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大规模鉴定彩易福彩质,粘彩易福彩及其 O在月经周期期间内膜粘液中的糖基化*

  • YLVA Andersch-Björkman
    脚注
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    医学生物化学系,Göteborg大学,413 90哥德堡,瑞典
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  • Kristina A. Thomsson.
    脚注
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    医学生物化学系,Göteborg大学,413 90哥德堡,瑞典
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  • Jessica M.HolménAlsson
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    医学生物化学系,Göteborg大学,413 90哥德堡,瑞典
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  • Erling Ekerhovd
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    斯哈格伦大学医院妇产科,哥德堡大学,413 45 45哥德堡,瑞典
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  • Gunnar C. Hansson.
    一致
    应讨论谁的通信:医学生物化学部,Göteborg大学,Medicinaregatan 9a,413 90哥德堡,瑞典。电话:46-31-7733488;传真:46-31-416108
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    医学生物化学系,Göteborg大学,413 90哥德堡,瑞典
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了瑞典研究理事会(授予7461和质谱仪),在瑞典西部(瑞士),Wallenberg基金会,Ingabritt和Arne Lundberg基金会,以及瑞典战略研究基金会 - 粘膜免疫学和疫苗中心(MIVAC)。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
    §这位作者对这项工作进行了平等的贡献,并以字母顺序出现。
      粘液填充人的颈部开口阻断进入子宫,但这必须是相对的并且允许精子在排卵中渗透。我们研究了这种粘液,其彩易福彩质和粘彩易福彩的含量,以及粘彩易福彩O在排卵前,期间和之后的颈椎分泌物中的糖基化。收集来自12个受试者的宫颈粘膜分泌物,用聚丙烯酰胺或琼脂糖/聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,并用银,阿尔西亚蓝色或Coomassie蓝色染色染色。从纳米LC-FT-ICR MS和MS / MS分析,消化并在排卵前和粘液带的彩易福彩质和粘液带。在针对NCBI非冗余彩易福彩质数据库和内部粘合彩易福彩数据库中搜索后,我们确定了194彩易福彩。鉴定了三种凝胶形成(MUC5B,MUC5AC和MUC6)和两个跨膜粘彩易福彩(MUC16和MUC1)。用于分析粘彩易福彩O - 糖基化,将来自六个个体的分离的粘彩易福彩被呈涂成PVDF膜,以及O通过还原β-消除并用毛细管HPLC-MS和-MS / MS分析 - Glycans。发现至少50个中性,唾液酸和含硫的寡糖。 GlCNAC-6Galnacol核心2结构的增加和NeuAc残基的相对降低是排卵的典型,而NeuAc-6Galnacol和NeuAc-3Gal-表位对于非排卵相是典型的。因此,排卵的宫颈粘液的特征在于中性岩藻糖基化的寡糖的相对增加。在月经周期期间粘液的这种综合表征表明粘彩易福彩糖基化作为排卵的主要变化,但仍未理解与改变的物理化学性质和精子渗透性的关系。
      子宫颈用子宫连接阴道,并且是“打开”进入雌性子宫内膜和腹腔。宫颈粘液填充了子宫颈的开口,并作为一个重要的保护屏障,防止病原体升入子宫。分泌到阴道中,粘液也很重要,因为它捕获微生物,并冲洗这些从阴道中保护,以保护子宫和阴道上皮。然而,粘液阻断进入子宫腔必须相对于允许精子进入排卵。这反映在宫颈粘膜分泌物中,其在其物理化学性质的循环变化作为对激素变化的反应。在排卵期间,粘液体积增加10-20倍并且变得更少粘稠。实际上,已经显示出改变的粘液性能是肥沃窗口的非常好的预测因子(
      • bigelow J.L.
      • 邓森D.B.
      • 斯坦福J.B.
      • Ecochard R.
      • GNOTH C.
      • 科伦坡B.
      肥沃窗口中的粘液观察:概念的更好预测因子比性交时间。
      )。宫颈粘液的重要性也通过观察结果说明了宫颈分泌物的异常,其负责不孕症的不孕症,在约5-10%的不孕症(
      • 莫里亚山A.
      • Shimoya K.
      • ogata i.
      • Kimura T.
      • Nakamura T.
      • Wada H.
      • ohashi K.
      • azuma c.
      • Saji F.
      • 村田y.
      分泌白细胞彩易福彩酶抑制剂(SLPI)颈部颈部宫颈粘液中的正常循环。
      )。
      尽管重要的是,仍有有限的生化理解宫颈粘液的组成以及在排卵期间改变的情况。大多数宫颈粘液是水(95-99%),但它还含有有机组分,无机离子,酶,杀菌彩易福彩,血浆彩易福彩和尤其粘彩易福彩的复杂混合物。粘液是大型聚合物分子,其有助于粘液的粘弹性凝胶性质,因此它们是重要的,包括在彩易福彩质组研究中。然而,由于其大尺寸,聚合物性质和异质糖基化,粘彩易福彩具有复杂的表征。粘彩易福彩多聚体通过二硫键连接在一起,由500多KDA的彩易福彩质单体构建。超过80%碳水化合物的大量糖基化将群体增加到超过2MDA。内膜性上皮的主要凝胶形成粘液转录物是MUC5B(
      • gipson i.k.
      • 瘟疫米科德S.
      • MOCCIA R.
      • 詹Q.
      • Toribara N.
      • HO S.B.
      • gargiulo a.r.
      • 山III,J.A.
      MUC4和MUC5B转录物是人体内膜的普遍粘膜信使核糖核酸核糖核核酸。
      )。人宫颈粘液中的MUC5B粘彩易福彩的量在月经周期和排卵中的峰值期间变化,表明这种较大的粘彩易福彩物种可能是影响精子转动到子宫的重要因素(
      • gipson i.k.
      • MOCCIA R.
      • 刺激性S.
      • Argueso P.
      • gargiulo a.r.
      • 山J.A.
      • offner g.d.
      • Keutmann H.T.
      中环宫颈粘液峰的MUC5B粘彩易福彩的量。
      )。基于Northern Blot的研究 原位 杂交进一步表明其他粘合彩易福彩基因由内部局部上皮表达(
      • gipson i.k.
      人腹膜围的粘液。
      )。
      所有粘彩易福彩含有大型粘彩易福彩结构域,也称为PTS结构域,其富含氨基酸丝氨酸,苏氨酸和脯氨酸,并提供大量的附着位点 O - 链接的碳水化合物(
      • gipson i.k.
      人腹膜围的粘液。
      ,
      • hollingsworth m.a.
      • Swanson B.J.
      癌症在癌症中:保护和控制细胞表面。
      )。粘彩易福彩的特定流变和流体动力学性能可以归因于它们的广泛 O - 糖基化。凝胶形成粘液的碳水化合物链作为两种和更多糖残留物的异质中性,唾液酸化和硫酸寡糖(
      • Cooper C.A.
      • Wilkens M.R.
      • 威廉姆斯K.L.
      • 包装机N.H.
      大胆的生物o-linked glycan数据库。
      )。在排卵期间改变的粘彩易福彩糖基化可以伴随改变的生化特性,但在月经周期期间的宫颈粘彩易福彩糖基化的组织化学研究产生了关于这种循环变化的矛盾的结果(
      • 吉尔克斯C.B.
      • 里德P.E.
      • 克莱特P.B.
      • 欧文D.A.
      正常月经周期期间宫颈粘液分泌上皮细胞化学变化。
      ,
      • van kooij r.j.
      • Roelofs H.J.
      • Kathmann G.A.
      • Kramer M.F.
      人宫颈粘液及其粘液糖彩易福彩在月经周期期间。
      ,
      • Argueso P.
      • 瘟疫米科德S.
      • Tisdale A.
      • gipson i.k.
      用月经循环的人宫颈粘液分泌物中T抗原和N-乙酰萘胺寡糖的变化。
      )。在本研究中,通过使用质谱(HPLC-MS / MS),对月经周期进行了对糖基化的更完全分析,其旨在表征和获得关于宫颈粘彩易福彩糖基化的半定量信息。我们的方法是基于简单快速的方法,消耗少量的起始材料。
      因此,人宫颈彩易福彩的彩易福彩质组分析包括粘彩易福彩组分和月经周期中的粘彩易福彩糖基化的彩易福彩质组分析因此是为了更好地理解保护生殖道的复杂过程。然而,由于它们的大小和致密的存在,难以鉴定彩易福彩质组学的粘彩易福彩难以 O - 在粘彩易福彩结构域中的糖基化,阻断这些部分分子用于彩易福彩质鉴定。此外,在公共数据库中没有完全测序并正确组装几种粘液,这些东西由于低击中分数而阻碍了这些彩易福彩质的鉴定。通过编制粘彩易福彩数据库并通过使用ICR-FT质谱法使用粘彩易福彩肽的高精度鉴定来解决并绕过这些问题。
      为了在月经周期中尽可能地完成彩易福彩质组和粘彩易福彩分析,粘液从健康供体轻轻分离。鉴定许多彩易福彩质从特异性分泌物中反射它们的来源,含有剥离细胞以及细胞外液体和血液。可以在月经循环上检测彩易福彩质组合物中没有一致的改变。 muc5b mucin是一个主要组成部分,其 O - 糖基化显示在排卵中的一致差异。该研究是第一种方法,其进行粘液凝胶和分泌物的综合生化表征的方法,其包括不仅包括彩易福彩质,还包括粘彩易福彩及其糖基化。

      材料和方法

       试剂 -

      除非另有说明,否则所有化学品均可从西格玛购买。

       样品收集和准备 -

      25至36岁之间的12名健康,定期循环妇女的总数均已注册研究。所有妇女获得批准和知情同意。样本的收集在瑞典哥德堡哥德堡的妇产科和妇科举行。宫颈粘液样品(n = 36)通过与长结核彩易福彩注射器的吸入从内膜中获得。在一次月经周期的排卵前,期间和之后收集来自每个妇女的样本。通过经阴道超声评估排卵,并通过测量中肺血清孕酮水平来证实。循环日从月经的第1天提供。宫颈粘液在塑料管中收集并直接储存在-80℃。在排卵前,每位患者的粘液量为〜100-150μl,排卵时间为200-250μl,排卵后0-25μl。将每个样品用相同量的非还原样品缓冲液(4%SDS,125米)溶解(4%m Tris-HCl缓冲液,pH6.8,30%甘油和5%溴酚蓝)。用DTT(最终浓度为20米,溶液m)在磁力搅拌下在95℃下。减少两次,然后在45米中孵育m 碘乙酰胺在室温下磁力搅拌1小时。

       一维SDS-PAGE和SDS-琼脂糖复合凝胶电泳用于分离彩易福彩质和粘彩易福彩 -

      通过一维SDS-PAGE和SDS-AGPAGE分析人颈部分泌物的彩易福彩质和粘膜,
      所用的缩写是:焦觉,复合琼脂糖聚丙烯酰胺凝胶电泳;加那儿糖, N - 乙酰甘氨酸氨基氨基酚。
      分别。对于彩易福彩质分析,在3-15%梯度凝胶(1.5mm厚)和3%堆叠凝胶上,用不连续的SDS-PAGE分析〜1-11μl样品。
      • raemmli u.k.
      在噬菌体T4头部组装过程中裂解结构彩易福彩。
      )在35 mA,直到颜色前部迁出凝胶。用Coomassie Blue(Biosafe Coomassie G-250,Bio-rad)或银染料进行染色(
      • Blum H.
      • 贝尔H.
      • 总计h.j.
      改善聚丙烯酰胺凝胶中植物彩易福彩,RNA和DNA的银染色。
      )。精密彩易福彩质标准(Bio-rad)用作分子量标记物。如Schulz所述,制备用于粘液分析的一维SDS-琼脂糖复合凝胶(0-7%丙烯酰胺,1%琼脂糖) 等等。 (
      • Schulz B.L.
      • 包装机N.
      • Karlsson N.G.
      用凝胶电泳分离的糖彩易福彩和粘彩易福彩的O型寡糖的小规模分析。
      )。将10-50μl宫颈粘液样品加载到凝胶上并用硼酸盐/ Tris缓冲液在冰上在4℃下运行(192米m 硼酸,pH调节至7.6与TRIS,1米m EDTA和0.1%SDS)在30mA /凝胶中为3-3.5小时,直至染料前凝胶外部耗尽。琼脂糖凝胶用阿尔西亚蓝色染色(
      • Schulz B.L.
      • 包装机N.
      • Karlsson N.G.
      用凝胶电泳分离的糖彩易福彩和粘彩易福彩的O型寡糖的小规模分析。
      )。

       消化彩易福彩质 -

      选择和切除染色彩易福彩质或粘液带,然后选择并切除在500μl50%ACN,25米的振荡器上剥去3×30分钟的3×30分钟m NH4HCO3。将凝胶片在真空蒸发器中干燥40分钟,然后加入15μl胰彩易福彩酶(25米10μg/ mlm NH4HCO3; Promega,Madison,Wi)。将样品在37℃下孵育过夜。在振荡器上以15μl50%ACN,5%TFA萃取肽30分钟。将肽提取物转移至0.6ml硅化管(X型)。在30μl50%ACN,0.2%TFA中重新浸出凝胶片,并合并提取物。将肽提取物冻干至干燥,并立即重悬于18μl0.1%乙酸中。

       肽分析 -

      样品注射和LC通过使用HTC-PAL自动进样器(CTC Analytics AG,​​Zwingen,瑞士)进行了配备的Cheminert Valve(0.25毫米孔,C2V-1006D-CTC; Valco Instruments Co.,Schenkon,Schenkon,Switzerland)。 Agilent 1100系列脱气器和毛细管泵(安捷伦科技,帕洛阿尔托,加利福尼亚州)。将两种微升的彩易福彩质消化混合物捕获到填充3μm的捕食物(4cm×100μm内径)上捕获3μm的再批量-pur-pur c18-AQ粒子(Maisch GmbH博士,Ammerbuch,德国),并位于阀门切换配置中的两个微孔T接线器(0.15毫米孔; Valco Instruments Co.)之间。在喷射器和第一微孔t之间连接100μm稠合石英毛细管,其中80cm×50μm熔融二氧化硅毛细管用作浪费的分离器并连接到可切换的rheodyne阀(纳米升降,Nieuwkoop,荷兰。由质谱软件(Xcalibur,Thermo Finegan,San Jose,CA)控制。在第二个T和rheodyne阀之间,另外100μm熔融石英毛细管连接到柱并浪费。分析柱(17cm×50μm内径)由熔融的二氧化硅毛细管组成,其填充与与预铸模相同的颗粒。在注射期间,第一T上的分裂限制闭合,而另一个分裂是打开的,并且5μl/ min 100%A(0.1%HCOOH)的流速通过捕集柱并输出浪费。 3分钟后,打开第一个分裂,闭合第二个分裂,梯度开始(250μl/ min,0.1%HCOOH,0-50%ACN,50分钟),流速〜100nl / min的流速。柱子。纳米ESI界面(Thermo Electron,Bremen,Germany)在内部进行了改进。将分析柱密封在钢筛(1μm孔,50μm厚度)上,并连接到发射器(锥形熔融硅,20-μm内径)中 1/16-INCH穿过钻孔联盟(Valco Instruments Co.)。施加到联合的电压为+ 1.4 kV。质谱仪是配备有7-Tesla ICR磁体(LTQ-FT,Thermo Electron)的混合线性离子阱-CT-ICR MS仪器。质谱仪以数据相关模式操作,以在MS和MS / MS采集之间自动切换。调查MS Spectra(来自 m/z 在FT-ICR仪器中获得了400至1600),并且在每个FT扫描中的三种最强烈的双重或三次带电离子分段并在线性离子阱中分析。

       彩易福彩质和粘彩易福彩识别 -

      使用Program“Extract_msn.exe”(Thermo FinNegan)从原始数据中提取峰值列表。没有使用平滑。搜索是使用搜索程序吉祥物进行的(2.1.0版,矩阵科学,伦敦,英国)进行。搜索参数设置如下:MS精度,15 ppm; MS / MS精度,0.5 da;一个错过了乳沟;固定半胱氨酸的碳酰胺甲基改性;氧化甲硫氨酸的可变改性。对来自SDS凝胶彩易福彩条带的肽提取物的搜索分别进行来自SDS凝胶的彩易福彩质条带作为四个合并的彩易福彩质带1-15和13-28(第9天)和29-44和42-56(第14天)进行的四个合并的搜索(参见 Fig. 2)。来自LC-FT MS / MS实验的串联质谱进行了搜索从国家生物技术信息中心(NCBI)下载的非冗余彩易福彩序列数据库,2005年5月10日含有2,869,704个条目(www.ncbi.nlm.nih.gov/)。针对NCBI数据库的搜索显示95%肽同一性高于33以上的单个离子分数,99%水平为高于40。彩易福彩质鉴定的最小标准被设定为高于99%水平的两种独特的肽。如果彩易福彩质被鉴定为两次(IE。 在覆盖第9天或第14天样品的两个合并搜索中,仅报告了最佳的肽覆盖率。对从复合凝胶中获得的粘彩易福彩肽提取物进行的搜索分别以与排卵前和排卵期间的粘液带1-5和6-10的合并搜索进行。搜索MS数据,用于编译的MUCIN数据库并由我们的组提供(www.medkem.gu.se/mucinbiology/databases.)。人粘彩易福彩数据库是1.0版,含有16次粘彩易福彩序列(完整序列的MUC1,MUC2,MUC5B,MUC12,MUC13,MUC15,MUC17,MUC19和MUC20和MUC3A,MUC3B,MUC5AC的部分序列,和muc16)。吉祥物评分系统受到构成合并搜索文件的MS峰值列表的数量,还受到合并搜索文件的影响,还影响了MUCIN数据库中的序列条目数。为了能够使用吉祥物评分系统,首先针对更大的NCBI数据库进行搜索以获得相关的单独离子分数(95%肽同一性显着性水平,99%水平以上35级)。选择这些离子刻度间隔进行评估,用于评估当与粘彩易福彩数据库一起搜索时获得的结果,以及彩易福彩质鉴定的两个独特肽高于99%肽意义水平的两个独特肽的最小标准。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2从患者4之前(第9天)和期间(第15天,第15天)减少和烷基化彩易福彩来自患者4(11μL)的彩易福彩质 OV.)排卵在SDS-PAGE凝胶(3-15%)上分离并用Coomassie蓝色染色染色。 覆盖外部车道的注释带1-56除了前面的粘彩易福彩外,胰彩易福彩酶化,然后通过纳米-1C-FT MS / MS进行分析进行彩易福彩质鉴定。结果在补充表S1中给出。将强烈染色的带14和43鉴定为聚-Ig受体,鉴定带16和45的带16和45作为白彩易福彩。

       粘彩易福彩寡糖分析 -

      宫颈粘液衍生的粘彩易福彩通过Sds-agpage分离,并湿涂衬垫在转移缓冲液中的Immobilon PSQ膜(Millipore,Bedford,MA)中(25米m Tris, 192 mm 甘氨酸,0.04%SDS,20%MeOH)在900 mA时2小时。将膜用Alcian Blue染色,切除粘彩易福彩条带,并且寡糖被释放,并通过还原β-消除释放(
      • Schulz B.L.
      • 包装机N.
      • Karlsson N.G.
      用凝胶电泳分离的糖彩易福彩和粘彩易福彩的O型寡糖的小规模分析。
      )。通过使用与肽分析相同的仪器进行样品注射和毛细管HPLC(见上文)。将样品重悬于10μl水中并注入石墨化的碳柱(150×0.32-或0.25mm内径),其中包含5μm高钙粒子(Thermo-Hypersil,Runcorn,UK)。用h洗脱寡糖 2O / ACN梯度含有7米m NH4HCO3 (0-50%ACN 5-25分,然后在80%ACN中进行10分钟的洗涤步骤)。流速为5μl/ min,通过用熔融的石英限制器(40cm×50μm内径40cm×50μm)分离泵的液体流动保持。在芬内纳LTQ线性离子阱质谱仪上记录质谱仪,负离子模式具有离子最大离子源(Thermo Finegan)。毛细管温度为340℃,毛细管电压为31 V,电喷雾电压为3.2kV。对于MS / MS实验,归一化碰撞能量为20%,激活时间为30毫秒。用四个扫描事件进行质谱:用质量范围全扫描 m/z 300-2000后跟连续的MS / MS扫描在每个全扫描中的三个最强烈离子的碎片突破后扫描。

      结果

       宫颈粘液中的彩易福彩质 -

      通过温和的吸入,从12个健康女性中从12名健康女性中收集宫颈开口的粘液,以使上皮和血细胞的数量最小化。如图所示,在月经周期内的吸气粘液体积变化 Fig. 1 (总容积)。将DTT减少的粘液烷基化并在3-15%的SDS-PAGE凝胶上分离,并通过银色染色液体带(Fig. 1)。观察到几个强烈和一些不太强烈的带,包括凝胶顶部的强烈染色带。后一支带由粘液组成,粘液分别在复合凝胶上进行分析(见下文)。通过银色染色粘液比糖基化的彩易福彩质更弱,表明在粘彩易福彩带中发现的彩易福彩质占宫颈粘液。从单个个体排卵期间,期间和之后的一般彩易福彩质分布相对恒定,但是,与循环日7和12例例中有一些例外,与受试者1的第19天相比。然而,比较所有12名妇女的分析显示在月经周期上没有彩易福彩质模式的一致性改变。为了进一步分析彩易福彩质的性质,通过彩易福彩质组学研究排卵前和排卵前和期间的粘液样品,并由一个人提出(Fig. 2)。通过SDS-PAGE分离样品,用Coomassie蓝色开发,整个车道(顶部的粘彩易福彩带除外)在28件中切成28件,如所示的主要不同的带 Fig. 2。通过纳米LC FT-ICR MS和MS / MS分析胰彩易福彩酶消化带。在根据所提供的NCBI非冗余数据库中搜索MS / MS串联质谱后,共识别了总共189个彩易福彩质 补充表S1。仅在两种以前或在排卵期之前或期间鉴定的一些彩易福彩质在另外两种中筛选。这些结果被收集在 补充表S2。粘彩易福彩肽被排除并单独分析。主要条带对应于聚Ig受体(带14和43)和白彩易福彩(带16和45)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1从3个体之前,在(标记为“之前,从三个体收集的宫颈分泌物中减少和烷基化彩易福彩OV.“),排卵后。 将彩易福彩质在SDS-PAGE凝胶(3-15%)上分离并用银染色染色。 以下 每条泳道被赋予总粘液体积(vol)从指定的循环日(从月经的第1天定义)从三个人的子宫颈收集。装载的体积是指在每个车道中施加的总体积的体积。受试者3的较高体积和更低的彩易福彩质浓度是自然变化。

       宫颈粘液 -

      通过分解大粘彩易福彩的梯度焦点分析DTT减少和烷基化的宫颈粘液样品。 Alcian Blue,一种结合带负电荷的低聚糖的污渍,揭示了粘彩易福彩带(Fig. 3)。粘彩易福彩的尺寸为2-3MDA。粘液的曲线来自三个月度时间点和不同的人彼此类似。随着电泳迁移率的增加,凝胶揭示了几种具有降低强度的梯状带状图案。如图所示,分离了几个个体的排卵前和排卵中的十个粘彩易福彩带 Fig. 4 通过纳米LC-ICR MS和MS / MS胰彩易福彩酶消化后分析。结果进行了对愈合的内部人粘彩易福彩数据库的合并搜索(www.medkem.gu.se/mucinbiology/databases.)。我们确定了三种凝胶形成和两个跨膜粘彩易福彩(表I.补充表S3)。 MUC5B是从鉴定的肽(83肽)的总数判断的粘合剂中最丰富的粘合彩易福彩。这对应于整个彩易福彩质的16%的肽覆盖率。这是高百分比,因为粘彩易福彩的大多数肽是糖基化的,因此不能从肽数据库中鉴定。 MUC5B肽来自其富含Cys的N和C Termini以及粘合在粘彩易福彩结构域之间的重复Cys-D结构域。在所有粘合剂带中发现了MUC5B粘彩易福彩的肽(Fig. 4, 乐队1-10)通过agpage揭示。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3从3个个体中收集的宫颈分泌物的减少和烷基化粘彩易福彩在(标记为 OV.),排卵后。 通过SDS-agpage分离彩易福彩质并用Alcian Blue染色。这 数字 给予 以下 每个车道都表示总体积(vol)应用的分泌物。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4从宫颈分泌物(9μl)的(第9天)和(第15天)排卵期间的减少和烷基化粘彩易福彩(OV.)通过SDS-AgPage分析并用Alcian Blue染色。 带注释的乐队(1–10通过纳米-LC-FT MS / MS进行彩易福彩质化并分析用于彩易福彩质鉴定。
      表I.在受试者4之前和排卵前和排卵期之前和期间收集的宫颈粘液分泌物中鉴定的粘彩易福彩
      样本肽数量
      MUC5B
      a 六种鉴定的肽共同。
      MUC5AC
      a 六种鉴定的肽共同。
      MUC6MUC16MUC1
      95–99%
      b 肽意义上的身份水平。
      >99%
      b 肽意义上的身份水平。
      95–99%>99%95–99%>99%95–99%>99%95–99%>99%
      Day 6575329285222
      第14天(排卵)7736205152
      彩易福彩质大小(KDA)590>550
      c 近似尺寸;排序尚未完成。
      >2200
      c 近似尺寸;排序尚未完成。
      2352122
      d 近似尺寸;发生多态变体。
      a 六种鉴定的肽共同。
      b 肽意义上的身份水平。
      c 近似尺寸;排序尚未完成。
      d 近似尺寸;发生多态变体。
      Muc5Ac粘彩易福彩的尺寸和结构类似于MUC5B,并分别用33个肽(32和26个肽,排卵前和排卵期间)鉴定。与MUC5B相比,MUC5AC的较低肽覆盖率表明MUC5AC不太丰富。在所有分析的粘合彩易福彩条带中鉴定了MUC5Ac粘彩易福彩(Fig. 4),发现除了粘彩易福彩结构域外,发现肽遍布彩易福彩质。还鉴定了第三凝胶形成粘膜MUC6。该粘彩易福彩仅在排卵前收集的样品中鉴定。发现只有10个肽,表明比其他肽较低。在三个上部,最慢的迁移带中发现了muc6肽(Fig. 4, 乐队1-3)。除了来自C末端的两种肽外,大多数肽源自彩易福彩质的N-末端一半。
      除了形成凝胶形成粘彩易福彩外,还鉴定了两个跨膜粘彩易福彩。总共31种鉴定的肽源于MUC16,分别从排卵前和在排卵前和期间鉴定了27和20个肽。这些肽在复合凝胶上的三个较低,更快的迁移粘液带(Fig. 4, 乐队3-58–10)。肽主要来自彩易福彩质的糖基化的C-末端较少。最后在两个时间点鉴定了两种muc1粘彩易福彩的肽;这些也来自其C末端端。

       宫颈粘膜的糖基化 -

      O从六个个体分析了宫颈粘液的糖基化。粘膜分离的粘彩易福彩被呈涂成PVDF膜,和 O - 用负模式LC-MS和-MS / MS进行释放和分析。三个最慢的迁移粘膜乐队(见 Fig. 3)分析了每个周期日。典型的质谱揭示了具有分子离子和MS / MS碎片的非同性恋寡糖,揭示了进一步的结构信息(
      • Schulz B.L.
      • 包装机N.
      • Karlsson N.G.
      用凝胶电泳分离的糖彩易福彩和粘彩易福彩的O型寡糖的小规模分析。
      ,
      • 舒尔茨B.J.
      • 奥克斯利D.
      • 包装机N.H.
      • Karlsson N.G.
      鉴定两种高唾液酸化的人泪液DMBT1同种型:人泪中的主要高分子质量糖彩易福彩。
      ,
      • Karlsson N.G.
      • Schulz B.L.
      • 包装机N.H.
      负离子LC-Electrospray-MSN的中性O型寡糖醛醇的结构测定。
      )。总离子光谱的实例显示了来自第9天和第14天的粘彩易福彩低聚糖的分子量图案( Fig. 5)。在不同的循环天中发现的寡糖是中性,唾液酸化和硫酸寡糖的混合物(补充表S4)。在排卵前后收集的粘液上的聚糖相似,由唾液酸化的低聚糖主导。主要峰值 m/z 这些光谱675(见 Fig. 5)由两个三糖,Gal-3的两种唾液酸化同种型组成(Neuac-6.)Galnacol(连接到Galnacol的6个连接的分支均以粗体为大胆),并且不太丰富的Neuac-Gal-Galnac序列(Fig. 6)。相反,在排卵期间收集的宫颈粘膜的低聚糖谱由中性低聚糖(Fig. 5)。四个寡糖同种型,一个在 m/z 749与序列gal-3(GAL-4GLCNAC-6)Galnacol和三个中性岩氧化戊二糖 m/z 895序列FUC-GAL-3(GAL-GLCNAC-6)Galnacol,Gal-3(FUC-GAL-4GLCNAC-6)Galnacol和Gal-3(FUC-(GAL-)GLCNAC-6)Galnacol相对于排卵期间的其他寡糖(Fig. 6)。从所有六个人获得的寡糖型曲线中存在类似的趋势。粘液将粘液分离成具有不同电泳迁移率的几条带,如图所示 Fig. 3 不能通过不同的糖基化解释,因为来自同一个体的聚糖似乎是相同的(结果未显示)。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5总离子光谱 O - 在排卵前收集的Alcian蓝染色带中的寡糖的寡糖(第9天, 最佳在排卵期间(第14天, 底部)。 用毛细管LC-MS和-MS / MS分析寡糖。所确定的寡糖序列列于 .
      图缩略图GR6.
      Fig. 6人宫颈粘液寡糖相对于月经周期期间相对于其他序列增加。 所示是基于MS和MS / MS的结构的结构 O从六个人的宫颈粘液中释放的糖粉。在排卵前,期间和之后收集样品。己糖残基被假设是加仑的,假设脱氧糖残基被认为是岩藻糖(f), N - 假设 - 乙酰己糖胺是Glcnac和 N - 乙酰己酰胺醇被假定是碱的碱,因为这些是由他人进行的单糖组成分析中发现的单糖(
      • yurewicz e.c.
      • Moghissi K.S.
      纯化人中腹粘液的纯化及其寡糖的表征,尺寸,组合物和微观偶联性。
      )。

      讨论

      在本研究中,我们确定了宫颈粘液的彩易福彩质组和Glyce,其保护进入子宫腔。粘液由其主要成分,粘液占主导地位,该粘彩易福彩是粘液的大部分凝胶状属性。这也是宫颈粘液的情况,其中凝胶形成粘彩易福彩MUC5B是与MUC5Ac一起的主要组分。由于粘彩易福彩的主要组成部分是他们的 O-Glycans,我们对粘彩易福彩Glyce的分析也反映了宫颈粘液Glycome的主要部分。对于宫颈粘液彩易福彩质组的完整图像,研究了除粘彩易福彩以外的彩易福彩质。
      鉴定了194个彩易福彩质总数,许多存在于排卵前和期间收集的宫颈分泌物中。所鉴定的彩易福彩质涵盖了与多种生物过程和细胞和分泌性质相关的广泛彩易福彩质官能类。本研究的主要目的是在月经周期期间识别宫颈粘液组合物的改变。当通过凝胶电泳分离其他彩易福彩质而不是粘彩易福彩,来自不同循环天的银染色彩易福彩质谱显示出常见的模式,不同的个体或循环天之间存在一些差异。这些差异的主要原因是收集纯粘液的问题。粘液通常含有上皮细胞,但我们还观察到本身本身的收集程序会影响上皮细胞和血液的量。在项目的初始阶段,使用普通刷法收集材料。然而,这给了大量的宫颈上皮细胞和血液。为了提高分析材料的质量,通过温和抽吸收集样品。此外,这给了可变数量的上皮细胞,有时少量的红细胞,但远低于刷法。血液在β-珠彩易福彩的存在下反映,上皮细胞反映在彩易福彩质组分析中鉴定的大量细胞内和膜组分中。虽然有些差异可能是由于个体变异性可能是由于各种变异性,但导致在凝胶电泳和彩易福彩质组学上观察到的大部分差异导致了大部分。
      宫颈粘液通常还含有细胞外液,如白彩易福彩存在的那样,在所有分析的受试者中越丰富的组分中的一种。许多已鉴定的彩易福彩质是血清和细胞外液的正常成分;其他是粘液的已知组分。粘液成分的实例是Lact转甲酸酯(乳铁彩易福彩),聚Ig受体和IgA,全部发现具有高分度。其他彩易福彩质也可能直接分泌到粘液中,例如DMBT1和IgG结合彩易福彩的Fc片段(FCGBP)。宫颈粘液中未描述一些彩易福彩质,但已在唾液分泌中描述(
      • 谢H.
      • Rhodus n.l.
      • 格里芬r.j.
      • Carlis J.v.
      • 格里芬T.J.
      通过自由流动电泳基肽分离和串联质谱鉴定的人唾液彩易福彩目录。
      )。这些包括淀粉酶,胱抑素和钙结合彩易福彩S100。 LPLUNC1彩易福彩(VON EBNER唾液腺彩易福彩)仅在唾液中鉴定。因此,似乎宫颈粘液含有许多细胞,血清和特定的粘液彩易福彩。在学习不同个体的许多凝胶电泳彩易福彩质模式之后,在月经周期和比较彩易福彩质组分析期间的不同时间点之后,我们无法识别普通彩易福彩质中的任何明显的改变。
      转向粘彩易福彩,我们鉴定了五种不同的粘彩易福彩:三种不同的粘彩易福彩:三种凝胶形成(MUC5B,MUC5AC和MUC6)和两个膜结合的粘彩易福彩(MUC1和MUC16)。除Muc16之外,已经通过粘彩易福彩基因表达的转录分析描述了除MUC16之外的这些粘液(
      • gipson i.k.
      人腹膜围的粘液。
      )。通过针对彩易福彩质骨架的抗体确定的,在整个月经周期中发现了MUC5B粘彩易福彩在整个月经周期中发现(
      • gipson i.k.
      • MOCCIA R.
      • 刺激性S.
      • Argueso P.
      • gargiulo a.r.
      • 山J.A.
      • offner g.d.
      • Keutmann H.T.
      中环宫颈粘液峰的MUC5B粘彩易福彩的量。
      ),Muc5b和muc5ac都存在于孕妇的宫颈粘液塞中(
      • kickstrom c.
      • 戴维斯J.R.
      • Eriksen G.v.
      • veerman e.c.i.
      • Carlstedt I.
      MUC5B是来自人唾液腺,呼吸道和内塞的主要凝胶形成,低聚粘彩易福彩:鉴定糖橡胶和C末端切割。
      )。我们的结果支持前一位概念,即Muc5B是宫颈粘液的主要粘彩易福彩。然而,我们还发现了Muc5Ac粘彩易福彩的肽数量相对较多的肽,表明该粘彩易福彩也以大量存在(表I.)。 agpage中的粘彩易福彩带均未归因于单一粘合剂。这种观察结果与在排卵中增加的MUC5B表达的先前概念(
      • gipson i.k.
      • MOCCIA R.
      • 刺激性S.
      • Argueso P.
      • gargiulo a.r.
      • 山J.A.
      • offner g.d.
      • Keutmann H.T.
      中环宫颈粘液峰的MUC5B粘彩易福彩的量。
      )。这三种凝胶形成粘彩易福彩的功能差异仍然尚不清楚。 MUC5B和MUC6对于腺体均为典型的腺体,而MUC5AC通常在脚杯细胞中发现。目前不了解这些单个粘液在宫颈粘液中的功能重要性。
      鉴定了两个跨膜粘彩易福彩,MUC1和MUC16。 MUC1粘彩易福彩已被研究为子宫上皮的组分(
      • 布莱曼M.
      • 那个A.
      • 卡森D.
      MUC1:生殖组织上皮的多功能细胞表面分量。
      )和与癌症有关,例如乳腺癌和胰腺癌(
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      • Swanson B.J.
      癌症在癌症中:保护和控制细胞表面。
      )。子宫中的muc1表达在孕酮主导的分泌阶段的类固醇激素控制和峰。子宫MUC1以及其他组织中的MUC1的功能作用还不太了解。然而,已经从研究细胞内信号传导的细胞质尾部的研究获得了一些洞察力(
      • 辛格p.k.
      • hollingsworth m.a.
      在信号转导中的细胞表面相关粘液。
      )。最近,细胞外海域结构的结构进一步了解其潜在功能(
      • 澳门B.
      • 约翰逊D.G.A.
      • Hansson G.C.
      • HärdT.
      在膜结合的MUC1粘膜的海域粘合粘合彩易福彩质的自动彩易福彩分解。
      )。切割的海域域名是断点,可能是用于机械力,保护电池的同时,同时可以是机械传感器。鉴定为MUC1的肽均位于海域裂解外部的N-末端部分。这可能表明外部已经与膜锚分离。宫颈粘液muc1不太可能是来自两个彩易福彩质的彩易福彩质(Qggflglsnik)的两种鉴定的肽(补充表S3)。此外,在我们的宫颈样本中鉴定的MUC16粘彩易福彩具有至少62个海域中可能被切割的域之一(
      • 澳门B.
      • 约翰逊D.G.A.
      • Hansson G.C.
      • HärdT.
      在膜结合的MUC1粘膜的海域粘合粘合彩易福彩质的自动彩易福彩分解。
      )。最近克隆了MUC16粘彩易福彩并显示为具有超过22,000个氨基酸的巨琥·粘彩易福彩(
      • 尹b.w.t.
      • DNISTRIAN A.
      • Lloyd K.O.
      卵巢癌抗原Ca125由Muc16粘彩易福彩基因编码。
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      Ca125基因:新发现的糖基化的N-末端结构域的延伸使该细胞外层幕结构的尺寸加倍。
      )。鉴定的大多数肽(补充表S3)除了四个之外,在MUC16序列中发生几次。这种粘彩易福彩是卵巢癌抗原CA125(
      • 尹b.w.t.
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      Ca125卵巢癌抗原的分子克隆。
      )由特异性抗体OC125检测到(
      • 尹b.w.t.
      • DNISTRIAN A.
      • Lloyd K.O.
      卵巢癌抗原Ca125由Muc16粘彩易福彩基因编码。
      )。该抗体已用于宫颈粘液,其阳性染色表明存在MUC16粘彩易福彩的存在(
      • de bruijn h.w.
      • van beeck calkoen-carpay t.
      • jager s.
      • DUK J.M.
      • Aalders J.G.
      • Fleuren G.J.
      肿瘤标志物Ca 125是正常宫颈粘液的常见组分。
      )。同样在我们的实验中,OC125抗体染色了彩易福彩质印迹带,证实了MUC16粘彩易福彩的存在(结果未显示)。关于MUC16粘彩易福彩的正常功能,对宫颈粘液中的作用很少。
      我们没有鉴定对应于先前所示的膜跨越粘膜MUC4的肽在子宫颈的高mRNA水平下表达,相当于MUC5B的水平(
      • gipson i.k.
      • 瘟疫米科德S.
      • MOCCIA R.
      • 詹Q.
      • Toribara N.
      • HO S.B.
      • gargiulo a.r.
      • 山III,J.A.
      MUC4和MUC5B转录物是人体内膜的普遍粘膜信使核糖核酸核糖核核酸。
      )。这种差异的原因仍然不清楚。一种可能的解释可能是MUC4转录物未翻译成彩易福彩质。粘彩易福彩也难以与彩易福彩质组学鉴定,因为大多数肽是糖基化的,因此未在彩易福彩质数据库中鉴定。我们的结果表明,Muc4不是子宫颈中的主要粘合剂。来自同一循环日的还原粘液的复合凝胶上具有不同电泳迁移率的多条带的存在仍未解释(Fig. 3)。彩易福彩质组学结果表明,所有分析的粘彩易福彩条带含有粘彩易福彩的混合物。在所有分析的条带中发现了Muc5b和muc5ac肽。在例如人支气管上皮细胞粘液中也已经观察到与复合凝胶上的多条带类似的图案(
      • 霍尔曼准噶。
      • Karlsson N.G.
      • 阿卜杜拉L.H.
      • randell s.h.
      • Sheehan J.K.
      • Hansson G.C.
      • 戴维斯C.W.
      来自人支气管上皮细胞培养物的粘彩易福彩及其O-聚糖。
      )和唾液粘液(
      • Thomsson K.A.
      • 舒尔茨B.J.
      • 包装机N.
      • Karlsson N.G.
      人类唾液中的MUC5B糖基化反映了血型和分泌者状态。
      ),后者通过糖族存在解释。然而,我们对不同的子宫颈粘彩易福彩带的寡糖分析表明这些具有相似的糖基化。对存在多个粘合剂带的一个可能的解释可以是通过如前所述的彩易福彩质单体之间形成不可可降解键来产生多聚物分子(
      • Axelsson M.A.B.
      • 问人n。
      • Hansson G.C.
      来自LS 174T细胞的O-糖基化的MUC2单体和二聚体是水溶性的,而在生物合成期间形成的较大的MUC2物种是不溶的并且含有不可可获得的分子间键。
      )。在凝胶形成粘膜中切割以及不同粘彩易福彩和糖基化的组合可以加入在复合凝胶上观察到的多个粘合彩易福彩条带。
      O宫颈粘膜的糖粉透露超过50种不同的中性,唾液酸化和硫酸寡糖。我们的结果公开了比以前观察到的更多样化的宫颈粘彩易福彩糖基化。使用传统的生化方法,其它方法以前已经分离和测序排卵期间收集的宫颈分泌物的八个中性和唾液酸寡糖(
      • yurewicz e.c.
      • Matsuura F.
      • Moghissi K.S.
      人中胞外宫颈粘彩易福彩的唾液酸寡糖结构研究。
      ,
      • yurewicz e.c.
      • Matsuura F.
      • Moghissi K.S.
      人中性宫颈粘液中性低聚糖的结构表征。
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      • yurewicz e.c.
      • Moghissi K.S.
      纯化人中腹粘液的纯化及其寡糖的表征,尺寸,组合物和微观偶联性。
      )。我们还确定了这八种组分,尽管我们并不总能够分配唾液酸残基的确切位置。在此分析的受试者是血基O型,并且其中大多数对于分泌器和Lewis是阳性的,如鉴定的低聚糖结构中反映。典型的这些粘彩易福彩寡糖是高度的岩藻糖基化(补充表S4)和血液组H表征的存在。因此,显而易见的是,妇女的血型状态反映在宫颈粘液中,这些粘液可能影响感染易感性的东西。事实上,已经观察到缺乏功能性Fut2岩氧基转移酶的分泌物 - 阴性女性更容易发生复发性 念珠菌白葡萄酒 vaginitis (
      • Kulkarni D.G.
      • Venkatesh D.
      非分泌器状态;阴道念珠菌病的概述因素。
      )。
      在月经周期期间观察到的主要改变在粘合剂中 O - 糖基化。这 O - 在排卵前后在粘彩易福彩中几乎相同,但在排卵中基本上不同。中性低聚糖的相对丰度 相对 在排卵期间增加酸性。改变的一些主要聚糖如图所示 Fig. 6。观察到的特征改变是NeuAc2-6的降低,其在碱中连接到Galnacol和NeuAc2-3至Gal-Galnacol,在排卵中,核心2聚糖的伴随增加(Gal1-3(GLCNAC1-6)Galnacol)通常用岩藻糖替代。这 GLCNAC-6在排卵时通常也硫酸盐。因此,主要的改变可能是核心2 glcNAc转移酶的增加以及唾液酸糖酶的减少。以前使用组织化学和更简单的生物化学方法的研究还提出了排卵期的循环糖基化变化(
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      调节不同荷尔蒙国家宫颈粘液变化的因素。
      )。
      本观察结果使得了解组成和宫颈粘液前进的周期性变化。粘液在排卵前和之后相似,但在中间卷中不同。我们没有观察到粘液中发现的大量小彩易福彩质中的任何差异。相反,最显着的差异是粘彩易福彩糖基化的转变。目前不明白这种转变的生理重要性,但可能会通过物理化学变化或与粘液中的凝集素的相互作用改变改变粘液性能。排卵中的粘液糖基化也可以通过其低唾液酸含量来促进精子渗透。尽管除了粘彩易福彩糖基化之外,粘液的组成似乎是相对常数的,但是例如粘彩易福彩的其他改变可以有助于改变的粘液性能。一个这样一个可能的例子是最近观察到的muc5ac粘彩易福彩的自催化裂解(
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      富含人Muc5Ac粘液的C-末端半胱氨酸的GDPH序列中的裂解。
      ),也需要在宫颈粘液中研究的东西。

      致谢

      我们非常感谢Hasse Karlsson和Thomas Larsson(彩易福彩质组学核心设施)的帮助。 Tiange Lang承认用于编译MUCIN数据库的工作。

      补充材料

      参考

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