用于细胞溶质羧肽酶1的天然底物的C-术语筛网1揭示了酸性蛋白C Termini的加工*

  • Sebastian Tanco.
    隶属关系
    医疗蛋白质研究,VIB,B-9000根特,比利时

    格伦大学生物化学系,B-9000格伦蒂姆

    生物医学研究所和生物化学研究所和生物化学系和分子生物学系,大学Autōnomade巴塞罗那,08193 Bellaterra,巴塞罗那,西班牙
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  • 奥利维亚侵权
    隶属关系
    生物医学研究所和生物化学研究所和生物化学系和分子生物学系,大学Autōnomade巴塞罗那,08193 Bellaterra,巴塞罗那,西班牙
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  • 汉斯解除
    隶属关系
    医疗蛋白质研究,VIB,B-9000根特,比利时

    格伦大学生物化学系,B-9000格伦蒂姆
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  • Francesc Xavier Aviles.
    隶属关系
    生物医学研究所和生物化学研究所和生物化学系和分子生物学系,大学Autōnomade巴塞罗那,08193 Bellaterra,巴塞罗那,西班牙
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  • Kris Gevaert.
    隶属关系
    医疗蛋白质研究,VIB,B-9000根特,比利时

    格伦大学生物化学系,B-9000格伦蒂姆
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  • Petra Van Damme.
    一致
    应如何解决对应的通信:医疗蛋白质研究部,法兰德斯生物技术生物技术研究所,根特大学,A.Baertsoenkaai 3,B-9000特纳,比利时;电话:+ 32-92649279;传真:+ 32-92649496;
    隶属关系
    医疗蛋白质研究,VIB,B-9000根特,比利时

    格伦大学生物化学系,B-9000格伦蒂姆
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  • 朱莉娅洛伦佐
    一致
    应解决谁的通信:生物技术研究所和生物医药和生物化学系,生物化学和分子生物学系,Universitat Autgernoma de巴塞罗那,IBB-Campus de La Uab,08193 Bellaterra,巴塞罗那,西班牙。电话:+ 34-935868936;传真:+ 34-935812011。
    隶属关系
    生物医学研究所和生物化学研究所和生物化学系和分子生物学系,大学Autōnomade巴塞罗那,08193 Bellaterra,巴塞罗那,西班牙
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  • 作者脚注
    * f.x.a.和J.L.承认支持西班牙经济和竞争力(Mineco),Grant Bio2013-44973-R和欧洲委员会(Project FP7-Health-2009-241919-Livimode)。公斤。已得到Prime-XS项目的支持,由欧盟第7框架计划提供资助的协议编号262067。
    本文包含补充图。 S1至S4和表S1至S5。
      细胞溶质羧肽酶(CCPS)构成了与轴突再生和神经元变性相关的M14金属羧肽酶的新亚家族。 CCPS是氯化淀粉化酶,能够催化聚谷氨酸侧链的缩短和微管蛋白,Telokin和Myosin轻链激酶的基因编码的C末端。这些酶的功能并不完全理解,部分原因是缺乏关于细胞中的C末端蛋白质处理及其功能影响的信息。通过C末端COFRADIC,一种位置蛋白质组学方法,我们搜索了CCP1的蜂窝基板目标,这是这个家庭最相关的成员。我们在这里确定了七种新推定的CCP1蛋白质底物,包括核糖体蛋白,平移因子和高迁移率组蛋白。此外,我们首次表明CCP1处理谷氨酸和C末端的天冬氨酸。这些C末端在分子相互作用中的含义进一步表明CCP1介导的酸性蛋白质尾部的缩短可能调节蛋白质 - 蛋白质和蛋白质-DNA相互作用。
      细胞溶质羧肽酶(CCPS)
      使用的缩写是:
      CCPS.
      细胞溶质羧肽酶
      cofradic.
      组合分数对角线色谱
      eIF4H
      真核翻译开始因子4h
      HMGB.
      高迁移率组蛋白B.
      ID。
      内径
      地图
      微管相关蛋白
      MCPS.
      Metallocarbox型酶
      MLCK1
      肌球蛋白轻链激酶1
      Nna1
      由腋窝诱导的神经系统核蛋白
      PCD.
      Purkinje细胞变性
      聚乙烯亚胺
      RPS9
      40s核糖体蛋白S9
      TRAD1
      Traf型锌手指结构域蛋白质。
      1使用的缩写是:CCPS.
      细胞溶质羧肽酶
      cofradic.
      组合分数对角线色谱
      eIF4H
      真核翻译开始因子4h
      HMGB.
      高迁移率组蛋白B.
      ID。
      内径
      地图
      微管相关蛋白
      MCPS.
      Metallocarbox型酶
      MLCK1
      肌球蛋白轻链激酶1
      Nna1
      由腋窝诱导的神经系统核蛋白
      PCD.
      Purkinje细胞变性
      聚乙烯亚胺
      RPS9
      40s核糖体蛋白S9
      TRAD1
      Traf型锌手指结构域蛋白质。
      形成最近描述的M14金属羧酰型酶(MCP)与神经变性(
      • Rodriguez de la Vega M.
      • 塞维利亚r.g.
      • Hermoso A.
      • 洛伦佐J.
      • 坦戈斯。
      • Diez A.
      • Fricker L.D.
      • Bautista J.M.
      • Aviles F.X.
      NNA1样蛋白是一种新的和多样的M14亚家族的活性金属羧肽酶。
      ,
      • Rodriguez de la Vega M.
      • 洛伦佐J.
      • 侵权O.
      • Aviles F.X.
      • Bautista J.M.
      纤毛相关细胞溶质羧肽酶(CCPS)的功能偏析和新兴作用。
      ,
      • Kalinina E.
      • Biswas R.
      • Berezniuk I.
      • Hermoso A.
      • Aviles F.X.
      • Fricker L.D.
      小鼠细胞溶质羧肽酶的新型亚家族。
      ,
      • 王T.
      • 摩根J.I.
      Purkinje细胞变性(PCD)小鼠:神经元变性和再生之间的意外分子链接。
      )。人和小鼠基因组编码六个CCP成员(CCP1-6),均与NNA1(官方症引起的神经系统核蛋白),第一个报告和最佳特征的CCP亚家族成员。当筛选在轴突再生期间上调的基因时,鉴定了NNA1,后来重命名的CCP1,发现与MCP家族成员同源(
      • 哈里斯A.
      • 摩根J.I.
      • Pecot M.
      • Soumare A.
      • 奥斯本A.
      • 翱翔。
      再生电动机神经元Express NNA1,新的ATP / GTP结合蛋白与含锌羧酸锌有关。
      )。这一发现建议CCP在轴突再生中的作用,这是通过研究进一步证实的 C. Elegans. 表明轴突后轴突再生需要CCP6(
      • Ghosh-Roy A.
      • Goncarov A.
      • jin y。
      • Chisholm A.D.
      Kinesin-13和微管蛋白的后期改变调节轴突再生中的微管生长。
      )。功能突变丧失 CCP1 / NNA1 基因导致purkinje细胞变性的ataxic表型(PCD.) 老鼠 (
      • Fernandez-Gonzalez A.
      • la spada a.r.
      • 脚蹬J.
      • Higdon J.C.
      • 哈里斯B.S.
      • Sidman R.L.
      • 摩根J.I.
      • Zuo J.
      由腋窝诱导的基因,NNA1中的突变引起的purkinje细胞变性(PCD)表型。
      ),其特征在于小脑紫癜细胞的晚期退化(3-5周龄)(
      • Mullen R.J.
      • e
      • Sidman R.L.
      Purkinje细胞变性,小鼠的新神经突变。
      )。在显示生殖异常的旁边,这些小鼠还表现出神经系统中其他细胞类型的选择性退化;也就是说,丘脑神经元,视网膜光感受器和嗅灯泡二尖瓣细胞(
      • 空白J.C.
      • Mullen R.J.
      • 拉马米。
      PCD小脑突变小鼠的视网膜变性。 II。电子显微镜分析。
      ,
      • Greer C.A.
      • 牧羊地G.M.
      神经突变小鼠浦羽细胞变性(PCD)中的二尖瓣细胞变性和感觉功能。
      ,
      • o'gormans。
      • Sidman R.L.
      “purkinje细胞变性”突变小鼠中丘脑神经元的退化。 I.神经元损失的分布。
      )。这些发现将CCP转发为神经元变性和再生之间的意外分子联系。虽然CCP1功能丧失的分子途径导致神经元变性 PCD. 未完全理解小鼠,已经提出了不同的机制,例如内质网应激(
      • kyuhou s。
      • kato n.
      • Gemba H.
      紫癜细胞变性小鼠内质网胁迫和活性微胶质的出现。
      ),功能障碍线粒体(
      • Chakrabarti L.
      • ENG J.
      • Ivanov N.
      • 花园G.A.
      • la spada a.r.
      自噬激活和增强的乳化物在神经元死亡之前表征PCD小鼠的PURKINJE细胞。
      ),通过异常的微管相关蛋白(MAPS)的异常水平的微管稳定性失调(
      • 李杰。
      • 顾x。
      • 可能。
      • Calicchio M.L.
      • 孔D.
      • 滕y.d.
      • yu l.
      • 李克特上午。
      • 瓦尔丹尼亚克。
      • Pasqualini R.
      • ARAP W.
      • libermann t.a.
      • 斯奈德e.y.
      • Sidman R.L.
      NNA1通过赖氨酸氧化酶的肽和NF-κB信号传导介导Purkinje细胞树突式发育。
      ),增加水管蛋白聚谷氨酰胺水平(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      )和由DNA病变的积累引起的逐步转录沉默(
      • 巴尔兰斯州F.C.
      • Casafont I.
      • 拉法加V.
      • Weruaga E.
      • Alonso J.R.
      • Berciano M.T.
      • Lafarga M.
      PCD小鼠中的Purkinje细胞变性揭示了与缺陷DNA修复有缺陷的染色质重组和基因沉默。
      ,
      • 巴尔兰斯州F.C.
      • Casafont I.
      • Weruaga E.
      • Alonso J.R.
      • Berciano M.T.
      • Lafarga M.
      核仁破坏和CAJAL身体拆卸是尿红杂交细胞DNA损伤诱导的神经变性的核标志。
      ,
      • valero J.
      • Berciano M.T.
      • Weruaga E.
      • Lafarga M.
      • Alonso J.R.
      PCD突变体小鼠中的二尖瓣细胞的细胞与DNA损伤,转录抑制和核斑点和Cajal身体的重组有关。
      )。
      最近,显示了小管蛋白处理中CCP的主要功能。 CCP亚家族,CCPS 1,4,5和6的四个成员,具体取出滤液管蛋白的基因编码的C末端谷氨酸残基(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      )。此外,CCPS 1,4和6缩短在线素上翻译后添加的聚谷氨酸侧链(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      )。另一方面,CCP5优先除去聚谷氨酰胺事件的分支点(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      ,
      • Kimura Y.
      • Kurabe N.
      • Ikegami K.
      • Tsutsumi K.
      • Konishi Y.
      • kaplan o.i.
      • Kunitomo H.
      • Iino Y.
      • Blacque O..
      • setou m.
      Caenorhabditis elegans和哺乳动物细胞源羧肽酶(CCPS)中鉴定小管蛋白脱谷氨酸酶。
      ,
      • Berezniuk I.
      • 里昂P.J.
      • Sironi J.J.
      • 肖H.
      • setou m.
      • 一个geletti R.H.
      • Ikegami K.
      • Fricker L.D.
      细胞溶质羧肽酶5从微管蛋白中除去α-和γ连接的谷氨酸。
      )。建议由于缺乏功能性CCP1引起的异常高的聚酰胺化水平,负责神经元变性 PCD. mice (
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      )。最近的研究进一步支持CCP和微管之间的联系,因为CCP的分类学分布表明其主要功能与纤毛和基底体有关(
      • Rodriguez de la Vega M.
      • 洛伦佐J.
      • 侵权O.
      • Aviles F.X.
      • Bautista J.M.
      纤毛相关细胞溶质羧肽酶(CCPS)的功能偏析和新兴作用。
      )。同样,这是 C. Elegans. CCP1 Ortholog,CCPP-1描述了调节感觉纤毛中微管的结构完整性,并沿着它们运输(
      • o'Hagan R.
      • Piasecki B.P.
      • Silva M.
      • Phirke P.
      • Nguyen K.C.
      • 大厅D.H.
      • 斯沃摩达P.
      • 巴尔米。
      管蛋白脱谷氨酸酶CCPP-1调节C.秀丽隐杆线虫中感觉纤毛的功能和稳定性。
      )。
      CCP1还发现C-inaligally Procound Telokin和肌球蛋白轻链激酶1(MLCK1)(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      ),肌球蛋白功能的调节剂。因此,假设CCP1可能切割额外的基材并识别这些可能有助于阐明其功能并理解观察到的一些异常 PCD. 老鼠。例如,描述了CCP1的核定位,但其在核过程中可能的功能仍然尚不清楚(
      • 哈里斯A.
      • 摩根J.I.
      • Pecot M.
      • Soumare A.
      • 奥斯本A.
      • 翱翔。
      再生电动机神经元Express NNA1,新的ATP / GTP结合蛋白与含锌羧酸锌有关。
      )。在这方面,巴尔兰塔斯 等等。 观察到广泛的染色质重组 PCD. 小鼠,导致未填写的DNA积累,最终达到浦本群细胞死亡(
      • 巴尔兰斯州F.C.
      • Casafont I.
      • 拉法加V.
      • Weruaga E.
      • Alonso J.R.
      • Berciano M.T.
      • Lafarga M.
      PCD小鼠中的Purkinje细胞变性揭示了与缺陷DNA修复有缺陷的染色质重组和基因沉默。
      )。
      在这里,我们在HEK293T细胞中使用C-Terminal Cofradic对CCP1底物进行了蛋白质组屏幕,最近开发的C-Trominomics方法(
      • van damme p.
      • Staes A.
      • 布鲁诺斯S.
      • 赫尔森K.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • Aviles F.X.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      互补的位置蛋白质组学,用于筛选内外和外泌蛋酶的基材。
      )。总体而言,我们确定了七种新推定的CCP1底物,所有这些载体中的所有包含酸性氨基酸在其基因编码的C末端中。这些底物中的两种验证证实了C-术语鉴定的加工事件,并证明这些是CCP1对这些蛋白质的直接作用的结果。分析这些酸性尾部在蛋白质中诸如高迁移率组蛋白B(HMGBS)的作用,LED指导我们通过缩短这些尾部来推测CCP1,可能调节蛋白质 - 蛋白质和蛋白质-DNA相互作用。

      实验步骤

       细胞培养

      HEK293T细胞(美国型文化收集(ATCC),Manassas,VA)在Dulbecco的改良Eagle的培养基(DMEM)中培养,4.5克/升葡萄糖和谷氨酸 - 我补充了10%胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA) 37°C,10%CO2 和95%的湿度。 HEK293F细胞(Invitrogen)在Freestyle 293表达培养基(Invitrogen)中在旋转振荡器(120rpm)的烧瓶中,在37℃下,8%CO2和70%的湿度。

       分子克隆和转染

      将人CCP1(UNIPROT Q9UPW5-1)的全长cDNA序列克隆到popinfs载体中(
      • Berrow N.S.
      • alderton d。
      • Sainsbury S.
      • Nettleship J.
      • assenberg r.
      • rahman n。
      • stuart d.i.
      • 欧文斯r.j.
      适用于高通量表达筛选应用的多功能连接无关的克隆方法。
      )。 A. -tag II(
      • Schmidt T.G.
      • Skerra A.
      用于一步纯化和高亲和力检测或蛋白质捕获的Strep标签系统。
      )在CCP1的C末端引入了血凝素(HA)表位。 CCP1 E270Q(使用牛CPA的编号系统,人类CCP1中的E1102Q)突变体由Quikchange站点诱变产生突变体,根据制造商的协议(Stratagene,La Jolla,CA)。含有Traf型锌手指结构域域的全长cDNA序列(TRY1,UNIPROT O14545)和人高迁移率组蛋白B3(HMGB3,UNIPROT O15347)被克隆到PTRIEX-6载体中(EMD Millipore,Billerica,MA )并且结果都是一个 -TAG和HA-TAG在其N Termini上引入。人高迁移率组蛋白B1(HMGB1,UniProt P09429)和B2(HMGB2,Uniprot P26583)的全长编码序列亚克隆到MBU-I-8856载体中(由Sven-Ghent大学Sveneyckerman教授提供,比利时)和该SRα启动子驱动的真核表达载体引入了这些蛋白质的N末端的Myc-标签。 补充图。S1 图示了本研究产生的构建体。
      使用线性25-kda聚乙烯亚胺(PEI)(PEI)进行DNA转染(PEI)(Polysciences,Warrington,PA)进行。简而言之,将DNA与PEI以1:3的比例混合,并在室温下在无血清培养基中培养15分钟。在40-50%的汇合下,HEK293T细胞暴露于每毫升培养物的1.4μgDNA的转染复合物60小时。 HEK293F细胞,106 每毫升细胞,每毫升培养为60小时,在1μgDNA下暴露于转染复合物。

       重组蛋白的表达和纯化

      CCP1,HMGB3和TRY1在哺乳动物细胞中表达和用A纯化亲和力 -Tactin Affinity Column(IBA GmbH,Göttingen,德国)。简而言之,如上所述用编码的构建体转染HEK293F细胞 - 这些蛋白质的标记版本。 60小时后,洗涤细胞并重新悬浮在2×107 每mL结合缓冲液的细胞(100米m Tris-HCl,pH 8.0,150米m 注释NaCl,使用EDTA的蛋白酶抑制剂混合物SET III(EMD Millipore))。然后对细胞进行三轮冻融裂解,并通过以16,000×离心清除细胞裂解物 g 在4°C下5分钟。清除的裂解物加载到a上 - 用粘合缓冲液平衡的蛋白柱。在用七个柱体积的结合缓冲液洗涤步骤之后, 用洗脱缓冲液洗脱并分级(补充2.5米的结合缓冲液)洗脱并分级m Desthiobiotin)。汇集了通过SDS-PAGE分析的最纯净的洗脱级分。

       体外衬底验证测定

      将亲和力纯化的CCP1在37℃下在5ng /μl,在37℃下在37℃下在CCP1缓冲液中以亲和纯化的TRY1或HMGB3在25ng /μl(80μm)m PIPES, pH 6.8, 1 mm MgCl2,补充有EDTA的蛋白酶抑制剂混合物组III(EMD Millipore))。在对照实验中,10米m o-phenanthroline,金属蛋白酶抑制剂加入到反应中(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      ,
      • Felber J.P.
      • COOMBS T.L.
      • Vallee B.L.
      羧肽酶A抑制1,10菲咯啉的机制。
      )。
      完整和加工的HMGB3的蛋白质分析由纳米LC-MS在水域纳米型HPLC(Waters Corporation,Milford,MA)内耦合到ESI-Quadrupole(Q) - 飞行(TOF) (Waters Corporation)质谱仪。简而言之,首先在捕获柱上装载10ng蛋白/μl的10μlHMGB3溶液(内部制成,100μm内径(ID)×20mm长度,5μmReprosil-pur Basic-C4-HD珠粒,Maisch博士,Ammerbuch-Rentringen,德国)以10μl/ min的流速,在2%乙腈中0.1%TFA。 4分钟后,将捕获柱与分析柱直接置入(内部制成75μm,即×170mm长度,3μmReprosil-pur Basic-C4-HD珠子,Maisch)。用线性梯度洗脱蛋白质,每分钟的1.7%的乙腈增加,流速为300 nL / min。使用Leu-Enkephalin的连续锁定质量校正校准MS光谱,获得500ppm的精度。 MASTLYNX软件(WATERS CORPORATION)的MAXENT 1 Deconvolution算法用于将多电荷的离子转换为真实大规模的最大频谱。
      纯化重组HMGB3的肽质量指纹纹理通过凝胶胰蛋白酶消化进行,然后使用超声-TOF-MS分析使用超薄的特性MALDI-TOF质谱仪(BRUKER DALTONICS,BREMEN)如前所述(
      • 托雷斯M.J.
      • trejo s.a.
      • Obregon W.D.
      • Aviles F.X.
      • Lopez L.M.
      • Natalucci C.L.
      Vasconcellea Quercifolia LaTex中存在的蛋白水解系统的表征。
      )。 Flexanalysis软件(版本3.3,Bruker Daltonics)用于创建峰值列表和生物源软件软件包(版本3.2,Bruker Daltonics)用于解释MS Spectra(Matrix Science,UK)和鉴定胰蛋白酶地图。序列编辑器3.2(Biotools 3.2,Bruker Daltonics)用于将实验胰蛋白酶肽图的指纹与胰蛋白酶肽图进行比较 在Silico. 胰蛋白酶消化,寻找无与伦比的峰值暗示到翻译后修改(PTMS)。以下标准用于该标准 在Silico. 酶消化:最多三个错过的胰蛋白酶切割并且仅允许单肽电荷,将150ppm设定为前体质量耐受性和蛋白质N末端的乙酰化,甲硫酸氧化氧化物,并且半胱氨酸残基的核化甲基化物被设定为可变修饰。

       免疫印迹

      对于免疫印迹,转染细胞在磷酸盐缓冲液中重悬,补充有0.1%或1%的Nonidet P-40,以及完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,德国)。将悬浮液对三回合的冻融裂解溶解,通过以16,000×离心清除细胞裂解物 g 在4°C下7分钟。将清除提取物与4×SDS-PAGE加载缓冲液混合,并在95℃下煮沸10分钟。离心后的颗粒在1×SDS-PAGE中煮沸以产生不溶性分数样品。对于全细胞裂解物样品,将4×SDS-PAGE加载缓冲液加入到细胞裂解物中而不先前离心。通过SDS-PAGE分析每种裂解物或级分的等量,并将分离的蛋白质被电印迹到PVDF膜(EMD Millipore)上,随后用5%脱脂乳封闭2小时。然后将PVDF膜在4℃下与初生抗体孵育16小时。使用以下一抗抗体:抗δ2-微管蛋白(1:1000; EMD Millipore),抗聚庚(抗聚酰胺化; 1:2000; MA GOROVSKY的礼物),防哈(HA-7; 1:3000 ; sigma),反标签II(mab-classic; 1:1000; IBA GmbH),抗酪氨酸 - 抗酪氨酸(TUB-1A2; 1:5000; SIGMA),抗β-肌动蛋白(1:100,000; SIGMA),抗HMGB2(AB67282; 1:500; ABCAM,CAMBRIDGE,UK),抗GAPDH(AB9484; 1:3000; ABCAM),抗组蛋白H3(1:2000;小区信号,DANVERS,MA)和抗PARP(1:4000; BD Pharmingen,San Diego,CA)。用PBS(PBS-T)的0.05%Tween 20洗涤后,用HRP标记的山羊驴抗兔(1:5000; GE Healthcare,Piscataway,NJ)或山羊抗小鼠(1:5000)检测原发性抗体(1:5000 ; Bio-Rad,慕尼黑,德国)。在PBS-T中三次洗涤后,用Immobilon西部化学燃烧器HRP底物(EMD Millipore)可视化免疫反应条带。
      对于使用Odyssey红外成像器(Li-Cor Biosciences,LiNcoln,Ne)可视化的免疫印迹进行了类似的方案,不同的是用卫生络阻断缓冲液(Li-Cor Biosciences)封闭膜,并且使用的二级抗体是山羊抗小鼠 - irdye 680和山羊抗兔 - irdye 800cw(Li-Cor Biosciences)。

       N-末端和C末端肽的分离

      HEK293T细胞在PBS中洗涤,重新悬浮在2×107 cells per ml in 50 mm 磷酸钠缓冲液,pH8.0,100米m NaCl, and 0.5 mm EDTA补充有完全蛋白酶抑制剂混合物(Roche Diagnostics GmbH)。对细胞进行三轮冻融裂解并通过以16,000×离心清除 g 在4°C下5分钟。根据制造商的说明,用生物-Rad的蛋白质测定测定蛋白质浓度,并加工1ml含有2.5mg蛋白质的清除细胞裂解物。将盐酸盐酸盐加入到细胞裂解物中以终浓度为4 m 使蛋白质变性。使用磺基-N-羟基琥珀酰亚胺D,伯胺在30℃下乙酰化2小时3 - 乙酸盐含量为10米m。通过将羟胺加入40米的最终浓度来反转O-乙酰化m 并在30℃下孵育10分钟。通过添加20μm进一步淬灭乙酰化试剂m 甘氨酸在30℃下10分钟。通过缓冲液交换除去过量的试剂至1.5ml 10米m NH4HCO3,pH 7.9,使用1 ml Illustra NapTM值-10列(GE Healthcare)。在95℃下加热蛋白质5分钟后,将它们放置在冰上5分钟后,在37℃下在37℃下消化N-乙酰化蛋白质,并在酶中以序列级修饰的胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)在酶中消化过夜/衬底比为1/100(w / w)。如前所述进行C末端C末端协议的后续步骤(
      • van damme p.
      • Staes A.
      • 布鲁诺斯S.
      • 赫尔森K.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • Aviles F.X.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      互补的位置蛋白质组学,用于筛选内外和外泌蛋酶的基材。
      )。由于RP-HPLC分离,分馏和合并,产生了96个样品。将样品干燥并重新溶解在20μl2米中m TCEP和2%乙腈用于后续LC-MS / MS分析。

       LC-MS / MS分析

      使用终极3000 RSLC纳米LC系统(Dionex,Amsterdam,荷兰)在线连接到LTQ orbitrap Velos(Thermo Fisher,Bremen,Germany),使用终极3000 RSLC纳米LC系统(Dionex,Amsterdam,荷兰)进行2μL样品混合物的LC-MS / MS分析。如前所述执行LC-MS / MS分析和MS / MS峰值列表的生成(
      • 坦戈斯。
      • 洛伦佐J.
      • Garcia-Pardo J.
      • Degoeve S.
      • 玛特L.
      • Aviles F.X.
      • Gevaert K.
      • van damme p.
      蛋白质组衍生的肽文库研究羧肽酶的底物特异性谱。
      )。使用吉祥物蒸馏器软件(2.2.1.0版,矩阵科学)创建吉祥物通用文件(MGF)。然后使用吉祥物守护进程(版本2.3,Matrix Science)将生成的MS / MS峰值列表搜索吉祥物。这些搜索在Swiss-prot数据库中进行了分类数据库(2011_05 Uniprotkb / swiss-prot数据库,其中包含20,286人的人类参赛作品)。设置了以下搜索参数:使用半argc / p酶设置搜索Spectra,允许没有错过的裂缝。将前体离子的质量耐受设定为10ppm,并在片段离子上至0.5 da。此外,吉祥物的C13设置设定为1.肽电荷设定为1+,2+或3+,仪器设置置于ESI-Trap上。为了鉴定丁啡化肽,将可变修饰设定为焦蛋白形成N-末端谷氨酰胺和固定修改包括D.3 - 在赖氨酸,甲硫氨酸氧化与甲硫氨酸 - 硫氧化物的乙酰化,并丁酸乙酯(12C4 或者 13C4)肽n termini。此外,我们还搜索了含有D的肽3 - 在赖氨酸和甲硫氨酸氧化时的乙酰化作为固定修饰,以及N-末端谷氨酰胺和乙酰化和d的焦蛋白形成3 - N末端的乙酰化作为可变修饰。只扣留了唯一的肽并在阈值分数上得分,得分于阈值分数,扣留95%的置信度。选择了这种置信水平,因为我们通常发现丁酰胺化的C末端肽的吉祥物评分(
      • van damme p.
      • Staes A.
      • 布鲁诺斯S.
      • 赫尔森K.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • Aviles F.X.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      互补的位置蛋白质组学,用于筛选内外和外泌蛋酶的基材。
      )。通过搜索诱饵数据库(由DbToolkit算法制作的2011_05人机Uniprotkb / swiss-prot数据库的逆转版本,估计的假发现率
      • 玛特L.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      dbtoolkit:处理肽中心蛋白质组学的蛋白质数据库。
      ))在频谱水平下被发现是3%(
      • Kall L.
      • Storey J.D.
      • maccoss m.j.
      • 贵族W.S.
      使用诱饵数据库对由串联质谱法鉴定的肽的意义。
      )。质谱蛋白质组学数据已经沉积在Proteomexchange联盟(http://www.proteomexchange.org)通过自豪的合作伙伴存储库(
      • VizCaino J.A.
      • 科特兰特。
      • Csordas A.
      • 戴安斯J.A.
      • Fabregat A.
      • 抚养金。
      • 怜悯J.
      • alpi E.
      • Birim M.
      • Contell J.
      • o'kelly g.
      • SchoEnegger A.
      • Ovelleiro D.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • 里奥斯D.
      • 王R.
      • Hermjakob H.
      蛋白质组学标识(骄傲)数据库和相关工具:2013年的状态。
      ,
      • 王R.
      • Fabregat A.
      • 里奥斯D.
      • Ovelleiro D.
      • 抚养金。
      • 科特兰特。
      • 怜悯J.
      • Csordas A.
      • Perez-Riverol Y.
      • Reinger F.
      • Hermjakob H.
      • 玛特L.
      • VizCaino J.A.
      骄傲检查员:可视化和验证MS蛋白质组学数据的工具。
      )数据集标识符PXD000834和DOI 10.6019 / PXD000834。
      肽量化(12C4- 相对 13C4 - 用吉祥物蒸馏器定量工具箱(2.2.1版)进行)进行。量化方法详细说明如下:约束搜索,是的;蛋白质比例,平均;报告细节,是的;最小肽,1;协议,前体;允许大规模时间匹配,是的;允许洗脱班,没有;所有费用状态,是的;和固定修改,质量值。通过将所有匹配的光肽的提取的离子色谱图峰面积与重肽的肽的萃取的离子色谱峰面积进行比较来计算蛋白质的比率。识别显着改变的C Termini,强大的统计数据(
      • Huber P.J.
      • ronchetti e.m.
      )应用于所有识别的计算比的基本-2对数值(12C4-ButyryLated /13C4 - 酸化的)肽双峰被设为真实。然后,R软件包用于统计计算以计算Log2转化的肽比的概率分布。我们将Neo-C末端肽视为那些加工的C Termini(IE。 后一种肽缺少多达20个氨基酸的数据库注释C末端),其具有更高的水平(根据统计分析和使用严格的统计分析 p 超表达CCP1的HEK293T细胞蛋白质组中0.0001)的值阈值。被设定为FALSE的比率全部通过个人检查来验证。

       用酸性C Termini分析Swiss-Prot蛋白条目的发生

      一个 在Silico. 使用Scanperite进行搜索推定的人CCP1基材(
      • de Castro E.
      • SIGRIST C.J.
      • Gattiker A.
      • Gulliard V.
      • langendijk-genevaux p.s.
      • Gasteiger E.
      • Bairoch A.
      • Hulo N.
      Scanperite:检测蛋白质中的售卖所签名匹配和比例相关的功能和结构残留物。
      )使用模式[ED](n)>,其中n表示蛋白质的C末端的连续酸性残基的数量,其被允许从1到32变化。在图案中进行了图案搜索 HOMO SAPIENS. 2014_03 UNIPROTKB / SWISS-PLAT数据库的分类,使用默认设置(除非允许拼接变体除外)。
      为了估计用酸性C末端尾部发现蛋白质的概率,我们假设了一种随机模型的序列,其中不同的氨基酸在蛋白质序列中独立发生(
      • 卡林S.
      • altschul s.f.
      通过使用普通评分方案评估分子序列特征的统计显着性的方法。
      )。结果,概率(p)寻找一个主题 n1n2n3 is 在哪里 nZZ 是天然存在的氨基酸, Z =(A,R,N,D,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T,W,Y,V); p(nj)是氨基酸的自然发生 n 在蛋白质组中,这些数字是由由ICelogo计划为人类瑞士 - Prot数据库计算的平均事件获得(
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • 玛特L.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过icelogo改善了蛋白质共识序列的可视化。
      )。当应用于C末端时, j = 1对应于C终端位置, j = 2到倒数第二个位置, j = 3到敌人的位置,等等。为了寻找酸性图案,我们对独特的氨基酸不感兴趣,而是在Glu或Asp的存在下。因此,我们对寻找这些两个氨基酸中的任何一种感兴趣的概率感兴趣, 即P(E或D)。因此,基于(方程1),在整个蛋白质组中找到的概率,蛋白质 i 或者更加连续的酸性残基计算如下

      结果

       研究设计和样品制备

      先前已经表明,羧肽酶CCPS 1,4和6不仅修剪翻译后添加的聚谷氨酸侧链,还在对肌蛋白功能的两个重要调节剂的基因编码的C末端谷氨酸延伸起作用; mlck1和telokin(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      )。然后表明,在其C Termini上携带多个谷氨酸残基的额外蛋白也可以是CCP基材。在此上下文中,我们使用C末端组合分数对角线(C末端C末端Cofradic)位置蛋白质组学方法对CCP1的天然基底进行了无偏见的搜索。
      • van damme p.
      • Staes A.
      • 布鲁诺斯S.
      • 赫尔森K.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • Aviles F.X.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      互补的位置蛋白质组学,用于筛选内外和外泌蛋酶的基材。
      )。 C-末端CoFradic是一种定量方法,其富集C-末端肽,从而指向报告C末端蛋白处理事件的肽(IE。 neo-c termini)因此促进了羧肽酶的天然底物的发现(
      • van damme p.
      • Staes A.
      • 布鲁诺斯S.
      • 赫尔森K.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • Aviles F.X.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      互补的位置蛋白质组学,用于筛选内外和外泌蛋酶的基材。
      )。
      我们选择了HEK293T的细胞进行本研究,因为前面表明该细胞系构成了一个简单且适当的蜂窝系统学习CCP1功能(
      • Berezniuk I.
      • vu h.t.
      • 里昂P.J.
      • Sironi J.J.
      • 肖H.
      • Burd B.
      • setou m.
      • 一个geletti R.H.
      • Ikegami K.
      • Fricker L.D.
      细胞溶质羧肽酶1参与加工α-和β-管蛋白。
      )。我们在HEK293T细胞中瞬时转染了全长CCP1,并分析了其对翻译后修饰(PTMS)的不同小管蛋白的影响。经72小时后转染后,Western印迹分析表明CCP1的过度表达产生的Δ2-微管蛋白的水平增加(Fig. 1A1B),符合以前的报告(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      ,
      • Berezniuk I.
      • vu h.t.
      • 里昂P.J.
      • Sironi J.J.
      • 肖H.
      • Burd B.
      • setou m.
      • 一个geletti R.H.
      • Ikegami K.
      • Fricker L.D.
      细胞溶质羧肽酶1参与加工α-和β-管蛋白。
      )。值得注意的是,对于过表达的CCP1,除了主150-KDA带,可以观察到~120-130 kda和80-90kda的ccp1片段(Fig. 1A)。据报道用于鼠标的天然和重组CCP1的类似模式(
      • 吴H.Y.
      • 王T.
      • Li L.
      • Correia K.
      • 摩根J.I.
      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      )和人(
      • Rodriguez de la Vega M.
      • 洛伦佐J.
      • 侵权O.
      • Aviles F.X.
      • Bautista J.M.
      纤毛相关细胞溶质羧肽酶(CCPS)的功能偏析和新兴作用。
      )orthologs。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1CCP1过表达增加了Δ2-微管蛋白的水平。 A,HEK293T细胞中的CCP1转染。制备来自对照细胞或表达HA标记CCP1的细胞的蛋白质提取物。使用抗HA抗体通过Western印迹分析样品(30μg蛋白质提取物)。除了主要的150-KDA带,可以观察到~120-130 kda和80-90kDa的附加带,类似于文献中先前报告的图案(
      • Rodriguez de la Vega M.
      • 洛伦佐J.
      • 侵权O.
      • Aviles F.X.
      • Bautista J.M.
      纤毛相关细胞溶质羧肽酶(CCPS)的功能偏析和新兴作用。
      ,
      • 吴H.Y.
      • 王T.
      • Li L.
      • Correia K.
      • 摩根J.I.
      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      )。 B,检测微管蛋白PTMS。使用抗δ2-微管蛋白和抗Tyr-Cumulin抗体通过Western印迹分析来自对照细胞或表达细胞的CCP1的提取物。蛋白质印迹探测抗β-肌动蛋白用作加载控制。

       C末端COFRADIC分析识别CCP1基板

      知道表达的CCP1在HEK293T细胞中有效,我们继续进行C-Terminal Cofradic(
      • van damme p.
      • Staes A.
      • 布鲁诺斯S.
      • 赫尔森K.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • Aviles F.X.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      互补的位置蛋白质组学,用于筛选内外和外泌蛋酶的基材。
      )以鉴定蛋白质组水平的CCP1切割的基材。来自控制HEK293T细胞的提取物(IE。 如上所述,并行处理过表达CCP1的模拟转染的)和HEK293T细胞(
      • van damme p.
      • Staes A.
      • 布鲁诺斯S.
      • 赫尔森K.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • Aviles F.X.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      互补的位置蛋白质组学,用于筛选内外和外泌蛋酶的基材。
      )。在C末端Cofradic中,来自全蛋白质胰蛋白酶消化中存在的内肽的强阳离子交换(SCX)来富含N-末端和C末端肽。随后的后代谢和化学稳定同位素标记的游离胺具有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的同位素变体 - 丁丁酸酯(IE。 NHS酯的 12C4 - 对照样品和对照样品 13C4 - 用CCP1过表达的样品的 - 丁酸酯允许对N-末端和C末端肽的偏析,以及用于基于MS的定量,从而实现每个蛋白质组的分离的C末端肽的相对定量。
      在LC-MS / MS分析和数据库搜索之后,我们预期蛋白C Termini的不同读数鉴定和量化。大多数蛋白质C Termini预计不会通过CCP1处理(Fig. 2A),并且,结果,它们对应的C末端肽应该以相似浓度存在于两个蛋白质谱系中(Fig. 2C)。类似地,预期通过不同的羧肽酶(或其他蛋白酶)的蛋白质C-末端加工,得到这种读数。然而,CCP1底物应该在蛋白质组中被加工到较高的范围内,其中CCP1过表达(Fig. 2B)。结果,应在对照样品中的较高水平下发现相应的完整性C末端肽(或数据库引燃蛋白C-末端肽)( Fig. 2D)。另外,预期CCP1过表达的蛋白质组中产生的产生的新C-末端肽(C-C-蛋白水解裂解产生的C-末端肽)在蛋白质组中存在更高的水平(Fig. 2E)。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2通过C末端Cofradic分析鉴定CCP1转染细胞中的C末端蛋白水解处理事件。 A,表示未通过CCP1处理的蛋白质的表示。剪刀表明胰蛋白酶切割位点。 N末端胰蛋白肽在红色中着色。 C末端胰蛋白肽是绿色/蓝色的着色。内部胰蛋白肽是黄色的。 B,表示由C-Termly通过CCP1加工的蛋白质的表示。 C,在蛋白质谱系(肽A)中未加工的C-末端肽的质谱表示。该质谱将同样地表示通过不同于CCP1的蛋白酶显示两种蛋白质组中的C末端肽。 D,由CCP1(肽B)处理的蛋白质的完整C末端肽的质谱表示。 E,由CCP1(肽C)加工的蛋白质的新型末端肽的质谱表示。 F,鉴定α-微管蛋白1a / 1b作为ccp1衬底。 α-微管蛋白1a / 1b的三透电新末端末端的质谱,但13C4-edmaalekdyeevgvsvegegegegeg(残留物423-448;但13C4,α-氨基修饰 13C4 - 丁酸)。
      总共确定了1259个独特的数据库注释N Termini,886个独特的数据库注释蛋白C Termini,75个加工蛋白C Termini(IE。 只考虑从数据库注释C Terminus缺少多达20个氨基酸的肽)(补充表S1)。后者的大多数是在两个蛋白质粒中的相似水平,从而指向由CCP1以外的蛋白酶处理的蛋白质或伪像(IE。 样品制备期间产生的C末端腐烂)。有趣的是,我们确定了九个加工的C Termini,其含量高得多的水平(超过七倍, p <0.0001)在HEK293T细胞的蛋白质组中过表达CCP1(表I.)。所确定的Neo-C Termini的注释MS / MS光谱 表I. 提供 补充图S2。我们专注于我们对这些Neo-C Termini的分析,因为它们直接指向推定的CCP1基板。特别地,这些新的末端中的两个对应于加工后的α-管蛋白C Termini,已知由CCP1加工的蛋白质(Fig. 1B 和 references (
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      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      ,
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      细胞溶质羧肽酶1参与加工α-和β-管蛋白。
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      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      )))。 C-末端Cofradic鉴定了α-微管蛋白1a / 1b的加工后的c末端(Edmaalekdyeevgvsgegegeg;残留物423-448),其几乎独特存在于过表达CCP1的HEK293T细胞蛋白质组中(Fig. 2F)。此外,我们还鉴定了一种Neo-C末端(EdmaalekdyeevgaDggedgedgedggedggedggedggedggedggedggedggedggedggedggedggedggedGgedgedggedggedGgedGedggedGgedggedGgedggedggseg(α-微管蛋白同种型(α-微管蛋白1C)作为CCP1过表达样品中的单态物。两种肽对应于Δ3-微管蛋白的C末端,缺乏α-管蛋白的最后三个残基的管蛋白形式。与以前的报告巧合(
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      细胞溶质羧肽酶1参与加工α-和β-管蛋白。
      ),我们的数据确认CCP1生成Δ2-微管蛋白的能力(Fig. 1B)或δ3-小管蛋白(表I.通过从滤液α-管蛋白的C末端去除一个或两个Glu残基;考虑到另一种与CCP1不同的酶负责释放来自α-小管蛋白的C-末端Tyr(
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      肿瘤抑制器RARRE1与细胞质羧肽酶AGBL2相互作用以调节α-小管蛋白横膦循环。
      )。
      表I.CCP1在其基因编码的C-Terminus中处理的蛋白质列表
      蛋白质加入号码测定确定的新核末端切割氨基酸L / H比率亚细胞本地化功能
      α-管蛋白1a / 1bQ71U36 / P68363C终端CofradicEdmaalekdyeevgvdsvegeeg.ee(y)
      a 在α-微管蛋白的情况下,我们认为CCP1用作底物的底物池,其在细胞中自然存在(
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      )。
      N / A.细胞质微管
      α-管蛋白1cQ9BQE3C终端CofradicEdmaalekdyeevgadsadgedge.ee(y)
      a 在α-微管蛋白的情况下,我们认为CCP1用作底物的底物池,其在细胞中自然存在(
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      )。
      N / A.细胞质微管
      真核翻译开始因子4hQ15056C终端CofradicEEVVQKEQ.EN / A.细胞质翻译启动
      胸膜P16949C终端CofradicknkeskdpadeteaD0.029细胞质微管调节
      40s核糖体蛋白S9P46781C终端Cofradicknakkgqggagagde.EED.N / A.细胞质翻译启动
      C终端CofradicknakkgqggagagddEED..N / A.
      TRAF型含锌手指结构域蛋白质O14545C终端CofradicTakakpskqqgagda.Eeeeee.0.14细胞质调节TLR4和RLH途径
      高迁移率组蛋白B3O15347C终端Cofradickkveeede.Eeeeeeeeeeeeeeeee.0.083核/细胞质转录调节,染色质
      C终端Cofradickkveeed.EeeeEeeeeeeeeeeeede.N / A.
      高迁移率组蛋白B2P26583Western Blot.EdeeeeeeeededeeeedEeedeeedeedee
      b 展示这些蛋白质的C-末端,尽管没有鉴定CCP1切割位点。
      核/细胞质转录调节,染色质
      高迁移率组蛋白B1P09429Western Blot.Eeeedeedeedeeeeededededeedddde.
      b 展示这些蛋白质的C-末端,尽管没有鉴定CCP1切割位点。
      核/细胞质转录调节,染色质
      肌球蛋白轻链激酶1 / Telokin
      c 在我们的筛选中未鉴定该衬底,但先前通过Rogowski报道了直底小鼠底物 等等。 (
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      )。
      Q6PDN3Western Blot.Eeeeee.
      d 基于Western印迹显示Δ2-微管蛋白的增加。
      细胞质肌球蛋白功能调节剂
      n / a,不适用于计算的不可能 m/z 由于没有轻肽离子而导致的比率( IE。 未在对照样品中鉴定的肽)。
      a 在α-微管蛋白的情况下,我们认为CCP1用作底物的底物池,其在细胞中自然存在(
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      肿瘤抑制器RARRE1与细胞质羧肽酶AGBL2相互作用以调节α-小管蛋白横膦循环。
      )。
      b 展示这些蛋白质的C-末端,尽管没有鉴定CCP1切割位点。
      c 在我们的筛选中未鉴定该衬底,但先前通过Rogowski报道了直底小鼠底物 等等。 (
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      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      )。
      d 基于Western印迹显示Δ2-微管蛋白的增加。
      除了α-小蛋白外,我们还确定了七个属于五个新推定的CCP1基板的新C Termini(表I.)。有趣的是,在所有情况下,CCP1释放的氨基酸是酸性氨基酸,底物特异性部分与先前的报告一致。这些肽中的两种表明CCP1介导的来自蛋白质的C末端的单个氨基酸:在真核翻译因子4h(EIF4H)的情况下,在真核翻译因子4h(EIF4H)的情况下,从C末端释放谷氨酸。以前的报告显示CCP1对C末端谷氨酸的作用(
      • Rogowski K.
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      细胞溶质羧肽酶1参与加工α-和β-管蛋白。
      ,
      • 吴H.Y.
      • 王T.
      • Li L.
      • Correia K.
      • 摩根J.I.
      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      ),有人建议CCP1不识别天冬氨酸(
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      • 摩根J.I.
      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      )。我们观察到的COSTHMIN的C末端的修剪表明CCP1确实能够释放C末端的天冬氨酸。此外,指向40S核糖体蛋白S9(RPS9)的C末端处理的两种肽。这里,CCP1分别从RSP9的C末端分别除去三和四个氨基酸(IE。 除去C-末端ASP和两种或三个后续的Glu残基, 表I.)。鉴于M14 MCP一次只释放一个氨基酸,预计CCP1依次释放这些氨基酸(
      • 吴H.Y.
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      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      )。还鉴定了含Traf型锌手指结构域的蛋白质(TRY1)作为推定的CCP1底物。 TRY1含有六个谷氨酸的C末端延伸,CCP1似乎能够释放所有这些。值得注意的是,我们还确定了高迁移率组蛋白B3(HMGB3)的两种Neo-C末端,其表明CCP1除去了最多15或16个氨基酸。
      有趣的是,当鉴定和除α-微管蛋白1c除外,这些推定的CCP1基材的相应完整C Termini的水平不会显着改变(补充表S2)。这可能表明,细胞中这些推定的CCP1底物的处理程度通常是低的。然而,具有显着改变的表达式的α-微管蛋白1c的完整性C末端与基板的预期读出不匹配(Fig. 2C),但似乎在样品中似乎具有CCP1过表达的样品中的浓度较高。然而,使用识别不同小管蛋白同种型的抗体的Western印迹分析显示在两种样品中显示出相同的Tyr-Cumulin(Fig. 1B)。

       验证推定的CCP1基板

      从鉴定的五个新推定的CCP1基板中,选择了两种以进一步验证; TRY1和HMGB3。 TRY1含有六个谷氨酸残留物的C末端延伸,CCP1能够顺序地去除所有这些(Fig. 3A)。因此,我们使用设计用于识别小管蛋白中至少三个连续谷氨酸残基的聚谷氨酸侧链(
      • 尚Y.
      • 李b.
      • Gorovsky M.A.
      Tetrahymena Hotherophila含有常规的γ-管蛋白,其差异化差异化不同的微管组织中心所需的所需。
      ),但另外识别三种或更多种谷氨酸的基因编码的C末端(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
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      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
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      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      )。 n终端 - 和HA标记的TRAD1在HEK293F单元中与CCP1或CCP1的非活动形式过表达(CCP1-E270Q)。后者含有M14金属球蛋白酶酶的关键催化残基的突变(使用牛羧肽酶A的编号系统,人CCP1中的E270Q),其极化了负责梳理粘合剂的攻击的金属结合水分子(
      • 吴H.Y.
      • 王T.
      • Li L.
      • Correia K.
      • 摩根J.I.
      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      ,
      • Arolas J.L.
      • Vendrell J.
      • Aviles F.X.
      • Fricker L.D.
      Metallocarbox型酶:生物医学的新兴药物靶标。
      )。由于Polye抗体的敏感性低,我们通过其N终端富集了TRY1 -标签。随后与针对其N末端HA标签的抗体的TRY1的Western Blot分析(Fig. 3B)显示TRY1从具有相似效率的细胞系富集。请注意,CCP1已被复制,因为它也包含一个 - 它的C终点(Fig. 3B)。有趣的是,当用活性CCP1共同表达时,Polye抗体检测到Trad1的C终点,但在与活动CCP1共同表达时(Fig. 3B)。此外,我们将纯化的重组CCP1直接培养纯化的重组TRY1,发现TRY1不再被Polye抗体(Fig. 3C)。但是,在O-菲咯啉的存在下(
      • Huber P.J.
      • ronchetti e.m.
      ),金属蛋白酶的特异性抑制剂,Polye抗体仍然能够识别亲和纯化的TRY1,这表明CCP1依赖性除去TRAD1的酸性尾巴。因此,我们的数据验证TRY1作为新颖和直接CCP1基板。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3TRY1和HMGB3是直接CCP1基板。 A,CCP1能够除去TRY1的所有酸性C末端氨基酸。表示由聚抗体识别的表位。 B,TRY1的C终点由Active CCP1处理。 / HA-标记的TRAD1在HEK293F单元中使用Active CCP1或无效(E270Q)CCP1进行COTRANSFECTE。商品用蛋白质提取物富集 -Tactin列。使用抗蛋白质印迹分析等量的蛋白质洗脱液 抗体。 CCP1也通过其C终端富集 -标签。聚合抗体显示与非活性CCP1共表达时TRY1 C末端的完整性,但不能与活性酶共表达时。 C, 体外 验证TRY1作为直接CCP1基板。纯化的重组Trad1在37℃下与CCP1孵育2小时,在MCP抑制剂O-菲咯啉(O-Phen)的存在或不存在下,并使用Polye抗体分析。 D,HMGB3由两个中央DNA结合结构域(HMG盒)和长酸性C末端尾部组成。 CCP1能够从其C末端依次释放多达16个酸性氨基酸。 HMG盒的大小和酸性尾巴仅仅是说明性的,并且不代表其真实尺寸。 E,HMGB3由CCP1处理。 用活性或无活性(E270Q)CCP1进行COTANSFRAGGED HMGB3。使用HA标签抗体通过Western印迹分析等量的每种细胞提取物,以证明CCP1变体的同等表达水平。使用反的蛋白质印迹 抗体显示用活性CCP1共表达时抗体的HMGB3的出现。 F, 体外 将HMGB3验证为直接CCP1基板。纯化的重组HMGB3在37℃下与CCP1一起孵育,在存在或不存在10米m O-Phen,并通过SDS-PAGE进行分析。
      至于HMGB3,CCP1似乎从其C末端去除相当长的酸性氨基酸(Fig. 3D)。因此,我们期望观察HMGB3前体MW的显着变化 相对 通过SDS-PAGE处理的对应物。这样,n-terminally - 用活性或非活性或非活性CCP1,在HEK293T细胞中与HMGB3共表达。 Western印迹分析表明,除了完整的HMGB3波段之外,当HMGB3用活性CCP1共表达时,发现HMGB3的蛋白水解片段(Fig. 3E)。具有不同电泳迁移率的HMGB3片段的外观与C-Terminal Cofradic鉴定的CCP1介导的处理一致。通过测定重组产生和纯化的蛋白质,我们还可以通过CCP1直接加工HMGB3,但仅在没有O-菲罗琳(Fig. 3F)。最后,我们使用蛋白质质谱法测量纯化的HMGB3蛋白的质量( - 蛋白质)。 Q-TOF分析确定了从HEK293F细胞纯化为25,300±12.65Da的完整HMGB3的分子量(补充图S3A)表示该蛋白质缺乏其引发剂蛋氨酸,是N-末端乙酰化的,并且缺乏C末端谷氨酸(预测MW 25303.3Da)。肽质量指纹分析证实了这些PTM的存在(补充图。S3B补充表S3和S4)。 CCP1产生的HMGB3片段的质量为23,377±11.67 da(补充图。S3C),其对应于CCP1的HMGB3的15个额外C末端残基的释放(预测MW 23380.6Da)。因此,这是 体外 切割产品与由C末端COFRADIC鉴定的HMGB3 Neo-C Termini的一个完全相关,所有这些结果都将HMGB3验证为直接CCP1基板。

       预测额外的CCP1基板

      我们的研究结果表明,CCP1的底物特异性仅限于Glu和Asp残留物。我们利用这种特征来执行 在Silico. 使用Scanperite工具扫描其他潜在的CCP1目标(
      • de Castro E.
      • SIGRIST C.J.
      • Gattiker A.
      • Gulliard V.
      • langendijk-genevaux p.s.
      • Gasteiger E.
      • Bairoch A.
      • Hulo N.
      Scanperite:检测蛋白质中的售卖所签名匹配和比例相关的功能和结构残留物。
      )。我们的搜索(实验程序中所示的参数)返回分别在其C末端的7,5和111个人蛋白质的列表,其中7,36和111个人蛋白质含有7,5和3个或更多个连续的酸性氨基酸。 表二 显示用五个或更多个连续的酸性C末端残基击中蛋白质。 补充表S5 显示含有C Termini的次数,具有三种或更多种酸性残基。蛋白质的数量 表二 单独机会比预期高76倍;在2014_03 Uniprotkb / Swiss-prot数据库中的20,257个人蛋白质中,预期具有五种或更多个连续酸性C末端残留物(考虑到谷氨酸和天冬氨酸的固有频率(或为其蛋白质)瑞士科素中的人蛋白分别为7.1%和4.7%)。更具体地说,发现具有10个或多个连续的C末端酸性残基的蛋白质非常不可能(1,1.86×109 蛋白质);然而,九种人蛋白质具有至少10个残基的酸性延伸。
      表二含有在其基因编码的C-末端中的至少5个连续酸性残基的延伸的人蛋白质清单
      数字名称uniprot.C-Terminus.
      1高迁移率组蛋白B1P09429Skkkk.Eeeedeedeedeeeeededededeedddde.
      2推定的高迁移率组蛋白B1样1B2RPK0Skkkk.Eeeedeedeedeeeedeedeededddde.
      3高迁移率组蛋白B2P26583KNNEP.EdeeeeeeeededeeeedEeedeeedeedee
      4高迁移率组蛋白B3
      a 这些蛋白质已经被鉴定为CCP1基材。
      O15347arkkv.Eedeee.EEEEEEEEEEEEEEEEEEEEE
      5首页obox蛋白Hox-A7P31268Aadka.deeddeeeeeeee
      6细胞溶质嘌呤5'-核苷酸酶P49902ithch.deddeeeeeeee
      7易位蛋白质sec63同源物Q9UGP8FEDSF.Eeeeee.EEDDD
      8含有MTERF域的蛋白2Q7Z6M4eaedn.dededdeee.
      960S核糖体蛋白L22P35268FQINQ.deeeeeded
      10cal sequestrin-1P31415地质edddddddd
      11泛素硫酸酯酶Zranb1Q9UGI0SLSDG.eededdede.
      12钙依赖性分泌物活化剂1Q9ULU8SMKDS.deedeedd
      13推定的高迁移率组蛋白B3样P0C6E5aqkkv.EED.EDEE
      14RNA聚合酶相关蛋白Leo1Q8WVC0kyvis.Deeeeddd
      15LIM结构域和肌动蛋白结合蛋白1Q9UHB6rnryy.DEDEDEE
      16单通膜蛋白质,具有富含天冬氨酸的尾部1,线粒体Q9H4I9DIFVP.edddddd.
      17calsequestrin-2O14958dndds.DDDDE.
      18细胞周期控制蛋白50BQ3MIR4ryqdq.DDDDEE
      19二肽氨基氨基肽酶样蛋白6P42658TVTAK.edeeed.
      20首页obox蛋白Hox-B7P09629德拉亚Eeeeee.
      21Metaxin-1Q13505LGMA.Eedeee.
      2240s核糖体蛋白S9
      a 这些蛋白质已经被鉴定为CCP1基材。
      P46781Gagag.ddeeed.
      23蛋白质永恒的同源物Q9UNS1Kryqi.埃德德德
      24TRAF型锌手指域蛋白1
      a 这些蛋白质已经被鉴定为CCP1基材。
      O14545Gagda.Eeeeee.
      25富含酸性亮氨酸的核磷蛋白32家族成员E.Q9BTT0AEDDG.EED..D.
      26干扰素α-诱导蛋白6P09912kylds.eedee.
      27肌球蛋白轻链激酶,平滑肌
      a 这些蛋白质已经被鉴定为CCP1基材。
      Q15746歌格Eeeee.
      28胆碱磷酸胞嘧啶细胞酰基转移酶aP49585Aydis.Edeed
      39蛋白质SSX1Q16384EISDP.EED.DE.
      30蛋白质SSX2.Q16385EISDP.EED.DE.
      31蛋白质SSX3Q99909EISDP.EED.DE.
      32蛋白质SSX4.O60224EISDP.EED.DE.
      33蛋白质SSX7.Q7RTT5EISDP.EED.DE.
      34蛋白质SSX8.Q7RTT4概要EED.DE.
      35蛋白质SSX9.Q7RTT3EISDP.EED.DE.
      36跨膜蛋白190Q8WZ59eeteg.eeeed.
      a 这些蛋白质已经被鉴定为CCP1基材。
      我们的扫描液分析指向不同的高迁移率组蛋白作为潜在的CCP1靶标。特别地,高迁移率组蛋白B1(HMGB1)和B2(HMGB2)在其C末端(30和22个残基)含有异常大量的酸性残基。为了确认符合HMGB3,这些可以是CCP1底物,在HEK293T细胞中,N-末端Myc标记版本的两种蛋白质在HEK293T细胞中具有活性或无活性CCP1。 Western Blot分析表明CCP1确实处理了HMGB2的C末端(Fig. 4B)。也可以观察到分子量较低的HMGB2的第二切割产物,但在较低水平(Fig. 4B)。 CCP1还能够处理HMGB1的C末端(Fig. 4A),但与HMGB3或HMGB2相比,较低程度。在这种情况下,处理导致几个蛋白质片段。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4HMGB.2和HMGB1由CCP1处理。 CCP1能够切割C Terminus A,hmgb1和 B,HMGB2。 N-Termogly Myc标记的HMGB1或HMGB2用主动或非活动的CCP1分配。使用HA标签抗体通过Western印迹分析等量的每种细胞提取物,以显示CCP1变体的等于表达水平。使用抗Myc抗体的Western印迹显示出用活性CCP1共表达时HMGB蛋白的C末端加工形式的外观。
      CCP1部分地在核中定位,如Rodriguez de La Vega所示 等等。 通过在HeLa细胞中的共聚焦显微镜分析,揭示核和细胞质中CCP1的粒状分布(
      • Rodriguez de la Vega M.
      • 洛伦佐J.
      • 侵权O.
      • Aviles F.X.
      • Bautista J.M.
      纤毛相关细胞溶质羧肽酶(CCPS)的功能偏析和新兴作用。
      )。此外,最近,鉴定并表明CCP1的N-末端区域中的核导出信号(NES),表明CCP1涉及由CRM1依赖性核出口介导的核对细胞质重定位化(
      • Thakar K.
      • Karaca S.
      • 港口S.A.
      • Urlaub H.
      • kehlenbach r.h.
      使用定量质谱法识别CRM1依赖性核出口尸体。
      )。由于CCP1在核过程中的功能仍然尚不清楚,所以可以识别可能的核基质。 HMGB1和HMGB2在核中定位,但通过主动运输机制连续地穿梭到细胞质,平衡转向核积累(
      • MOSEVITSKY M.I.
      • novitskaya v.a.
      • Iogannsen M.G.
      • Zabezhinsky M.A.
      HMG1和HMG2蛋白质核 - 细胞质分布的组织特异性及其可能的功能。
      ,
      • Kuehl L.
      • 萨尔蒙德B.
      • Tran L.
      几只大鼠组织核和细胞质中的高迁移率群蛋白的浓度。
      ,
      • Stros M.
      HMGB.蛋白质:与DNA和染色质的相互作用。
      ,
      • Busin M.
      • Neihart N.K.
      抗染色体HMG蛋白的抗体染色哺乳动物细胞的细胞质。
      )。为了排除HMGB蛋白的裂解的可能性,由于HMGB蛋白的异常定位发生(IE。 由其过度表达产生),我们使用抗HMGB2抗体来分析HEK293T细胞中的内源HMGB2过表达CCP1或CCP1-E270Q。 Western印迹分析显示,在过表达活性CCP1的细胞中,在过表达活性CCP1的细胞中外源HMGB2的外观外观的外观,当不活性CCP1突变体过表达时(补充图S4,车道1-2)。因此,在这种情况下,我们通过分析内源HMGB2蛋白,确认CCP1处理HMGB2的酸性C末端尾部的能力。鉴于HMGB2部分与染色质部分相关联,我们将全细胞蛋白裂解物分离为可溶性级分(含细胞源和核可溶性蛋白)和染色质不溶性级分,发现大多数加工的HMGB2存在于染色质(-Assacocated)级分中(补充图S4,车道3-6)。这可能表明染色质HMGB2更易于CCP1切割,或者,加工后HMGB2对染色质显示更高的亲和力(
      • Stros M.
      HMGB.蛋白质:与DNA和染色质的相互作用。
      ,
      • 李克。
      • 托马斯J.O.
      酸性尾对HMG1,2类蛋白质DNA结合特性的影响:尾部切换和尾部去除的见解。
      )。然而,需要进一步的研究来阐明这种观察,并阐明在这项工作中观察到的这些和其他蛋白水解加工事件的功能影响。与之研究 PCD. 敲门可能会提供鉴定的推定基质的进一步验证。

      讨论

      复合蛋白质组中的羧肽酶底物的鉴定一直在挑战,直到最近的C末端位置蛋白质组学技术的发展(
      • van damme p.
      • Staes A.
      • 布鲁诺斯S.
      • 赫尔森K.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • Aviles F.X.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      互补的位置蛋白质组学,用于筛选内外和外泌蛋酶的基材。
      ,
      • 席克宁o.
      • 巴雷奥。
      • HUESGEN P.F.
      • 总体上行
      蛋白质羧基末端的蛋白质组分析:C谓词。
      ,
      • 徐G.
      • Shin S.B.
      • jaffrey s.r.
      C-末端肽阳性选择蛋白C-末端的化学酶标记。
      ,
      • 刘M.
      • 张L.
      • 姚杰。
      • 杨P.
      • lu h.
      C-末端肽鉴定和定量方法:基于恶唑酮化学的同位素精氨酸标记掺入。
      ,
      • Sonomura K.
      • Kuyama H.
      • Matsuo E.
      • Tsunasawa S.
      • Nishimura O.
      蛋白质C-末端肽通过酰化反应的特异性分离及其用于将官能团引入肽中的优点。
      )。以前,使用C-尾探测本构c末端蛋白分解 大肠杆菌 (
      • 席克宁o.
      • 巴雷奥。
      • HUESGEN P.F.
      • 总体上行
      蛋白质羧基末端的蛋白质组分析:C谓词。
      ),恶唑龙化学使研究自然Neo-C Termini ThermoanaErobacter tengcongensis. (
      • 刘M.
      • 张L.
      • 姚杰。
      • 杨P.
      • lu h.
      C-末端肽鉴定和定量方法:基于恶唑酮化学的同位素精氨酸标记掺入。
      当添加到人PC3细胞裂解物中时,使用C-末端CoFradic用于筛选人羧肽酶A4的底物(
      • van damme p.
      • Staes A.
      • 布鲁诺斯S.
      • 赫尔森K.
      • Colaert N.
      • Timmerman E.
      • Aviles F.X.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      互补的位置蛋白质组学,用于筛选内外和外泌蛋酶的基材。
      )。在这项工作中,我们介绍了旨在在细胞背景下鉴定羧肽酶的蛋白质底物的第一个蛋白质组学研究。这里,C末端Cofradic分析导致鉴定在HEK293T细胞中直接由人CCP1直接产生的9种加工C Termini。这里的推定天然底物与先前报道的衬底MLCK1 / Telokin一起鉴定在一起(表I.),支持CCP1在基因编码酸性C Termini的蛋白水解加工中的作用。
      值得注意的是,在由C-末端Cofradic鉴定的推定底物中,我们发现α-微管蛋白,已经过度研究的已知的CCP衬底(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      ,
      • Berezniuk I.
      • vu h.t.
      • 里昂P.J.
      • Sironi J.J.
      • 肖H.
      • Burd B.
      • setou m.
      • 一个geletti R.H.
      • Ikegami K.
      • Fricker L.D.
      细胞溶质羧肽酶1参与加工α-和β-管蛋白。
      ,
      • 吴H.Y.
      • 王T.
      • Li L.
      • Correia K.
      • 摩根J.I.
      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      )。此外,观察到对酸性残留物的偏好是与之前的报告一致(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      ,
      • Berezniuk I.
      • 里昂P.J.
      • Sironi J.J.
      • 肖H.
      • setou m.
      • 一个geletti R.H.
      • Ikegami K.
      • Fricker L.D.
      细胞溶质羧肽酶5从微管蛋白中除去α-和γ连接的谷氨酸。
      ,
      • Berezniuk I.
      • vu h.t.
      • 里昂P.J.
      • Sironi J.J.
      • 肖H.
      • Burd B.
      • setou m.
      • 一个geletti R.H.
      • Ikegami K.
      • Fricker L.D.
      细胞溶质羧肽酶1参与加工α-和β-管蛋白。
      ,
      • 吴H.Y.
      • 王T.
      • Li L.
      • Correia K.
      • 摩根J.I.
      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      )。这里鉴定的所有推定的CCP1底物位于细胞质或细胞核中,其与CCP1的亚细胞定位一致(
      • Rodriguez de la Vega M.
      • 洛伦佐J.
      • 侵权O.
      • Aviles F.X.
      • Bautista J.M.
      纤毛相关细胞溶质羧肽酶(CCPS)的功能偏析和新兴作用。
      ,
      • Kalinina E.
      • Biswas R.
      • Berezniuk I.
      • Hermoso A.
      • Aviles F.X.
      • Fricker L.D.
      小鼠细胞溶质羧肽酶的新型亚家族。
      ,
      • 哈里斯A.
      • 摩根J.I.
      • Pecot M.
      • Soumare A.
      • 奥斯本A.
      • 翱翔。
      再生电动机神经元Express NNA1,新的ATP / GTP结合蛋白与含锌羧酸锌有关。
      )。我们通过COTRANSFECTING CELLED CCP1和CCP1进一步验证了TRAD1和HMGB3作为CCP1基质。这使我们可以在蜂窝上下文中验证,两种蛋白质的C末端修整在有源CCP1的存在下发生。此外, 体外 使用纯化的底物的实验证实已鉴定的新核末端是CCP1对这些蛋白质的直接作用的结果。
      它以前假设CCP通常会识别和处理与基因编码的C Termini以谷氨酸伸展的C Termini(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      )。这里鉴定了CCP1底物的第一次显示CCP1处理谷氨酸以及天冬氨酸C末端残基。我们使用了iCelogo表示(
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • 玛特L.
      • vandekerckhove J.
      • Gevaert K.
      通过icelogo改善了蛋白质共识序列的可视化。
      )为了可视化CCP1的衍生底物特异性,所述CCP1的特异性被认为被限制为酸性残基,其偏好于天冬氨酸(Fig. 5)。除了要求扩展衬底特异性分布之外,ICELOGO还显示出基质选择中的非预拉伸结合亚的关键作用。该结果同意最近的报告,描述了生物素-3E是比生物素-2E更好的CCP1底物,因此显示该酶的偏好对于更长的酸性尾部(
      • 吴H.Y.
      • 王T.
      • Li L.
      • Correia K.
      • 摩根J.I.
      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      )。之前的报告指出,CCP1无法释放C末端天冬氨酸残基(
      • Rogowski K.
      • van dijk J.
      • Magiera m.m.
      • BOSC C.
      • DELOULME J.C.
      • 博森阿
      • Peris L.
      • 金N.D.
      • Lacroix B.
      • 格劳姆。
      • 因为n。
      • 拉罗式C.
      • DESAGHER S.
      • 霍尔米
      • 一个driux A.
      • moutin m.j.
      • Janke C.
      一种与神经变性相关的蛋白质甲酰胺酶的家族。
      ,
      • 吴H.Y.
      • 王T.
      • Li L.
      • Correia K.
      • 摩根J.I.
      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      )。鉴于我们的数据,我们假设CCP1确实切断了天冬氨酸,但比谷氨酸酸盐更低。实际上,CCP1从RPS9和HMGB3中切割天冬氨酸,但它们所识别的最终产品还表明CCP1在遇到P1或P1'中的天冬氨酸残基时,CCP1减速或停止其蛋白水解活动(表I.)。此外,与HMGB2或HMGB3相比,驻留在HMGB1的C末端的天冬氨酸残基的较高比例可以解释为什么该蛋白质的裂解程度降低(图。 3.E4)。 体外 测定显示HMGB3尾部的处理(Fig. 3F)和生物eee,但未能检测到比色测定中的生物氧化物肽的CCP1切割(数据未显示)(
      • 吴H.Y.
      • 王T.
      • Li L.
      • Correia K.
      • 摩根J.I.
      紫癜细胞变性(PCD)小鼠NNA1的结构和功能分析。
      )。在像HMGB蛋白中发现的那些存在的长期酸性尾部的情况下,ASP的裂解可能受到青睐,其中通过有利于酸性残基来占用非纯度。
      图缩略图GR5.
      Fig. 5源自推定的CCP1基板的底物特异性谱。 IceLogo (
      • Colaert N.
      • 赫尔森K.
      • 玛特L.
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      通过icelogo改善了蛋白质共识序列的可视化。
      )用于显示与参考组(以下)相比显示在不同鉴定的CCP1推定基板位置处的富集的残基( IE。 瑞士 - Prot数据库中的人蛋白的C末端)。对于Icelogo准备,我们考虑了MCPS依次释放氨基酸。结果,当释放几种氨基酸以进入最终鉴定的产物时,消化的中间产物用作新基质,并通过CCP1进一步消化。因此,当制备icelogo时,消化的中间产物被认为是不同的个子底物,结果考虑了35个CCP1基质。这里认为只考虑了蛋白质组学鉴定的那些底物。在表示中,根据Schechter描绘了基板残余物 &Berger命名。将序列组中的每个位置处的氨基酸发生的频率与参考组中的发生进行比较。只有统计上有显着的残留物 p 绘制值≤0.05。与参考组相比,氨基酸高度显示了实验组中的位置氨基酸频率的差异。在实验组中统计上或持续的残留物分别在Icelogo的上部或下部示出。
      为了进一步支持CCP1在基因编码的C终端处理中的作用,我们搜索了描述所示的C终端修改的自然发生的报告 表I.。在α-微管蛋白的情况下,已知一种Δ2-微管蛋白的池在细胞中自然存在(
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      )。此外,我们搜索了CCP1是负责任的羧肽酶的证据 体内 对于这些C终端处理事件中的一些。 Berezniuk. 等等。 在HEK293T细胞中进行了CCP1击倒实验,并观察到Δ2-微管蛋白水平显着下降(
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      细胞溶质羧肽酶1参与加工α-和β-管蛋白。
      )。野生型和野生型蛋白质印迹分析 PCD. 鼠标表明MLCK1和Telokin在没有CCP1的情况下完整C Termini(IE。PCD. 小鼠),但在野生型小鼠中加工C Termini(
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      鉴于对缺乏其酸性C末端尾部的缺乏影响其功能,鉴于这种综合研究,HMGB蛋白可以提供CCP1介导的C末端加工的功能影响的线索。这些研究中的大多数是用HMGB1或HMGB2进行的,并且尚未在最近发现的哺乳动物HMGB蛋白如HMGB3上进行。 HMGBS是涉及各种核染色质相关方法的非骨蛋白,如转录,复制,重组,DNA修复和基因组稳定性(
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      )。哺乳动物HMGB由两个中央DNA结合结构域(HMG盒A和B)和带负电的C末端区域组成,其在不同物种之间高度保守(
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      )。 HMGB1和HMGB2的酸性尾部对直线和超底DNA的结合产生负面影响(
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      HMG 1和2与负超底层DNA的比相互作用由其酸性C末端结构域调节,并涉及其HMG 1/2盒中的半胱氨酸残基。
      )通过酸性尾部与HMGB盒的分子间相互作用介导,从而屏蔽这些域与其他相互作用。然而,这些酸性尾部似乎以许多其他方式调节HMGB的生物学功能。例如,它们涉及HMGB1和HMGB2的核细胞质传输,并影响其定位(
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      HMG2蛋白的核积累是由具有长DNA结合序列的基本区域介导的,并且核内的保留需要酸性羧基末端。
      )。此外,HMGB1的C末端尾部对于转录刺激至关重要(
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      其靶结合与核体连接剂DNA和转录刺激需要HMGB1的酸性C-尾。
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      )基本上通过其与组蛋白H1和H3的相互作用(
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      HMGB.1和接头组蛋白的相互作用通过它们的酸性和碱性尾部发生。
      )。此外,据报道,HMGB1 C末端尾部在DNA修复,染色质重塑和DNA复制中发挥重要作用(
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      )。 Marintcheva. 等等。 建立模型,以解释噬菌体T7的SSDNA结合蛋白的酸性尾部的作用,这可以扩展到其他蛋白质如核糖体蛋白,平移因子和HMG蛋白(
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      噬菌体T7和SsDNA的SSDNA结合蛋白的酸性C末端尾部竞争相同的结合表面。
      )。根据该模型,这些蛋白质的酸性尾部将通过结合调节其结合伴侣(DNA或其他蛋白质)的亲和力,从而使其基本结合裂解物脱落。在这种情况下,通过缩短这些酸性尾的长度的CCP1将调节蛋白质 - 蛋白和DNA-蛋白质相互作用。事实上,这符合影响小管蛋白C末端的PTM的拟议作用;调制电机蛋白质,并映射到小管蛋白的C末端区域的结合(
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      致谢

      我们感谢生物技术研究所和生物医学研究所(IBB-UAB)的细胞文化设施,为技术援助和骄傲的团队提交给储存库的质谱数据。 S.T是比利时联邦科学(Belspo)的博士后研究员。 P.V.D.是研究基金会的博士后研究员 - Flanders(FWO-Vlaanderen)。

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