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肥胖蛋白质在肥胖和胰岛素抵抗中的羰基化

鉴定脂肪细胞脂肪酸结合蛋白作为4-羟基诺纳的细胞靶标*
  • Paul A. Grimsrud.
    隶属关系
    生物化学系,分子生物物理学,明尼苏达大学,明尼苏达州,明尼苏达州55455
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  • Matthew J. Picklo. Sr.
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    北达科他大学药物,生理学,生理学和治疗学系,北达科他州大叉子大学58203
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  • 蒂莫西J. Griffin
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    生物化学系,分子生物物理学,明尼苏达大学,明尼苏达州,明尼苏达州55455
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  • David A. Bernlohr.
    一致
    应讨论谁的通信:生物化学部,明尼苏达大学的生物化学,分子生物物理学和生物物理学,321教堂圣S E.,明尼阿波利斯,MN 55455。电话。:612-624-2712;传真:612-625-2163
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    生物化学系,分子生物物理学,明尼苏达大学,明尼苏达州,明尼苏达州55455
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了国家卫生大学授予DK053189,明尼苏达农业实验站和明尼苏达肥胖中心(D A B.);由NHLBI,国家健康机构授予T32 HL07741(P a G.);国家卫生研究院拨款ag025371(t j g.);由国家研究资源中心授予P20 RR17699-01,从生物医学研究卓越中心(到M J P.)。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
      肥胖是一种温和炎症的状态与增加的氧化应激相关。通常,促氧化条件导致反应性醛,例如反式-4-羟基-2-壬醛(4-HNE)和反式-4-氧代-2-诺,其涉及各种代谢疾病的发展。为了以肥胖的结果研究4-HNE的蛋白质改性及其与胰岛素抵抗的潜在关系,使用蛋白质组学技术在脂肪组织中鉴定醛改性蛋白质。将来自贫胰岛素敏感和肥胖胰岛素抗性C57BL / 6J小鼠的脂肪蛋白与生物素酰肼孵育并使用辣根过氧化物酶 - 缀合的链霉抗生物素蛋白检测。高碳水化合物,小鼠的高脂肪饲料导致总脂肪蛋白羰基化的〜2-3倍。一致于肥胖症中氧化应激的增加,谷胱甘肽S-转移酶A4(GSTA4)的丰度是肥胖小鼠的脂肪组织中的〜3-4倍的关键酶。为了鉴定特定的羰基化蛋白,使用抗植物 - 琼脂糖亲和层析,蛋白水解消化,并进行LC-ESI MS / MS,捕获来自肥胖小鼠的生物素酰肼改性的脂肪蛋白。鉴定了有趣的酶参与细胞应激响应,脂毒性和胰岛素信号传导,例如谷胱甘肽S-转移酶M1,过氧化锆1,谷胱甘肽过氧化物酶1,真核伸长因子1α-1(EEF1α1)和丝素A.发现脂肪细胞脂肪酸结合蛋白,一种含有胰岛素抗性调节的蛋白质,被发现在体内用4-HNE羰基化。用4-HNE的脂肪细胞脂肪酸结合蛋白的体外改性映射到Cys-117,使用4-HNE的R或S对映体等效地发生,并降低了蛋白质对脂肪酸〜10倍的亲和力。这些结果表明,肥胖症伴随着许多脂肪调节蛋白的羰基化的增加,该蛋白质可以作为增加的氧化应力和胰岛素抗性的发展之间的机械连接。
      反应性氧气(ROS)
      使用的缩写是:ROS,反应性氧物种; a-fabp,脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(也称为ap2); E-FABP,上皮脂肪酸结合蛋白(也称为KLBP或MAL-1); 4-HNE, trans -4-羟基-2-nonenal(也称为4-羟基诺); 4 - 一个, trans -4- oxo-2-nonenal; 1,8-ans,1-苯胺萘萘8-磺酸; PBST,PBS含有0.05%Tween 20; ER,内质网; HRP,辣根过氧化物酶; GSTA4,谷胱甘肽 S - 转移酶A4(也称为GSTA4-4或GSTA4); βME,β-巯基乙醇; JNK,C-Jun N-末端激酶; EEF1α1,真核伸长因子1α-1。
      1使用的缩写是:ROS,反应性氧物种; a-fabp,脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(也称为ap2); E-FABP,上皮脂肪酸结合蛋白(也称为KLBP或MAL-1); 4-HNE, trans -4-羟基-2-nonenal(也称为4-羟基诺); 4 - 一个, trans -4- oxo-2-nonenal; 1,8-ans,1-苯胺萘萘8-磺酸; PBST,PBS含有0.05%Tween 20; ER,内质网; HRP,辣根过氧化物酶; GSTA4,谷胱甘肽 S - 转移酶A4(也称为GSTA4-4或GSTA4); βME,β-巯基乙醇; JNK,C-Jun N-末端激酶; EEF1α1,真核伸长因子1α-1。
      由于细胞中正常代谢过程产生反应性氮物质,包括线粒体中电子传输链的解耦和NADPH氧化酶的过量NADPH的氧化(
      • Finkel T.
      • 霍尔布鲁克N.J.
      氧化剂,氧化应激和老化生物学。
      )。由于促氧化条件增加或抗氧化体系的下降,与抗氧化系统的下降以及各种炎症和代谢疾病状态高,包括阿尔茨海默病,黄斑病变,肺功能障碍和肥胖连接的胰岛素抵抗(
      • 史密斯M.A.
      • rottkamp c.a.
      • nunomura a。
      • Raina A.K.
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      阿尔茨海默病的氧化胁迫。
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      • Winkler B.S.
      • Boulton M.E.
      • GOTTSCH J.D.
      • 斯特恩伯格·斯
      氧化损伤和年龄相关的黄斑变性。
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      严重慢性阻塞性肺病中氧化应激和呼吸肌功能功能障碍。
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      • Nakajima Y.
      • Nakayama O.
      • Makishima M.
      • Matsuda M.
      • Shimomura I.
      肥胖症中氧化应激增加及其对代谢综合征的影响。
      )。尽管氧化应激在疾病机制中的确切作用未得到完全理解,但是已知ROS与细胞中的蛋白质,DNA,碳水化合物和脂质高度反应。膜磷脂的多不饱和酰基链的ROS引发的过氧化可导致霍克切割和随后形成脂质衍生的反应性醛(
      • Uchida K.
      4-羟基-2-NANENAL:氧化应激的产物和介体。
      )。
      由脂质过氧化形成的各种反应性醛, trans -4-羟基-2-nonenal(4-HNE)和 trans -4-Oxo-2-Nonenal(4-一)由于其高丰度和强烈的反应性,对氧化疾病具有显着贡献(
      • Uchida K.
      4-羟基-2-NANENAL:氧化应激的产物和介体。
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      • Benedetti A.
      • Comporti M.
      • Esterbauer H.
      鉴定4-羟基诺,作为源自肝微粒体脂质过氧化的细胞毒性产物。
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      • 李S.H.
      • 布莱尔I.A.
      4-Oxo-2-Nonenal作为脂质过氧化新产物的表征。
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      • Sayre l.m.
      • 林D.
      • 袁Q.
      • 朱克。
      • 唐X.
      从脂质氧化产品产生的蛋白质加合:专注于HNE和一个。
      )。通过将4-HNE特异性地(解毒)通过还原成醇(醛还原酶),氧化成羧酸(醛脱氢酶),或与谷胱甘肽缀合(谷胱甘肽 S - 转移酶)(
      • Honzatko A.
      • Brichac J.
      • 墨菲T.C.
      • 雷伯格A.
      • 库巴托瓦省A.
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      脑线粒体反式4-羟基-2-NANRENAL的对映选择性代谢。
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      • Poli G.
      • Lindahl R.
      醛代谢酶在肝细胞脂质过氧化醛产物中的介导作用中的作用。
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      • Sharma R.
      • 杨Y.
      • 沙姆达A.
      • awasthi s.
      • awasthiy.c.
      谷胱甘肽S转移酶的抗氧化作用:免受氧化毒性的保护和应激介导的细胞凋亡的调节。
      )。然而,一些4-HNE的部分逃离了代谢,并与其他亲核试剂形成了包括蛋白质和DNA的聚核试剂。在蛋白质的情况下,4-HNE与半胱氨酸和组氨酸残留物的侧链和赖氨酸常常反应,尽管较小程度(
      • Carini M.
      • aldini G.
      • Facino r.m.
      用肽和蛋白质检测4-羟基-Trant-2-Nonenal(HNE)加合物的质谱。
      )。尽管在膜中形成反应性脂质,但由于其相对高的溶解度,它可以扩散到细胞质和核中,使其与远离氧化形成初始位点的蛋白质反应(
      • oberley t.d.
      • 丰田
      • szweda l.i.
      羟基诺蛋白质蛋白质加合物在正常人肾脏和选定人肾癌中的定位。
      )。
      已经显示出蛋白质的4-HNE改性对其目标具有各种影响。 4-HNE的烷基化经常抑制酶的活性;实例包括na+ k +-ATPase和NADP.+ - 依赖异偶酯脱氢酶(
      • Miyake H.
      • 卡达尤A.
      • OHYASHIKI T.
      脑Na蛋白质构象的分子刚度增加 + k + - 用4-羟基-2-NAN1AL改性酶。
      ,
      • 杨杰夫。
      • 杨大师。
      • 公园J.W.
      纳迪普斯的失活+ - 脂质过氧化产物的依赖性异柠檬酸脱氢酶。
      )。然而,在某些情况下,已经提出了4-HNE改性以增加关键调节蛋白的活性,例如表皮生长因子受体的二聚化和与配体无关的激活(
      • 刘W.
      • akhand a.a.
      • 加藤米
      • Yokoyama I.
      • Miyata T.
      • KUROKAWA K.
      • Uchida K.
      • Nakashima I.
      4-羟基诺植物触发表皮生长因子受体连接的信号途径,用于生长抑制。
      )或激活NRF2(核因子红细胞2相关因子2)转录因子,导致增加了抗氧化反应中的基因的表达(
      • levonen a.l.
      • 兰德阿
      • Ramachandran A.
      • Ceaser e.k.
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      氧化还原细胞信号传导细胞机制:半胱氨酸改性在控制抗氧化剂响应抗氧化剂防御中的作用,响应亲电泳脂氧化产物。
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      • 刘伦。
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      • 莱珀氏Y.
      • Forman H.J.
      在大鼠上皮型II细胞中通过EPRE / NRF2信号传导γ-谷氨酸转琥珀肽酶通过EPRE / NRF2信号传导诱导。
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      • 西J.D.
      • Marnett L.J.
      脂质过氧化产物,4-羟基-2-壬醛诱导的基因表达的改变。
      )。除了改变酶的活性之外,已经显示出4-HNE烷基化以改变一些蛋白质的降解速率(醇脱氢酶和αB-结晶)(
      • Carbone D.L.
      • Doorn J.A.
      • Petersen D.R.
      4-羟基诺调节醇脱氢酶的26S蛋白酶体降解。
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      • Marques C.
      • Pereira P.
      • 泰勒阿。
      • 梁J.N.
      • reddy v.n.
      • szweda l.i.
      • 尚F.
      透镜上皮细胞中HNE改性蛋白的泛素依赖性溶酶体降解。
      )。
      肥胖关联的胰岛素抵抗最近导致与ER压力的发展和ROS增加有关(
      • Furukawa S.
      • 富士塔T.
      • Shimabukuro M.
      • Iwaki M.
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      • Shimomura I.
      肥胖症中氧化应激增加及其对代谢综合征的影响。
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      • ozcan u.
      • 曹问:
      • yilmaz E.
      • 李阿..
      • Iwakoshi N.N.
      • ozdelen E.
      • 丘脑G.
      • Gorgun C.
      • 粘合剂L.H.
      • Hotamisligil G.S.
      内质网应激链接肥胖,胰岛素作用,2型糖尿病。
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      • HOSTIS N.
      • 罗森e.d.
      • 着陆器E.S.
      反应性氧物种具有多种形式的胰岛素抵抗的因果作用。
      )。从C57BL / 6J小鼠中分离的脂肪细胞具有饮食诱导的肥胖症的反应性氧气(
      • 瓦斯伊。
      • Yarkoni M.
      • Bashan N.
      • Eldar-Finkelman H.
      增加的葡萄糖摄取促进肥胖,胰岛素抗体小鼠的脂肪细胞中的氧化应激和PKC-δ活化。
      )。人和鼠脂肪组织以及培养的3T3-L1脂肪细胞中的氧化应激影响脂联蛋白和肿瘤坏死因子α(
      • Furukawa S.
      • 富士塔T.
      • Shimabukuro M.
      • Iwaki M.
      • 山田Y.
      • Nakajima Y.
      • Nakayama O.
      • Makishima M.
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      • Shimomura I.
      肥胖症中氧化应激增加及其对代谢综合征的影响。
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      • 伯格A.H.
      • Iyengar P.
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      • 梳理T.P.
      • Rajala M.W.
      • 杜X.
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      • Barzilai N.
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      • Brownlee M.
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      脂肪细胞的高血糖诱导的炎症反应:反应性氧物种的作用。
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      • 飙升A.F.
      • 微生物M.
      • Cozzone D.
      • Bernoud-Hubac N.
      • Bouzaidi-tiali N.
      • 拉加德米
      • 格洛恩A.
      氧化应激对3T3-L1脂肪细胞脂联素分泌和乳酸盐产生的影响。
      )。由于脂肪组织分泌的脂肪因子对肝脏和肌肉中的胰岛素敏感性具有显着影响,确定脂肪组织中氧化应激的影响是了解2型糖尿病和全身能量代谢的分子机制的重要步骤
      • 海湾H.
      • 普通话L.
      • defronzo r.a.
      脂肪细胞,游离脂肪酸和异位脂肪在2型糖尿病的发病机制中的作用:过氧化物激素增殖物激活的受体激动剂提供了合理的治疗方法。
      )。用脂质过氧化产物的脂肪蛋白的改性可以是将氧化应激与胰岛素抗性的一种有贡献因子。
      在这项研究中,我们研究了4-HNE和瘦肉和肥胖C57BL / 6J小鼠中的4-HNE和其他醛的修饰。为了实现这一点,使用酰肼化学与蛋白质上的醛合物偶联(
      • Mirzaei H.
      • Regnier F.
      羰基化蛋白的亲和色谱选择,然后使用串联质谱鉴定氧化位点。
      )。生物素酰肼标记允许评估羰基化的相对程度,以及鉴定这种修饰的新靶点,包括脂肪细胞脂肪酸结合蛋白(A-FABP)。

      实验步骤

       化学试剂 -

      EZ-Link Biotin酰肼,FitC-链霉抗生物素蛋白,聚-HRP链霉抗生物素蛋白和免疫纯净固定的单体抗霉素试剂素购自Periers。 4-HNE购自Cayman Chemicals(Ann Arbor,Mi)。兔抗4-HNE抗体购自Alpha Diagnostic International(San Antonio,TX)。小鼠抗谷胱甘肽 S - 从Absova Corp.(台北,台湾)购买 - 转移酶A4(GSTA4)抗体。从Promega购买测序级修饰的胰蛋白酶。内皮蛋白酶Glu-C购自Roche应用科学。从分子探测器购买1-苯胺萘萘8-磺酸(1,8-ANS),Inc.ECL.ECL Western印迹检测试剂购自Amersham Biosciences。 C4 和 C18 拉链尖端移液管和YM10超滤膜购自Millipore(Billerica,MA)。 C18 Seppak墨盒是从水域购买的(Milford,MA)。高脂肪,高碳水化合物饮食F3282购自生物产业(法国人,NJ)。 (R)-4-hne和(S如前所述合成-4-HNE(
      • Honzatko A.
      • Brichac J.
      • 墨菲T.C.
      • 雷伯格A.
      • 库巴托瓦省A.
      • Smoliakova i.P.
      • Picklo Sr.,M.J.
      脑线粒体反式4-羟基-2-NANRENAL的对映选择性代谢。
      )。

        动物-

      C57BL / 6J小鼠在3周龄在3周内断奶,以诱导肥胖连接的胰岛素抵抗(
      • Surwit R.S.
      • kuhn c.m.
      • Cochrane C.
      • mccubbin j.a.
      • FEICLOS M.N.
      饮食诱导的C57BL / 6J小鼠II型糖尿病。
      )。使用这种饲养方案,在12周龄的年龄时,动物表现出使用葡萄糖和胰岛素耐受试验以及夹紧研究(
      • Hertzel A.v.
      • 史密斯L.A.
      • 伯格A.H.
      • Cline G.W.
      • Shulman G.I.
      • Scherer P.E.
      • Bernlohr D.A.
      脂质代谢和脂肪酸结合蛋白核含氟和转基因小鼠的脂质代谢水平。
      )。将动物置于12小时光/暗循环和喂食 自由 继续进入水。通过12周的宫颈位错,每年处死小鼠,并回收附睾脂肪组织。将组织样品分解并在-80℃下储存直至需要。明尼苏达大学机构动物护理和使用委员会批准了所有实验。

       生物素酰肼改性和检测 -

      脂肪组织样品在100米处均质化m sodium acetate, 20 mm NaCl, 0.1 mm EDTA,pH 5.5(偶联缓冲液)补充有0.1米m PMSF,2μg/ mL胃蛋白酶,2μg/ ml抑肽蛋白,2μg/ ml leapeptin。将提取物进行离心(100,000× g 对于1小时,在4℃下,除去浮动脂饼,将可溶性蛋白质级分在-80℃下冷冻直至所需的。使用BCA测定法测定蛋白质浓度。对于醛检测,将提取物(50μg/样品)孵育,终浓度为0.5米m EZ-Link Biotin酰肼(5米m 在DMSO中制备的股票在室温下偶联2小时,通过SDS-PAGE(14%丙烯酰胺)来解决,并转移至PVDF膜。在含有0.05%Tween 20(PBST)的PBS中在4℃下封闭膜,用10mg / ml BSA在PBST中洗涤,并在室温下用FitC缀合的链霉抗生物素蛋白(1:50稀释)在室温下温育1小时或HRP缀合的链霉抗生物素蛋白(1:10,000稀释)。使用FUJI成像仪或ECL检测生物素-IVIDIN相互作用。
      对于蛋白质的4-HNE改性的免疫缩进,在4℃下用10mg / ml BSA在PBST中封闭膜过夜,并在4℃下与抗-4-HNE兔多克隆抗体(1:1,000稀释)孵育16小时在1mg / ml BSA的PBST中。将膜在PBST中洗涤,在室温下与HRP缀合的山羊抗兔二抗(1:10,000稀释)温育1小时,并通过ECL检测免疫反应性。对于A-Fabp或Gsta4的检测,使用抗A-FABP兔多克隆抗体(1:10,000稀释)或抗GSTA4小鼠多克隆抗体(1:2,500)用于初级抗体孵育。 HRP缀合的山羊抗小鼠二抗(1:10,000稀释)专门用于GSTA4检测。对于A-FABP和GSTA4检测,整个程序中使用10mg / ml BSA的阻断条件。

       含羰基化蛋白的富集 -

      将可溶性脂肪组织蛋白(10mg)与0.5米孵育m EZ-LINK-在室温下偶联2小时的Biotin酰肼,并在4℃下详述PBS,pH7.4释放地透析。为了除去非特异性地与琼脂糖结合的蛋白质,最初将提取物在室温下通过1-mL左右琼脂糖4b,并且将流动施加到单体抗霉素柱1小时以最大化结合。用含有0.5的PBS洗涤柱子 m NaCl除去非特异性结合的蛋白质,并通过添加2米洗脱特别结合的蛋白质 M D. -biotin。用氯仿和甲醇沉淀洗脱的蛋白质,在氮气下干燥,并在-20℃下储存直至使用(
      • Wessel D.
      • flugge u.i.
      洗涤剂和脂质存在下稀溶液中蛋白质在稀释溶液中进行定量回收的方法。
      )。

       通过LC-ESI MS / MS鉴定羰基化蛋白质

      将羰基化蛋白质在250μl50μm中溶解m NH4 HCO 3, 1 mm CaCl2,pH8.5(胰蛋白酶消化缓冲液)并用10μg胰蛋白酶在37℃下用10μg胰蛋白酶消化。通过用TFA酸化停止消化,并将样品应用于Seppak C.18 墨盒脱落并去除未消化的蛋白质。用80%乙腈溶液洗脱肽,水中0.1%TFA;干;并以20μl01%的甲酸重构。
      使用先前描述的方法实现LC-MS / MS的肽分析(
      • 谢H.
      • Bandhakavi S.
      • 格里芬T.J.
      评价串联质谱型蛋白质组学复合肽混合物的制备等电焦点:富集血红素瘤粒子粒细胞粒细胞粒子粒子粒细胞群的案例研究。
      ,
      • 谢H.
      • Rhodus n.l.
      • 格里芬r.j.
      • Carlis J.v.
      • 格里芬T.J.
      通过自由流动电泳基肽分离和串联质谱鉴定的人唾液蛋白目录。
      )。简要地将每个20-μl样品加载到浓缩和脱盐的预柱上,然后是c18 在线分析毛细管柱(75μm内径×12cm)。在0.1%甲酸中以0.1%甲酸的线性梯度在60分钟内以〜250nl / min的流速在0.1%甲酸的线性梯度上洗脱,然后在0.1%甲酸中以80%乙腈的等物质洗脱。使用LCQ经典离子阱质谱仪(Finnigan Mat,San Francisco,CA)或LTQ线性离子阱质谱仪系统(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)进行洗脱肽的串联MS分析。对于每个MS测量扫描,为LCQ上的MS / MS选择前三个最丰富的前体离子(
      • 谢H.
      • Bandhakavi S.
      • 格里芬T.J.
      评价串联质谱型蛋白质组学复合肽混合物的制备等电焦点:富集血红素瘤粒子粒细胞粒细胞粒子粒子粒细胞群的案例研究。
      ),在LTQ上选择前四个最强烈的前体离子(
      • 谢H.
      • Rhodus n.l.
      • 格里芬r.j.
      • Carlis J.v.
      • 格里芬T.J.
      通过自由流动电泳基肽分离和串联质谱鉴定的人唾液蛋白目录。
      )。用于每个平台上的数据收集的仪器设置与之前发布的数据收集相同(
      • 谢H.
      • Bandhakavi S.
      • 格里芬T.J.
      评价串联质谱型蛋白质组学复合肽混合物的制备等电焦点:富集血红素瘤粒子粒细胞粒细胞粒子粒子粒细胞群的案例研究。
      ,
      • 谢H.
      • Rhodus n.l.
      • 格里芬r.j.
      • Carlis J.v.
      • 格里芬T.J.
      通过自由流动电泳基肽分离和串联质谱鉴定的人唾液蛋白目录。
      ),Xcalibur 2.0软件用于创建峰值列表。
      通过使用BioWorks 3.2软件和续集搜索算法分析片段和父离,并通过续集搜索算法来鉴定蛋白质(
      • ENG J.K.
      • mccormack a.l.
      • yates j.r.
      一种与蛋白质数据库中氨基酸序列相关的肽串联质谱数据的方法。
      )使用国际蛋白质指数(IPI)鼠标数据库,版本3.03(在搜索时包含42,402个蛋白条目),附加载有逆转的数据库,其中每个蛋白质的逆转序列,以促进错误的阳性率估计(
      • 彭J.
      • eliasj.e.
      • Thororen C.C.
      • Licklider L.J.
      • Gygi S.P.
      多维色谱评价与串联质谱(LC / LC-MS / MS)进行大规模蛋白质分析:酵母蛋白质组。
      )。将蛋氨酸氧化作为可变改性。对于父子离子和1.0进行颗粒离子,将质量耐受设定为2.0,并且特定胰蛋白酶作为允许两个内部错过的裂解的酶。每个肽匹配都被分配了概率得分(p 得分)使用程序肽先知(
      • 凯勒阿。
      • nesvizhskii a.i.
      • Kolker E.
      • Aeberberold R.
      经验统计模型来估计MS / MS和数据库搜索的肽识别的准确性。
      )。概率得分截止值设置为0.2,用于从多次击中(两个或更多个独特肽)和0.90时鉴定的蛋白质,用于单击。使用这些阈值的假阳性率低于1%,如反向数据库搜索所估计,并与我们以前的研究一致(
      • 谢H.
      • 格里芬T.J.
      使用二维线性离子阱进行串联质谱型蛋白质组学的高灵敏度与假肽序列匹配的高敏感性和增加潜力之间的折衷。
      )。

       纯化fabps-

      重组上皮脂肪酸结合蛋白(E-FABP)和A-FABP 大肠杆菌 并如前所述纯化(
      • 凯恩C.D.
      • COE N.R.
      • WANLANDHAM B.
      • Krieg P.
      • Bernlohr D.A.
      重组角质形成细胞脂质结合蛋白(MAL-1)的表达,纯化和配体结合分析,在肿瘤皮肤细胞中发现过表达的细胞内脂质结合。
      ,
      • 徐Z.H.
      • Buelt M.K.
      • Banaszak L.J.
      • Bernlohr D.A.
      脂肪细胞脂质结合蛋白的表达,纯化和结晶。
      )使用酸和protamine硫酸盐分级的组合,然后使用Sephadex G-75进行凝胶过滤色谱。对于E-FABP,使用额外的阳离子交换层析步骤。组氨酸标记的A-FABP(他-A-A-FABP)表达 大肠杆菌 如前所述,通过镍亲和层析和凝胶过滤色谱法纯化(
      • Jenkins-Kruchten a.e.
      • Bennaars-Eiden A.
      • 罗斯J.R.
      • 沉W.J.
      • Kraemer F.B.
      • Bernlohr D.A.
      脂肪酸结合蛋白激素敏感脂肪酶相互作用。脂肪酸依赖于结合。
      )。通过与先前描述的方法从小鼠脂肪组织纯化A-FABP,用于从3T3-L1 adipocytes纯化(
      • Matarese V.
      • Buelt M.K.
      • Chinander L.L.
      • Bernlohr D.A.
      从人和鼠细胞纯化脂肪细胞脂质结合蛋白。
      )。

       MARDI-TOF的体外4-HNE改性的检测

      纯化的E-Fabp与0.5米温育m 在10米的22°C下4-HNE 20分钟m 磷酸钾,150米m NaCl,pH 7.4(标准4-HNE收缩缓冲液)。用100米淬灭反应m β-巯基乙醇(βME),并详尽地透析蛋白质以除去过量的4-HNE和βME。 C4 Ziptips用于抑制样品,并通过MALDI-TOF MS确认E-FAB上的4-HNE加合物的存在。对于A-FABP,将蛋白质与10米的4-HNE一起温育m 磷酸钾,10米m NaCl,pH 7.4(低盐4-HNE收缩缓冲液),并且在通过用TFA酸化停止反应后,在MALDI-TOF靶中发现蛋白质在MALDI-TOF靶中发现ZIPPIP。
      如前所述收集未消化蛋白质的MALDI-TOF光谱(
      • Bennaars-Eiden A.
      • HIGGINS L.
      • Hertzel A.v.
      • kapphahn r.j.
      • Ferrington D.A.
      • Bernlohr D.A.
      体外4-羟基对上皮脂肪酸结合蛋白的共价修饰。抗氧化生物学作用的证据。
      )。简而言之,在50:50乙腈中用锡替酸作为基质(3,5-二甲氧基-4-羟基氨基酸)用SINAPINIC酸产生样品:纳米腈,0.1%TFA。 Bruker Biflex III(Bruker Biosciences,Billerica,MA)配备了n2 激光(337nm,3-ns脉冲长度)和微通道板检测器用于收集线性模式,正极性的数据,其加速潜力为19 kV。通过平均〜200激光射击获得每个光谱。使用单独和双重带电峰进行外部校准的马心细胞色素 c (average mass [MH+],12,361 da)。通过将4-HNE改性蛋白的峰强度除以改性和未改性蛋白的峰强度的总和来估计蛋白质改性的相对量。

       MALDI-TOF MS / MS-对FABP肽的4-HNE改性位点分析

      在标准的4-HNE收益缓冲液中,在室温下将其标记的A-FABP与4-HNE孵育15小时。将蛋白质在4℃下透析,对25米m 碳酸氢铵,pH8.0。将蛋白质与6孵育 m guanidine HCl, 10 mm EDTA, 10 mm DTT在56℃下为1小时,以变性并减少蛋白质。将蛋白质冷却至室温并以20米的最终浓度与碘乙酸一起温育 m 在黑暗中在室温下30分钟。将蛋白质透析到胰蛋白酶消化缓冲液中,并与胰蛋白酶在37℃下孵育15小时,或透析25米m 磷酸钠,pH 7.8(Glu-C消化缓冲液)并在室温下与Glu-C孵育15小时。对于两种酶,使用1:20蛋白酶:蛋白质的比例。用TFA酸化停止消化。用Seppak C脱盐肽18 根据制造商的说明,用α-氰基-4-羟基氨基酸的指示弹药。肽混合物的全部扫描从800〜3500 m/z 在QSTAR XL四极杆飞行时间质谱仪上收集选择离子的串联质谱数据(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA)。 TOF区域加速电压为4 kV,注射脉冲重复率为6.0 kHz。使用20Hz的激光重复率在337nm,~9μJ的337nm,~9μj的激光能量下产生激光脉冲。质谱是阳性模式收集的〜50激光射粉的平均值。使用人血管紧张素II每天进行外部校准(单同步觉[MH+] m/z,1046.5417; Sigma)和肾上腺激素激素片段18-39(单同步率[MH+] m/z,2465.1989; Sigma)。使用分析师QS中的周期性噪声滤波器从MS / MS光谱中减去噪音,并将质心峰值列表提交给吉祥物,并在国家生物技术信息中搜查非冗余(NCBINR)(2006年12月1日) 亩肌肉 数据库(在搜索时包含107,811个蛋白条目),包括4-HNE作为可变改性,具有大规模公差,用于前体离子的0.5,对于片段离子0.5。质心峰值群众从分析师QS导出并使用GraphPad Prism软件进行图表。

       配体结合 -

      使用0.5米温育a-fabpm 室温下的4-HNE 5小时,孵育100米m βME,广泛透析25米m Tris-HCl,pH。 7.4(1,8- ans结合缓冲液)。通过监测蛋白质滴定到500 n时,通过监测荧光的变化来确定天然和4-HNE改性A-FABP的1,8-ANS结合亲和力m 如前所述的1,8-ANS结合缓冲液中的1,8-ANS(
      • 凯恩C.D.
      • Bernlohr D.A.
      用于使用1-苯胺萘8-磺酸的位移的细胞内脂质结合蛋白的简单测定。
      )。分别使用376和472nm的激发和发射波长,每个用于每个4nm的狭缝宽度。使用GraphPad Prism软件进行非线性回归,以将数据拟合到一个站点结合等温物。对于4-HNE处理的蛋白质的等温摩擦为双组分系统,特别是为4-HNE改性物种产生理论结合等温。解离常数(Kd)从非线性回归确定值。

       统计分析-

      所有值表示为平均值±S.E.通过执行双尾学生确定统计学意义 t 试验假设差异不平衡。 p values <0.05被认为是显着的。

      结果

      为了评估瘦和肥胖小鼠的脂肪组织蛋白质上的羰基化的相对程度,将生物素酰肼用作化学标签,以将蛋白质与游离羰基耦合。作为验证生物素酰肼检测羰基化蛋白的能力的初始方法,评估纯化的E-FABP,已知的4-HNE改性的靶标(
      • Bennaars-Eiden A.
      • HIGGINS L.
      • Hertzel A.v.
      • kapphahn r.j.
      • Ferrington D.A.
      • Bernlohr D.A.
      体外4-羟基对上皮脂肪酸结合蛋白的共价修饰。抗氧化生物学作用的证据。
      )。通过MALDI-TOF MS分析蛋白质(蛋白质)时,通过存在156A的质量偏移来确认4-HNE修饰。Fig. 1)。对应于156Da的质量大于E-FABP的质量的峰值在没有与4-HNE的孵育的情况下未检测到(补充图1)。将4-HNE改性和未修饰的E-FABP与生物素酰肼孵育后,通过SDS-PAGE分解样品,转移至PVDF膜,并与FITC-链霉抗生物素蛋白一起温育。如图所示 Fig. 1, 插入 ,生物素酰肼仅改性4-HNE改性的E-FABP而不是天然形式。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1检测E-FABP的4-HNE改性。 纯化的重组小鼠E-FAB与0.5米温育m 4-HNE 体外 ,使用MALDI-TOF MS评估修饰程度。 插入 ,10μg的4-HNE改性和未修饰的E-FABP与生物素酰肼偶联,通过SDS-PAGE分解,转移到PVDF膜中,并用FITC-链霉抗生物素蛋白呈印迹。
      使用最初开发用于检测E-FABP的4-HNE改性的方法,可溶性脂肪蛋白提取物与生物素酰肼偶联,通过SDS-PAGE分解,转移到膜,并用HRP-链霉抗生物素蛋白呈衬垫。反应变量如生物素酰度酰度浓度,温度,蛋白质量和反应时间,以优化内源性羰基化的检测(补充图2)。反应对温度或生物素酰肼浓度相对不敏感,但取决于反应中蛋白质的量。标准条件为0.5米m 选择生物素酰肼,50μg蛋白质,2小时和22℃,用于所有后续的生物素酰肼/ HRP-链霉抗生物素蛋白印迹实验。为了确认生物素酰肼对于醛特别特异,如前用于二硝基苯肼(
      • yan l.j.
      • ORR W.C.
      • Sohal R.S.
      基于十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳,免疫化学检测,等电聚焦和微量序列鉴定氧化蛋白。
      ),用纳米孵育可溶性脂肪蛋白质4 将醛还原给原发性醇。透析后,蛋白质与生物素酰肼偶联并用HRP-链霉抗生物素蛋白呈涂(补充图3)。减少蛋白质的信号强度显着降低,证实来自与生物素酰肼偶联的未更好的蛋白的信号强度主要来自蛋白质上的醛基。
      检查各种组织中羰基化蛋白质的轮廓以及证实由生物素酰肼检测到的内源性羰基化包括4-HNE改性蛋白质,可溶性蛋白质提取物由小鼠眼睛,肺,舌和脂肪组织制备。使用通过SDS-PAGE分辨的标准条件与生物素酰肼偶联,转移至PVDF膜,并用HRP-链霉抗生啶蛋白呈蛋白质,与Biotin酰肼偶联。此外,使用抗4-HNE抗体对平行样品进行免疫化学分析。如图所示 Fig. 2,在各种组织中检测到不同的蛋白质羰基化模式,通常,改性蛋白质的谱相似,尽管生物素酰肼法似乎更敏感并检测到比抗-4-HNE抗体更多的蛋白质。作为酰肼化学已被显示为特异性的羰基(
      • yan l.j.
      • ORR W.C.
      • Sohal R.S.
      基于十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳,免疫化学检测,等电聚焦和微量序列鉴定氧化蛋白。
      ),通过众所周知的4-HNE除了4-HNE之外,由生物素酰肼检测的附加条带可能出现来自其他羰基修改(
      • Uchida K.
      4-羟基-2-NANENAL:氧化应激的产物和介体。
      ,
      • Stadtman e.r.
      蛋白质氧化和老化。
      )。此外,没有用生物素酰肼法观察到由抗4-HNE抗体检测的一些条带,并且可以是经常观察到抗体检测的非特异性反应性的结果(在所有样品中观察到的〜55kDa的黑暗涂片)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2不同鼠组织中羰基化蛋白的检测。 来自眼睛的可溶性提取物(50μg)(E), 肺 (L), 舌头 (T)或脂肪组织(A)与生物素酰肼(使用标准条件)偶联,并通过用HRP-链霉抗生物素蛋白喷射(左侧面板)或用抗-4-HNE抗体免疫印迹(右侧面板)检测羰基化蛋白质。另外的样品尚未与生物素酰肼( - BH. [是否对对照进行HRP-链霉抗生物素蛋白。蛋白质标准的分子量(KDA)显示在 剩下 .
      为了研究肥胖症中蛋白质的羰基化程度,通过SDS-PAGE分辨,转移到PVDF膜的生物素酰肼,与生物素酰肼偶联,转移到PVDF膜,转移到PVDF膜的溶解量(50μg)来自生物素酰肼组织的溶于量(50μg)的可溶性蛋白质。 -streptavidin(Fig. 3 A)。用密度测定法(标准化为总蛋白质)的信号强度的定量增加(p <0.05)来自肥胖小鼠的样品中蛋白质(〜2-3倍)的羰基化相对于贫苯甲酸盐( 图3B. )。这一发现与汗衫报告的人同意 等等。 (
      • 瓦斯伊。
      • Yarkoni M.
      • Bashan N.
      • Eldar-Finkelman H.
      增加的葡萄糖摄取促进肥胖,胰岛素抗体小鼠的脂肪细胞中的氧化应激和PKC-δ活化。
      与对照细胞喂养的动物相比,谁测量了高脂肪喂养小鼠的脂肪细胞中的脂肪细胞中的2倍。与高脂肪喂食小鼠的脂肪组织中的RO增加一致,来自肥胖动物的提取物的减少3-4倍(p <0.05)在GSTA4蛋白与精益动物相比(Fig. 4)。 GSTA4催化4-HNE至谷胱甘肽的迈克尔(4-HNE为底物的特异性),其降低的丰度可能有助于来自高脂肪喂食小鼠的脂肪组织中的反应性醛的增加(
      • 杨Y.
      • 特伦特M.B.
      • 他是
      • 舔S.D.
      • Zimniak P.
      • awasthiy.c.
      • Boor P.J.
      谷胱甘肽-S-转移酶A4-4调节内皮中的氧化应激:人类动脉粥样硬化中可能的作用。
      ,
      • 煽动M.R.
      • 辛格S.P.
      • Czernik p.j.
      • 棒子D.
      • montague d.c.
      • Ceci J.D.
      • 杨Y.
      • awasthi s.
      • awasthiy.c.
      • Zimniak P.
      Mgsta4-4的生理作用,谷胱甘肽S-转移酶代谢4-羟基宁:Mgsta4零鼠的产生和分析。
      )。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3来自瘦和肥胖小鼠的脂肪组织中蛋白质的羰基化。A,来自瘦脂肪组织的可溶性蛋白质(50μg)(L)和肥胖(O)小鼠与生物素酰肼偶联,通过SDS-PAGE分解,转移至PVDF,并用HRP-链霉抗生物素蛋白呈印蛋白。蛋白质的分子量(KDA)显示在 剩下 . B,相对羰基化(表示为肥胖小鼠的平均值的百分比)从印迹中确定 A 通过密度测定法(归一化至总蛋白质)。值表示为平均值±s.e. (n = 3; *, p < 0.05).
      图缩略图GR4.
      Fig. 4瘦弱的小鼠GSTA4的蛋白质水平。 通过SDS-PAGE分解来自瘦酵母组织的可溶性蛋白质(50μg),转移到PVDF,并用抗GSTA4抗体免疫。通过密度测定法(标准化为总蛋白质)测定相对丰度(表明瘦小鼠的平均值的百分比)。值表示为平均值±s.e. (n = 8; *, p < 0.05). 插入 ,代表瘦肉(L)和肥胖(O)来自抗GSTA4免疫印迹的样品。
      为了鉴定靶醛改性的蛋白质,来自肥胖小鼠的可溶性脂肪蛋白与生物素酰肼偶联并通过固定化的单体抗素通过亲和层析富集。用生物素洗脱结合的蛋白质,用胰蛋白酶消化并进行LC-ESI MS / MS。通过分析母体和片段离子来鉴定蛋白质(补充图4)使用续集。使用“实验程序”下描述的续集参数进行筛选所有数据。实验在多次进行并在没有生物素酰肼偶联的情况下重复以控制抗霉素柱的非特异性富集。除去没有生物素酰肼偶联的富集的所有蛋白质后,产生了作为脂肪组织中醛改性靶标的可溶性蛋白质列表( 表I. )。与角蛋白,血清蛋白,胰蛋白酶和假想蛋白相匹配的肽也从列表中取出。将所鉴定的蛋白质分选到以下簇中:碳水化合物和脂质代谢,信号转导,抗氧化酶/细胞应激响应,核酸代谢,蛋白质合成/劣化和结构/电动机蛋白。特别值得注意的是A-FABP / AP2,细胞质脂肪酸载体蛋白和多烯族脂质结合蛋白的成员,其包括先前表征的E-FABP(
      • Bennaars-Eiden A.
      • HIGGINS L.
      • Hertzel A.v.
      • kapphahn r.j.
      • Ferrington D.A.
      • Bernlohr D.A.
      体外4-羟基对上皮脂肪酸结合蛋白的共价修饰。抗氧化生物学作用的证据。
      )。
      表I. 脂肪组织中羰基化蛋白的鉴定
      因为发现了a-fabp是一个 体内 通过LC-ESI MS / MS在脂肪组织中醛修饰的靶标,使用来自A-FABP-NULL小鼠的脂肪提取物确认用4-HNE(Fig. 5)。通过生物素酰肼偶联/ HRP-链霉抗生物素素印迹对来自野生型小鼠的可溶性脂肪蛋白提取物进行醛检测,在〜15kDA下检测到突出的修饰蛋白质,其在蛋白质萃取小鼠中不存在。当将这些相同的样品与抗4-HNE抗体进行免疫印迹时,观察到类似的结果。为了进一步验证A-FABP是4-HNE修改的目标 体内 ,从小鼠脂肪组织中纯化蛋白质。生物素酰肼/链霉抗生物素蛋白印迹和免疫印迹与抗4-HNE抗体证实,用4-HNE改性A-FABP 体内 (Fig. 5 )。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5 体内 羰基化和4-HNE改性A-FABP。 剩下 ,来自A-FABP NULL( - / - )和野生型脂肪组织的可溶性蛋白质(50μg)( WT. )使用生物素酰肼偶联或免疫化学使用抗-4-HNE和抗A-FABP抗血清来评估小鼠。 正确的 ,从鼠脂肪组织中纯化A-FABP并进行平行分析。
      确定化学计量 体内 使用指向4-HNE和A-FABP的抗体的4-HNE改性A-FABP,使用抗体和FABP的定量免疫印迹(补充图5)。通过测定组织提取物中的总A-FABP和4-HNE改性的A-FABP的浓度,计算用肥胖小鼠脂肪组织改性的A-FABP的级分。通过免疫缩进A-FABP或4-HNE改性的A-FABP,估计通过肥胖小鼠的脂肪组织中的4-HNE改变6-8%的A-FABP。鉴于A-FABP的总丰度为〜250μ m in adipocytes (
      • Matarese V.
      • Buelt M.K.
      • Chinander L.L.
      • Bernlohr D.A.
      从人和鼠细胞纯化脂肪细胞脂质结合蛋白。
      ),估计4-HNE改性蛋白的浓度为15-20μm.
      为了进一步表征用4-HNE的A-FAB的改性,将纯化的蛋白质与0.5米温育m (R )- 或者 ( S)-4-HNE或50:50的外消旋混合物用于各种时间长度,使用MALDI-TOF质谱法评估改性程度(线性模式)。如图所示 Fig. 6,蛋白质的改性程度之间没有统计学差异(R )- 或者 ( S)-4-HNE与外消旋混合物相比。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6通过4-HNE对映体的体外改性A-FABP。 将纯化的A-Fabp与0.5米温育m (R)-4-hne,(S)-4-HNE,或50:50外消旋混合物。经过各种时间点,对蛋白质进行MALDI-TOF MS分析。从光谱峰强度估计4-HNE修饰的相对程度。实验是一式三份完成的 误差酒吧 显示。 广场 represent (R )-4-hne, represent (S)-4-hne,和 钻石 表示50:50外消旋混合物。
      识别A-FABP的4-HNE改性的部位 体外 , 他的 6 - 用4-HNE温育和用胰蛋白酶或Glu-C促进A-Fabp,并将所得肽进行MALDI-TOF MS / MS分析(
      • Jenkins-Kruchten a.e.
      • Bennaars-Eiden A.
      • 罗斯J.R.
      • 沉W.J.
      • Kraemer F.B.
      • Bernlohr D.A.
      脂肪酸结合蛋白激素敏感脂肪酶相互作用。脂肪酸依赖于结合。
      )。 这 m/z 初始MS光谱中的丰富离子的值证明了Glu-C的Fabp序列覆盖率为47.7%,胰蛋白酶的73.5%(数据未显示)。对于胰蛋白酶和glu-C消化,父母离子 m/z 分离与用4-HNE(胰蛋白酶1076.5和Glu-C的胰蛋白酶107.5和1628.8)改性的Cys-117的肽对应的值并进行碎片以产生MS / MS光谱(Fig. 7)。 MS / MS光谱中的许多离子观察到与用4-HNE改性的CYS-117的肽预测的碎片模式中的那些(表二)。在碰撞诱导的解离过程中,4-HNE修饰本身似乎经历显着的中性损失片段(标记为[M + H]+1 - 156用于母离子和*用于片段离子的* Fig. 7),在4-HNE改性肽的MS / MS分析期间常见的事件(
      • Carbone D.L.
      • Doorn J.A.
      • Kiebler Z.
      • Sampey B.P.
      • Petersen D.R.
      通过4-羟基-2-NONENAL抑制HSP72介导的蛋白质重折叠。
      ,
      • Carbone D.L.
      • Doorn J.A.
      • Kiebler Z.
      • ickes b.r.
      • Petersen D.R.
      慢性酒精性肝病大鼠模型中4-羟基的热休克蛋白90改变。
      )在某些情况下形成具有4-HNE修饰的父母和片段离子,并在其他情况下缺席。存在 b 离子104.0和260.1 m/z 在Glu-C消化肽的光谱中( 图7A 标记为 b1b1*)验证4-HNE修改是否为CYS-117 m/z 值对应于n终端 b1 仅由半胱氨酸组成的离子,没有添加4-hne。 104.0 m/z 峰值表示未修饰的Cys-117,其中260.1 m/z 峰值代表与4-HNE改性相同的半胱氨酸,完整,额外的156 m/z 单位。此外还有156个 m/z 单位只是看到了 b 用于胰蛋白酶肽的离子,其中Cys-117是给定片段的一部分(指示Cys-117的4-HNE改性的离子以粗体显示 表二)。没有发现含有Cys-117的碎片有4-HNE加合物,并且没有检测到任何其他4-HNE改性的肽以进行消化。 a-fabp没有组氨酸残留物,只有一个额外的半胱氨酸,Cys-1,使其成为唯一的候选人作为潜在的部位 体外 4-HNE改性。虽然离子有 m/z 对于胰蛋白酶和Glu-C,检测到未改性(用碘乙酸烷基化)状态的肽对应于具有Cys-1的肽的值,在每种情况下,不存在用于4-HNE改性肽的相应离子。用4-HNE的赖氨酸的反应性比半胱氨酸或组氨酸的反应弱得越低,并且我们发现在可检测水平下没有赖氨酸改性的证据。此外,MS / MS光谱 Fig. 7 被提交给吉祥物以使用4-HNE作为可变修改以无偏见的方式搜索鼠标数据库。对于胰蛋白酶和Glu-C消化,来自A-Fabp的Cys-117静脉改性肽是胰蛋白酶的分子量搜索得分的顶部评分序列与Glu-c的39(其中分子量搜索)得分大于32表示身份或广泛的同源性 p < 0.05) (
      • Pappin D.J.
      • HOJRUP P.
      • bleasby a.j.
      通过肽质量指纹快速鉴定蛋白质。
      )。这种证据表明Cys-117是A-FABP上4-HNE改性的部位 体外 .
      图缩略图GR7.
      Fig. 74-HNE改性A-FABP肽的MS / MS光谱。 用0.5米改性A-FABPm 4-HNE 体外 并用glu-c蛋白酶消化(A)或胰蛋白酶(B)。在每种情况下,离子 m/z 对应于预测的4-HNE改性肽分离并进行碎片化。两者都是[m + h]+1 对应于4-HNE改性肽的母离子峰以及对应于4-HNE的中性损失的峰值([M + H]+1 - 156)标记。这 by 观察到的离子标记为几个观察到的 a 离子,一个精氨酸残基的甲基离子(IMM。 arg。)和对应于水损失的离子( - H2O)。表现出4-HNE中性损失的片段离子是用的 星号 (*).
      表二在4-HNE改性的A-FABP肽的MS / MS碎片中观察到的离子
      验证Cys-117是 体内 修改的部位(以及与4-HNE的蛋白质的反应性同意 体外 ),用Glu-C消化小鼠脂肪组织的A-FABP并进行MALDI-TOF MS。获得的光谱具有67.9%的A-FABP的序列覆盖率。峰值在1641.8和1530.6 m/z 被检测到,对应于含有Cys-1(乙酰化)和用碘乙酸烷基化的Cys-117的未修饰的肽。尽管对应于用4-HNE或4-1改性的Cys-1的肽对应观察到峰,但是在1626.6,1627.6和1628.6的峰簇中改性的肽 m/z (信号:每个峰值的4和5之间的噪声)被观察到(补充图6)并与理论单位素缺陷一致 m/z 用4-一(1626.8)和4-HNE(1628.8)改性的Cys-117预测的Glu-C肽的值。虽然目前尚不清楚1628.6 m/z 峰是同位素包络的一部分,用于单异点峰值在1626.6 m/z (作为1627.6峰值可能是)或是它是独立修改的结果,这些 m/z 值与在此观察到的修饰的GLU-C肽一致 体外 studies (表二)。此外,在控制Glu-C中不存在此峰簇 大肠杆菌 - 抑制的重组A-FABP,其具有74.0%的A-FABP的序列覆盖,并包含与用碘乙酸烷基化的Cys-117对应的峰值对应的峰(数据未显示)。
      为了探讨4-HNE改性A-FABP对其脂肪酸结合活性的影响,用4-HNE改性重组蛋白,并监测替代荧光配体1,8-α的结合(
      • 凯恩C.D.
      • Bernlohr D.A.
      用于使用1-苯胺萘8-磺酸的位移的细胞内脂质结合蛋白的简单测定。
      )。 Fig. 8 显示本地和4-HNE改性蛋白的结合等温线,其具有展示a的天然a-fabp Kd of 2.05 ± 0.17 μm 和4-HNE改性的A-FABP展出 Kd of 23.20 ± 4.18 μm (p < 0.05).
      图缩略图GR8.
      Fig. 84-HNE改性A-FABP对1,8-ANS结合的影响。 用或没有0.5米改进后m 4-HNE,将FABP滴定为1,8- ans,并根据监测荧光的变化来计算结合等温。实验一式三份完成,所示结果是三次试验的代表。 广场 代表未经处理的A-FABP,和 三角形 代表4-HNE改性的A-FABP。

      讨论

      肥胖症和2型糖尿病与ER压力的增加相关(
      • Furukawa S.
      • 富士塔T.
      • Shimabukuro M.
      • Iwaki M.
      • 山田Y.
      • Nakajima Y.
      • Nakayama O.
      • Makishima M.
      • Matsuda M.
      • Shimomura I.
      肥胖症中氧化应激增加及其对代谢综合征的影响。
      ,
      • ozcan u.
      • 曹问:
      • yilmaz E.
      • 李阿..
      • Iwakoshi N.N.
      • ozdelen E.
      • 丘脑G.
      • Gorgun C.
      • 粘合剂L.H.
      • Hotamisligil G.S.
      内质网应激链接肥胖,胰岛素作用,2型糖尿病。
      )和增加ROS(
      • Furukawa S.
      • 富士塔T.
      • Shimabukuro M.
      • Iwaki M.
      • 山田Y.
      • Nakajima Y.
      • Nakayama O.
      • Makishima M.
      • Matsuda M.
      • Shimomura I.
      肥胖症中氧化应激增加及其对代谢综合征的影响。
      ,
      • ozcan u.
      • 曹问:
      • yilmaz E.
      • 李阿..
      • Iwakoshi N.N.
      • ozdelen E.
      • 丘脑G.
      • Gorgun C.
      • 粘合剂L.H.
      • Hotamisligil G.S.
      内质网应激链接肥胖,胰岛素作用,2型糖尿病。
      )。对胰岛素抗性的一种可能的肥胖因子是氧化应激诱导的脂质过氧化,并通过反应性醛如4-HNE和4-一剂改性蛋白质。为了深入了解脂肪蛋白的羰基化程度,将生物素酰肼用作具有游离醛基团的蛋白质的亲和标签(
      • Mirzaei H.
      • Regnier F.
      羰基化蛋白的亲和色谱选择,然后使用串联质谱鉴定氧化位点。
      )。而其他研究表明氧化应激标记物如丙二醛和ROS测量(
      • Furukawa S.
      • 富士塔T.
      • Shimabukuro M.
      • Iwaki M.
      • 山田Y.
      • Nakajima Y.
      • Nakayama O.
      • Makishima M.
      • Matsuda M.
      • Shimomura I.
      肥胖症中氧化应激增加及其对代谢综合征的影响。
      ,
      • 瓦斯伊。
      • Yarkoni M.
      • Bashan N.
      • Eldar-Finkelman H.
      增加的葡萄糖摄取促进肥胖,胰岛素抗体小鼠的脂肪细胞中的氧化应激和PKC-δ活化。
      )据我们所知,这是脂肪组织中与肥胖有关的脂肪组织中直接蛋白质修饰的第一个报告。伴随高脂肪饲料的蛋白质羰基化的〜2-3倍增加同意其他氧化应激测量(
      • 瓦斯伊。
      • Yarkoni M.
      • Bashan N.
      • Eldar-Finkelman H.
      增加的葡萄糖摄取促进肥胖,胰岛素抗体小鼠的脂肪细胞中的氧化应激和PKC-δ活化。
      )。此外,在肥胖小鼠的脂肪组织中鉴定了37种醛修饰的靶标。
      我们在本研究中鉴定的几种蛋白质以前报道以前是羰基化的或4-HNE-在其他系统中进行4-HNE改性。甘油醛-3-磷酸脱氢酶和谷胱甘肽 S - 转移酶M1已被证明是4-HNE的靶标(
      • GELFI C.
      • de Palma S.
      • RIPAMONTI M.
      • Eberini I.
      • 等待R.
      • Bajracharya A.
      • Marconi C.
      • 施耐德A.
      • Hoppeler H.
      • Cerretelli P.
      藏人高度适应的新方面:蛋白质组学方法。
      )。此外,二氢嘧啶酶相关蛋白2已被证明是在阿尔茨海默病患者的脑中被羰基化,并且在用过氧化氢处理时发现三糖 - 磷酸异构酶1在酵母中被羰基化(
      • CASTECNA A.
      • Aksenov M.
      • Thongboonkerd V.
      • Klein J.B.
      • 刺穿下
      • 酒R.
      • Markesbery W.R.
      • Butterfield D.A.
      阿尔茨米尔疾病脑中氧化改性蛋白的蛋白质组学鉴定。第二部分:二氢嘧啶素酶相关蛋白2,β-烯醇酶和热休克同源71。
      )。随着我们发现在脂肪和其他组织中用生物素酰肼和抗4-HNE抗体检测蛋白质之间的相似之处,我们假设通过生物素酰肼偶联的富集鉴定的许多蛋白质是4-HNE改性(Fig. 2)。然而,由于氨基酸侧链氧化和其他脂质过氧化产物也可以导致蛋白质上的醛基(
      • Uchida K.
      4-羟基-2-NANENAL:氧化应激的产物和介体。
      ,
      • Stadtman e.r.
      蛋白质氧化和老化。
      ),需要进行额外的研究以确认当我们为FABP所做的每种特定蛋白质上存在的修饰类型。
      从该实验室的工作表明,E-FABP是视网膜4-HNE改性的目标,并且修饰位点是Cys-120(对应于A-Fabp中的Cys-117)(
      • Bennaars-Eiden A.
      • HIGGINS L.
      • Hertzel A.v.
      • kapphahn r.j.
      • Ferrington D.A.
      • Bernlohr D.A.
      体外4-羟基对上皮脂肪酸结合蛋白的共价修饰。抗氧化生物学作用的证据。
      )。 a-fabp和e-fabp是细胞内脂肪酸结合蛋白质多核家族的构件,共用〜60%的氨基酸同一性,并且具有基本上可叠加的二级和三级结构(
      • Hohoff C.
      • Borchers T.
      • Rosow B.
      • Spener F.
      • van tilbeurgh H.
      重组人表皮型脂肪酸结合蛋白的表达,纯化和晶体结构测定。
      ,
      • gutierrez-gonzalez l.h.
      • Ludwig C.
      • Hohoff C.
      • Rademacher M.
      • Hanhoff T.
      • Ruterjans H.
      • Spener F.
      • 卢克C.
      人表皮型脂肪酸结合蛋白(E-FABP)的溶液结构和骨干动力学。
      )。 Fabp Multigene系列的定义特征是一种大型内部充水腔,用作疏水性配体结合结构域。与A-Fabp的脂质结合发生在具有由Arg-106,Arg-126和Tyr-128配位的羧基的定义的脂肪酸结合位点内发生羧基(
      • Reese-Wagoner A.
      • 汤普森J.
      • Banaszak L.
      脂肪细胞脂质结合蛋白的结构性质。
      )。对于疏水探针1,8-ANS的4-HNE改性A-FABP的结合亲和力降低(Fig. 8)同意CYS-117作为修改的网站(Fig. 7)并且与A-FABP APO-和全蛋白酶形式的各种晶体和NMR研究一致。在各种脂肪酸结合形式(棕榈酸盐,硬脂酸盐和arachidonate)中A-Fabp的X射线晶体分析表明C 3 to C6 绑定的脂质区域位于Cys-117附近(
      • Lalonde J.M.
      • Bernlohr D.A.
      • Banaszak L.J.
      脂肪细胞脂质结合蛋白的X射线晶体结构与棕榈酸盐和十六烷磺酸络合。腔粘结位点的性质。
      ,
      • 徐Z.
      • Bernlohr D.A.
      • Banaszak L.J.
      脂肪细胞脂质结合蛋白为1.6-Å分辨率。食用素的晶体结构和结合饱和和不饱和脂肪酸。
      ,
      • Lalonde J.M.
      • Levenson M.A.
      • Roe J.J.
      • Bernlohr D.A.
      • Banaszak L.J.
      脂肪细胞脂质结合蛋白与花生酸络合。滴定热量测定和X射线晶体研究。
      )。此外,Cys-117的化学改性 体外 通过巯基试剂的电池降低了A-Fabp对脂肪酸的亲和力,并且脂肪酸结合减毒Cys-117改性(
      • Buelt M.K.
      • Bernlohr D.A.
      巯基试剂的修饰脂肪细胞脂质结合蛋白及脂肪酸结合结构域的分析。
      )。在本研究之前,据信只有长而长的链脂肪酸被认为在腔内结合(
      • 凯恩C.D.
      • Bernlohr D.A.
      用于使用1-苯胺萘8-磺酸的位移的细胞内脂质结合蛋白的简单测定。
      )。该报告意味着FABP的配体结合特异性比以前认为和延伸到中链醛。将来将有趣的是,确定睾丸FABP是否具有相同的结构保守的半胱氨酸残基,也是4-HNE改性的。
      存在含有离子的峰的存在 m/z 1626.6和1628.6在MALDI-TOF MS谱中 体内 用glu-c消化的纯化a-fabp(补充图6)与Cys-117的发现是一致的 体外 修改现场(Fig. 7)。进一步支持 体内 在Cys-117进行修饰,重组消化 大肠杆菌 - 一个 - fabp( 大肠杆菌 缺乏用于4-一和4-HNE合成的大量多不饱和脂肪酸底物)揭示了这些中没有峰簇 m/z 价值观。 A-Fabp的改性物种的重要部分并不奇怪 体内 除了4-HNE之外,可以在Cys-117下用4-α(符合1626.6峰)烷基化(符合1628.6峰)。因为4-on含有相对于4-HNE的羟基的电气酮酮功能,因此已经测量了比4-HNE更具反应性(
      • Doorn J.A.
      • Petersen D.R.
      脂质过氧化产物4-羟基-2-壬酯和4-氧代-2-壬比的共价修饰氨基酸亲核试剂。
      )。
      以前表明,A-FABP在小鼠中具有胰岛素抵抗力的作用(
      • Hertzel A.v.
      • 史密斯L.A.
      • 伯格A.H.
      • Cline G.W.
      • Shulman G.I.
      • Scherer P.E.
      • Bernlohr D.A.
      脂质代谢和脂肪酸结合蛋白核含氟和转基因小鼠的脂质代谢水平。
      ),与野生型C57BL / 6J凋落物相比,A-Fabp-null小鼠相对胰岛素敏感性。鉴于此,4-HNE的共价结合可以促进全蛋白质结构,模拟脂肪酸结合状态。由于A-FABP和激素敏感脂肪酶的相互作用先前被显示为依赖于脂肪酸(
      • Jenkins-Kruchten a.e.
      • Bennaars-Eiden A.
      • 罗斯J.R.
      • 沉W.J.
      • Kraemer F.B.
      • Bernlohr D.A.
      脂肪酸结合蛋白激素敏感脂肪酶相互作用。脂肪酸依赖于结合。
      ),用4-HNE改性A-FABP的水平可能对脂肪细胞的脂肪分解产生显着影响。在这项研究中,估计6-8%的A-FABP在肥胖小鼠的脂肪组织中用4-HNE进行修饰。由于脂肪组织中a-fabp的高水平表达(250μm),这种看似适度的部分被修饰将积累到相对高的浓度(
      • Miyake H.
      • 卡达尤A.
      • OHYASHIKI T.
      脑Na蛋白质构象的分子刚度增加 + k + - 用4-羟基-2-NAN1AL改性酶。
      ,
      • 杨杰夫。
      • 杨大师。
      • 公园J.W.
      纳迪普斯的失活+ - 脂质过氧化产物的依赖性异柠檬酸脱氢酶。
      ,
      • 刘W.
      • akhand a.a.
      • 加藤米
      • Yokoyama I.
      • Miyata T.
      • KUROKAWA K.
      • Uchida K.
      • Nakashima I.
      4-羟基诺植物触发表皮生长因子受体连接的信号途径,用于生长抑制。
      ,
      • levonen a.l.
      • 兰德阿
      • Ramachandran A.
      • Ceaser e.k.
      • dickinson d.a.
      • Zanoni G.
      • 明天J.D.
      • 达利 - Usmar V.M.
      氧化还原细胞信号传导细胞机制:半胱氨酸改性在控制抗氧化剂响应抗氧化剂防御中的作用,响应亲电泳脂氧化产物。
      ,
      • 张H.
      • 刘H.
      • dickinson d.a.
      • 刘伦。
      • e-metlethwait
      • 莱珀氏Y.
      • Forman H.J.
      在大鼠上皮型II细胞中通过EPRE / NRF2信号传导γ-谷氨酸转琥珀肽酶通过EPRE / NRF2信号传导诱导。
      ,
      • 西J.D.
      • Marnett L.J.
      脂质过氧化产物,4-羟基-2-壬醛诱导的基因表达的改变。
      μm 在肥胖的小鼠中修饰的a-fabp)。在瘦和肥胖小鼠中修饰A-Fabp的相对范围与总蛋白质羰基化的〜2-3倍增加一致(Fig. 3),通过改变激素敏感的脂肪酶活性,可以部分地有助于肥胖症的胰岛素抗性的增加。
      a-fabp的潜在作用是抗氧化蛋白,在细胞中清除4-hne(
      • Bennaars-Eiden A.
      • HIGGINS L.
      • Hertzel A.v.
      • kapphahn r.j.
      • Ferrington D.A.
      • Bernlohr D.A.
      体外4-羟基对上皮脂肪酸结合蛋白的共价修饰。抗氧化生物学作用的证据。
      )。谷胱甘肽是针对4-HNE的良好表征抗氧化剂,已被证明是对(S)-4-HNE在其GST催化的迈克尔加合物形成(
      • Hiratsuka A.
      • Tobita K.
      • 锡达赫
      • Sakamoto Y.
      • Nakano H.
      • ogura K.
      • Nishiyama T.
      • Watabe T.
      (S)尿肝谷胱甘肽S-转移酶同种型对4-羟基-2(e) - NoneNal对映异构体的 - 豚鼠和大鼠。
      )。 A-FABP与4-HNE的对映体的组成的事实表明,这种4-HNE清除的作用不会与谷胱甘肽的那种完全重叠。由于4-HNE的两个立体异构体形成在细胞中,FABP与(R)-4-HNE可能是调节自由4-HNE浓度的重要途径。
      本研究中鉴定的其他几种蛋白质作为羰基化靶标可能有助于胰岛素抵抗和炎症。过洛昔洛蛋白1和谷胱甘肽过氧化物酶1的良好表征作用是在细胞中还原氢过氧化物,包括脂质氢过氧化物(
      • 木Z.A.
      • 施罗德E.
      • 罗宾哈里斯J.
      • Poole L.B.
      过氧杂志的结构,机制和调节。
      ,
      • DREVET J.R.
      抗氧化谷胱甘肽过氧化物酶家族和精子:一个复杂的故事。
      )。然而,通过控制蛋白质和脂质的氧化还原状态,还显示过氧化毒素和谷胱甘肽过氧化物酶对信号转导途径的调节很重要。具体地,NFκB的核定位,已知通过对脂肪表达有助于脂肪组织中胰岛素抗性的应激活化转录因子,部分通过过洛昔洛辛和谷胱甘肽过氧化物酶蛋白(
      • 康S.W.
      • Chae H.Z.
      • SEO M.S.
      • 金库克。
      • 贝恩斯I.C.
      • Rhee S.G.
      哺乳动物过氧杂志同种型可以减少对生长因子和肿瘤坏死因子-α产生的过氧化氢。
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      • jin d.y.
      • Chae H.Z.
      • Rhee S.G.
      • Jeang K.T.
      NF-κB活化中新型人硫氧化酶过氧化物酶的调节作用。
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      • Kretz-Remy C.
      • Mehlen P.
      • mirault m.e.
      • Arrigo A.P.
      谷胱甘肽过氧化物酶过表达抑制IκB-α磷酸化和降解及后续NF-κB活化。
      )。此外,存在活性位点半胱氨酸(过氧化锆1)和硒细胞(谷胱甘肽过氧化物酶)残基的存在使得这些酶的强烈候选者通过用4-HNE烷基化而灭活,这可能在激活肥胖症中的NFκB应激反应方面发挥作用。此外,谷胱甘肽 S - 转移酶和醛脱氢酶家族成员是针对4-HNE和其他亲电子脂质的重要抗氧化剂(
      • Uchida K.
      4-羟基-2-NANENAL:氧化应激的产物和介体。
      )。通过改性的潜在失活可能通过扩增肥胖症中的氧化应激来有助于细胞应激。
      已显示肌动蛋白长丝结合蛋白丝丝素A与胰岛素受体相互作用并抑制胰岛素信号转导(
      • 他H.J.
      • kole s.
      • kwon y.k.
      • 乌鸦M.T.
      • 伯尼尔M.
      丝素A与胰岛素受体的相互作用改变了促丝蛋白激活蛋白激酶途径的胰岛素依赖性活化。
      )。菲素蛋白A与脂质的改性如4-HNE可能有助于其定位于质膜,增加与胰岛素受体的相互作用和抑制胰岛素作用。 Calumenin,一种涉及ER中钙通量调节的蛋白质,也是羰基化的有趣靶标,因为已经表明ER应力在肥胖症中激活(
      • ozcan u.
      • 曹问:
      • yilmaz E.
      • 李阿..
      • Iwakoshi N.N.
      • ozdelen E.
      • 丘脑G.
      • Gorgun C.
      • 粘合剂L.H.
      • Hotamisligil G.S.
      内质网应激链接肥胖,胰岛素作用,2型糖尿病。
      ,
      • jung d.h.
      • 莫S.H.
      • 金D.H.
      alumenin,多个EF手加入2+ - 粘连蛋白,与兔骨骼肌肌肉网中的ryanodine受体-1相互作用。
      )。在ER应激的条件下,错误折叠的蛋白质在ER管腔中积聚并引发展开的蛋白质反应和JNK的激活,这已知是增加胰岛素受体基质-1的丝氨酸磷酸化(
      • ozcan u.
      • 曹问:
      • yilmaz E.
      • 李阿..
      • Iwakoshi N.N.
      • ozdelen E.
      • 丘脑G.
      • Gorgun C.
      • 粘合剂L.H.
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      在本研究中观察到的肥胖小鼠的脂肪组织中GSTA4蛋白(〜3-4倍)的量减少(Fig. 4)与发表的微阵列数据一致,证明肥胖C57BL / 6J小鼠的脂肪组织中的GSTA4 mRNA表达降低(
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      致谢

      感谢Bernlohr和Griffin研究小组的所有成员,他们为这项工作提供了有用的建议,并具体地利用Lisa Smith和Wendy Wright进行维护和护理动物和Mikel Roe,以获得仪器方法的帮助。我们还感谢Leann Higgins博士和明尼苏达大学员工的质谱和蛋白质组学中心,用于仪器运行指导和明尼苏达超级计算研究所的封闭群。

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