Cystmtraq-基于硫醇的氧化性氧化还原蛋白质组学的一致方法*

  • 詹妮弗帕克
    脚注
    隶属关系
    佛罗里达大学佛罗里达大学遗传研究所生物学研究所32611

    植物分子和细胞生物学计划,佛罗里达大学,佛罗里达州普罗兰,佛罗里达州32610
    搜索本作者的文章
  • 凯利平原
    脚注
    隶属关系
    佛罗里达大学佛罗里达大学遗传研究所生物学研究所32611

    植物分子和细胞生物学计划,佛罗里达大学,佛罗里达州普罗兰,佛罗里达州32610
    搜索本作者的文章
  • 佛豪朱
    隶属关系
    佛罗里达大学佛罗里达大学遗传研究所生物学研究所32611
    搜索本作者的文章
  • 宁朱
    隶属关系
    佛罗里达大学佛罗里达大学遗传研究所生物学研究所32611
    搜索本作者的文章
  • 六辰
    一致
    应解决谁的通信:六元陈,博士,电话:1-352-273-8330,传真:1-352-273-8284。
    隶属关系
    佛罗里达大学佛罗里达大学遗传研究所生物学研究所32611

    植物分子和细胞生物学计划,佛罗里达大学,佛罗里达州普罗兰,佛罗里达州32610

    佛罗里达大学佛罗里达大学的生物技术研究中心研究中心32610
    搜索本作者的文章
  • 作者脚注
    *我们感谢Howard Hughes医学院为F. Zhu提供本科研究奖。该工作得到了国家科学基金会(MCB 0818051和MCB 1412547)到S. Chen的支持。
    本文含有补充材料。
    ¶这些作者平等为这项工作做出了贡献。
      蛋白质氧化还原规则在许多生物过程中起重要作用。蛋白质半胱氨酸硫醇对氧化还原的敏感性敏感,可以用作氧化还原开关,其打开或关闭信号和代谢途径,以确保对环境刺激或应力的快速反应。在这里,我们报告了一种新的综合蛋白质组学方法,称为Cystmtraq,其在一个实验中结合了两种类型的异疗法标签,半胱氨酸串联质量标签和同学标签,用于相对和绝对量化。该方法不仅能够同时分析半胱氨酸氧化还原的变化和总蛋白质水平的变化,而且还允许确定善意氧化还原通过蛋白质周转校正改变蛋白质中的半胱氨酸。俯视蛋白质后改变实验的蛋白质水平变化的因素可能导致结果误导。分析蛋白质后期改性动力学和蛋白质水平变化的能力将在生物学和医学的许多领域提前推进蛋白质组学研究。
      蛋白质半胱氨酸硫醇的氧化还原状态的变化用作各种生物过程中的调节器开关(
      • 去你。
      • 琼斯D.P.
      映射半胱氨酸蛋白质:氧化还原硫醇的分析。
      )。氧化还原循环由众所周知的因子(如富勒森林)和谷胱甘肽 - 谷蛋白系统(谷胱甘肽 - 谷氨酸)系统为调节,减少氧化半胱氨酸。其他氧化还原酶和氧化剂,例如活性氧物质主要是氧化半胱氨酸硫醇基团(
      • Ghezzi P.
      • Bonetto V.
      氧化还原蛋白质组学:鉴定氧化改性蛋白质。
      ,
      • Barty J.W.
      • 汉普顿M.B.
      • 冬季冬季C.C.
      约束细胞中过氧化氢敏感硫醇蛋白的蛋白质组学检测。
      )。为了映射和量化半胱氨酸的氧化还原修饰,已经开发了几种方法和方法,主要使用硫醇特异性试剂和同位素标签。二维凝胶电泳技术与荧光染料标记相结合(例如 monobromobimane (
      • Alkhalfioui F.
      • 雷纳德M.
      • Vensel W.H.
      • Wong J.
      • Tanaka C.K.
      • 赫尔克曼W.J.
      • Buchanan B.B.
      • 蒙特里希尔
      在萌发期间,硫昔林连接的蛋白质减少 Medicago Truncatula. seeds.
      ,
      • alvarez s.
      • 威尔逊G.H.
      • 陈S.
      拟南芥体内氧化还原调节蛋白的蛋白质组学分析。
      )和花青染料(
      • 傅C.
      • 胡锦涛
      • 刘涛。
      • 以前t.
      • 萨文玛J.
      • 李H.
      用数字和ICAT的氧化还原敏感蛋白质组的定量分析。
      ,
      • 朱M.
      • 朱恩
      • 哈德阿。
      • assmann s.m.
      • 陈S.
      基于硫醇的氧化还原蛋白在脱落酸和茉莉酸甲酯信号中 芸苔栗鸟 guard cells.
      ))和具有同位素标记的无凝胶技术(例如 同位素编码的亲和标记(
      • 傅C.
      • 胡锦涛
      • 刘涛。
      • 以前t.
      • 萨文玛J.
      • 李H.
      用数字和ICAT的氧化还原敏感蛋白质组的定量分析。
      ,
      • 朱M.
      • 朱恩
      • 哈德阿。
      • assmann s.m.
      • 陈S.
      基于硫醇的氧化还原蛋白在脱落酸和茉莉酸甲酯信号中 芸苔栗鸟 guard cells.
      ,
      • 去你。
      • roede J.R.
      • orr m.
      • 梁Y.
      • 琼斯D.P.
      集成氧化还原蛋白质组学和线粒体代谢组学,以确定CD毒性的机制。
      ),cystmt
      使用的缩写是:
      cystmt.
      半胱氨酸反应性串联质量标签
      itraq.
      具有相对和绝对定量的异交标签
      cystmtraq.
      半胱氨酸反应性串联质量标签,具有同学标签,用于相对和绝对定量
      HCD.
      高能碰撞解离。
      1使用的缩写是:cystmt.
      半胱氨酸反应性串联质量标签
      itraq.
      具有相对和绝对定量的异交标签
      cystmtraq.
      半胱氨酸反应性串联质量标签,具有同学标签,用于相对和绝对定量
      HCD.
      高能碰撞解离。
      (
      • 帕克J.
      • 朱恩
      • 朱M.
      • 陈S.
      使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化钇蛋白酶。
      )和Itraq标记含富含半胱氨酸的肽(
      • 麦克杜纳格B.
      • Martínez-Acedo P.
      • várquezJ.
      • Padilla A.
      • Sheehan D.
      • BárcenaJ.A.
      Itraq试剂在半胱氨酸残基相对量化可逆氧化还原状态的应用。
      ,
      • Tambor V.
      • 猎人C.L.
      • Seymour S.L.
      • Kacerovsky M.
      • Stulik J.
      • Lenco J.
      CYSTRAQ- ITRAQ的组合和富集的半胱氨酸肽用于露出和定量隐藏蛋白质蛋白。
      ,
      • Mermelekas G.
      • Makridakis M.
      • Koeck T.
      • Vlahou A.
      氧化还原蛋白质组学:通过基于凝胶和LC-MS的方法从残留物修饰到推定的生物标志物鉴定。
      ,
      • 刘P.
      • 张H.
      • 王H.
      • 夏Y.
      氧氮蛋白鉴定拟南芥蛋白质组中的氧化还原敏感性半胱氨酸,一种定量的氧化还原蛋白质组学方法。
      ,
      • 苏D.
      • 长边m.j.
      • 郭杰。
      • Hatchell K.E.
      • Chu R.K.
      • Clauss T.R.W.
      • aldrich J.T.
      • 吴S.
      • Purvine S.
      • 营地D.G.
      • 史密斯r.d.
      • thrall b.d.
      • 钱W.
      树脂辅助富集和异巴丙基丙酮鼠中小鼠巨噬细胞蛋白质组学鉴定及定量。
      ))通常用于鉴定潜在的氧化还原敏感的半胱氨酸残基并定量氧化还原变化。
      除了众所周知的能力和与二维凝胶电泳相关的基于二维凝胶电泳和无露面的方法(
      • 陈S.
      • 哈德阿。
      植物蛋白质组学的进展。
      ),每种方法都有其在氧化还原蛋白质组学中的优点和缺点。例如,二维凝胶电泳方法允许检查与氧化还原和蛋白质水平变化有关的斑点模式。然而,基于点体积的量化变得有问题,因为每个斑点通常含有来自复杂样品的多于一种蛋白质。此外,有限数量的荧光试剂损害复用能力,并且使用青色染料的使用不允许修饰半胱氨酸的映射(
      • 傅C.
      • 胡锦涛
      • 刘涛。
      • 以前t.
      • 萨文玛J.
      • 李H.
      用数字和ICAT的氧化还原敏感蛋白质组的定量分析。
      ,
      • 朱M.
      • 朱恩
      • 哈德阿。
      • assmann s.m.
      • 陈S.
      基于硫醇的氧化还原蛋白在脱落酸和茉莉酸甲酯信号中 芸苔栗鸟 guard cells.
      )。其他硫醇标记方法,如使用N-乙基马来酰亚胺,生物素-N- [6-(Biotinamido)己基] -3-(2-吡啶二硫代噻唑)丙酰胺(
      • Izquierdo-Alvarez A.
      • 拉莫斯E.
      • Villanueva J.
      • Hernansanz-AugustínP.
      • Fernández-Rodriguez R.
      • Tello D.
      • Carrascal M.
      • Martínez-Ruiz A.
      差分氧化还原蛋白质组学允许鉴定在内皮细胞中的半胱氨酸残基上可逆地氧化的蛋白质响应于急性缺氧。
      )和同位素编码的亲和标签允许比同位素编码的亲和标签的情况下含有半胱氨酸的肽,半胱氨酸修饰位点的映射和双链实验(
      • 傅C.
      • 胡锦涛
      • 刘涛。
      • 以前t.
      • 萨文玛J.
      • 李H.
      用数字和ICAT的氧化还原敏感蛋白质组的定量分析。
      ,
      • 朱M.
      • 朱恩
      • 哈德阿。
      • assmann s.m.
      • 陈S.
      基于硫醇的氧化还原蛋白在脱落酸和茉莉酸甲酯信号中 芸苔栗鸟 guard cells.
      )。为了使能复用,最近使用4-或8-Plex Itraq标签来标记含半胱氨酸的肽与硫醇 - 亲和层析(
      • 麦克杜纳格B.
      • Martínez-Acedo P.
      • várquezJ.
      • Padilla A.
      • Sheehan D.
      • BárcenaJ.A.
      Itraq试剂在半胱氨酸残基相对量化可逆氧化还原状态的应用。
      ,
      • Tambor V.
      • 猎人C.L.
      • Seymour S.L.
      • Kacerovsky M.
      • Stulik J.
      • Lenco J.
      CYSTRAQ- ITRAQ的组合和富集的半胱氨酸肽用于露出和定量隐藏蛋白质蛋白。
      ,
      • 苏D.
      • 长边m.j.
      • 郭杰。
      • Hatchell K.E.
      • Chu R.K.
      • Clauss T.R.W.
      • aldrich J.T.
      • 吴S.
      • Purvine S.
      • 营地D.G.
      • 史密斯r.d.
      • thrall b.d.
      • 钱W.
      树脂辅助富集和异巴丙基丙酮鼠中小鼠巨噬细胞蛋白质组学鉴定及定量。
      ,
      • Izquierdo-Alvarez A.
      • 拉莫斯E.
      • Villanueva J.
      • Hernansanz-AugustínP.
      • Fernández-Rodriguez R.
      • Tello D.
      • Carrascal M.
      • Martínez-Ruiz A.
      差分氧化还原蛋白质组学允许鉴定在内皮细胞中的半胱氨酸残基上可逆地氧化的蛋白质响应于急性缺氧。
      )。另一种复用技术Cystmt是开发的,特别是用来自六种不同样品的蛋白质的游离硫醇基团(
      • 帕克J.
      • 朱恩
      • 朱M.
      • 陈S.
      使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化钇蛋白酶。
      )。虽然这些多路复用技术已经找到了效用,但他们没有解决实验过程中蛋白质营业额的问题,许多研究人员忽略了可能导致误导性结果的重要因素(
      • 去你。
      • roede J.R.
      • orr m.
      • 梁Y.
      • 琼斯D.P.
      集成氧化还原蛋白质组学和线粒体代谢组学,以确定CD毒性的机制。
      ,
      • 刘P.
      • 张H.
      • 王H.
      • 夏Y.
      氧氮蛋白鉴定拟南芥蛋白质组中的氧化还原敏感性半胱氨酸,一种定量的氧化还原蛋白质组学方法。
      ,
      • 苏D.
      • 长边m.j.
      • 郭杰。
      • Hatchell K.E.
      • Chu R.K.
      • Clauss T.R.W.
      • aldrich J.T.
      • 吴S.
      • Purvine S.
      • 营地D.G.
      • 史密斯r.d.
      • thrall b.d.
      • 钱W.
      树脂辅助富集和异巴丙基丙酮鼠中小鼠巨噬细胞蛋白质组学鉴定及定量。
      ,
      • Muthuramalingam M.
      • matros A.
      • Scheibe R.
      • 嘲笑H.P.
      • DIETZ K.J.
      体外和体内叶绿体的氢敏感蛋白质组。
      )。只有少数研究人员试图比较蛋白质组学实验中确定的潜在氧化还原变化,从平行或不同的研究获得的总蛋白质水平变化(
      • 傅C.
      • 胡锦涛
      • 刘涛。
      • 以前t.
      • 萨文玛J.
      • 李H.
      用数字和ICAT的氧化还原敏感蛋白质组的定量分析。
      ,
      • 朱M.
      • 朱恩
      • 哈德阿。
      • assmann s.m.
      • 陈S.
      基于硫醇的氧化还原蛋白在脱落酸和茉莉酸甲酯信号中 芸苔栗鸟 guard cells.
      ,
      • Izquierdo-Alvarez A.
      • 拉莫斯E.
      • Villanueva J.
      • Hernansanz-AugustínP.
      • Fernández-Rodriguez R.
      • Tello D.
      • Carrascal M.
      • Martínez-Ruiz A.
      差分氧化还原蛋白质组学允许鉴定在内皮细胞中的半胱氨酸残基上可逆地氧化的蛋白质响应于急性缺氧。
      )。然而,该策略的成功往往是低的,因为在实验变异和质谱间随机采样问题的结果中,氧化还原实验中量化的许多蛋白质不存在或未在总蛋白质组学实验中量化(
      • 冲P.K.
      • GaN C.S.
      • PHAM T.K.
      • 赖特P.C.
      相对和绝对量化(ITRAQ)再现性的同位式标签:多次注射的含义。
      ,
      • 李杰。
      • 酸值H.J.
      无标签定量霰弹枪蛋白质组学分析水稻籽粒发育。
      )。
      为了克服这一挑战,我们开发了一种双标签策略,在一个实验中使用ITRAQ和Cystmt进行同时测定可量化的半胱氨酸氧化还原和蛋白质水平变化。这个名为Cystmtraq的新策略利用每个标签进行其特定的化学性质。 Cystmt标签(m/z 六个样品的126,127,128,129,130​​和131用于标记响应于治疗的蛋白质硫醇,而ITRAQ标签(m/z 六个样品的114,115,116,117,119和121用于标记肽的N末端,以分析实验期间的蛋白质水平变化。通过利用不同的质量标签及其标记特异性,可以量化蛋白质氧化还原的变化和同一实验中的总水平。蛋白质氧化还原调节是一种普遍存在的过程(
      • 去你。
      • 琼斯D.P.
      映射半胱氨酸蛋白质:氧化还原硫醇的分析。
      ,
      • Ghezzi P.
      • Bonetto V.
      氧化还原蛋白质组学:鉴定氧化改性蛋白质。
      ,
      • Mermelekas G.
      • Makridakis M.
      • Koeck T.
      • Vlahou A.
      氧化还原蛋白质组学:通过基于凝胶和LC-MS的方法从残留物修饰到推定的生物标志物鉴定。
      ),这种新的整合Cystmtraq方法的效用预计将在许多生物和医学领域大大推进氧化还原蛋白质组学研究,从而有利于广泛的科学家。

      实验步骤

       样品制备

      含有牛血清白蛋白,α-lactabumis,β-半乳糖苷酶,溶菌酶,鼻甲素和来自AB Sciex Itraq标签套件(AB Sciex Inc.,Foster City,CA)的β-乳酰叶蛋白的六种蛋白质混合物用于优化双标签程序和氧化实验。蛋白质在含有6的裂解缓冲液中溶解 m urea, 50 mm Tris, and 1 mm 乙二胺四乙酸,pH7.5,减少5米m 特里斯(2-羧乙基)膦在室温下为1小时。用1米进行氧化处理m H2O2 室温下为1小时。在处理后使用Zeba柱(Thermo Scientific Inc.)以除去还原和氧化剂。 Ellman对游离硫醇的测试是如前所述的测定的游离硫醇浓度(
      • Bulaj G.
      • Kortemme T.
      • Goldenber D.P.
      多肽半胱氨酸硫醇的电离 - 反应性关系。
      )。用于优化标记程序的样品以10-μg,20μg和40μg复制制备,以检查1:2:4折比率。制备每种浓度的两个独立重复。以固定量为20μg制备用于鉴定氧化还原蛋白和半胱氨酸的样品,并包括还原,组合氧化和减少的四个比例(1:1,1:2,1:4和1:8),并氧化样品。文化 大肠杆菌 (F 80Lac.zΔm15δ(Lac.Zya-argf)u169 recA1 结尾A1 HSD.R17 (rk,M.k+) phA supE44 λ Thi.1 GYL.A96 rel.A1)在培养基中饱食均匀生长至 A600 在37℃下为0.4,并用500μm处理m Naocl 1小时。如前所述进行蛋白质提取(
      • Leichert L.I.
      • Gehrke F.
      • Gudiseva H.V.
      • Blachellt T.
      • 伊伯特M.
      • Walker A.K.
      • Strahler J.R.
      • 安德鲁斯P.C.
      • 雅各布U.
      量化体内氧化胁迫对硫醇氧化还原蛋白质的变化。
      )。

       Cystmt和Itraq标签

      如制造商(Thermo Scientific Inc.,Bremen,Germany)和Parker所示进行硫醇的直接和逆向标记 等等。 (
      • 帕克J.
      • 朱恩
      • 朱M.
      • 陈S.
      使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化钇蛋白酶。
      ), 分别。用于优化标记程序的蛋白质样品在处理后直接标记 特里斯(2-羧乙基)膦和Zeba柱清洗。我们用1倍的变化标记了样品,126 m/z 127. m/z,有2倍折叠的人更换128 m/z 129. m/z,和4倍折叠的人随130 m/z 131. m/z。对氧化还原实验进行反向标记。减少和氧化的样品接受了10米的烷基化m 2-碘乙酰胺在37℃下为1小时。通过用5米的处理来制备用于反向标记的降低的硫醇m 特里斯(2-羧乙基)膦在室温下为1小时。在Cystmt标记之前对两个样品进行快速清理Zeba柱。将样品组合以氧化成减少样品,增加每比率的减少样品的量,同时保持恒定的蛋白质总量。比率包括1:1(127 m/z),1:2(128 m/z),1:4(129 m/z)和1:8(130 m/z)。用126个标记完全减少和氧化样品 m/z 131. m/z, 分别。对于每个标记方法,使用3倍过量的囊肿标签以计算的游离硫醇,并在室温下进行标记2小时。根据ITRAQ手册(AB SCIEX Inc.)在37℃下进行12小时(
      • 帕克J.
      • 朱恩
      • 朱M.
      • 陈S.
      使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化钇蛋白酶。
      )。随后用C18脱盐柱(Nest Group Inc.,Southborough,MA)清洗肽,然后冻干至干。
      对于ITRAQ标记,将冻干样品重新悬浮于0.5 m 三乙基铵碳酸氢铵。根据制造商的手册(AB SCIEX Inc.)标记样品,并将最终浓度的70%异丙醇用于所有ITRAQ标签。标记后,用H淬灭样品2o,组合和冻干。用于优化双标签程序的样品进行直接标记,114 m/z 115. m/z 检查1倍的变化,116 m/z 117. m/z 对于2倍的变化,和119 m/z 和121. m/z 一个4倍的变化。用于氧化还原实验的样品,还原样品,1:1,1:2,1:4,1:8和氧化样品用114重组 m/z, 115 m/z, 116 m/z, 117 m/z, 119 m/z和121. m/z。为了 大肠杆菌 样品,用囊肿标签标记三种对照生物重复(126 m/z, 128 m/z和130. m/z)然后用Itraq标签(113 m/z, 117 m/z和119. m/z)。用囊肿标签标记了三种NaoCl处理的生物重复(127 m/z, 129 m/z和131. m/z)然后用Itraq标签(114 m/z, 116 m/z和121. m/z)。

       强阳离子交换和LC-MS / MS

      肽溶解在强阳离子交换溶剂A(25%(v / v)乙腈,10米中m 甲酸铵和0.1%(v / v)甲酸,pH2.8)和使用具有聚糖HPLC 1260系统的分级,具有多硫代乙基柱(2.1×100mm,5μm,300)。用0%至20%溶剂B的线性梯度洗脱肽(25%(v / v)乙腈和500μmm 铵甲酸铵,pH6.8)超过50分钟,然后在5分钟内升温至100%溶剂B.通过监测280nm处的吸光度来收集六个级分。将级分冻干并溶解在10μl负载溶剂(3%V / V乙腈,0.1%v / v乙酸)中并加载到C18百墨纳米射线柱上(75μm内径,3μm,100,迪奥克斯Inc.,Bannockburn,IL)。洗脱梯度在97%溶剂A(0.1%v /乙酸,3%v / v乙腈)/ 3%溶剂B(0.1%v / v乙酸,96.9%v / v丙酮腈)中并完成40 %溶剂A / 60%溶剂B在90分钟内。每次运行后,用90%溶剂B洗涤柱,并用溶剂A重新平衡A. MS / MS分析在LTQ轨道XL质谱仪上进行,在阳性模式下应用数据相关的MS扫描和MS / MS采集(Thermo Scientific,Bremen,德国)。调查全扫描MS谱(m/z 400-1800)在orbitrap中获得了决议 r = 60,000 at. m/z 400.用于获取HCD的MS / MS检测的10个具有检测的10个最强烈离子的数据依赖性分析在400时设定为7500 m/z 分辨率为30,000个信号阈值,35个归一化碰撞能量的5-MS激活时间,动态排除为30秒,重复计数为1.典型的质谱条件包括2.2 kV,无护套和辅助气体流量的喷射电压,加热毛细管温度为200°C,毛细管电压为44 V,管透镜电压为165 V,离子隔离宽度为1.0 m/z。根据制造商的使用SDS,牛磺酸钠,MRFA肽和Ultramark的混合物,根据制造商的指导来进行质谱仪校准。

       数据库搜索和数据分析

      蛋白质组发现者1.4含有续集算法(Thermo Scientific Inc.,Bremen,Germany)用于搜索由IPI的背景中的六蛋白混合物(AB Sciex Inc.)的序列组成的数据库 HOMO SAPIENS. 序列数据库(2012年7月12日下载; 91,464个条目)用于六种蛋白质样本和来自NCBI的细菌数据库(2013年4月3日下载; 14,961,948条参赛作品) 大肠杆菌 样品。谱图格和光谱选择器的蛋白质组发现者节点分别设定为300Da和5kDa的最小和最大前体质量的频谱特性滤波器和光谱选择器。续集算法用于蛋白质鉴定。将参数设定为胰蛋白酶消化的两种最大未缺少的裂解位点,绝对Xcorr阈值为0.4,以及0.1的片段离子截止百分比。公差被设定为10 ppm前体质量耐受性和0.01-DA片段质量容差。动态修饰包括磷酸化(+79.966(S,T,Y)),氧化(+15.995Da(m)),氨基甲酰基(+57.021Da(c)),Itraq8plex(+304.205de(k),和cystmt6plex(+304.177 DA(c))。N-末端改性为ITRAQ8PLEX(+304.205AD)。蛋白质识别用于蛋白质识别,具有0.01的严格目标假发现率的参数和放松的目标假发现率为0.05。记者将离子量化节点设置为20ppm的峰积分容限,并且在囊肿和ITRAQ报告器离子峰值强度下进行噪声与噪声比率阈值的2ppm的峰值探测器使用的质量探测器。过滤肽结果仅包括具有假发现速率置信度和半胱氨酸残基的肽。
      在肽和蛋白质鉴定后,分析Cystmt和Itraq数据集,并在相应的报告离子中进行折叠变化。总结了相同肽的报告离子峰值强度,并且这些值是数值 2 转变。如前所述除去异常值(
      • 町H.
      • Kim Y.
      • Jun H.J.
      • 李斯。
      • 李约。
      OutlierD:使用大分回归在质谱数据上使用定量回归来检测R包。
      )。在优化实验期间产生的比率相对于1倍设定,并且手段被标准化为它们各自的重复(
      • Hebert A.S.
      • Merrill A.E.
      • Bailey D.J.
      • 仍然是a.j.
      • Westphall M.S.
      • 威兵e.r.
      • Pagliarini D.J.
      • Coon J.J.
      中子编码的多路复用蛋白质组定量的质量签名。
      )。相对于1:1设定在施用氧化还原处理期间产生的比率,并且从所有样品峰强度中减去用于减少样品的背景峰值强度值。手段也被标准化为各自的重复(
      • Hebert A.S.
      • Merrill A.E.
      • Bailey D.J.
      • 仍然是a.j.
      • Westphall M.S.
      • 威兵e.r.
      • Pagliarini D.J.
      • Coon J.J.
      中子编码的多路复用蛋白质组定量的质量签名。
      )。对于蛋白质量化,需要至少三种独特的肽。通过求解所有相应肽的报告离子峰强度(
      • 卡里拉罗B.
      • Yanofsky C.
      • Laboissiere S.
      • 纳顿r.
      • kearney r.e.
      组合肽强度以估计相对蛋白质丰富的方法。
      )和如上所述产生的比率。为了从生物样品中分析数据,我们根据上述报道,从中值归一化峰强度值下相应地计算了比率。学生们 t 进行LOG2转化处理/控制比上的测试(双尾),并且 p 通过Q值虚假发现速率方法进一步纠正值(
      • Storey J.D.
      一种直接的虚假发现率的方法。
      )。 Q值小于0.05的肽和大于1.2或小于0.8的倍数变化被认为是统计学意义。用囊肿标记的显着肽面对通过ITRAQ定量的显着蛋白质。学生们 t 在囊肿标记的肽的折叠变化和通过ITRAQ定量的相应蛋白质的折叠变化进行测试。考虑到通过ITRAQ定量的蛋白质的折叠变化(以下)考虑蛋白质的折叠变化( 补充图。S1)。
      鉴定的所有肽和蛋白质的列表可以在补充材料中找到(补充表S2,S3和S4)。

      结果

       Cystmt和Itraq双标签Cystmtraq程序的优化

      为了测试衍生自六蛋白质混合物的肽的双标记的可行性,实施直接标记方法,控制不同样品的量以观察样品之间的实验折叠变化(补充图S2)。将蛋白质等来分为六个样品,两个在10μg,2个,2至20μg,20μg下。在减少后,使用囊肿标签来标记六个样品。然后将样品进行胰蛋白酶消化和ITRAQ标记,然后混合以产生1:1:2:2:4:4的理论折叠变化。记者离子比率从蛋白质组发现者出口,通过检查报告离子比的偏差从肽和蛋白质的预期值检查报告离子比的偏差来确定标记效率。使用1×,2×和4倍的折叠改变以检查双标签效率,我们发现含半胱氨酸的肽用囊肿标记,然后进行预期的折叠变化(Fig. 1A, 补充图S3)。胺标记的肽标签也显示了预期的折叠变化(Fig. 1A, 补充图S3)。在ITRAQ定量相对于Cystmt定量中观察到的更大可变性可能是由于分析的肽数量的差异。当仅分析含半胱氨酸的肽时,囊肿和ITRAQ定量的变化相似,(补充图S4)。有趣的是,肽水平定量可以扩展到蛋白质水平(IE。 蛋白质水平变化也遵循预期比率)(补充图S5)。半胱氨酸肽的MS / MS光谱分析显示,低质量区域中ITRAQ标签的折叠变化与囊肿标签的折叠变化相似(Fig. 1B),表明ITRAQ和Cystmt标签都以相同的效率标记不同官能团的肽。 ITRAQ定量数据的相关性分析和Cystmt定量数据显示,两个数据集高度相关(R2 = 0.94) (Fig. 1C)。这些结果表明,使用不同的等因素标签(ITRAQ和Cystmt),肽的双标记是可行的。可以在肽和蛋白质水平下确定样品的预期折叠变化。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1Cystmtraq标记可行性和性能。 A,显示使用囊肿和ITRAQ定量获得的肽比的测量(盒子和晶须)和预期值(虚线红线0,1和2)的箱图。 B,肽MPCTEDYLSLILNR的代表性MS / MS光谱显示1:1:2:2:4:4倍的ITRAQ标签(m/z 114,115,116,117,119和121)和Cystmt标签(m/z 126,127,128,129,130​​和131)。 C,Cystmt与Itraq定量的高相关,显示了双标签Cystmtraq方法中的偏差(R.2 = 0.94).

       Cystmtraq鉴定氧化还原蛋白和半胱氨酸的建立

      为了在氧化还原实验中实现双标记方法,分别减少两组蛋白质,然后在不同比例中组合,同时保持每个样品中的恒定总蛋白质量(补充图S6)。使用间接标记程序,其中六种蛋白质混合物接受硫醇烷基化,还原氧化硫醇,以及随后用硫醇特异性囊肿标签标记和胺标记的ITRAQ标签(补充图S6)。经处理的样品的囊肿比反映了样品中氧化蛋白的相对量,并且实验比率原始以适合所有样品的预期值(Fig. 2A, 补充图S7A)。 ITRAQ标签的分析显示,样品中的肽量没有改变(Fig. 2B, 补充图S7B),蛋白质水平的结果与肽水平的结果一致(补充图S8)。光谱分析显示含半胱氨酸肽的Cystmt和Itraq标记的类似趋势(Fig. 2C),含非半胱氨酸肽中的Itraq标记没有变化(Fig. 2D)。这些结果清楚地表明,双阻碍标记程序允许人类检查半胱氨酸氧化还原的变化,同时监测蛋白质水平变化,如果有的话。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2使用Cystmtraq的半胱氨酸氧化还原变化和蛋白质水平变化的鉴定和定量。 箱图显示用Cystmt标签获得的半胱氨酸肽比的测量(盒子和晶须)和预期值(虚线红线-0.58,-1.32,-2.17和1)(A用ITRAQ标签(预期值为0)获得的含非半胱氨酸的肽水平(B)在从氧化的样品中,以1:2,1:4和1:8的比例降低。 C,含半胱氨酸肽FLDDDDDDDIMCVK的代表性MS / MS谱显示半胱氨酸氧化还原与ITRAQ标签(m/z 114,115,116,117,119和121)和Cystmt标签(m/z 126,127,128,129,130​​和131)。 D,含非半胱氨酸的肽VyveelkptpegCleqk的代表性MS / MS谱显示出与ITRAQ标签没有明显的蛋白质水平变化(m/z 114,115,116,117,119和121)。

       Cystmtraq在大肠杆菌氧化还原蛋白质组学中的应用 氧化应激下的细胞

      我们进一步测试了Cystmtraq在复杂样品的氧化还原蛋白质组学中的应用。使细胞暴露于氧化应激,我们治疗指数增长 大肠杆菌 cells with 500 μm NaoCl 1小时诱导细胞氧化还原和蛋白质水平的变化(补充图S9)。将细胞培养物直接收获到冰冷的100%(w / v)tca中。这种“酸陷阱”步骤非常重要,因为添加TCA不仅裂解细胞,而且对所有硫醇酸盐进行质子化,这显着减缓了硫醇二硫化物交换反应(
      • Lighert L.I.
      • 雅各布U.
      蛋白质硫醇修饰在体内可视化。
      )。总共鉴定了912个含半胱氨酸的肽,其中96.5%具有Itraq和Cystmt标记。在912个含半胱氨酸的肽中,33分显性氧化氧调节,显示Q值≤0.05,增加≥1.2倍或≤0.8倍降低(补充表S1)。在氧化还原蛋白质中,10(例如 先前报道了外膜蛋白A,甘油-3-磷酸脱氢酶和苹果酸脱氢酶具有氧化还原敏感的半胱氨酸(补充表S1)。当考虑蛋白质水平变化时,含有氧化氢敏感性纤维素的33个肽中的5个也显示出显着的蛋白质量变化(Fig. 3A)。将耐粘菌素受体I和果糖 - 双磷酸醛糖酶分配为仅在分析Cystmt定量时调节的氧化还原。然而,当施用蛋白质转换校正时(基于ITRAQ定量),这些蛋白质没有显示出显着的氧化还原调节(Fig. 3B)。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3Cystmtraq的生物学应用。 A,鉴定含有蛋白质水平变化的含半胱氨酸肽,氧化还原肽和肽的数量。在Cystmt标签中具有≥1.2或≤0.8的倍数变化的半胱氨酸肽和≤0.05的Q值被认为是氧化还原。使用相同的标准来确定肽与ITRAQ标签进行蛋白质水平变化。 B,半胱氨酸氧化还原量鉴定为氧化还原的五种肽校正蛋白质周转前后调节:(a)cfedngllydlleqggr,(b)nvgsfdnnnvgsgmvgapacgdvmk,(c)apsllqlspdwtsnc,(d)gcgaldwgmqsr,和(e)illecvk。

      讨论

      本文呈现的结果表明,用两种不同系列的等因素标签,囊肿和ITRAQ双标记蛋白质是可行的,可用于检查一个实验中同时同时进行蛋白质氧化还原和总量。因为涉及半胱氨酸肽的富集步骤,因此该方法具有揭示氧化还原修饰的化学计量的潜力。然而,可以包括富集步骤以在双标记过程之后捕获低丰纹的氧化还原蛋白。在这种情况下,需要通过LC-MS / MS分析富集的分数和流动。
      与现有的氧化还原蛋白质组学方法相比(例如
      • 傅C.
      • 胡锦涛
      • 刘涛。
      • 以前t.
      • 萨文玛J.
      • 李H.
      用数字和ICAT的氧化还原敏感蛋白质组的定量分析。
      ,
      • 朱M.
      • 朱恩
      • 哈德阿。
      • assmann s.m.
      • 陈S.
      基于硫醇的氧化还原蛋白在脱落酸和茉莉酸甲酯信号中 芸苔栗鸟 guard cells.
      ,
      • Izquierdo-Alvarez A.
      • 拉莫斯E.
      • Villanueva J.
      • Hernansanz-AugustínP.
      • Fernández-Rodriguez R.
      • Tello D.
      • Carrascal M.
      • Martínez-Ruiz A.
      差分氧化还原蛋白质组学允许鉴定在内皮细胞中的半胱氨酸残基上可逆地氧化的蛋白质响应于急性缺氧。
      ),这种新开发的CystmtraQ方法是有利的,因为它允许研究人员准确识别和定量氧化还原性半胱氨酸,肽和蛋白质,并在氧化还原变化和总蛋白质变化之间获得高效率。因为在与相同样品的同一实验中使用Cystmt和Itraq,因此解决了氧化还原肽/蛋白质测定中蛋白质水平变化的样品变化和复杂性。通过高效率可以实现测定半胱氨酸肽的氧化还原敏感性的高置信度和准确性。因为该方法获取氧化还原和总蛋白水平信息,所以可以保留诸如气孔制剂和患者活组织检查等少量的样品。与使用两种不同的实验相比,导致鉴定的肽和蛋白质的较低的相关性和高变化,这种集成的Cystmtraq方法是有效且有效的。然而,应该指出的是,与MS2串联质量标签和ITRAQ技术相关的前体干扰的固有问题引起了比压缩(
      • L.
      • RAD R.
      • Gygi S.P.
      • 哈斯W.
      MS3消除了异巴里复用定量蛋白质组学中的比率变形。
      ,
      • 温格C.D.
      • 李米夫。
      • Hebert A.S.
      • Mcalister G.C.
      • Phanstiel D.H.
      • Westphall M.S.
      • Coon J.J.
      气相净化使得能够进行精确,多重蛋白质组定量,具有同位素标记。
      )。 MS3在新一代质谱仪上的功能(例如 Thermo Scientific orbitrap Fusion)可以克服这个问题。尽管如此,这种Cystmtraq技术突破将刺激氧化还原蛋白质组学的进展,以及其他生物学和医学领域的其他发生改性蛋白质组学。

      致谢

      通过具有数据集提交编号27189的骄傲伙伴储存库已经将质谱数据沉积到ProteomexChange联盟。

      补充材料

      参考

        • 去你。
        • 琼斯D.P.
        映射半胱氨酸蛋白质:氧化还原硫醇的分析。
        J. Biol。化学。 2013; 288: 26512-26520
        • Ghezzi P.
        • Bonetto V.
        氧化还原蛋白质组学:鉴定氧化改性蛋白质。
        蛋白质组学。 2003; 3: 1145-1153
        • Barty J.W.
        • 汉普顿M.B.
        • 冬季冬季C.C.
        约束细胞中过氧化氢敏感硫醇蛋白的蛋白质组学检测。
        生物学习。 j。 2005; 389: 785-795
        • Alkhalfioui F.
        • 雷纳德M.
        • Vensel W.H.
        • Wong J.
        • Tanaka C.K.
        • 赫尔克曼W.J.
        • Buchanan B.B.
        • 蒙特里希尔
        在萌发期间,硫昔林连接的蛋白质减少 Medicago Truncatula. seeds.
        植物理性。 2007; 144: 1559-1579
        • alvarez s.
        • 威尔逊G.H.
        • 陈S.
        拟南芥体内氧化还原调节蛋白的蛋白质组学分析。
        J.Chromatogr。 B. 2009; 877: 101-104
        • 傅C.
        • 胡锦涛
        • 刘涛。
        • 以前t.
        • 萨文玛J.
        • 李H.
        用数字和ICAT的氧化还原敏感蛋白质组的定量分析。
        J.蛋白质组。 2008; 7: 3789-3802
        • 朱M.
        • 朱恩
        • 哈德阿。
        • assmann s.m.
        • 陈S.
        基于硫醇的氧化还原蛋白在脱落酸和茉莉酸甲酯信号中 芸苔栗鸟 guard cells.
        植物J. 2014; 78: 491-515
        • 去你。
        • roede J.R.
        • orr m.
        • 梁Y.
        • 琼斯D.P.
        集成氧化还原蛋白质组学和线粒体代谢组学,以确定CD毒性的机制。
        毒素。 SCI。 2014; 139: 59-73
        • 帕克J.
        • 朱恩
        • 朱M.
        • 陈S.
        使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化钇蛋白酶。
        J. Vis。 Exp。 2012; 61: 3766-3791
        • 麦克杜纳格B.
        • Martínez-Acedo P.
        • várquezJ.
        • Padilla A.
        • Sheehan D.
        • BárcenaJ.A.
        Itraq试剂在半胱氨酸残基相对量化可逆氧化还原状态的应用。
        int。 J.蛋白质组学。 2012; 2012: 1-9
        • Tambor V.
        • 猎人C.L.
        • Seymour S.L.
        • Kacerovsky M.
        • Stulik J.
        • Lenco J.
        CYSTRAQ- ITRAQ的组合和富集的半胱氨酸肽用于露出和定量隐藏蛋白质蛋白。
        J.蛋白质组学。 2012; 75: 857-867
        • Mermelekas G.
        • Makridakis M.
        • Koeck T.
        • Vlahou A.
        氧化还原蛋白质组学:通过基于凝胶和LC-MS的方法从残留物修饰到推定的生物标志物鉴定。
        专家Rev.蛋白质组学。 2013; 10: 537-549
        • 刘P.
        • 张H.
        • 王H.
        • 夏Y.
        氧氮蛋白鉴定拟南芥蛋白质组中的氧化还原敏感性半胱氨酸,一种定量的氧化还原蛋白质组学方法。
        蛋白质组学。 2014; 14: 750-762
        • 苏D.
        • 长边m.j.
        • 郭杰。
        • Hatchell K.E.
        • Chu R.K.
        • Clauss T.R.W.
        • aldrich J.T.
        • 吴S.
        • Purvine S.
        • 营地D.G.
        • 史密斯r.d.
        • thrall b.d.
        • 钱W.
        树脂辅助富集和异巴丙基丙酮鼠中小鼠巨噬细胞蛋白质组学鉴定及定量。
        Radic。 BIOL。 Med。 2014; 67: 460-470
        • 陈S.
        • 哈德阿。
        植物蛋白质组学的进展。
        蛋白质组学。 2006; 6: 5504-5516
        • Izquierdo-Alvarez A.
        • 拉莫斯E.
        • Villanueva J.
        • Hernansanz-AugustínP.
        • Fernández-Rodriguez R.
        • Tello D.
        • Carrascal M.
        • Martínez-Ruiz A.
        差分氧化还原蛋白质组学允许鉴定在内皮细胞中的半胱氨酸残基上可逆地氧化的蛋白质响应于急性缺氧。
        J.蛋白质组学。 2012; 75: 5449-5462
        • Muthuramalingam M.
        • matros A.
        • Scheibe R.
        • 嘲笑H.P.
        • DIETZ K.J.
        体外和体内叶绿体的氢敏感蛋白质组。
        正面。植物SCI。 2013; 19: 4-54
        • 冲P.K.
        • GaN C.S.
        • PHAM T.K.
        • 赖特P.C.
        相对和绝对量化(ITRAQ)再现性的同位式标签:多次注射的含义。
        J.蛋白质组。 2006; 5: 1232-1240
        • 李杰。
        • 酸值H.J.
        无标签定量霰弹枪蛋白质组学分析水稻籽粒发育。
        蛋白质组SCI。 2011; 9: 51-61
        • Bulaj G.
        • Kortemme T.
        • Goldenber D.P.
        多肽半胱氨酸硫醇的电离 - 反应性关系。
        生物学习。 1998; 37: 8965-8972
        • Leichert L.I.
        • Gehrke F.
        • Gudiseva H.V.
        • Blachellt T.
        • 伊伯特M.
        • Walker A.K.
        • Strahler J.R.
        • 安德鲁斯P.C.
        • 雅各布U.
        量化体内氧化胁迫对硫醇氧化还原蛋白质的变化。
        Proc。 Natl。阿卡。 SCI。美国。 2008; 105: 8197-8202
        • 帕克J.
        • 朱恩
        • 朱M.
        • 陈S.
        使用同位素标记质谱法分析硫醇氧化钇蛋白酶。
        J. Vis。 Exp。 2012; 61: 3766-3791
        • 町H.
        • Kim Y.
        • Jun H.J.
        • 李斯。
        • 李约。
        OutlierD:使用大分回归在质谱数据上使用定量回归来检测R包。
        生物信息学。 2008; 24: 882-884
        • Hebert A.S.
        • Merrill A.E.
        • Bailey D.J.
        • 仍然是a.j.
        • Westphall M.S.
        • 威兵e.r.
        • Pagliarini D.J.
        • Coon J.J.
        中子编码的多路复用蛋白质组定量的质量签名。
        NAT。方法。 2013; 10: 332-334
        • 卡里拉罗B.
        • Yanofsky C.
        • Laboissiere S.
        • 纳顿r.
        • kearney r.e.
        组合肽强度以估计相对蛋白质丰富的方法。
        生物信息学。 2010; 26: 98-103
        • Storey J.D.
        一种直接的虚假发现率的方法。
        J. R. Stat。 SOC。 B. 2002; 64: 479-498
        • Lighert L.I.
        • 雅各布U.
        蛋白质硫醇修饰在体内可视化。
        Plos Biol。 2004; 2: e333
        • L.
        • RAD R.
        • Gygi S.P.
        • 哈斯W.
        MS3消除了异巴里复用定量蛋白质组学中的比率变形。
        NAT。方法。 2011; 8: 937-940
        • 温格C.D.
        • 李米夫。
        • Hebert A.S.
        • Mcalister G.C.
        • Phanstiel D.H.
        • Westphall M.S.
        • Coon J.J.
        气相净化使得能够进行精确,多重蛋白质组定量,具有同位素标记。
        NAT。方法。 2011; 8: 933-935