在天然条件下纯化和鉴定G蛋白偶联受体蛋白复合物*

  • avais m. daulat.
    脚注
    隶属关系
    细胞生物学系,Institut Cochin,UniversitéArisscartes,法国巴黎F-75014

    Inserm u567,Pariss Descartes,巴黎F-75014,法国

    CNRS UMR 8104,Pariss Descartes,巴黎F-75014,法国

    FacultédeMédecineRenédescartes,UMR-S 8104,UniversitéParisscartes,法国F-75014
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  • 帕斯卡·莫里斯
    隶属关系
    细胞生物学系,Institut Cochin,UniversitéArisscartes,法国巴黎F-75014

    Inserm u567,Pariss Descartes,巴黎F-75014,法国

    CNRS UMR 8104,Pariss Descartes,巴黎F-75014,法国

    FacultédeMédecineRenédescartes,UMR-S 8104,UniversitéParisscartes,法国F-75014
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  • 克鲁斯自然
    隶属关系
    Institut de Biologie Structurale et de Pharmacologie,CNRS UMR 5089,图卢兹31076,法国
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  • Jean-Luc Guillaume
    隶属关系
    细胞生物学系,Institut Cochin,UniversitéArisscartes,法国巴黎F-75014

    Inserm u567,Pariss Descartes,巴黎F-75014,法国

    CNRS UMR 8104,Pariss Descartes,巴黎F-75014,法国

    FacultédeMédecineRenédescartes,UMR-S 8104,UniversitéParisscartes,法国F-75014
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  • CédricBroussard.
    隶属关系
    细胞生物学系,Institut Cochin,UniversitéArisscartes,法国巴黎F-75014

    Inserm u567,Pariss Descartes,巴黎F-75014,法国

    CNRS UMR 8104,Pariss Descartes,巴黎F-75014,法国

    FacultédeMédecineRenédescartes,UMR-S 8104,UniversitéParisscartes,法国F-75014
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  • Bernard Monsarrat.
    脚注
    隶属关系
    Institut de Biologie Structurale et de Pharmacologie,CNRS UMR 5089,图卢兹31076,法国
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  • Philippe Delagrange.
    隶属关系
    Institut de Recherches Servier,Suresnes 92150,法国
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  • Ralf Jockers.
    一致
    应该解决对应的通信。电话:331-40-51-64-34;传真:331-40-51-64-30.
    隶属关系
    细胞生物学系,Institut Cochin,UniversitéArisscartes,法国巴黎F-75014

    Inserm u567,Pariss Descartes,巴黎F-75014,法国

    CNRS UMR 8104,Pariss Descartes,巴黎F-75014,法国

    FacultédeMédecineRenédescartes,UMR-S 8104,UniversitéParisscartes,法国F-75014
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  • 作者脚注
    *此工作部分由服务器,内部和CNRS的授权部分支持。本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此,本文必须明白“广告“按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
    本文的在线版本(可提供 http://www.mcponline.org)含有补充材料。
    **持有Egide奖学金。
    §§BénopoleToulouseMini-Pyrénées和RégionMidiPyrénés的支持。
      G蛋白偶联受体(GPCR)构成最大的膜受体家族,具有重要的治疗性重要性。 GPCR相关蛋白的鉴定是更好地理解这些受体的重要步骤。然而,目前的方法不符合分离的受体结构域(细胞内环或羧基末端尾部)可以用作“bait.”我们在此报告一种基于串联亲和纯化的方法,其克服质谱法克服了这些限制,因为整个受体用于鉴定在活哺乳动物细胞中形成的蛋白质复合物。人类的山1和山2选择褪黑激素受体作为模型GPCR。将两个受体用羧基末端尾部的串联亲和纯化标签标记,并在人胚胎肾293细胞中表达。优化受体溶解和纯化条件。通过G的共纯化验证该方法i蛋白质是众所周知的GPCR相互作用伴侣,但难以鉴定目前的蛋白质 - 蛋白质相互作用测定。几个新的和功能相关的mt1 - 和山2 - 鉴定了分配的蛋白质;其中一些是对受体常见的,其他人对每个亚型特异。在一起,我们的协议首次允许在适合质谱分析的量的天然条件下首次纯化GPCR相关蛋白质。
      超过800名成员,GPCRS
      使用的缩写是:GPCR,G蛋白偶联受体; 7tm,七透气; C-尾,羧基末端尾部; ERK,细胞外信号调节激酶; MT,褪黑激素受体;点击,串联亲和力净化; Tev,烟草蚀刻病毒; HEK,人类胚胎肾脏; [125i] MLT,2- [125i] Iocomelatonin; nt,无转染; MAPK,丝裂剂激活蛋白激酶; IRS,胰岛素受体底物; PP2,蛋白质磷酸酶2; ER,内质网。
      1使用的缩写是:GPCR,G蛋白偶联受体; 7tm,七透气; C-尾,羧基末端尾部; ERK,细胞外信号调节激酶; MT,褪黑激素受体;点击,串联亲和力净化; Tev,烟草蚀刻病毒; HEK,人类胚胎肾脏; [125i] MLT,2- [125i] Iocomelatonin; nt,无转染; MAPK,丝裂剂激活蛋白激酶; IRS,胰岛素受体底物; PP2,蛋白质磷酸酶2; ER,内质网。
      构成最大的膜受体系列(
      • 弗雷德里克森r.
      • Lagerstrom M.C.
      • Lundin L.G.
      • Schioth H.B.
      人类基因组中的G蛋白偶联受体形成五个主要家庭。系统发育分析,伞菌基团和指纹。
      ,
      • Vassilatis D.K.
      • Hohmann J.G.
      • 曾H.
      • 李F.
      • ranchalis J.E.
      • mortrud m.t.
      • 棕色A.
      • Rodriguez S.S.
      • 胜利J.R.
      • 赖特A.C.
      • Bergmann J.E.
      • Gaitanaris G.A.
      G蛋白偶联的人和小鼠的受体曲目。
      )。它们反应各种细胞外刺激,并针​​对人类疾病规定的一半药物(
      自然评论药物发现GPCR问卷参与者
      2004年GPCR研究状态。
      )。 GPCR是生理过程的关键控制器,如神经递血,细胞代谢,分泌,细胞分化和生长。 GPCR的原型拓扑由细胞外氨基 - 末端段,七个跨膜(7Tm)α-螺旋的疏水核心,它们在膜膜内形成三维筒,以及胞质羧基末端尾部(C -尾巴)。虽然受体的细胞外和/或疏水性7TM核心内的氨基酸参与配体结合,但受体的细胞内结构域由三个环和C尾部组成对于信号转导(
      • GaInetDinov R.R.
      • Fremont R.T.
      • Bohn l.m.
      • Lefkowitz R.J.
      • Caron M.G.
      G蛋白偶联受体和神经元功能的脱敏。
      )。
      已经使用了几种策略来鉴定GPCR相关的复合物。早期工作用过与生物素化配体的亲和柱,从组织中纯化生长抑制菌素受体-G蛋白复合物(
      • 布朗P.J.
      • Schonbrunn A.
      生长抑素受体-G蛋白复合物的亲和纯化证明了受体-G-蛋白偶联的特异性。
      )。随后根据usi的开创性工作 等等。 (
      • Husi H.
      • 沃德米
      • Choudhary J.s.
      • Blackstock W.P.
      • 格兰特S.G.N.
      NMDA受体 - 粘附蛋白信号复合物的蛋白质组学分析。
      ),使用受体特异性抗体进行GPCR相关蛋白质复合物的更多系统蛋白质组学分析(
      • Farr C.D.
      • Gafken P.R.
      • norbeck a.d.
      • Doneanu C.E.
      • Stapels M.D.
      • Barofsky D.F.
      • Minami M.
      • Saugstad J.A.
      天然代谢谷氨酸受体5蛋白复合物的蛋白质组学分析揭示了新的分子成分。
      )。然而,这些方法的一般应用受到每种GPCR的适当工具(标记配体,抗体等)的可用性的限制。后来,分离的细胞内域广泛用于将GPCR相关的蛋白质鉴定为酵母双杂交筛中的诱饵或产生亲和基质,用于纯化来自细胞提取物的相互作用蛋白质(
      • 千斤顶G.
      • 白色J.H.
      蛋白质 - 蛋白质偶联受体的相互作用。
      ,
      • el far o.
      • BETZ H.
      G蛋白偶联受体,用于神经递质氨基酸:C末端尾,拥挤的信号弹素。
      ,
      • Bockaert J.
      • 马林P.
      • Dumuis A.
      • FAGNI L.
      G蛋白偶联受体的“神奇尾”:功能蛋白网络的锚定。
      ,
      • Bockaert J.
      • Roussignol G.
      • BECAMEL C.
      • Gavarini S.
      • joubert l.
      • Dumuis A.
      • FAGNI L.
      • 马林P.
      GPCR相互作用蛋白(GIPS):性质和功能。
      )。使用5ht的整个c-尾2c 受体表达为GST融合蛋白,已鉴定超过15个蛋白质(
      • BECAMEL C.
      • Alonso G.
      • Geleotti N.
      • 德尼E.
      • jouin p.
      • Ullmer C.
      • Dumuis A.
      • Bockaert J.
      • 马林P.
      与5-HT2C受体相关的突触多曲线复合物:蛋白质组学方法。
      )。此外,诸如GPCR的PDZ结构域识别基序的分离的蛋白质 - 蛋白质相互作用基序已经成功地用于识别5HT的PDZ结构域识别基序的相互作用伙伴2a, 5HT2c和5ht.4 receptors (
      • BECAMEL C.
      • Gavarini S.
      • Chanrion B.
      • Alonso G.
      • Galeotti N.
      • Dumuis A.
      • Bockaert J.
      • 马林P.
      血清素5-HT2A和5-HT2C受体与特定的PDZ蛋白相互作用。
      ,
      • joubert l.
      • 汉森B.
      • 巴特G.
      • Sebben M.
      • Claeysen S.
      • 洪W.
      • 马林P.
      • Dumuis A.
      • Bockaert J.
      新分类Nexin(SNX27)和NHERF与5-HT4A受体剪接变体特异性相互作用:受体靶向中的作用。
      )。
      虽然可以鉴定几种GPCR相互作用的蛋白质,但这些方法显然具有重要的局限性,因为分离的受体子域1)不模仿GPCR拓扑(7TM域,细胞内环节的布置和C尾,受体寡聚化),2)不提供足够的膜环境,3)不允许在激动激活时募集蛋白质复合物。毫不奇怪地,众所周知的GPCR的相互作用伴侣如异映上的G蛋白难以使用这些技术难以识别。
      最近描述了串联亲和纯化(Tap)方法(
      • Rigaut G.
      • 舍甫琴科A.
      • rutz b.
      • 威尔m。
      • SERAphin B.
      一种蛋白质复合物特征和蛋白质组探索的通用蛋白质纯化方法。
      )。重要的是,该方法克服了上述限制,并且可以潜在地应用于任何蛋白质。感兴趣的全长蛋白质可以在哺乳动物细胞中表达,其中节省了亚细胞定位和翻译后修饰。此外,可以通过用不同的激素或药理学化合物治疗细胞诱导蛋白质复合物的募集。为了在完整细胞中形成的复合物进行两步亲和力层析纯化,Tap方法依赖于由两个IgG结合结构域,烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶切割位点组成的TAP标签,以及钙调蛋白结合结构域(
      • Dziembowski A.
      • SERAphin B.
      蛋白质复合物分析的最新发展。
      )。 TAP方法已成功用于接合酵母和哺乳动物细胞中的可溶性蛋白质的高通量鉴定(
      • Gavin A.c.
      • 博世M.
      • krause r.
      • Grandi P.
      • Marzioch M.
      • 鲍尔A.
      • Schultz J.
      • 瑞克准噶。
      • Michon A.M.
      • CRUCIAT C.M.
      • remor M.
      • Hofert C.
      • 赫尔德姆
      • Brajenovic M.
      • Ruffner H.
      • 梅里诺A.
      • Klein K.
      • 哈德克姆
      • 迪克森D.
      • 鲁迪T.
      • GNAU V.
      • 鲍奇A.
      • 巴斯克S.
      • HUHSE B.
      • Leutwein C.
      • Heurtier M.A.
      • copley r.r.
      • Edelmann A.
      • Querfurth E.
      • Rybin V.
      • 德鲁斯G.
      • Raida M.
      • bouwmeester t.
      • Bork P.
      • SERAphin B.
      • Kuster B.
      • Neubauer G.
      • Superti-Furga G.
      蛋白质复合物的系统分析酵母蛋白质的功能组织。
      ,
      • bouwmeester t.
      • 鲍奇A.
      • Ruffner H.
      • Angrand P.O.
      • 贝格明·戈尔
      • 克劳兰克K.
      • CRUCIAT C.
      • Eberhard D.
      • Gagneur J.
      • Ghidelli S.
      • HOPF C.
      • HUHSE B.
      • Mangano R.
      • Michon A.M.
      • Schirle M.
      • Schlegl J.
      • 施瓦布米
      • Stein M.A.
      • 鲍尔A.
      • Casari G.
      • 德鲁斯G.
      • Gavin A.c.
      • 杰克逊D.B.
      • joberty g。
      • Neubauer G.
      • 瑞克J.
      • Kuster B.
      • Superti-Furga G.
      人TNF-α/ NF-κB信号转导通路的物理和功能图。
      )。然而,特别是膜蛋白复合物的纯化,特别是GPCR相关的复合物已经不成功。
      在本研究中,我们开发了一种适用于纯化GPCR相关的复合物的改进的龙头方法。人类的山1和山2 选择褪黑激素受体作为模型GPCR。两个受体用尾尾的TAP标记标记,并且在HEK 293细胞中建立了相应的稳定克隆。在小规模实验中优化受体溶解和纯化,并且受体相关的络合物从大规模实验中纯化,随后通过纳米-LC-NaNO-ESI MS / MS鉴定。

      实验步骤

       受体构建 -

      公吨1-rluc和mt.2-rluc构造已在其他地方描述(
      • ayoub m.a.
      • Cuturier C.
      • Lucas-Meunier E.
      • 昂热S.
      • 脂肪钻头
      • Bouvier M.
      • Jockers R.
      通过生物发光共振能量转移监测活性细胞中褪黑素受体的配体独立二聚化和配体诱导的构象变化。
      )。获得mt1-tap和mt.2-tap构造,来自pcdna3-cmv-tap质粒的Tap标签盒(来自Nicolas Goardon,Institut Cochin,Paris,法国)的框架融合到MT的3'-末端1和山2 coding region.

       细胞培养和转染 -

      HEK 293细胞被培养并如其他地方所述转染(
      • ayoub m.a.
      • Cuturier C.
      • Lucas-Meunier E.
      • 昂热S.
      • 脂肪钻头
      • Bouvier M.
      • Jockers R.
      通过生物发光共振能量转移监测活性细胞中褪黑素受体的配体独立二聚化和配体诱导的构象变化。
      )。用G418(Invitrogen)选择稳定的细胞系。

       粗膜制备,放射性配体结合测定,和溶解 -

      如前所述制备粗膜(
      • 巴雷特P.
      • 麦克莱恩A.
      • 摩根P.J.
      通过溶解和凝胶电泳,通过溶解和凝胶电泳多种形式的褪黑激素受体-G蛋白复合物的证据。
      ,
      • 布莱顿L.
      • Roka F.
      • Petit L.
      • Decoppet P.
      • 天梭M.
      • 巴雷特P.
      • 摩根P.J.
      • 南夫C.
      • StroSberg A.D.
      • Jockers R.
      通过G的人Mel1a褪黑素受体的双信号传导i2, Gi3和G.q/11 proteins.
      )从未转染的,山1-tap-或mt2-tap表达HEK 293细胞。用饱和浓度标记膜(500pm2- [125i] Iocomelatonin([125i] mlt),和[125I]在粗膜,溶解的提取物或分接方法的不同步骤中测定MLT结合位点。 0.5%CHAPE,0.25%BRIJ®96V,0.5%Digitonin,0.5%Nonidet P-40(来自Sigma)和0.5%十二烷基甲酰胺(Roche Applicatic Sc​​ience)在溶解缓冲液中在4℃下进行过夜溶解(75米m Tris, 2 mm EDTA, 5 mm MgCl2,ph 8.0)。

       发光测量 -

      粗膜由稳定表达MT的HEK 293细胞系制备1-rluc或mt.2-Rluc和溶解于补充含量的溶解缓冲液,增加浓度的CHAPS,BRIJ96V,十二烷基胺或Digitonin。通过40000×离心分离可溶性级分。 g。将不溶性级分(颗粒)重悬于相同的缓冲液中,并通过添加Coelenterazine H(Interchim,Montluçon,法国)以5μ的终浓度来测量荧光素酶活性并重新悬浮的不溶性级分m。在488nm(Fusion™,Packard仪器有限公司)的发光计进行读数。溶解产率被定义为上清液中的荧光素酶活性的百分比,在总荧光素酶活性(颗粒+上清液)上。使用Nonidet P-40与荧光素酶活性测定不相容。

       免疫荧光显微镜 -

      HEK 293细胞在无菌玻璃玻璃上生长,并在-20℃下固定并透露在乙醇中20分钟。在PBS中封闭后,3%BSA 20分钟,将细胞与多克隆抗MT孵育1 or anti-MT2 室温下1小时的抗体。用PBS洗涤盖玻片三次,并在室温下在PBS中以1:1000稀释,在PBS,3%BSA(杰克逊免疫研究实验室)中孵育30分钟。通过共聚焦激光显微镜(Leica TCS SP2 Aobs)安装并分析盖玻片。

       SDS-PAGE和Western Blotting-

      整个细胞(ERK活化)或粗膜(受体检测)在室温下在SDS-PAGE加载缓冲液中过夜(62.5米)m Tris / HCl,pH 6.8,5%SDS,10%甘油,0.5%溴酚蓝)。将蛋白质分离10%SDS-PAGE并转移至硝酸纤维素。免疫斑分析与多克隆抗MT进行1,抗MT2 (
      • Angeloni D.
      • Longhi R.
      • 弗拉西尼E.
      针对人褪黑素受体MEL-1A(MT1)和MEL-1B(MT2)的抗体的生产和表征。
      ),抗磷酸-ERK或抗ERK2抗体(Santa Cruz Biotechnology)。使用与辣根过氧化物酶和ECL试剂(PERBIO)偶联的二次抗体揭示了免疫反应性。

       优化Tap标记程序 -

      在蛋白酶抑制剂混合物(Roche应用科学)的存在下,在4℃下在4℃下进行所有纯化步骤,1米m OrthovanaTate,2米m NAF。对于大规模的实验,粗膜由〜1×10制备9 HEK 293细胞并在溶解缓冲液中溶解过夜,浓度为0.5%的二硫脲或0.25%Brij96V,浓度为2mg蛋白/ ml。离心后40,000×离心后回收上清液 g 30分钟并用400μL兔IgG-琼脂糖(Sigma)温育4小时。将树脂用1ml溶解缓冲液洗涤三次,重悬于500μl相同的缓冲液中,并用100个单位的TEV蛋白酶(Invitrogen)温育过夜。收集上清液,与500μl钙调蛋白缓冲液混合(75米m Tris, 5 mm MgCl2, 50 mm CaCl2和0.5%Digitonin或0.25%Brij96V,pH 8.0),并用100μl钙调蛋白珠(Stratagene,La Jolla,Ca)温育2小时。用1ml钙调蛋白缓冲液洗涤珠子五次,用SDS-PAGE加载缓冲液洗脱保留的蛋白质。

       质谱和蛋白质鉴定 -

      Coomassie蓝色染色或银染色(
      • rabilloud t.
      2-D电泳凝胶的银染色。
      使用如前所述(
      • 舍甫琴科A.
      • 威尔m。
      • vorm o.
      蛋白质银染色聚丙烯酰胺凝胶的质谱测序。
      )。通过在线毛细管HPLC(Dionex / LC填充)分析胰蛋白酶消化,含有纳米粥QQ-TOF质谱仪(QSTAR Pulsar XL,Applied Biosystems,Foster City,CA)。在75μm内直径×15cm c上分离肽18 Pepmap™柱加载到300μm内径×5-mm Pepmap C上18 预柱(Dionex / LC Packings)。流速设定为200nl / min。在50分钟内使用0-50%的溶剂B的线性梯度洗脱肽(溶剂A为0.2%甲酸,在5%乙腈中,溶剂B在90%乙腈中为0.2%甲酸)。质谱仪以2.1 kV针电压以正离子模式操作。在由10秒的循环时间组成的信息相关的采集模式下连续获取MS和MS / MS数据。在每个循环内,MS频谱在该范围内累积1秒 m/z 300-2000后跟MS谱中三个最丰富的离子上的三个MS / MS采集。动态排除持续时间用于防止在30秒内的相同离子的重复选择。使用3个获得MS / MS数据 m/z 单位离子隔离窗口。根据前体离子的电荷状态和质量值自动调节碰撞能量。 MS / MS Spectra的峰值列表是使用分析师QS软件(版本1.1,应用生物系统)的Mascot.dll脚本(1.6b21)创建的。对于生成峰值列表,默认充电状态设置为2+,3+和4+; MS / MS数据以碱基峰的0%的阈值厘偏见并解剖学;拒绝少于五个峰的MS / MS光谱;用于分组的前体大量耐受设定为0.1;并且,组之间的最大周期数分别设定为60和1。使用Mascot®Search引擎(2.1.04版本),对人类序列,汇编MS / MS数据进行搜索的人类序列数据库,汇编Uniprot瑞士 - Prot和Uniprot Trembl数据库(分别为72,049个条目,第49.1和32.1版)。允许最多两种胰蛋白酶裂解,肽和MS / MS片段离子的质量耐受性为0.5Da。将半胱氨酸氨基甲酰化和丙酰胺和甲硫氨酸氧化设定为可变修饰。如果用至少一种肽鉴定蛋白质的离子率大于36的吉祥物意义阈值(p <0.05)。对于具有接近阈值的分数的蛋白质,通过手动解释对应的MS / MS数据来确认识别。为了评估这些大规模实验中的假阳性率,我们重复使用相同的搜索参数和验证标准对由相同编译的随机数据库重复搜索,其中序列已经反转。这些统计分析分别为2.1,4.1和5.8%的假阳性率为MT1-tap,mt.2-tap和控制实验。看 补充表I和II 有关已鉴定的肽的详细列表。

      结果和讨论

       公吨的功能表达1-tap和mt.2-tap融合蛋白在HEK 293细胞中

      人类的山1和山2 将褪黑激素受体用其C-尾的TaP标记标记,并在HEK 293细胞中建立了相应的稳定克隆。 HEK 293细胞具有人来源,在GPCR信号转导方面非常好,可以以与蛋白质组学分析相容的量制备,并且不表达大量的内源性褪黑激素受体。具有受体特异性抗体的Western印迹分析显示HEK-MT中预期分子大小的预期分子大小的免疫反应带 1-tap表达1.0±0.2 pmol的克隆1-tap / mg蛋白质(n = 3)和在一个hek-mt2-Tap Clone表达340±41 Fmol的MT2-tap / mg蛋白质(n = 3) (Fig. 1, ab)。亲和力常数(Kd)褪黑激素受体激动剂[125i] MLT为85±53(n = 3) and 267 ± 78 pm (n = 3) for MT1-tap和mt.2 - 分别与先前报道的野生型受体的值一致(
      • Petit L.
      • LaCroix I.
      • Decoppet P.
      • StroSberg A.D.
      • Jockers R.
      人Mel1A和Mel1B褪黑激素受体通过环状鸟苷3'-5'-一磷酸途径的差分信号。
      )。通过使用受体特异性抗体评估细胞表面处的受体的表达(Fig. 1, C-F.)。敲击和野生型受体全部在稳定转染的HEK 293克隆的血浆膜上表达。孵化HEK-MT1-tap和hek-mt2 - 用褪黑激素的克隆导致ERK1 / 2磷酸化的预期瞬时增加,与野生型受体的磷酸化相当(图1G.)。总而言之,这些数据表明,Tap标签的添加不会影响亚细胞定位和褪黑激素受体的功能。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1公吨的功能表达1-tap和mt.2-tap在稳定转染的HEK 293细胞中。ab,粗膜由用所示的受体稳定地转染的HEK 293细胞制备。通过SDS-PAGE分离变性样品并通过抗MT通过Western印迹分析1 (a)或抗mt2 (b)抗体。 MT的亚细胞定位1 (c),Mt.1-轻敲 (d),Mt.2 (e)或mt2-轻敲 (f)在稳定转染的HECK 293细胞中,通过使用抗MT进行免疫荧光监测细胞1 (cd)或抗mt2 (ef)抗体。 g,褪黑素刺激的动力学(100 nm)ERK激活稳定的克隆表达MT1,Mt.1-tap,mt.2,或山2-轻敲。在未转染的HEK 293细胞(未示出)中未观察到褪黑激素的ERK途径的活化。 ns. ,非特异性; P-ERK.,磷酸。

       优化受体溶解和纯化 -

      成功纯化GPCR和相关蛋白质的关键步骤包括轻度但有效的细胞溶解,以提取最大量的完整膜结合复合物。量化溶解的MT的量1和山2,我们使用表达rluc的细胞(Renilla. 荧光素酶) - Gagged MT1和山2 receptors (
      • ayoub m.a.
      • Cuturier C.
      • Lucas-Meunier E.
      • 昂热S.
      • 脂肪钻头
      • Bouvier M.
      • Jockers R.
      通过生物发光共振能量转移监测活性细胞中褪黑素受体的配体独立二聚化和配体诱导的构象变化。
      )。将这些细胞与不同浓度的洗涤剂一起温育过夜,通过测量可溶性和不可溶性级分中的荧光素酶活性来测定溶解产率(图2A)。溶解受体的量随着洗涤剂浓度的函数而增加,并达到50%(CHAP),65%(BRIJ96V),70%(Digitonin)或80%(十二烷基镁苷)的最大值。在该测定中不能分析用Nonidet P-40获得的数据,因为Nonidet P-40抑制了荧光素酶活性。获得了比较的结果1-rluc和mt.2-rluc。最小的洗涤剂浓度,用于产生最大受体溶解,用于研究溶解动力学(图。2B)。两次受体随着时间达到15小时后达到高原的时间逐渐溶解。对于进一步的实验,将受体用0.5%CHAPS,Digitonin,十二烷基甲酰胺或Nonidet P-40溶解,或者对于BRIJ96V的0.25%溶解15小时。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2褪黑素受体溶解条件的洗涤剂选择和优化。ab,HEK 293细胞的膜制剂稳定表达MT1-rluc或mt.2-Rluc在4℃下随着洗涤剂浓度的增加而孵育15小时(a)或用于在0.5%CHAP(•),Digitonin(○),或十二烷基镁(□)或0.25%Brij96V(▪)中的指示时间(b)。在可溶性和不溶性级分中测量荧光素酶活性以确定溶解的百分比。使用Nonidet p-40与荧光素酶活性测定不相容。 c,HEK 293细胞的膜制剂稳定表达MT1-tap或mt.2-tap标有[125I] MLT,在4℃下孵育过夜,在0.5%浓度的指定洗涤剂的情况下除了Brij96V,其用于0.25%。测定可溶性级分中的放射性量(黑条),[125i] MLT标记的MT1-tap和mt.2 - 在IgG涂覆的珠粒上回收 - 测定回收的放射性量(白色酒吧)。大量的 [125对于未转染的HEK 293细胞的MLT结合可忽略不计。
      评估溶解的MT的拓扑完整性1-tap和mt.2-tap,他们的绑定能力[125i]使用MLT。由HEK-MT制备的膜1-tap和hek-mt2-tap细胞用[125我] MLT。通过Tap标签的IgG结合模块溶解并固定在IgG涂覆的珠粒上(图2C.)。选择Digitonin和Brij96V的进一步实验为40-50%[125在这些条件下,I]常规保留在IgG珠粒上的MLT结合位点。使用这些优化的溶解条件,进行整个抽头程序。在每个步骤中监测功能受体的纯化,[125i] MLT结合测定。 [125I] MLT标记的受体从27±3(Digitonin)变化至15±2%(Brij96V)和33±2(Digitonin)至25±5%(Brij96V)(n > 5) for MT1和山2, 分别 (Fig. 3, ab)。通过α亚基的α亚基对褪黑激素刺激对褪黑激素刺激的共纯化进行评估i protein (Giα)(
      • 巴雷特P.
      • 麦克莱恩A.
      • 摩根P.J.
      通过溶解和凝胶电泳,通过溶解和凝胶电泳多种形式的褪黑激素受体-G蛋白复合物的证据。
      ,
      • 布莱顿L.
      • Roka F.
      • Petit L.
      • Decoppet P.
      • 天梭M.
      • 巴雷特P.
      • 摩根P.J.
      • 南夫C.
      • StroSberg A.D.
      • Jockers R.
      通过G的人Mel1a褪黑素受体的双信号传导i2, Gi3和G.q/11 proteins.
      )。而G.i在Digitonin-Solizilized MT的纯化过程中容易检测α1-tap和mt.2-轻敲 (图3C.), Gi使用Brij96V(未示出)时,α很少纯化,因为该洗涤剂显然破坏了受体/ g蛋白质相互作用。通过在最终纯化步骤中存在在Digitonin(未示出)存在下的Gβ亚基的情况下进一步证实异映酰基蛋白的完整性,其用于进一步实验。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3纯化Mt.1-tap和mt.2-tap和相关的gi proteins.ab,监测Digitonin-Solubilized的纯化(白色酒吧)或Brij96v-solubilized(黑条)[125i] MLT标记的MT1-轻敲 (a)和山2-轻敲 (b)在点击协议的每个步骤中。纯化产率表示为总膜的百分比[125i] MLT结合位点。 cam,洗脱钙调蛋白柱; IgG.,与IgG涂层柱结合; 索尔,溶解的分数; Tev.,用tev蛋白酶洗脱。 c,监测受体相关G的共纯化i来自褪黑素刺激细胞的蛋白质印迹α蛋白(15分钟,1μm)。 MB.,粗膜馏分。

       公吨的纯化和鉴定1 - 和山2 - 分配的蛋白质

      Tap标签程序的最终目的是通过质谱分析鉴定足量的受体纯化相关蛋白质。达到这一目标,粗膜的~1×109 HEK-MT1-tap,hek-mt2-Tap,制备非转染的HEK 293细胞,并将Digitonin-Solumizized级分提交到抽头程序。通过一维凝胶电泳分离洗脱,并且取决于受体表达水平,通过Coomassie Blue(MT)检测蛋白质 1-tap,~1 pmol / mg)或银染色(mt2-tap,〜0.3 pmol / mg)(Fig. 4, ab)。然而,在非转染(NT)HEK 293细胞中只能看到几个条带,而几种特定的蛋白质条带可重复存在于MT中1-tap-和mt.2-tap表达的细胞(n = 4)。用胰蛋白酶进行系统地切除和消化局部,并通过纳米-LC-NANO-ESI MS / MS分析所得肽,并用瑞士 - PROM和TREMBL数据库用吉祥物软件鉴定。在所有三个通道中检测到几种丰富的蛋白质,大多是线粒体或核糖体源性的蛋白质(NT,MT1-tap和mt2-tap)并被归类为非特异性蛋白质。蛋白质反复存在于MT中1-tap或mt.2-tap Lane但没有NT Lane的缺席被认为与MT有关1 or MT2, 分别 (表I.II)。始终诱饵蛋白(MT1和山2)在相应的车道中鉴定。每个受体在两个区域中,在45和90kDa,分别在45和90kDa,分别对应于受体的良好记录的单体和SDS抗性二聚体形式(
      • ayoub m.a.
      • Levoye A.
      • delagrange p.
      • Jockers R.
      与MT2同型二聚体相比,具有不同配体相互作用性的MT1 / MT2褪黑素受体异二聚体的优先形成。
      )。这表明两个受体都达到了它们的全功能性四元结构。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4大规模净化MT1-轻敲 (a)和山2-tap相关的(b) 复杂的。 Approximately 1 × 109 HEK-MT1-tap,hek-mt2-tap,未转染的HEK 293细胞被提交到TAP协议。通过凝胶电泳分离出eluates,并通过Coomassie蓝染色检测蛋白质(a)或银染色(b)。
      表I.公吨1相关蛋白
      瑞士 - Prot / Trembl加入号码 蛋白质标识分数覆盖范围独特肽的数量理论分子量也识别在Mt中2亚细胞本地化
      %
      诱饵蛋白质
      P48039褪黑激素受体1A型(MT1)35324939,349+血浆膜
      信号转导
      P62873鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚基1405291037,222+血浆膜
      Q9HAV0鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚基431822837,412+血浆膜
      P08754鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G.iα3639461640,375+血浆膜
      P63096鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G.iα1566461440,204+血浆膜
      P04899鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G.iα2409341140,294+血浆膜
      P095432',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶977347,549血浆膜
      P62834RAS相关蛋白RAP-1A9311220,974血浆膜
      P63000P21-RAC1828221,436
      P26641伸长因子1-γ19711549,956细胞质
      O14654胰岛素受体衬底414644133,685+细胞质
      Q60FE5菲素A.9413278,053+细胞质
      生物合成
      P27824Calnexin.前体837302067,526+ER膜
      P1102178-KDA葡萄糖调节蛋白511251672,288+呃腔
      P27797Caltretitulin.18912748,112呃腔
      Q15084蛋白质 - 二硫化物异构酶A61557348,091+呃腔
      交通
      O95292囊泡相关膜蛋白相关蛋白B / C.8315427,080
      P61026RAS相关蛋白RAB-1012114322,527内部组合
      其他
      O00264膜相关的孕酮受体组分119124621,527血浆膜
      Q96AG4含亮氨酸的含重复蛋白5931236934,909细胞内膜
      P57088跨膜蛋白33.10212327,960
      Q13151异质核核糖核蛋白A037728730,822细胞质
      表二公吨2相关蛋白
      瑞士 - Prot / Trembl加入号码 蛋白质标识分数覆盖范围独特肽的数量理论分子量也识别在Mt中1亚细胞本地化
      %
      诱饵蛋白质
      P49286褪黑激素受体1B型(MT2)19110440,162血浆膜
      信号转导
      P62879鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚基1929521537,222+血浆膜
      Q9HAV0鸟嘌呤核苷酸结合蛋白β亚基4511291037,412+血浆膜
      P63096鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G.iα1905602040,204+血浆膜
      P08754鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G.iα3899591940,375+血浆膜
      P04899鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G.iα2775642040,294+血浆膜
      O14654胰岛素受体衬底45461216133,685+细胞质
      Q60FE5菲素A.369614278,053+细胞质
      O60716cateninδ112664108,103细胞质
      O15355蛋白质磷酸酶2C同种型γ1195359,235细胞质
      生物合成
      P27824Calnexin.747281867,526+ER膜
      P1102178-KDA葡萄糖调节蛋白641281672,288+呃腔
      Q15084蛋白质 - 二硫化物异构酶A623516448,091+呃腔
      P2734814-3-3蛋白θ.968227,747细胞质
      交通
      Q5T201Coatomer蛋白复合物,α亚基5471520138,258呃/高尔基
      Q96QK1真空分选蛋白35377151191,649膜相关蛋白
      P42356磷脂酰肌醇4-激酶α13434231,143细胞内膜
      其他
      Q9NQX7整体膜蛋白2c8012230,224
      重要的是,在MT中存在异映上的G蛋白1 - 和山2 - 通过质谱法证实了聚合物。与褪黑素受体的已知偶联一致i 蛋白质,所有三个giα同种型(G的特异性肽)iα1–3)和两种不同的Gβ同种型(Gβ的特异性肽)1,4)被确定。 G蛋白和受体的共纯化验证了我们的方法,并提供了与其他目前可用的蛋白质 - 蛋白质相互作用测定相比的主要优点,其中G蛋白/受体相互作用通常丢失。这些结果清楚地表明我们的程序可以鉴定功能相关的GPCR相互作用的蛋白,其仅与在天然膜环境中表达的完整受体中联合。
      鉴定了几种先前未知的褪黑激素受体相关蛋白。有趣的是这些蛋白质定位于不同的亚细胞室(细胞溶胶,质膜和不同的细胞内膜室,例如内质网)。褪黑激素受体相关蛋白可分为三个功能性不同的群体:蛋白质可能参与受体生物合成,细胞内运输和GPCR的信号/调节(表I.II)。剩余蛋白质的功能,被归类为“其他”是未知的或看起来不直接与已知的GPCR功能相关联。这是MT的情况1可疑地参与mRNA成熟的特异性异质核核糖核糖蛋白A0(
      • 克里克星中午
      • Swanson M.S.
      HNRNP复合物:组成,结构和功能。
      )是MAPK活化蛋白激酶2的主要基材,其本身在GPCR促进的P38 MAPK刺激时自身激活(
      • 卢梭S.
      • 莫里斯N.
      • Peggie M.
      • 坎贝尔D.G.
      • Gaestel M.
      • 科恩P.
      抑制SAPK2A / P38通过MAPKAP-K2预防HNRNP A0磷酸化及其与细胞因子MRNA的相互作用。
      )。
      菲素A和胰岛素受体底物4(IRS4)被鉴定为MT的常见成员1 - 和山2 - 分配的复合物。与这些发现一致,先前已显示菲妥A与GPCR系列的其他几个成员相互作用,包括多巴胺D2 / D3(
      • 李米
      • Bermak J.C.
      • 王Z.W.
      • 周Q.Y.
      调制多巴胺D.2 通过肌动蛋白结合蛋白(ABP-280)的受体信号传导。
      ,
      • 林R.
      • Karpa K.
      • Kabbani N.
      • 高盛 - 摇滚P.
      • Levenson R.
      多巴胺D2和D3受体通过与菲素A的相互作用与肌动蛋白细胞骨架连接。
      ),钙传感(
      • awata h.
      • 黄C.
      • handlogten m.e.
      • 米勒R.T.
      钙传感受体和氟胺,潜在的支架蛋白的相互作用。
      ,
      • Hjalm G.
      • Macleod R.J.
      • 基辅O.
      • Chattopadhyay N.
      • 棕色尤。
      菲素-A与钙感应受体的羧基末端尾部结合,其参与促丝瘤激活蛋白激酶的载体激活的相互作用。
      )和μ-opioid受体(
      • Onoprishvili I.
      • 和ria m.l.
      • Kramer H.K.
      • Ancevska-Taneva N.
      • 希尔杰下午
      • 西蒙e.j.
      μ阿片类受体和菲素A之间的相互作用参与受体监管和贩运。
      )。 IRS4的作用记录不足。 IRS4在成纤维细胞生长因子受体信号传导中的参与(
      • 多恩比上午。
      • 奥尔森J.V.
      成纤维细胞生长因子信号传导酪氨酸磷蛋白酶:胰岛素受体基质-4的作用。
      )已经描述了与蛋白质磷酸酶4的相互作用(
      • mihindukulasuriya K.A.
      • 周G.
      • 秦吉。
      • tan t.h.
      蛋白质磷酸酶4与肿瘤坏死因子-α刺激后的胰岛素受体底物4相互作用和下调。
      )。
      我们也能够识别几吨1特异性信号蛋白,如RAC1,RAP-1A和2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶和蛋白质伸长因子1-γ(EEF-1Bγ)。有趣的是,小GTP酶RAC1和RAP-1已被证明在5HT的下游功能4 受体和营养野生核苷酸交换因子EPAC1(
      • Maillet M.
      • 罗伯特S.J.
      • Cacquevel M.
      • Gastineau M.
      • Vivien D.
      • Bertoglio J.
      • Zugaza J.L.
      • Fischmeister R.
      • Lezoualc'h F.
      RAP1和RAC之间的串扰调节SAPPα的分泌。
      )。属于PDE3A家族的2',3'-环核苷酸3'-磷酸二酯酶参与了营地和CGMP等第二信使的降解(
      • Lugnier C.
      循环核苷酸磷酸二酯酶(PDE)超家族:特异性治疗剂发展的新靶标。
      )。已知褪黑激素受体的激活来调节第二个使者(
      • Petit L.
      • LaCroix I.
      • Decoppet P.
      • StroSberg A.D.
      • Jockers R.
      人Mel1A和Mel1B褪黑激素受体通过环状鸟苷3'-5'-一磷酸途径的差分信号。
      )。据报道,EEF-1Bγ和其他伸长因子通过与受体的直接相互作用来调节GPCR功能(
      • McClatchy D.B.
      • Knudsen C.R.
      • 克拉克B.F.
      • Kahn R.A.
      • 大厅R.A.
      • Levey A.I.
      M4毒蕈碱乙酰胆碱受体和伸长因子1A2之间的新型相互作用。
      ,
      • CHO D.I.
      • 橡木M.H.
      • 杨H.J.
      • Choi H.K.
      • Janssen G.M.
      • kim。
      多巴胺D3受体与伸长因子-1Bβγ之间的直接和生化相互作用。
      )。
      cateninδ1(p120)和蛋白质磷酸酶2cγ(pp2cγ)已被鉴定为mt2 - 特异性信号蛋白。虽然已知P120通过NFκB活化通过调节Rho GTP酶来影响细胞内信号传导,但其在GPCR信号中的特定作用目前未知(
      • Perez-Moreno M.
      • 戴维斯米。
      • 黄娥。
      • pasolli h.a.
      • Reynolds A.B.
      • Fuchs E.
      P120-Catenin介导皮肤中的炎症反应。
      )。几种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶参与活性GPCR的磷酸化(
      • shih m.l.
      • 林F.B.
      • 斯科特J.D.
      • 王H.Y.
      • Malbon C.C.
      β的动态复合物2 - 具有蛋白质激酶和磷酸酶的肾上腺素能受体以及瓜林的作用。
      )。据报道,PP2A和PP2B亚细胞的磷酸酶靶向GPCR,而PP2C亚家族成员已被证明是去磷酸化代谢谷氨酸受体3(
      • Flajolet M.
      • rakhilin s.
      • 王H.
      • 斯卡沃巴N.
      • Nuangchamnong N.
      • Nairn A.c.
      • 格林加德P.
      蛋白质磷酸酶2C选择性地结合,并去磷酸化代谢物谷氨酸受体3。
      )。确定PP2Cγ是否参与MT将会有趣2 dephosphorylation.
      涉及受体生物合成中涉及的大多数已鉴定的蛋白质存在于受体相关的复合物中。这是预期的,因为所有GPCR都怀疑遵循相同的生物合成途径。有趣的是鉴定的蛋白质与不同的不同受体结构域相互作用,包括细胞质和内质网(ER)腔受体界面。相比之下,贩运贩运的蛋白质在两种受体亚型之间有明显不同,表明不同的贩运行为。
      除了异映上的gi 蛋白质,对褪黑激素受体相互作用伙伴的曲目不大。这使得难以估计我们的数据集涵盖的已知交互伙伴的比例。然而,可以假设许多交互伙伴可能至少与其他几个GPCR相互作用,可以进行粗略估计。对于Mt. 1和山2 已经显示出鉴定的蛋白质的35和45%,以与其他GPCR相互作用。额外的25%和20%的MT1和山2 互动者分别与GPCR函数(信令,贩运等)有关。因此,对两个受体的相互作用伙伴的总体率为“有道理”代表〜60%。
      我们是否错过了任何已知的/疑似互动伙伴?虽然没有直接显示,功能研究清楚地表明褪黑激素受体(
      • Levoye A.
      • 大坝J.
      • ayoub m.a.
      • Guillaume J.L.
      • Cuturier C.
      • delagrange p.
      • Jockers R.
      孤儿GPR50受体特别抑制MT1 褪黑激素受体通过异二聚化作用。
      )与大多数其他GPCR相互作用,与β-Arectionins相互作用,这是一个参与受体脱敏,内化和信号传导的蛋白质系列(
      • 重新re。
      • Lefkowitz R.J.
      仁慈和β-arriagins:受体沉默,贩运和信号的角色。
      )。已知这种相互作用是激动的刺激和瞬态的。我们的数据集中的β-arrier in的缺失表明,这种瞬态相互作用可能需要通过在纯化之前通过化学交联来稳定。
      来自完整哺乳动物细胞的蛋白质复合物的纯化是水龙头技术的优点之一。这也意味着相互作用复合物的组分取决于所选择的蜂窝环境。正如我们所选择的HEK 293成纤维细胞,我们的研究我们希望识别相当普遍地表达的互动伴侣,而不是特定于细胞类型(IE。 特定神经元特定的合作伙伴。鉴定为褪黑激素受体鉴定的蛋白质的再到蛋白质证实了这一预测。下一步骤将通过表达在表达具有良好定义的功能的内源受体中的神经元或内分泌细胞中表达TAP标记的褪黑激素受体来识别细胞类型特异性相互作用伙伴。
      一起携带我们的Tap协议首次允许在适合质谱分析的量的天然条件下纯化GPCR相关蛋白质。鉴定来自不同蜂窝隔室的相互作用伙伴识别单体和/或二聚体受体物种的额外和细胞内受体结构域。这提出了在鉴定GPCR相关蛋白质复合物中的主要方法进展。此外,该方法相对较快,产生少量的非特异性蛋白质,并且不需要通过共分免沉淀实验确认相互作用。在MT之间获得了类似的结果1和山2 就溶解效率,复杂稳定性和纯化产生了该方案而言,提出了更一般的应用。越来越多的TAP标签变体,包括分割TAP标签(
      • Dziembowski A.
      • SERAphin B.
      蛋白质复合物分析的最新发展。
      ),证明了该方法的灵活性,并允许对任何GPCR均匀和异二聚体进行快速优化的可能性。

      致谢

      我们感谢N. Goardon(Institut Cochin,Paris,France)和Drs。 G. Fraschini(米兰,意大利)和D. Angeloni(Pisa,意大利)分别提供Tap标签表达式磁带和抗褪黑激素受体抗体。我们感谢Patty Chen关于稿件的评论,Luc Camoin博士专家咨询,并在项目的初始阶段提供帮助。

      补充材料

      参考

        • 弗雷德里克森r.
        • Lagerstrom M.C.
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