷 N-glycans从总血清中释放。 只有主要的聚糖被注释。所有专业 N在总血清上UPLC色谱图中鉴定的庚烷存在于单个糖蛋白色谱图中,该糖蛋白色谱图均显示血清糖基化在很大程度上由最高丰度蛋白质(IgG,IgM和IgA,TRF,HPT和A1AT)主导。全部使用SNFG Glycan命名法。

       GlycoseqCAP技术的优点和局限性

      这种技术进步提供 N-Glycosylation信息用于IgG,IgM,IgA,TRF,HPT和A1At,并用作许多感兴趣的糖蛋白的模板,其可用作未来应用的个性化医学工具。发达的工作流程的一个主要优点是能够从单个临床来源具有多路复用的血晶信息。此外,PHYTIPS可重复使用,并在连续三次运行和1个月的存储之后显示出良好的再现性。然而,关于包括其他糖蛋白的技术延伸的一个限制是对靶向糖蛋白的选择性和特异性具有高选择性和特异性的亲和树脂的要求(例如 抗体或凝集素)和在某些情况下,可能需要大量的生物材料(在这种情况下血清),用于降低丰富的糖蛋白。此外,分析师必须在酶促释放之前认识到靶向糖蛋白的纯度 N-Glycans。例如,最近的出版物注意到用户考虑了其他污染血浆糖蛋白的不同水平的普遍存存(
      • Lauc G.
      • 沃克诺维奇F.
      • 邦德A.
      • 凉亭M.
      • Wuhrer M.
      痕量的N-聚糖包括硫酸化物质可以源自各种血浆糖蛋白,不一定是IgG。
      )。在我们的研究中,我们小心通过SDS-PAGE评估糖蛋白的纯度(Fig. 1)系统地改变捕获,结合和洗涤步骤的数量,以最大化PNGase F释放之前的纯度 N-Glycans。如在任何亲和力纯化的情况下,其他糖蛋白的小痕迹也有助于 N鉴定的糖膀结构,尽管是微小的比例。
      在正常人体血清中六个丰富的糖蛋白的糖基化数据与前面鉴定的人血清鉴定的总甘油池对一致(Fig. 2)(
      • Stockmann H.
      • O'Flaherty R.
      • Adamczyk B.
      • Saldova R.
      • rudd下午
      自动化,高通量血清甘草化平台。
      ,
      • Saldova R.
      • Asadi Shehni A.
      • Haakensen V.D.
      • Steinfeld I.
      • 希尔第米
      • 克里尔I.
      • Helland A.
      • Yakhini Z.
      • børresen-dale a.l.
      • rudd下午
      高分辨率定量UPLC与乳腺癌和全身特征的N-糖基化的关联。
      )。来自人血清的所有主要聚糖在表征的一个/多种单独的糖蛋白中鉴定出来。在大部分中,由于使用荧光标记AQC,在这种少量血清(50μL)上使得在这种少量血清(50μl)上的这种鉴定,其显示与传统标签相比的荧光检测增加了20倍。 2-AB释放 N我们之前为人类IgG描述过的糖粉(
      • Stockmann H.
      • 杜克里..
      • Millan Martin S.
      • rudd下午
      超高吞吐量,基于超滤的N-Glycomics平台,用于超型液相色谱(超(3))。
      ,
      • O'Flaherty R.
      • 哈林森上午
      • Hanley P.J.
      • Takon C.H.
      • Fadda E.
      • rudd下午
      氨基喹啉荧光标记阻碍了通过牛肾α-L-岩藻糖苷酶(BKF)抑制N-聚糖核心α(1-6)岩藻糖的高效除去。
      )。在血清上进行了各种高通量大规模研究 N - 自2009年以来的吉利水平(
      • knezevic A.
      • Polasek O.
      • Gornik O..
      • 鲁丹一世。
      • 坎贝尔H.
      • 海沃德C.
      • Wright A.
      • KOLCIC I.
      • o'donoghue n。
      • 骨头J.
      • rudd下午
      • Lauc G.
      人血浆N-Glyce的变异遗传性和环境决定因素。
      ,
      • knezevic A.
      • Gornik O..
      • Polasek O.
      • Redzic I.
      • Novokmet M.
      • rudd下午
      • 赖特A.F.
      • 坎贝尔H.
      • 鲁丹一世。
      • Lauc G.
      老化,体重指数,血浆脂质谱和吸烟对人血浆N-聚糖的影响。
      ,

      Lauc G.等人,。 (2010)基因组学符合糖类 - 人N-Glycame的第一个GWAS研究将HNF1α作为血浆蛋白岩藻糖基化的主调节器。 Plos Genet。 6,DOI:ARTN E1001256 10.1371 / journal.pgen1001256。 (2010)。

      )。这些研究产生了显着的贡献,以了解糖基化在许多疾病中的作用,但无法确定所涉及的确切糖基化加工途径。在单个糖蛋白水平上,大规模研究集中于IgG N - 迄今为止,(32)留下足够的范围,以便将来对单个糖蛋白水平进行调查。另外,也可以从血清中链接显着的改变 N通过使用本作作品中鉴定的主要聚糖通过外推至特异性糖蛋白。

       血清IgG,IgA和IgM的分析和详细的N-聚糖分析

      为了执行糖过细胞以比较两个不同群体的糖基化(例如血清IgG N与卵巢癌队列相比的正常种群中的糖化酶)重要的是产生可重复的曲线并充分表征 N-glycomes。为此,我们承担了对发布的最全面的研究 N迄今为止人血清中单个糖蛋白的糖粉。 UPLC色谱图(针对每个单独的糖蛋白)被整合并分成甘油峰(GPS),每个GP通常占一个或多种聚糖。
      血清IgG N-glycome UplC色谱图分为25个GPS(改编自使用23 GPS的文献程序11)考虑到 N - 来自卵巢癌患者的IgG人血清突出的术语。在三个不同日内绘制了25个IGG GP区域(G1-G25),在三个不同的日子里提供了在集成峰面积上的标准误差棒(Fig. 3A, 补充表S7)。大多数GPS(21/25)对于具有低于25%的差异系数(CV)值的技术复制,具有低于GPS G1,G15和G25的例外的技术重复。这些GPS累积地占IgG总峰面积的少量(0.35%) N-glycome在技术复制中。表征如下进行:从葡萄糖单元(GU)值(通过将洗脱位置匹配到标准葡聚糖水解曲线和使用糖碱软件(现在迁移到Glycostore)而获得的初步结构(获得//www.glycostore.org/)(
      • 赵某。
      • 沃尔什一世。
      • 亚伯拉罕J.L.
      • 罗伊尔L.
      • Nguyen-Khuong T.
      • 斯宾塞D.
      • Fernandes D.L.
      • 包装机N.H.
      • rudd下午
      • 坎贝尔M.P.
      Glycostore:用于聚糖分析的保留属性数据库。
      )),通过外糖苷酶阵列消化来证实(Fig. 3B)使用电喷雾(ESI-LC)液相色谱质谱仪(补充表S1)。他们同意文学(
      • Stockmann H.
      • 杜克里..
      • Millan Martin S.
      • rudd下午
      超高吞吐量,基于超滤的N-Glycomics平台,用于超型液相色谱(超(3))。
      ,
      • Pučićm.
      • kneževića。
      • VidičJ.
      • Adamczyk B.
      • Novokmet M.
      • PolašekO.
      • Gornik O.
      • Supraha-Goreta S.
      • Wormald M.R.
      • redzići。
      • 坎贝尔H.
      • Wright A.
      • 哈斯蒂N.D.
      • 威尔逊J.F.
      • 鲁丹一世。
      • Wuhrer M.
      • rudd下午
      • josićd。
      • Lauc G.
      IgG. - 可变异性和IgG Glycome中IgG Glyce中IgG变异性的高通量分离和糖基化分析。
      )(添加先前未识别的高甘露糖种(M7))并呈现 补充表S6.
      图缩略图GR3.
      Fig. 3串行捕获和 N - 从人血清纯化人血清IgG,IgM和IgA的糖过细胞。 25 IgG聚糖峰面积(G1-G25),24个IgM峰面积(M1-24)和25个IgA甘油峰面积(A1-A25)在三个不同的日子(3A)。标准错误显示为误差栏。 AQC标记的IgG,IgM和IgA的测序 N通过使用具有葡萄糖单元(GU)的超糖糖苷酶(GU)来观察UPLC-HILIC色谱图,以促进聚糖鉴定(3B)。消化AQC标记的IgG,IgM和IgA N在下列顺序ABS中加入唾液酸酶(ABS),半乳糖苷酶(BTG),己糖苷酶(BUH),岩藻糖苷酶(BKF)和甘露糖苷酶(JBM),ABS + BTG,ABS + BTG + GUH,ABS + BTG + GUH + BKF和ABS + BTG + GUH + BKF + JBM。对于IgG,箭头表示用于所选峰的糖残基的切割:主要聚糖Fa2G2S1和Fa2G2S2。对于IgM,箭头表示所选峰的糖残基的切割:主要聚糖Fa2G2S1和Fa2BG2S1。对于IgA,箭头表示用于所选峰的糖残基的切割:主要聚糖A2G2S1,FA2G2S2和FA2BG2S2。 SNFG命名法用于聚糖表示。
      血清IgM和IgA的等效数据 N-glycomes分别分成24(M1-M24)和25(A1-A25)GPS,并显示在 Fig. 3 (再现性数据 补充表S7)。对于IGM,所有GPS(M1-M24)都显示出技术复制的良好再现性(低于25%)。类似地,IgA对所有主要GPS(A2-A25,低于25%)显示出良好的再现性,但是对于第一和最后GPS(A1,A25)的表现出略高的CVS占IgG总数的0.92% N-glycome。 IgM和IgA的结构分配 N - 使用GU值和LC-MS以与血清IgG类似的方式表征 - 庚烷(补充表S2和S3)并呈现 补充表S6。对于血清IGM,结构分配 N-Glycans与先前报告的文献价值同意(
      • 阿诺德J.N.
      • Wormald M.R.
      • suter d.m.
      • radcliffe c.m.
      • 哈维D.J.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      • SIM R.B.
      人血清IgM糖基化:鉴定可与人甘露结合凝集素结合的糖果实。
      )在我们的分析中发现了一些额外的聚糖(13种新特征的组合物,其中总共53个),包括一些M5A1系列(M5A1,M5A1G1和M5A1G1S(6)1),FA1系列(FA1,FA1G1和FA1G1S1),A2系列(A2G1S(6)1和A2G2S(6,6)2)和A2B系列(A2BG1S(6)1)。对于IGA,结构分配 N-Glycans同意先前描述的文献报告(
      • Mattu T.S.
      • 请求r.j.
      • 威利斯A.c.
      • 克里安米
      • Wormald M.R.
      • lellouch a.c.
      • rudd下午
      • Woof J.M.
      • DWEK R.A.
      人血清IgA1,Fab和Fc区的糖基化和结构及N-糖基化对Fcalpha受体相互作用的作用。
      ,
      • 邦德A.
      • 尼古拉斯。
      • Jansen B.C.
      • Stavenhagen K.
      • 空白D.
      • Kammeijer G.S.
      • Kozak R.P.
      • Fernandes D.L.
      • Hensbergen P.J.
      • Hazes J.M.
      • van der burgt y.e.
      • Dolhain R.J.
      • Wuhrer M.
      纵向监测免疫球蛋白妊娠期间的糖基化通过同时进行N-和O-糖肽的MARDI-FTICR-MS分析。
      ,
      • 罗伊尔L.
      • Roos A.
      • 哈维D.J.
      • Wormald M.R.
      • van gijlswijk-janssen d。
      • Redwan El r.m.
      • 威尔逊I.A.
      • 达哈姆。
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      分泌IGA和O-聚糖提供先天和自适应免疫系统之间的联系。
      )。如在IgM的情况下,鉴定另外的聚糖(16/55)在我们的深入分析中未在文献中未描述,其中包括一些单一长期和双向物种(A1,A2 [6] G1,A2 [3] G1,FA2 ),混合物种(M4A1,M4A1G1,M4A1G1S(6)1,M4A1BG1,M5A1G1,M5A1G1S(6)1),A3系列(A3,A3G2,A3G2S(6)1,A3G3S2,FA3)和M10。

       血清TRF,HPT和A1AT的分析和详细的N-聚糖分析

      如前所述,通过连续提取从人血清中纯化急性期蛋白,TRF,HPT和A1At,如前所述和释放 N-glycans用Uplc-Hilic分析的AQC标记。绘制28TRF(T1-T28),31 HPT(H1-H31)和28A1AT(AT1-AT28)甘油峰面积,在三个不同的日子中至少有五个技术复制,以提供标准误差棒(Fig. 4A, 4B 和再现性数据 补充表S7)。除了HPT中的GPS T1和T5(Glycan峰面积为0.02%)的GPS T1和T5(总甘油峰面积为0.03%),HPT的良好再现性(CV低于25%)的良好再现性总数 N-glycome在技术复制中。 A1AT的再现性 N-glycome是最低(是在序列中纯化的最后糖蛋白),仅具有19/28甘油峰,其良好可再现的CV值低于25%。其余部分(AT1,AT3-5,AT8-10,AT12,AT14)占总A1AT总数的2.67% N-glycome,总数的比例相对较小 N-glycome。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4串行捕获和 N - 人血清TRF,HPT和A1At的糖过细胞,从人血清纯化。 绘制了28个TRF聚糖峰面积(T1-T28),31 HPT甘油峰面积(H1-H31)和28A1AT甘油峰面积(AT1-AT28),在三个不同的几天内进行五次技术复制(4A)。标准错误显示为误差栏。 AQC标记为TRF,HPT和A1AT的测序 N通过用葡萄糖单元(GU)的超糖糖苷酶(GU)来观察UPLC-HILIC色谱图以促进聚糖鉴定(4B)。消化AQC标记的TRF,HPT和A1AT N在下列顺序ABS中加入唾液酸酶(ABS),半乳糖苷酶(BTG),己糖苷酶(BUH),岩藻糖苷酶(BKF)和甘露糖苷酶(JBM),ABS + BTG,ABS + BTG + GUH,ABS + BTG + GUH + BKF和ABS + BTG + GUH + BKF + JBM。在TRF中,箭头表示用于所选峰的糖残基的切割:主要聚糖A2G2S(3,6)2和A2G2S2(6,6)2。在HPT中,箭头表示用于所选峰的糖残基的切割:主要聚糖A3G3S3,A2G2S2和A2G2S1。在A1AT中,箭头表示所选峰的糖残基的切割:主要聚糖A3G3S3和A2G2S2.SNFG命名法用于聚糖表示。
      AQC标记为TRF,HPT和A1AT(Fig. 4) N使用外糖苷酶阵列和与葡萄糖单元(GU)值和LC-MS组合的数据进行测序,以促进聚糖鉴定。至于免疫球蛋白,许多新发现 N介绍了Glycans以及与TRF文献中已提交的主要聚糖协定(
      • Sarrats A.
      • Saldova R.
      • PLA E.
      • 埃斯特堡。
      • 哈维D.J.
      • struwe w.b.
      • De Llorens R.
      • rudd下午
      • peracaula R.
      肝脏癌症肝癌和慢性胰腺炎中肝急性期蛋白的糖基化。
      ),HPT(
      • Sarrats A.
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      • 哈维D.J.
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      肝脏癌症肝癌和慢性胰腺炎中肝急性期蛋白的糖基化。
      ,
      • 富士堡T.
      • Shinohara Y.
      • 天梭B.
      • 庞帕。
      • Kurogochi M.
      • SAITO S.
      • 阿莱y.
      • Sadilek M.
      • Murayama K.
      • 戴尔A.
      • Nishimura S.
      • hakomori s.i.
      前列腺癌患者血清血红蛋白与良性前列腺疾病或正常科目的糖基化状态。
      )和a1at(
      • Sarrats A.
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      • 埃斯特堡。
      • 哈维D.J.
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      肝脏癌症肝癌和慢性胰腺炎中肝急性期蛋白的糖基化。
      ,
      • 麦卡锡C.
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      • rudd下午
      • mcelvaney n.g.
      • Reeves E.P.
      急性期蛋白质糖基化与焦点对α-1抗胰蛋白酶在急性和慢性炎症条件下的作用和重要性。
      )。新识别的聚糖列表用δ符号突出显示 辅助表S6。对于TRF,在本出版物中首次鉴定了48种聚糖组合物中的28个。最重要的是,我们确定未以前针对TRF识别的FA3G3系列,其占总数的近4% N-glycome。类似地,对于HPT和A1AT,第一次鉴定32/47和28/44甘油组合物。对于HPT,FA3系列大约是大约的。总数的3% N-glycome和新鉴定的甘草A3F1G3S3占大约。峰面积的2%。

       抗体类别糖基化的比较:IgG,IgM和IgA

      我们探讨了所选抗体的糖基化,以获得抗体类的结构功能关系。需要考虑的一个重要点是血清糖蛋白是活性成分和废物的组合,这可能使解释复杂化。施用IgG,IgM和IgA抗体糖基化的结构相似性和差异,用于合并的正常人血清(Fig. 5A, 5B)。来自UPLC数据产生的衍生的糖基化性状(辅助表S6)从每个糖蛋白的个体GPS的总和计算(补充表S8)。糖基化性状的缩小变化,例如半乳糖基化,岩藻糖基化,唾液酸化,分化GlcNAcs(聚糖,具有二分裂的聚糖 N - 乙酰甘氨酸胺残基),可以观察到高甘露糖,杂交或分支(单南年纪念,长期,三合一体)。总体而言,所有抗体都表现出高比例的Biannarary结构(>60%)少于/无单南万宁/三合一体结构,如先前在文献中的文件(
      • 阿诺德J.N.
      • Wormald M.R.
      • suter d.m.
      • radcliffe c.m.
      • 哈维D.J.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      • SIM R.B.
      人血清IgM糖基化:鉴定可与人甘露结合凝集素结合的糖果实。
      ,
      • Pučićm.
      • kneževića。
      • VidičJ.
      • Adamczyk B.
      • Novokmet M.
      • PolašekO.
      • Gornik O.
      • Supraha-Goreta S.
      • Wormald M.R.
      • redzići。
      • 坎贝尔H.
      • Wright A.
      • 哈斯蒂N.D.
      • 威尔逊J.F.
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      • Wuhrer M.
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      • josićd。
      • Lauc G.
      IgG. - 可变异性和IgG Glycome中IgG Glyce中IgG变异性的高通量分离和糖基化分析。
      ,
      • 罗伊尔L.
      • Roos A.
      • 哈维D.J.
      • Wormald M.R.
      • van gijlswijk-janssen d。
      • Redwan El r.m.
      • 威尔逊I.A.
      • 达哈姆。
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      分泌IGA和O-聚糖提供先天和自适应免疫系统之间的联系。
      )。另外,对所有三种糖蛋白观察到高度的半乳糖化酶(>60%)。仅针对与文献报告一致的IgG或IgM鉴定α2,6-连接的唾液酸(含有Neu5ac形式)和没有对应的α2,3-连接的唾液酸(
      • 阿诺德J.N.
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      • 哈维D.J.
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      人血清IgM糖基化:鉴定可与人甘露结合凝集素结合的糖果实。
      ,
      • Pučićm.
      • kneževića。
      • VidičJ.
      • Adamczyk B.
      • Novokmet M.
      • PolašekO.
      • Gornik O.
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      • Wormald M.R.
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      • 坎贝尔H.
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      • 鲁丹一世。
      • Wuhrer M.
      • rudd下午
      • josićd。
      • Lauc G.
      IgG. - 可变异性和IgG Glycome中IgG Glyce中IgG变异性的高通量分离和糖基化分析。
      )。另外,仅在IgA中含有α2,3-连接的唾液酸,如前所述(
      • 邦德A.
      • 尼古拉斯。
      • Jansen B.C.
      • Stavenhagen K.
      • 空白D.
      • Kammeijer G.S.
      • Kozak R.P.
      • Fernandes D.L.
      • Hensbergen P.J.
      • Hazes J.M.
      • van der burgt y.e.
      • Dolhain R.J.
      • Wuhrer M.
      纵向监测免疫球蛋白妊娠期间的糖基化通过同时进行N-和O-糖肽的MARDI-FTICR-MS分析。
      )。从IgG到IgM至IgA(分别为22%,60%和85%),观察到增加的唾液酸化。 IgG含有相对于IgM或IgA(分别为58和28%)的最高比例的核岩糖基化(93%),并且没有针对血清抗体系列鉴定外臂岩藻糖。该观察结果与血清抗体的其他报告一致(
      • 阿诺德J.N.
      • Wormald M.R.
      • suter d.m.
      • radcliffe c.m.
      • 哈维D.J.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
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      人血清IgM糖基化:鉴定可与人甘露结合凝集素结合的糖果实。
      ,
      • 邦德A.
      • 尼古拉斯。
      • Jansen B.C.
      • Stavenhagen K.
      • 空白D.
      • Kammeijer G.S.
      • Kozak R.P.
      • Fernandes D.L.
      • Hensbergen P.J.
      • Hazes J.M.
      • van der burgt y.e.
      • Dolhain R.J.
      • Wuhrer M.
      纵向监测免疫球蛋白妊娠期间的糖基化通过同时进行N-和O-糖肽的MARDI-FTICR-MS分析。
      ,
      • Pučićm.
      • kneževića。
      • VidičJ.
      • Adamczyk B.
      • Novokmet M.
      • PolašekO.
      • Gornik O.
      • Supraha-Goreta S.
      • Wormald M.R.
      • redzići。
      • 坎贝尔H.
      • Wright A.
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      • 威尔逊J.F.
      • 鲁丹一世。
      • Wuhrer M.
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      • Lauc G.
      IgG. - 可变异性和IgG Glycome中IgG Glyce中IgG变异性的高通量分离和糖基化分析。
      )。 IgA含有最高丰富的Boting Glcnacs(52%)和半乳糖残留物(93%)和对于其他抗体未观察到的三合一结构(0.9%)的非常小的比例。 IgM表现出最低量的长轴结构(64%)和半乳糖基(65%),但大量高甘露糖结构(31%)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5介绍了用于健康人血清的选定抗体(IgG,IgM,IgA)和急性期蛋白(TRF,HPT,A1AT)的糖基化性状(5A)。 该值表示为总糖基化的百分比,并由提供的数据计算 。抗体(IgG,IgM和IgA)和急性期蛋白(TRF,HPT,A1AT)的糖基化特征作为对照图(5B and 5C)。

       急性期蛋白糖基化性状:TRF,HPT和A1AT

      与在其蛋白质结构方面共享结构相似性的所选抗体不同,所选择的急性期蛋白(TRF,HPT和A1AT)具有较少的共性并且表现出更多不同的糖基化性状。这些结构相似性和差异呈汇集正常人血清(Fig. 5A, 5C)。至于抗体,观察到高度的半乳糖化(95%),用于选定的急性期蛋白,但相对较少量的总岩藻糖苷(<确定了20%),核对核心岩藻糖和外臂岩藻糖残基的组合(本研究中所选血清抗体中未鉴定)。 Sainyl Lewis.x (Slex)基序(Neu5acα2-3galβ1-4[Fucα1-3]含有外臂岩藻糖残基的Glcnacβ)在人血清急性期蛋白中鉴定,尽管小比例。值得注意的是,如在抗体糖基化的情况下,α2,6-连接的唾液酸(65%)在相应的α2,3-连接的唾液上占优势( <10%)注释的唾液酸。在先前对急性期蛋白的研究中,许多唾液酸键类型含糊不清(
      • Sarrats A.
      • Saldova R.
      • PLA E.
      • 埃斯特堡。
      • 哈维D.J.
      • struwe w.b.
      • De Llorens R.
      • rudd下午
      • peracaula R.
      肝脏癌症肝癌和慢性胰腺炎中肝急性期蛋白的糖基化。
      ,
      • 富士堡T.
      • Shinohara Y.
      • 天梭B.
      • 庞帕。
      • Kurogochi M.
      • SAITO S.
      • 阿莱y.
      • Sadilek M.
      • Murayama K.
      • 戴尔A.
      • Nishimura S.
      • hakomori s.i.
      前列腺癌患者血清血红蛋白与良性前列腺疾病或正常科目的糖基化状态。
      ),因此我们提供最广泛的急性期蛋白质的崩溃 N - 糖基化。观察到较大比例的较高支化结构,例如三合一结构(10%),并且观察到四烯类聚糖的存在。与TRF或A1AT相比,HPT表现出三安(22%)和四年度(6%)结构的最高相对量。

       功能研究的糖基化性状

      一系列糖蛋白的糖基化性状的定量在此首次从单一的人血清来源呈现(Fig. 5)。人们可以设想这些信息是功能研究的起点,以研究糖基化在我们的免疫系统中的特定作用,并且具有在甘油纳米甲醛中传统方法的额外优势,以探讨一种单一实验中的多种糖蛋白的作用。例如,关于人血清(IgG,IgM和IgA)中最丰富的抗体同种型如何讨论抗原但使用量化的聚糖性状,与抗体 - 抗原测定相结合,可以为糖基化的作用提供更清晰的图像,以如何提供更清晰的图像这个背景。单独从我们的糖基化性状中,无法预测生物学功能,但它可能为进一步调查提供基础。例如,考虑到IgG1的逝退的功能实例,增加抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)(
      • 刘SD。
      • Chalouni C.
      • 年轻的J.C.
      • junttila t.t.
      • sliwkowski m.x.
      • Lowe J.B.
      缺孔抗体增加了依赖性依赖性信号传导组分的活化,以加强促进ADCC的方法。
      ,
      • Pereira N.A.
      • Chan K.F.
      • 林P.C.
      • 宋Z.
      治疗性抗体中的“较少是更”:具有增强的抗体依赖性细胞细胞毒性的逐渐消耗的抗癌抗体。
      ),并观察人血清中抗体岩藻糖基化水平,IgG(93%)和IgM或IgA核心岩藻(58和28%)之间的显着差异可能提示与IgG更有效地将血清IgA募集效应细胞更有效地比较ADCC或IgM。重要的是,必须认为我们仅在人血清样品中测量,这些数据不一定反映组织/细胞特异性抗体糖基化水平。除了核心岩剂内,我们报道了抗体类别的外臂岩藻糖。值得注意的是,据报道了外臂岩藻糖基化用于分泌组分(SC) N-glycans的IgA,但相应的J或H链没有 N-glycans(
      • 罗伊尔L.
      • Roos A.
      • 哈维D.J.
      • Wormald M.R.
      • van gijlswijk-janssen d。
      • Redwan El r.m.
      • 威尔逊I.A.
      • 达哈姆。
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      分泌IGA和O-聚糖提供先天和自适应免疫系统之间的联系。
      )。众所周知,血清IgA主要是单体,并且不含J链和SC,因此我们在本研究中没有报告矛盾的结果。抗体同种型的糖基化性质之间的另一个有趣分化是IgA(85%)相对于IgM(60%)和IgG(22%)的高丰唾液酸化。我们提出血清IgA使用静电相互作用和空间梗阻/粘附作为用于对抗感染的主要机械模式,但如果使用这种唾液化用于抗原结合/效应函数的目的,则尚不清楚。 FC和FAB的更深入分析 N血清IgA的糖基化将在这方面发光。最后对于抗体类,我们报告了血清IgM的高甘露糖结构(31%)的最高比例。这种高甘露糖的比例高于先前报道的23%的值为血清IgM,而相应的半乳糖基化量较低(65%),与84%的文献值相比(
      • 阿诺德J.N.
      • Wormald M.R.
      • suter d.m.
      • radcliffe c.m.
      • 哈维D.J.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      • SIM R.B.
      人血清IgM糖基化:鉴定可与人甘露结合凝集素结合的糖果实。
      )。我们建议现代技术的进步允许更准确和精确的分配 N在我们的研究中 - 但它不容忽视两项研究中使用的人血清群可能不同。
      与主要由B细胞产生的免疫球蛋白相反,包括TRF,HPT和A1AT的主要血浆糖蛋白源自肝细胞,其仅表达了非常低的FUT8岩藻糖基转移酶,因此含有低百分比的核心岩石化聚糖(
      • Pučićm.
      • kneževića。
      • VidičJ.
      • Adamczyk B.
      • Novokmet M.
      • PolašekO.
      • Gornik O.
      • Supraha-Goreta S.
      • Wormald M.R.
      • redzići。
      • 坎贝尔H.
      • Wright A.
      • 哈斯蒂N.D.
      • 威尔逊J.F.
      • 鲁丹一世。
      • Wuhrer M.
      • rudd下午
      • josićd。
      • Lauc G.
      IgG. - 可变异性和IgG Glycome中IgG Glyce中IgG变异性的高通量分离和糖基化分析。
      )。如预期,我们观察到急性期蛋白的核心岩藻糖的较低水平与我们研究中的抗体课程相比(Fig. 5)。另一个有趣的点涉及急性期蛋白质的复杂性增加 N - 与免疫球蛋白课程相比的糖基化(Fig. 5),具有四年度聚糖,这些糖蛋白存在于这些糖蛋白中未与抗体类分离出来。我们找不到生物学理由原因是为什么 N - 在这些急性期蛋白中更加分枝,但它可能与其炎症性质有关。而且,这些糖蛋白含有SELX基序。已知Slex在细胞 - 细胞识别和其他过程中发挥至关重要的作用,并且已知在癌细胞中过表达(
      • 梁J.X.
      • 梁Y.
      • 高W.
      癌症患者SiaLyl Lewis X过度表达的临床病理和预后意义:荟萃分析。
      )。因此,该特征在卵巢癌队列的背景下尤为重要。

       卵巢癌中所选糖蛋白的糖过细胞和统计学意义

      综合分配 N-glycans和计算的糖蛋白IgG,IgM,IgA,TRF,HPT和A1At的衍生糖基化性状在正常人体血清中,我们用卵巢癌患者培养了卵巢癌的群体来利用可量化的 N - (1)检测卵巢癌和(2)分辨疾病阶段的糖基化改变,努力为未来提供早期诊断的临床工具。
      N - 从7例对照和27例卵巢癌患者(在生物清单中归类为临床线或转移)的7例正常对照组(IgG,IgM,IgA,TRF,HPT和A1AT)的蛋白质(IgG,IgM,IgA,TRF,HPT和A1AT) 补充表S9)分析了一种试验组,得到总共204种加工的甘油蛋白。根据个体糖蛋白(以下)将曲线分成甘草峰(GPS)(例如 IgG的G1-G25)和该值呈现为总%峰面积的比例 补充表S10-S15 对于糖蛋白IgG,IgM,IgA,TRF,HPT和A1At。还计算得出的糖基化性状,并如前所述衍生(补充表S8)。控制年龄,统计学意义(Tukey诚信显着差异(HSD)与ANOVA,通常分布(数据未显示))针对每个选定的糖蛋白的所有GPS和糖基化性状测量,并呈现给 补充表S16-S21以及临床变量(补充表S22)正常之间 相对 边界,转移性 相对 边界,正常 相对 转移性临床样本。这 p 使用Benjamini-Hochberg提出的5%虚假发现率(FDR)方法来纠正多个测试误差(
      • Benjamini Y.
      • Hochberg Y.
      控制虚假发现率 - 一种实用而强大的多种测试方法。
      )。调整后 p <0.05被认为是统计学意义。提出了显着的GPS,糖基化性状和患者的临床参数 Fig. 6 用于糖蛋白系列。 Boxplots(Fig. 6C)和主要的甘草(Fig. 6B)对于统计而言,还提出了显着的GPS /糖基化性状。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6每个糖蛋白和临床参数的统计学显着的GPS和糖基化性状(Y =是) p values <0. 05(使用Benjamini-Hochberg提出的5%FDR校正多种测试错误(
      • Benjamini Y.
      • Hochberg Y.
      控制虚假发现率 - 一种实用而强大的多种测试方法。
      ))对于卵巢癌癌症队列正常 相对 边界,转移性 相对 边界和正常 相对 metastatic (6A)。提出了每个统计学意义的GP的主要聚糖(6B)。对于统计上显着的GPS,糖基化性状和LOGCA125呈现Boxplots,用于邻列(红色),转移性(绿色)和正常(蓝色)样本(6C)。
      从所选的糖蛋白中,TRF显示正常患者之间的最佳歧视(n = 7)和边界(n = 6)或转移性患者(n = 21)。最值得注意的是,TRF糖基化可以使用四个单独的GPS(T11,T16,T17和T18)来区分正常和横向样本,由此CA125,卵巢癌检测的金标准没有显示出相同的统计显着分离。岩藻丝化也脱颖而出作为这种歧视可能被利用的特征。 TRF的GPS /糖基化特征不能区分该队列中的转移性和边缘样本,而CA125确实表现出显着性。
      若干研究呈现了卵巢癌生物学中TRF的证据(
      • 罗克菲尔德S.
      • Raffel J.
      • Mehta R.
      • 克里曼
      • 南欧南米
      铁过载和卵巢癌中的铁代谢改变。
      )。此外,在文献中审查了在癌症和其他炎症疾病的背景下TRF糖基化的改变(
      • 麦卡锡C.
      • Saldova R.
      • Wormald M.R.
      • rudd下午
      • mcelvaney n.g.
      • Reeves E.P.
      急性期蛋白质糖基化与焦点对α-1抗胰蛋白酶在急性和慢性炎症条件下的作用和重要性。
      ,
      • Gornik O..
      • Lauc G.
      炎性疾病中血清蛋白的糖基化。
      )。携带在一起,TRF唾液酸化通常在疾病状态中改变,并且在该研究中也不例外,其中唾液酸(α2,6)与正常对照相比,在转移性癌群中改变了唾液酸(α2,6)。由于脱淡化的TRF具有更快的间隙,因此可能是细菌/病原体的进化策略,以促进血管生成。我们研究中更引人注目的是TRF岩藻糖基化的改变。已经显示TRF岩藻糖基化在疾病(如典型的半乳糖血症)(
      • Sturiale L.
      • 黑石r.
      • Fiumara A.
      • 佩雷斯米
      • Zaffanello M.
      • Sorge G.
      • 帕瓦通L.
      • ortorelli s.
      • o'brien J.f.
      • jaeken J.
      • Garozzo D.
      具有增加的岩藻糖基化和血清转移素N-聚糖的岩藻糖基化和分支在未处理的半乳糖瘤中的支化。
      )但迄今为止,我们的知识尚未在卵巢癌的背景下报告。未来的研究是有权进一步调查。
      此外,在转移性癌症中显着改变了颤脂蛋白糖基化(n = 18)与正常患者相比(n = 7)在该队列中六个不同的GPS(H2,H3,H11,H20,H 21和H 22)以及糖基化特征岩藻糖基化和SELX基丝。这些数据与文献报告一致(
      • 张某。
      • 李W.
      • 秦X.
      • 刘Y.
      人哈达福蛋白的N-糖基化及其与癌症相关性的见解。
      ),其中癌症中HPT的主要糖基化改变似乎是存在异常岩藻糖基化和唾液酸化结构以及增加的支化。

       卵巢癌中的歧视和聚类分析

      探索歧视分析对于健康(正常)的概率分类 相对 卵巢癌样品使用糖基化数据并与临床队列的CA125值相比。 Ca125抗原是一种高分子量糖蛋白,其由大部分上皮性卵巢癌表达,并且目前被认为是卵巢癌诊断的黄金标准,尽管其敏感性差和特异性差。它仅在1阶段上皮卵巢癌的〜50%上提出,在75-90%的患者中,许多医学障碍都注意到了恶性和良性(
      • 苔藓。
      • hollingworth J.
      • 雷诺兹下午
      CA125在临床实践中的作用。
      )。 ROC曲线(AUC)下的区域,敏感性(SEN)和特异性(SPE)进行了计算,与正常相关 相对 边界,转移性 相对 边界和正常 相对 转移性临床样本(补充表S23,S24和S25 分别)。各个模型对从边缘患者区分正常的态度进行了良好,具有来自HPT的衍生性状的最有前景的结果(AUC = 1.000,SEN = 1.000和SPE = 1.000)(Fig. 7A)。如果经过验证的话,该发现可以使用HPT糖基化具有早期检测卵巢癌的主要影响。同样地,正常观察到良好的歧视 相对 转移性患者。同样,HPT对所有峰,衍生性状及其组合显示出完美的歧视。但是,CA125也允许完美的歧视,因此这在此实例中否定了Glycome数据。没有糖基化特征可以区分临界和转移性患者,在这种情况下对CA125观察到优异的结果。
      图缩略图GR7.
      Fig. 7用于卵巢癌队列的值得注意的糖基化性状的歧视性能(HPT)正常癌症队列 相对 边界,正常 相对 转移和边界 相对 metastatic. 包括AUC,SEN和SPE的线性回归模型(7A),使用PCA使用HPT导出的特征作为普通输入(蓝色, n = 7) 相对 边界(橙色, n = 6)分离,正常(蓝色, n = 7) 相对 转移性(橙色, n = 18)和边界(橙色, n = 6) 相对 转移性蓝色, n = 18)分别是以下(7B)来突出显示第B部分。在括号中的主要成分的方差。
      使用主成分分析(PCA)和分层群集进行群集分析。 PCA结果提供 补充图S7-S12,并介绍了分层群集 补充图S13-S18 对于各种甘油峰的各自的糖蛋白IgG,IgM,IgA,TRF,HPT和A1At。在对单个聚糖峰值的PCA分析的正常,边界或转移样品之间没有观察到明确的歧视。对于分层聚类,没有针对糖蛋白IgG,IgM或A1AT观察到的主要聚类,但对于IgA,TRF和HPT观察聚类,分别具有清晰的转移和正常样本的聚类,并对HPT最明显的影响。考虑糖基化性状,HPT再次优于其他糖蛋白和PCA图显示 Fig. 7B 显示正常和边界样品和正常和转移样品的清晰分离,但边缘线之间没有分离 相对 与此数据集的AUC,SEN和SPE一致,转移样,符合AUC,SEN和SPE。

       卵巢癌的糖基因诊断工具

      卵巢癌诊断工具的可用性仍然难以捉摸。 CA125目前是市场上卵巢癌的最佳诊断工具,但对诊断早期卵巢癌是不可靠的(
      • Saldova R.
      • 罗伊尔L.
      • radcliffe c.m.
      • abd hamid um.
      • 埃文斯r.
      • 阿诺德J.N.
      • 银行R.E.
      • HUTSON R.
      • 哈维D.J.
      • Antrobus R.
      • Petrescu S.M.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      卵巢癌与急性期蛋白和IgG中的糖基化的变化有关。
      ,
      • Scholler N.
      • 城市N.
      Ca125在卵巢癌中。
      )。早期检测和随后治疗卵巢癌是一种吸引卵巢癌发病率的吸引力。在这项研究中,我们证实了这些文献发现,并表明CA125无法区分边界(n = 6) and normal (n = 7) samples (Fig. 6)。对于IgG,IgA,IgM,HPT和A1AT,我们再次在这些类之间无法看到任何显着的改变,而是发现TRF糖基化可以使用GPS T11,T16,T17和T18区分(Fig. 6)在我们的小临床队列中。如果可以复制和验证这些发现,则可以将TRF糖基化作为卵巢癌的早期检测工具被利用。为了探测TRF糖基化在卵巢癌中的潜在作用,在非常基础的水平上,我们测量了相对丰富的上调/下调 N-glycans对于统计上显着的GPS(Fig. 6B)并假设显性糖基化特征在疾病的进展中可能是显着的。两个主要的聚糖,在边界样本中调节上调(n = 6)含有核心FUCES-FA2G2(T11)和FA2G2S(6)1(T16),而逐渐减小逐渐减小A2G2S(3,6)2(T18)。考虑分类和聚类数据考虑TRF糖基化不能在与其他糖蛋白相比的类别之间不提供卓越的分化 - 没有观察到透明的PCA分化(补充图S10)但是分层聚类确实显示了解决组之间的权力的承诺(补充图S16)。
      关于聚类和分类分析,最好的表现者是HPT糖基化(Fig. 7)在PCA分析中显示清除分组。另外,关于HPT糖基化的统计发现,在转移性癌症患者中有两个核心岩藻糖基化物种Fa2G2(H11)和Fa2G2S(6,6)2(H20)的显着增加(n = 18)与正常对照相比(n = 7)和逐渐减少的络合物Glycan A3G3S2(H22)的减少。这些数据集体表明,在TRF和HPT的卵巢癌队列中,核心岩藻糖基化(FA2系列)显着上调。重要的是,先前发现FA2在使用独立的卵巢癌患者的血清中显着改变(增加) N-GlyCoAnalytical技术(
      • Saldova R.
      • 罗伊尔L.
      • radcliffe c.m.
      • abd hamid um.
      • 埃文斯r.
      • 阿诺德J.N.
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      • 哈维D.J.
      • Antrobus R.
      • Petrescu S.M.
      • DWEK R.A.
      • rudd下午
      卵巢癌与急性期蛋白和IgG中的糖基化的变化有关。
      )。我们提出这些变化反映了α(1-6) - 霉素转移酶(FUT8)或供体基质(GDP-岩藻糖)的表达水平的差异 内侧-Golgi在卵巢癌特异性细胞中。
      如上所述,TRF糖基化是我们研究中最显着改变的,并且HPT显示了在卵巢癌阶段的鉴别中所选急性期蛋白和抗体的聚类分析中最大的希望。糖蛋白在未来都需要进一步的功能研究。显着的是,在文献中,对于TRF在卵巢癌中的可能作用,尽管它用作商业产品的一部分,但涉及OVA1的多变量指数测定(2016年批准的),因此在卵巢癌中描述了很少的调查,其中包含五种血清生物标志物融入了使用专有算法的恶性风险评分0-10,由美国产科医生和妇科医生建议(

      美国o和妇科和妇科医学院的实践委员会(2016年)练习公告NO B-G174:附件群众的评估和管理。产物。 Gynecol。 128,E210-E226。

      )作为一种帮助评估伴有附件群众的妇女的工具。卵巢癌中HPT糖基化表达改变的优先级,其中特纳和同事发现了卵巢癌患者的分支,尤其是Triantennarnnar Glycans的增强表达(
      • 特纳。
      • Goodarzi M.T.
      • 汤普森S.
      卵巢癌中α-1蛋白酶抑制剂和Haptoglobin的糖基化:两种不同机制的证据。
      )。作为这种TRF和HPT作为卵巢癌治疗的有趣目标。关于剩余的糖蛋白,IgG,IgM和IgA糖基化学在来自晚期患者的卵巢癌的背景下进行评估 - 结果表明,将IgG糖基化谱与Ca125组合可以提高上皮性卵巢癌预测的准确性(
      • Ruhaak L.R.
      • 金库克。
      • stroble c.
      • 泰勒S.L.
      • 洪问:
      • 米亚塔托斯。
      • lebrilla c.b.
      • LieSerowitz G.
      卵巢癌患者血清中免疫球蛋白的蛋白质特异性差异糖基化。
      ),与我们的研究结果相比。在一个单独的研究中,使用IgG半乳糖基化用于辅助CA125患卵巢癌的差异诊断(
      • 钱Y.
      • 王Y.
      • 张X.
      • 周L.
      • 张Z.
      • 徐J.
      • 阮Y.
      • ren s.
      • 徐C.
      • 顾J.
      血清IgG半乳糖基化的定量分析有助于卵巢癌的鉴别诊断。
      )。在卵巢癌的背景下研究了一项早期的研究A1AT糖基化(
      • 汤普森S.
      • Guthrie D.
      • 特纳。
      岩石化形式的α-1-抗酸酯,预测卵巢癌中的化学疗法反应。
      )。作者的结论是,岩藻糖基化是糖基化特征,其在肿瘤生长存在下升高,但缓解缓解和化疗期间仍然很低。本研究不反映出A1AT岩藻糖基化在所选择的患者队列中的效用。

      结论

      本研究介绍了优雅的甘油蛋白详细表征和调查的优雅糖基因平台的发展 N - 糖基化:抗体IgG,IgM和IgA和急性期蛋白TRF,HPT和A1At。在该分析过程中,除了通过鉴定和分析超过一百多种甘油结构来实现每个糖蛋白的详细的糖蛋白,我们能够识别迄今尚未概述的新型甘草基板和特征。它在卵巢癌的背景下的效用是突出的-RF和HPT糖基化可以被利用为卵巢癌的生物标志物工具,并且可能发挥基本作用。更重要的是,这种综合性和可重复的糖过型技术可以提供显着的见解,并作为鉴定生物标志物的基线及其在一系列疾病中的调节。

      数据可用性

      本研究中的质谱数据通过储存库自由提供(//massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/dataset.jsp?task=a66ade995ac8431e80f6e27f11c55674)使用DataSet标识符MSV000083877。

      致谢

      我们感谢LEEDS多学科研究组织库进行样品。我们承认热科学捐赠抗哈帕氟胺捕获树脂。

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