人类睾丸磷酸磷蛋白酶显示激酶作为精子发生和睾丸癌的潜在靶标*

  • 作者脚注
    ‖当前的隶属度:复制与发展组的分子生物学,Institut d'InvestigacionsBiomèdiques八月PI我晒太阳(Idibaps),医学院,巴塞罗那大学,Casanova 143,08036,Barcelona,西班牙。
    司法卡斯蒂略
    一致
    可以解决谁的通信:繁殖和开发组的分子生物学,Institut d'InvestigacionsBiomèdiques八月PI晒太阳(Idibaps),医学院,巴塞罗那大学,Casanova 143,08036,巴塞罗那,西班牙。电话:++34 934021877;
    脚注
    ‖当前的隶属度:复制与发展组的分子生物学,Institut d'InvestigacionsBiomèdiques八月PI我晒太阳(Idibaps),医学院,巴塞罗那大学,Casanova 143,08036,Barcelona,西班牙。
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    领导Pharma BV,Pivot Park,Kloosterstraat 9,5349 AB,荷兰;
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  • jaco c. knol.
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    野生科医学实验室,医学肿瘤科,VU大学医疗中心,De Boelelaan 1117,1081HV阿姆斯特丹,荷兰;
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  • Cindy M. Korver.
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    生殖医学中心,研究院阿姆斯特丹复制与发展,阿姆斯特丹大学阿姆斯特丹大学,荷兰1105阿兹阿姆斯特丹
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  • 桑德拉·普尔玛
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    野生科医学实验室,医学肿瘤科,VU大学医疗中心,De Boelelaan 1117,1081HV阿姆斯特丹,荷兰;
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  • Thang V. Pham.
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    野生科医学实验室,医学肿瘤科,VU大学医疗中心,De Boelelaan 1117,1081HV阿姆斯特丹,荷兰;
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  • Richard R. de Goeij-de Haas
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    野生科医学实验室,医学肿瘤科,VU大学医疗中心,De Boelelaan 1117,1081HV阿姆斯特丹,荷兰;
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  • ans m.m.范毛皮
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    生殖医学中心,研究院阿姆斯特丹复制与发展,阿姆斯特丹大学阿姆斯特丹大学,荷兰1105阿兹阿姆斯特丹
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  • 康妮R. Jimenez.
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    野生科医学实验室,医学肿瘤科,VU大学医疗中心,De Boelelaan 1117,1081HV阿姆斯特丹,荷兰;
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  • Bastiaan J.H.詹森
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    可以解决谁的通信:铅制药BV,Pivot Park,Kloosterstraat 9,5349 AB,OSS,荷兰。 Tel.:P1(0)412782991;
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    领导Pharma BV,Pivot Park,Kloosterstraat 9,5349 AB,荷兰;
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  • 作者脚注
    *这项工作得到了来自欧盟-FP7-PEPLE-2013-ITN 603568:“Growsperm”的补助金。 van pelt和b.j.h.詹森。
    本文包含补充数据和表格。作者声明没有竞争的财务利益。
    ‖当前的隶属度:复制与发展组的分子生物学,Institut d'InvestigacionsBiomèdiques八月PI我晒太阳(Idibaps),医学院,巴塞罗那大学,Casanova 143,08036,Barcelona,西班牙。
      精子发生是一种复杂的细胞分化过程,包括标记的遗传,细胞,功能和结构变化。它需要紧张的调节,因为任何精子发生过程中的干扰会导致生育缺陷以及后代的障碍。为了提高精子发育期间信号转导的知识,我们对人类男性Gonad发生的磷酸化事件进行了大规模鉴定。使用TiO的金属氧化物亲和层析2与LC-MS / MS相结合,以通过全精精发作来分析成人人体睾丸的磷脂体。鉴定了总共8187种蛋白质衍生的磷酸肽,导致人睾丸磷蛋白迄今为止最完整的报告。磷酸化事件富集在与精子发生有关的蛋白质中,以及雄性腺中的高活性过程,例如转录和平移调节,细胞骨架组织,DNA包装,细胞周期和细胞凋亡。此外,鉴定了174个磷酸化激酶。通过鉴定的磷肽光谱的数量和激酶活化环的磷酸化状态,预测睾丸中最活跃的人蛋白激酶。 Cyclin依赖性激酶12(CDK12)和P21-活化激酶4(PAK4)的潜在功能已经探讨在Silico.,蛋白质 - 蛋白质相互作用分析,睾丸组织免疫检测,以及人胚胎癌细胞系中的功能测定。 CDK12与高尔基标记物的分致化表明该蛋白激酶在精子形成期间的潜在至关重要的作用。 Pak4已被发现在人体精子中表达,并且已经观察到对胚胎癌细胞对细胞凋亡的反应中的作用。我们的蛋白质发现分析在一起证实,蛋白激酶的磷素在精子分化中具有高度活性,并打开窗口,详细描述和验证潜在目标的潜在目标,用于调节男性生育和肿瘤行为。

      图形概要

      精子发生是一种复杂的细胞分化过程,在睾丸内发生在术中的睾丸(
      • de克雷斯德下午。
      • Loveland K.L.
      • Meinhardt A.
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      )。它包括紧密协调的遗传,细胞,功能性和结构性变化,产生高度专业的雄性配子,精子细胞(
      • de克雷斯德下午。
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      )。精子发生分为三个主要过程 - 有丝分裂,减数分裂和精子发生 - 包括由体细胞血清细胞机械和营养支持的不同胚细胞类型(
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      大鼠Ⅴ阶段Ⅴ型Ⅴ型细胞的三维重建:II。 Sertoli-sertoli和Sertoli-Grow-Cell关系的形态学。
      )。精子寄生尼在发芽性上皮的基础部分,并且经历了连续的有丝分裂分裂,以进行自我更新或分化对精子胶质细胞。此后,精子胶质细胞通过两种连续的减数分裂分部,这导致出现单倍体圆形精子。在精子发生的最后一步中,精子细长,大多数细胞质丢失,染色质被广泛改造,形成了施肥的专业结构,例如鞭毛和肌肉(
      • de克雷斯德下午。
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      哺乳动物精子protamine提取和分析:一种逐步的详细方案,并介绍预蛋白变化的方法。
      )。在该过程结束时,精子被释放到小管的内腔,以继续成熟在附睾中(
      • de克雷斯德下午。
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      附睾和前列腺素:它们在精子细胞的岗位成熟中的作用。
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      与精子成熟相关的附睾功能的新见解。
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      精子发生过程是任何步骤中的动感和紊乱会导致生育缺陷。因此,它需要在不同层面的紧张规范。虽然下丘脑 - 垂体睾丸轴的精子发生激素调节很好地理解(
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      雄激素受体作用在精子发生和生育率中:来自睾丸细胞特异性雄激素受体敲除小鼠的教训。
      ),其他调节层,例如通过磷酸化信号转导,仍然较少探索。众所周知,蛋白质磷酸化是在许多生物系统中调节细胞周期,细胞生长,细胞分化和细胞死亡的调节(
      • 费舍尔D.
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      从磷蛋白到磷蛋白蛋白质:历史叙述。
      )。此外,已经观察到睾丸特异性事件调节中的蛋白质磷酸化的作用,例如维持Sertoli细胞血液睾丸屏障和基础异质专业化(
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      丝裂原激活蛋白激酶,粘附结动力学和精子发生:近期数据的综述。
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      )。
      通过将磷酸盐基团添加到底物蛋白,蛋白激酶是细胞功能的关键调节因子,因此,用于调节精子发生的良好靶标和鉴定男性不孕症的潜在原因。在过去的几十年中,许多研究都集中在特定的激酶家族上,例如丝裂剂活化的蛋白激酶(MAPK),这对于精子发育至关重要(
      • 黄C.H.
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      TGF-β3通过RAS / ERK信号通路调节大鼠睾丸的血管上皮内的锚定结动力学:体内研究。
      )。具有精子发生中具有作用的其他已知的激酶是细胞周期调节剂Polo样激酶(刮)(
      • 约旦P.W.
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      在小鼠精子细胞中的Synaponemal复合物拆卸和磷酸化需要Polo样激酶。
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      • 薛Y.
      • 沙J.
      鼠标睾丸中磷蛋白酶组和激酶底物网络的系统分析。
      ),雄激素受体P21-活性激酶6(PAK6)(
      • 李S.R.
      • 拉莫斯S.M.
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      • Masiello D.
      • Swanson K.D.
      • lu m.l.
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      AR和ER与P21活化激酶(PAK6)相互作用。
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      • 约翰·克
      • 魏J.
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      AR和PAK6在雄激素刺激的PAK6激活之间的直接相互作用。
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      • Da Silva Correia J.
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      • 太阳Z.
      • Bokoch下午
      P21-活性激酶6介导的雄激素受体信号传导抑制的机理。
      )和睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶(TSSK)家族的成员,其在精子发生的最后阶段具有叫做精子发生的作用(
      • Kueng P.
      • Nikolova Z.
      • Djonov V.
      • 致锭A.
      • Rohrbach V.
      • Boehlen D.
      • Zuercher G.
      • andres a.c.
      • Ziemiecki A.
      参与精子发生的新型丝氨酸/苏氨酸激酶系列。
      )。然而,到目前为止,尚未进行人类睾丸发生的磷酸化事件的大规模鉴定。使用高通量技术将提供精子发生的分子调节的深度图像,并鉴定可能在该过程中可能必不可少的额外激酶。最近使用磷肽富集与MS合并用于对小鼠睾丸磷酸磷蛋白酶体剖面的系统分析(
      • QI L.
      • 刘Z.
      • 王J.
      • 崔Y.
      • 郭y.
      • 周T.
      • 周Z.
      • 郭X.
      • 薛Y.
      • 沙J.
      鼠标睾丸中磷蛋白酶组和激酶底物网络的系统分析。
      )。然而,由于啮齿动物和灵长类动物精子之间存在的生物和遗传差异,有必要在人类睾丸中进行这种研究的发展。
      在本研究中,我们对人体睾丸组织进行了全部精子发生的全局磷脂蛋白酶,以鉴定在雄性配子开发期间发生的最相关的信号通路。为此,金属氧化物亲和层析,采用高效二氧化钛(TiO2)耦合到MS的方法(
      • Kyono Y.
      • Sugiyama N.
      • 伊米米K.
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      羟基酸改性金属氧化物色谱法捕获的磷酸化肽的连续和选择性释放。
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      • 派尔斯队S.R.
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      无标记磷蛋白质的可行性及结直肠癌细胞系的基线信号传导。
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      • Shinoda K.
      • NA. kamura A.
      • Tomita M.
      • Ishihama Y.
      丙族羟基酸改性金属氧化物色谱法在蛋白质组学应用中纳米LC-MS / MS的脂族羟基酸改性金属氧化物色谱法富集。
      ),进行与组织学上完整的精子发生的人类睾丸的磷脂体。为了进一步研究磷调节,MS数据用于预测人睾丸中最活跃的激酶。我们的研究有助于了解由蛋白质磷酸化策划的人体精子发生的调节。此外,人类睾丸中最活性激酶的鉴定将窗口开放到详细的表征和验证潜在的良好目标,用于调节男性生殖细胞发育和睾丸癌进展。

      实验步骤

       生物材料

      经过双侧落叶切除术的患者在阿姆斯特丹在阿姆斯特丹(59-85岁)中的一部分前列腺癌治疗的一部分,捐赠了本研究中使用的人类睾丸样品。在嗜酶 - 苏木序染色后的睾丸形态学分析显示出所有情况下的正常精子发生,表明在产生睾丸精子的方面睾丸睾丸组织的类似功能。这些男性均未接受化疗或放射治疗。根据荷兰法律并由荷兰中央委员会涉及人类受试者(CCMO)的研究,这种备用组织可用于研究目的而无需进一步的道德批准,因为不需要额外的干预来获得组织。将所有患者的睾丸切成小块,随后在-196℃下冷冻,以通过MS或固定用于免疫检测。
      该研究还包括免疫组织化学分析的研究。来自肥沃成年人C57BL / 6雄性的小鼠睾丸的石蜡块被从UTRECHT大学动物伦理委员会批准的先前实验中使用。在将石蜡中嵌入免疫组化分析之前,将睾丸组织固定在稀释的Bouin中。
      用于功能分析的NCCIT细胞系代表了来自胚胎癌的未分化多能细胞类型,并在DMEM / F12中保持
      使用的缩写是:DMEM,Dulbecco的改良鹰的媒介; FBS,胎牛血清; FDR,虚假发现率;去,基因本体; IgG,免疫球蛋白G; MS / MS,串联质谱; TIO.2, 二氧化钛。
      (Lonza,巴塞尔,瑞士),含有10%的FBS,用青霉素和链霉素(10.000 U / ml),在37°C下为5%CO2。如其他地方所述培养细胞(
      • eini R.
      • 抚平H.
      • 吉利斯A.J.M.
      • Biermann K.
      • dorssers l.c.j.
      • looijenga l.h.j.
      SOX2在胚胎癌病因中的作用,基于NCCit和NT2细胞系的分析。
      )。

       睾丸组织裂解和消化

      来自三个人的人睾丸组织在含有9的裂解缓冲液中裂解 m Urea, 20 mm HEPES pH 8.0, 1 mm Na3 vo. 4 (Orthovanate),2.5米m Na4P2O7 (焦磷酸盐)和1米m Na2C3H76 (β-甘油磷酸盐),通过涡旋和超声处理。在裂解后,使用BCA方法(热电摇滚福德,IL)测定蛋白质浓度。 4.5米的组织裂解物减少m DTT在55℃下30分钟,冷却至室温,并在11米中烷基化m 碘乙酰胺在黑暗中为15分钟。随后,将组织裂解物在20米中稀释m HEPES pH 8.0将尿素浓度降低到2 m,用胰蛋白酶(Promega,Madison,Wi)消化过夜,酶/蛋白质比为1:50(w / w)。

       二氧化钛的磷酸富集(TiO2)

      对于磷酸肽富集,施加了先前基于高再现性基准基于二氧化钛的工作流程(
      • 派尔斯队S.R.
      • knol J.C.
      • de Reus I.
      • 刹车M.
      • SAMPADI B.K.
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      • Ishihama Y.
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      • JIMENEZ C.R.
      无标记磷蛋白质的可行性及结直肠癌细胞系的基线信号传导。
      )。对于每种人类睾丸组织样品,通过将TFA添加至最终浓度为1%并在冰上孵育15分钟,酸化500μg的胰蛋白酶消化物。用30mg Oasis脱盐样品 TM值 HLB墨盒(Waters Corporation,Milford,MA),先前用100%ACN激活并用0.1%TFA平衡。简而言之,将肽装入盒中,用0.1%TFA洗涤,用0.1%TFA / 80%ACN溶液洗脱。随后,用乳酸溶液(0.3g / ml乳酸,0.07%TFA,53%ACN)稀释脱盐肽1:1。对于TIO. 2 捕获,2.5毫克TiO2 珠子(GL科学,eindhoven,荷兰;10μm)填充在一个安装的200-μl移液管尖端,装有16g-针刺的C8 empore TM值 狭窄的SPE材料。包含TiO的提示2 用200μl0.1%TFA / 80%ACN洗涤床,并与200μL乳酸溶液平衡。在5次循环的200μl肽混合物中加载脱盐肽,并以1500×离心 g,4分钟。 tio.2 然后洗涤含有结合的磷酸肽,首先用200μL乳酸溶液洗涤,然后用200μL0.1%TFA / 80%ACN。通过1500×离心来进行所有步骤 g,4分钟。分别用50μL0.5%哌啶(Thermo Fisher Scientific,Bremen,Bremen,Bremen,Germany)和50μl5%哌啶的两步洗脱两步,随后在100μl20%H中淬灭34。使用200-μL移液管尖端脱盐,配有SDB-XC eMPORE的16G-Think灯 TM值 窄端的SPE材料,预先用20μl0.1%TFA / 80%ACN洗涤,并用20μL0.1%TFA平衡。将磷酸肽混合物加载并以1000×离心3分钟 g。然后用20μL0.1%TFA洗涤SDB-XC床,用20μL0.1%TFA / 80%ACN洗脱脱盐磷肽。将磷酸肽在真空离心机中干燥并溶解在20μl0.5%TFA / 4%ACN中。

       纳米LC-MS / MS

      使用最终3000纳米-SMS / MS系统(Dionex LC-Packings,Amsterdam,荷兰)分离来自全局和富集的富集的群体的每种人类睾丸生物复制的两种胰蛋白酶肽萃取物。遍历20- CM熔融二氧化硅柱(75μm内径)定制填充1.9μmReprosil-pur C18-AQ二氧化硅颗粒(120埃孔径; Maisch GmbH,Ammerbuch-Rentring,德国)。首先,肽被捕获在10mm捕集柱(100-μm内径)上,用5μmReprosil-pur C18-aq二氧化硅颗粒(120-Å孔直径),在6μl/ min和2%缓冲液B (缓冲液A:0.5%乙酸;缓冲液B:80%乙腈,0.5%乙酸),在60分钟内以300 - 40%的缓冲液B梯度分离在300nl / min中(90分钟注射到注射) 。将肽在+ 2kV和纳米喷雾器中电离成Q辐射质谱仪(Thermo Fisher Scientific)。完整的质量以70,000(在 m ,/ z,200),使用自动增益控制(AGC)目标值3×106 收费。使用1.6-AMU隔离宽度和25%归一化碰撞能量,将前10个肽信号(不包括充电状态1+)在更高能量的碰撞解离细胞中提交MS / MS。 MS / MS光谱在壁图中获得,分辨率为17,500(在 m ,/ z,200),使用AGC目标值2×105 收费和欠填充比率为0.1%。使用重复计数为1的动态排除和30秒的排除时间。

       来自MS / MS数据的蛋白质识别

      在纳米-SMS / MS之后获得的MS / MS光谱是针对UNIPROT人参考蛋白质组FASTA文件(2015年9月发布,Canonical和同种型,42122个条目)使用MaxQuant 1.5.2.8软件补充有常见的污染物Fasta文件(245条目) (
      • Cox J.
      MaxQuant能够高肽识别率,个体化P.P.B.范围质量精度和蛋白质组含蛋白质定量。
      ,
      • VizcaínoJ.A.
      • 德意曲e.w.
      • 王R.
      • Csordas A.
      • Reinger F.
      • ríosd.
      • 戴安斯J.A.
      • 太阳Z.
      • Farrah T.
      • Bandeira N.
      • binz p.a.
      • Xenarios I.
      • 艾森凯母线
      • Mayer G.
      • Gatto L.
      • 坎波奥A.
      • Chalkley R.J.
      • Kraus H.J.
      • Albar J.P.
      • 马丁内斯 - 巴尔多洛姆És。
      • APWEILER R.
      • OPENN G.S.
      • 玛特L.
      • 琼斯A.R.
      • Hermjakob H.
      Proteomexchange提供全球协调的蛋白质组学数据提交和传播。
      )。将酶特异性设定为胰蛋白酶,允许两种错过的裂解。半胱氨酸羧酰胺甲基化被设定为固定改性,丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸磷酸化,甲硫氨酸氧化和N-末端乙酰化,作为可变修饰。使用默认的MaxQuant设置,将肽前体离子进行4.5ppm的最大质量偏差,以及最大质量偏差为20ppm的片段离子。使用诱饵数据库策略在1%的FDR中过滤肽和蛋白质鉴定和现场本地化。当本地化概率是时,磷的本地化被认为是明确的>0.75。最小的肽长度为7个氨基酸,改性肽的最小andromeda评分为40,并且最小Δ评分为6.仅基于MS / MS光谱无法分化的蛋白质被分组为蛋白质组(默认最大设置) 。使用匹配的匹配 - 运行(MBR)选项检查肽识别在样品中传播。使用选定的无标签量化选项进行裂解物搜索。

       无标记的磷酸肽量化

      通过计数MS / MS光谱(光谱计数)量化磷肽(
      • 刘H.
      • Sadygov R.G.
      • yates j.r.
      霰弹枪蛋白质组学中相对蛋白质丰度的随机抽样与估算模型。
      )或通过其提取的离子强度(“最大值”)。对于每个样品,使用MaxQuant证据文件(“归一化强度”)标准化样品中所有鉴定肽的中值LOG10强度的磷酸肽强度。对于对应裂解物的蛋白质表达分析,光谱计数在每个样品中的计数的总和上归一化。

       激酶排名

      为了鉴定人类睾丸中最活跃的激酶,使用自定义表在R网资源中提取的数据,包括来自Kinbase的当前公认的蛋白激酶(http://kinase.com )(
      • 曼宁G.
      • 唠叨D.B.
      • 马丁内斯·
      • 猎人T.
      • sudarsanam s.
      人类基因组的蛋白激酶补体。
      )和HGNC的官方基因符号(http://www.genenames.org )(
      • 灰色K.A.
      • yates b.
      • 密封R.L.
      • Wright M.W.
      • Bruford E.A.
      Genenames.org:2015年的HGNC资源。
      )。在Phomics网站上提供的算法(http://phomics.jensenlab.org )(
      • Munk S.
      • Refsgaard J.C.
      • 奥尔森J.V.
      • Jensen L.J.
      )用于鉴定激酶活化环肽。
      来自MaxQuant“修饰特异性份数”表的磷肽数据与上面计算的光谱计数数据组合。表排与将多个Uniprot衍生的基因符号连接的磷酸肽数据被剥去成单独的行,用单个基因符号映射到官方HGNC批准的基因符号。将相同的磷酸肽连接到不同的UniProt基因符号的冗余行,但除去相同的HGNC映射符号。对于Kinome(磷酸氨基酶)分析,然后用衍生自蛋白激酶的磷酸肽(如kinbase所定义)的磷酸肽过滤表。对于激活回路分析,通过在Phomics网站的帮助下确定,再过滤在激活的激活区段中的肽进行肽。
      将Kinome和活化环形表格减少到在所有三个睾丸组织复制中检测到的磷酸肽的数据,并且从复制的光谱计数平均。为了考虑相同肽的多种磷酸化,通过将平均光谱计数乘以磷粉质的数量来计算修饰的度量。对于每次分析,在肽数据的聚集到蛋白质水平之后,绘制了前20个磷酸酶的(改性)平均光谱计数的条形图。堆叠的条形表示给定激酶的累积值,具有代表单个磷酸肽的贡献的条形段。

       人体睾丸蛋白质组和磷脂蛋白数据的生物信息分析

      比较鉴定为每种生物重复的磷酸肽和磷蛋白质的列表,并使用Venny 2.1进行可视化(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)。从三个个体(磷酸化和非磷酸化蛋白质; 3重复)中鉴定的人类睾丸中鉴定的蛋白质清单与其他人发表的人类睾丸捐赠者的先前蛋白质报告合并(
      • 刘M.
      • 胡Z.
      • QI L.
      • 王J.
      • 周T.
      • 郭y.
      • 曾Y.
      • 郑湾
      • 吴y.
      • 张P.
      • 陈X.
      • TU W.
      • 张T.
      • 周问
      • 江米
      • 郭X.
      • 周Z.
      • 沙J.
      人类睾丸蛋白质组学分析扫描新型癌症/睾丸蛋白。
      ),完成人睾丸蛋白的目录。 GO和途径浓缩分析在David V6.8(
      • 黄D.W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      生物信息学富集工具:大型基因清单综合功能分析的路径。
      ,
      • 黄D.W.
      • 谢尔曼B.T.
      • LEMPICKI R.A.
      用大卫生物信息学资源对大型基因清单的系统和综合分析。
      )。 Bonferroni校正多重比较后, p,价值观<0.001被认为是显着的。使用String 10.0数据库识别蛋白质 - 蛋白质交互网络(http://string-db.org/)。只有那些与高置信相互作用得分的相互作用(根据字符串10.0指示的评分≥0.7)都被包括在分析中。直接与利息目标(即CDK12和PAK4)直接与其生物学功能进行分类,使用UNIPROT知识库(UNIPROTKB / SWISS-PROM)网站(http://www.uniprot.org )。

       在人和小鼠睾丸组织中的激酶CDK12和PAK4免疫缩乳

      选择在睾丸磷蛋白质中鉴定的两种活性激酶被选择通过免疫检测程序进一步研究。从固定和嵌入式人和小鼠睾丸组织的切片以5μm切割并安装在超级冰柱(Menzel,Braunschweig,德国)上,在37℃下干燥过夜,并在4℃下储存直至进一步使用。
      对于免疫组织化学分析,睾丸切片被催留并用0.3%过氧化氢在PBS中处理10分钟,以抑制内源过氧化物酶。在室温下在补充有0.5%乙酰化BSA和5%山羊血清的5%BSA中封闭非特异性粘附位点。对于CDK12检测,睾丸部分与2μg/ mL抗CDK12(ORB317586; Biorbyt,San Francisco,CA)一起温育过夜,在4°C下过夜。对于PAK4检测,将部分与4μg/ ml抗PAK4(SC-390507; SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY INC,SANTA CRUZ,CA)一起温育过夜4°C。还包括含有相同浓度IgG的同种型对照。通过在室温下与电动抗性多辣根过氧化物酶缀合(免疫视觉技术,伯格拉姆,CA)孵育1小时,通过与电动抗性多辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠/兔/鼠抗体(免疫视觉技术,伯格拉姆,CA)进行地进行信号。随后,使用3,3'-二氨基苯甲酸(DAB)作为底物,作为血管蛋白作为占有王。使用Olympus BX41明亮的场显微镜(Olympus America Inc,Centre Valley,PA)检查幻灯片。
      对于免疫荧光分析,将脱蛋白化的载玻片与TrueBlack(Biotium,Fremont,Ca)自发荧光猝灭剂和超块(AAA999,Scytek Laboratories,Logan,UT)孵育,以阻止非特异性染色。如上所述将载玻片与4μg/ ml抗GM130(SC-55590; Santa Cruz Biotechnology Inc)或2μg/ ml VASA / DDX4(SC-517247; Santa Cruz Biotechnology Inc)和DAPI组合孵育抗CDK12。作为占有。信号用驴抗兔AF488(CDK12)或山羊 - 抗小鼠AF555(GM130和VASA / DDX4)进行了可视化。使用Leica DM 5000B(Leica Microsystems,Amsterdam,荷兰)检查幻灯片。

       MTS细胞增殖测定在PAK4 siRNA NCOIT转染细胞上凋亡诱导后

      为了评估Pak4下调对细胞增殖的影响,Nccit细胞,来自人胚胎癌的未分化细胞系,在2×10的6孔板中播种在6孔板中5 细胞/孔并在50%汇合后的第二天转染。目标加上人pak4 siRNA(智能池, l-003615-00,Dharmacon,GE生命科学,拉斐特,CO)用于转染。作为阴性对照,用靶标加不靶向siRNA#1转染细胞(d-001810-01-05)。将NCOIT细胞在含有10n的2ml转染培养基中孵育m 在Dharmafect4转染试剂(Dharmacon)中稀释的siRNA在37°C下的5%CO2 48小时,遵循制造商的说明。通过定量PCR测定PAK4 siRNA转染的效率。简而言之,在Qiazol裂解试剂(Qiagen GmbH,Hilden,德国)中收获细胞,并且使用纳米二普山阶级山峰(Thermo Fisher Scientific)进行分离出MRNA。随后,用Agilent 2200捆扎系统(安捷伦技术,圣克拉拉,加利福尼亚州)监测mRNA质量。用0.5μgrna和iscort进行RT-PCR TM值 cDNA合成试剂盒(Bio-rad,Hercules,CA)。定量PCR分析在CFX96热循环仪(BIO-RAD)中进行了IQ TM值 Sybr®GreenSubsmix(Bio-rad)和RT2 人类PAK4(QIAGEN)的QPCR引物测定。制作了两个分析重复。 HNRNPK,壬二和NUDT21的表达水平用作内源性对照。根据Hellemans,在QBase +(Biogazelle,Zwijnaarde,Belgium)中计算了多种参考基因标准化,跨越校准和误差传播的相对定量。 等等。 ,(
      • Hellemans J.
      • 肥胖者G.
      • de paepe A.
      • Speleman F.
      • Vandesompele J.
      QBase相对量化框架和软件用于管理和自动分析实时定量PCR数据。
      )。
      在96孔板中,在培养基中接种等数量的转染的NCCIT细胞(用PAK4 siRNA或不靶向siRNA)。对于诱导细胞凋亡,通过新鲜常规培养基(对照, n,= 3),含有0.1%FBS的新鲜培养基(血清饥饿, n,= 3)或含100米的新鲜培养基m Paclitaxel(细胞死亡诱导者受丝分裂逮捕; Sanbio,乌登,荷兰; n,= 3)。然后将细胞在37℃下孵育48小时,低于5%CO2。检测不同治疗后细胞增殖水平,Celltiter96®AQ ueoues 在制造商的适应症之后进行一种溶液细胞增殖测定法(PRomega)。

       实验设计与统计理由

      来自三个具有形态学正常精子发生的人的人睾丸组织用于通过TIO用于全球磷酸肽富集2 方法。已知这种方法在三个生物学复制中具有高再现性磷酸肽鉴定,并且对磷酸化氨基酸没有偏差,序列背景,肽长度或疏水性(
      • 派尔斯队S.R.
      • knol J.C.
      • de Reus I.
      • 刹车M.
      • SAMPADI B.K.
      • PHAM T.V.
      • Ishihama Y.
      • verheul h.m.w。
      • JIMENEZ C.R.
      无标记磷蛋白质的可行性及结直肠癌细胞系的基线信号传导。
      )。在本研究中获得的MS数据的额外质量分析之后,丢弃与该程序相关的任何潜在的技术方差源。为了减少睾丸样品的生物变异性对我们的结果的影响,只有在所有三种供体中鉴定的那些磷肽用于激酶排名。通过对Go和Reactome术语的富集分析预测所鉴定的蛋白质的功能介入,其中通过对应于单尾Fisher精确的易于分数来计算重要性 p, 价值。应用了多种比较的Bonferroni校正 p,价值观<0.001被认为是显着的。此外,使用高置信相互作用得分(得分≥0.7)预测蛋白质 - 蛋白质相互作用。
      通过免疫组织化学和免疫荧光染色来自3名男性和2个成年小鼠的睾丸组织上的免疫组织化学和免疫荧光染色,表达了两种鉴定的激酶,CDK12和PAK4的表征。用异型IgG抗体染色的部分用作对照。
      对于每个测试的条件,用Pak4 siRNA瞬时转染的NCCIT细胞的三种生物学复制探讨了PAK4在细胞凋亡反应中的参与。作为对照组的Nontargeting siRNA。假设正态分布,使用多个数据进行统计分析数据 t,在GraphPad Prism 7中测试(GraphPad软件,La Jolla,CA)。使用HOLM-SIDAK方法校正了结果的多种比较。 p,价值观<0.05被认为是显着的。

      结果

       人类睾丸磷脂蛋白酶和蛋白质组的组成

      使用TiO在本研究中进行的全局磷酸富集2 结合LC-MS / MS分析的方法导致人体睾丸中的8187种不同的磷酸肽,具有完全精子发生(Fig. 1A, 补充表S1),对应于2661个单独的磷酸蛋白(Fig. 1B ,; 补充表S1)。值得注意的是,所得鉴定的磷酸肽在强度方面的鉴定磷酸肽的百分比范围为90.45至92.11%(补充图。S1),表明高效的磷酸富集。 Maxquant的磷矿定位分析分配约89.7%的磷酸酯,苏氨酸,9.8%至苏氨酸,0.5%至酪氨酸(补充图。S1, 补充表S1)。在该分析中包含的三个供体样品之间观察到所鉴定的磷蛋白的高定量相关性,Pearson相关系数测距 r,= 0.954到 r,= 0.968和线性回归值范围从r2 = 0.9093 to r2 = 0.9370 (补充图。S1)。三种供体样品之间的MS鉴定的重叠为磷酸肽鉴定(3878磷酸肽)的47.4%,并且在单个磷酸蛋白(1716磷蛋白)方面的64.5%(Fig. 1A - - 1B,)。属于3重复重叠的磷酸肽显示比在所有三个样品中未识别的磷磷差异较高(补充表S1 )。
      图缩略图GR1.
      图。1。 人类睾丸磷脂蛋白酶和蛋白质组的组成。 A,显示磷酸肽数(基于光谱计数)的Venn图,由TiO鉴定2基于三种人睾丸组织中的磷蛋白酶从捐献者的含有全部精子发生的组织样品中的磷蛋白酶样品。 B,从睾丸磷肽清单中鉴定的磷蛋白蛋白蛋白蛋白的总数和生物重复内的重叠。 C,通过LC-MS / MS方法编制人类睾丸中鉴定的蛋白质。本研究中鉴定的蛋白质总目录与刘先生的前一份报告合并 等等。 ,(
      • 刘M.
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      • QI L.
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      • 张T.
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      • 郭X.
      • 周Z.
      • 沙J.
      人类睾丸蛋白质组学分析扫描新型癌症/睾丸蛋白。
      )。 D,在总人体睾丸蛋白质组内鉴定的磷蛋白蛋白的比例(目前的研究和刘 等等。 ,2013(52))。
      总组织裂解物的MS / MS分析导致鉴定3576种不同的蛋白质(补充表S2)。这些蛋白质与完整的磷蛋白列表的组合导致总共5158种不同的蛋白质,其中至少一种分析的人类睾丸组织样品(Fig. 1C,)。当将该人睾丸蛋白质列表与先前由刘和同事报告的数据进行比较时,他们使用来自一个具有正常精子发生的人的人睾丸组织鉴定了总共6985种不同的蛋白质(
      • 刘M.
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      • 沙J.
      人类睾丸蛋白质组学分析扫描新型癌症/睾丸蛋白。
      ),发现1105个蛋白质在本研究中专门检测到(Fig. 1C,)。睾丸蛋白的编译列表(代表我们的研究和刘的组合 等等。 ,2013年(
      • 刘M.
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      • TU W.
      • 张T.
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      • 郭X.
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      • 沙J.
      人类睾丸蛋白质组学分析扫描新型癌症/睾丸蛋白。
      ))通过使用MS技术,在人体睾丸中迄今为止鉴定了8090个基因产物,通过使用MS技术(Fig. 1C,)。从这些中,发现32.9%在本研究中被磷酸化(Fig. 1D ,)。

       人体睾丸磷酸磷蛋白酶的功能注释

      将睾丸磷蛋白酶与David V6.8进行富集和反应术语的富集分析。通过这样做,发现在人睾丸组织中进行的磷酸化事件主要涉及主要在染色体组织和DNA包装,细胞周期,RNA剪接和对应力的细胞反应(Fig. 2A, 补充表S3)。有趣的是,精子发生的过程也是超越的。具体地,本研究中鉴定的81种磷蛋白组织与精子产生和发育(Bonferroni纠正)有关 p, 价值< 0.0001; Fig. 2A, 补充表S3)。此外,该数据中的前5个富集的反应态途径揭示了磷酸化蛋白在NGF和EGFR的信号传导中,细胞周期,含有前mRNA的内含子的加工和细胞凋亡( 表I. )。
      图缩略图GR2.
      图2。 睾丸磷蛋白和激酶排名的功能性累容。 A,基于GO术语,对人类睾丸磷酸磷蛋白酶中最过度持久的生物过程丰富。 Bonferroni纠正了 p,价值观<0.001。 Go注释是排序的 p,价值(顶部的最高意义),以及每个GO类别的人类睾丸中发现的基因产品数量。 B,基于在所有三种生物学重复中鉴定的磷酸肽的光谱计数的蛋白激酶排名。堆叠的条表示给定激酶的累积值,具有代表来自相同激酶的单个磷酸肽的贡献的棒段。 C基于属于激酶活化环的磷酸肽的光谱计数,蛋白激酶排名。只有在所有三种生物重复中鉴定的磷酸肽用于激酶排名。堆叠的条表示给定激酶的累积值,具有代表来自相同激酶的单个磷酸肽的贡献的棒段。
      表I. 在人睾丸磷脂蛋白组数据集中的反应术语的过度表示。用David V6.8进行分析。反应术语:人磷脂蛋白酶组数据集中的过度持续的途径和相应的代码;基因计数:与属于特定反应类别的人睾丸中鉴定的人磷蛋白相对应的基因数; Bonferroni P值:单尾Fisher精确的P值在ondferroni校正后进行多重比较
      反应术语基因计数Bonferroni. p , 价值
      React_578:凋亡448.30E-05.
      React_125:加工含有内含子的前mRNA411.50E-05.
      React_152:细胞周期,有丝分裂851.10E-05.
      React_9417:EGFR的信令289.70E-09.
      React_11061:NGF的信令692.00E-11.
      根据Go细胞组分富集分析,睾丸磷蛋白似乎位于所有细胞盒中(表二)。值得注意的是,缩写物组在数据集中超越(表二),这同意富集MRNA相关的过程 Fig. 2A
      表二基因本体学细胞组分鉴定分析人类睾丸磷酸磷蛋白组数据集。用大卫v6.8进行分析。去细胞组分术语:在人磷脂蛋白组数据集中过度代表的去细胞分量注释;基因计数:对应于属于Go细胞组分类别的人睾丸中鉴定的人磷蛋白对应的基因数; Bonferroni P值:单尾Fisher精确的P值在ondferroni校正后进行多重比较
      去细胞分量术语基因计数Bonferroni. P值
      核腔3879.30E-43
      cytosol. 3494.20E-36
      骨髓2441.60E-27.
      微管细胞骨架1601.70E-19.
      染色体1414.30E-19.
      细胞交界处1343.30E-11
      核糖核苷络合物1231.20E-07.
      脾蛋白421.00E-04.

       预测睾丸组织中最活跃的人类激酶

      在人睾丸中鉴定的磷酸肽中,源自蛋白激酶序列。具体地,对应于174个不同激酶的磷酸肽在人睾丸磷酸磷蛋白组数据集中鉴定,其占据了人Kinome的32%。激酶是负责磷酸化的酶,它们的活化也取决于其自身的磷酸化状态。另外,观察到的磷酸肽MS / MS光谱的数量显示组织中某个激酶与途径中该激酶的活性相关(
      • Rikova K.
      • 郭阿。
      • 曾Q.
      • 可能A.
      • yu J.
      • 海克H.
      • NA. rdone J.
      • 韭葱。
      • Reeves C.
      • 李Y.
      • 胡Y.
      • 谭Z.
      • 斯托克斯米
      • Sullivan L.
      • 米切尔J.
      • Wetzel R.
      • 麦克奈尔J.
      • 任吉。
      • 元J.
      • bakalarski c.e.
      • Villen J.
      • Kornhauser J.M.
      • 史密斯B.
      • 李德。
      • 周X.
      • Gygi S.P.
      • GU T.L.
      • Polakiewicz R.D.
      • 赶紧J.
      • 梳理M.J.
      全球磷酸赖硒信令调查鉴定肺癌中的致癌酶。
      )。考虑到这一点,来自三种生物重复的三种磷酸肽子集的MS / MS数据(47.3%的鉴定的磷酸肽; Fig. 1A,)用于激酶排名(补充表S4)。根据计数的光谱的数量显示,前20名最突出的磷酸化激酶 Fig. 2B。有趣的是,大多数激酶也被发现在激活回路中磷酸化(Fig. 2C, 补充表S5),其表示人体睾丸中这些蛋白质的活性状态。
      本研究中进行的人睾丸激酶排名鉴定了属于同一家族的一些蛋白激酶,例如已知批判性地参与精子发生调节的马赛克。在人睾丸中鉴定了多个活性激酶的其他系列包括细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK),丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶D(PRKDS)和P21-活化的激酶(PAKS)等(Fig. 2B - - 2C,)。有趣的是,基于UNIPROT知识库(UNIPROTKB / SWISS-PROM)网站上提供的信息,这些预测的活性激酶中的大多数都与在人类睾丸总磷酸磷蛋白酶总量中发现的超级逗留GO注释有关(Fig. 2A,)。例如,CDK12参与mRNA剪接,并在调节细胞凋亡和细胞周期中的pak4。注意,到目前为止,这两个激酶都没有在精子发生中研究过。无论如何,据报道,CDK12和PAK4都在睾丸中高度表达,并且分别与其他精子发生相关蛋白质(例如Cyclin K和PAK6)相关联(从Uniprotkb知识库中提取的信息, http://www.uniprot.org;和人类蛋白质地图集, //www.proteinatlas.org/)。因此,在本研究中进一步探讨了CDK12和PAK4在人类睾丸中的潜在作用。

       CDK12蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质相互作用和睾丸表达

      CDK12被鉴定为人类睾丸中最突出的活性激酶之一。具体地,鉴定了11个CDK12磷酸肽,其中一个属于激酶活性回路(Fig. 2B - - 2C, 补充表S4,S5 )。
      串分析,包括总人睾丸蛋白质组(本研究中鉴定的磷酸化和非磷酸化蛋白质,并与刘和同事(
      • 刘M.
      • 胡Z.
      • QI L.
      • 王J.
      • 周T.
      • 郭y.
      • 曾Y.
      • 郑湾
      • 吴y.
      • 张P.
      • 陈X.
      • TU W.
      • 张T.
      • 周问
      • 江米
      • 郭X.
      • 周Z.
      • 沙J.
      人类睾丸蛋白质组学分析扫描新型癌症/睾丸蛋白。
      ), Fig. 1C,)揭示了CDK12与23个人睾丸蛋白的高置信相互作用(Fig. 3A,)。根据UNIPROT知识库中可用的信息分为三个官能团的CDK12-相互作用蛋白:(1)细胞周期调节,(2)mRNA剪接和(3)转录调控(Fig. 3A ,)。
      图缩略图GR3.
      图3。 CDK12蛋白质 - 蛋白质 - 蛋白质相互作用和表达在人体睾丸中。 A,CDK12与人睾丸蛋白(左)的蛋白质 - 蛋白质相互作用,由String 10.0数据库预测(置信度分数>0.7)。相互作用蛋白根据来自Uniprot知识库(Uniprotkb / Swiss-prot)(右)的数据分布在官能团中。 B,具有全精子发生的人睾丸组织中CDK12免疫组织化学的代表性图像。插入是人生细胞特定圆形结构中CDK12染色的更高放大率,由箭头(左)表示。与相同的IgG同种型用作阴性对照(右)。 C,用Golgi设备Marker Gm130(左侧)和细微标记DDX4(右侧)共染色CDK12。注意围绕Golgi结构的CDK12的共定位,由白色箭头表示。细胞用DAPI染色。
      CDK12的免疫组织化学分析显示,它以人睾丸的半成小管的后期精子细胞的明显结构表达(Fig. 3B,)。在小鼠睾丸组织部分中观察到可比较的染色(补充图S2),在相应的同学IgG控件中未检测到(Fig. 3B , 和 补充图S2)。有趣的是,使用免疫荧光显微镜,观察到具有Golgi设备标记GM130的CDK12的共定位(Fig. 3C(),而且没有用DDx4检测到重叠,痣颗粒的标记物(含有PiRNA和RNA结合蛋白的生殖细胞特异性细胞器; Fig. 3C,)。具体地,CDK12似乎局限于GOLGI设备的周围环境(Fig. 3C ,)。

       Pak4蛋白质 - 蛋白质相互作用和睾丸局部化

      在3个供体样品中通过MS鉴定三个PAK4磷酸肽(Fig. 2B, 补充表S4),其中一个代表激酶的活性环(Fig. 2C, 补充表S5)。字符串分析显示,在本研究中的MS方法以及刘的MS接近,在人类睾丸中鉴定的PAK4和其他蛋白质之间的48个高置信蛋白质 - 蛋白质相互作用以及刘 等等。 ,(
      • 刘M.
      • 胡Z.
      • QI L.
      • 王J.
      • 周T.
      • 郭y.
      • 曾Y.
      • 郑湾
      • 吴y.
      • 张P.
      • 陈X.
      • TU W.
      • 张T.
      • 周问
      • 江米
      • 郭X.
      • 周Z.
      • 沙J.
      人类睾丸蛋白质组学分析扫描新型癌症/睾丸蛋白。
      )( Fig. 4A,)。根据其相应的生物学功能,将预测的Pak4相互作用蛋白分为三个主要组,如下:(1)参与细胞迁移和细胞骨骼动态的人,(2)参与转录调控的人,以及(3)那些参与细胞周期,增殖和细胞凋亡的调节(Fig. 4A ,)。
      图缩略图GR4.
      图4。PAK4蛋白质 - 蛋白质相互作用和人类睾丸的表达。 A,PAK4与人睾丸蛋白(左)的蛋白质 - 蛋白质相互作用,由String 10.0数据库预测(置信度分数>0.7)。相互作用蛋白根据来自Uniprot知识库(Uniprotkb / Swiss-prot)(右)的数据分为官能团。 B,PAK4免疫组织化学的代表性图像在人睾丸组织中具有全精子发生。插入是人体精子子组中特定PAK4染色的更高放大率,由箭头(左)表示。相同浓度的异型IgG用作阴性对照(右)。
      在嗜聚小管中,在人体精子的子集上观察到PAK4表达(Fig. 4B,)。在小鼠睾丸中,除了精菌细胞外,还在血清细胞中检测到pak4(补充图S2)。在对人和小鼠睾丸部分进行的相应同种型对照中观察到精肽和血清细胞中没有染色(Fig. 4B , 和 补充图S2 )。

       pak4在胚胎癌细胞中的作用响应凋亡刺激

      靶向PAK4在NCCIT细胞中的siRNA转染导致降低PAK4 mRNA水平的77%(Fig. 5A,)。在血清剥夺条件下孵育转染细胞(0.1%FBS培养基)或100米m 紫杉醇,诱导细胞应激和凋亡。通过代谢活性细胞测量MTS四唑鎓化合物的生物诱导能力来监测SIPAK4转染的NCOIT细胞的能力。虽然在48小时培养期结束时,减少了瞬态PAK4倒塌在NCCIT细胞中的影响(Fig. 5A,),代谢活性(Live)细胞的数量显着降低(p, 价值<0.01; Fig. 5B,)。有趣的是,用细胞凋亡诱导物紫杉醇治疗后观察到主要差异,与对照NCOT细胞相比,瞬态滞下细胞中的60%较少的代谢活性细胞减少(Fig. 5B ,)。
      图缩略图GR5.
      图5。PAK4在胚胎癌细胞对凋亡刺激的反应中的作用。 A,PAK4在NCOCIT细胞(SIPAK4)中PAK4 siRNA转染后MRNA水平的瞬态截止效率与阴性对照(SINT)相比。在转染后(转染后)后右测定pak4 mRNA水平,在常规培养基(10%FBS培养基)存在下48h后,培养基中血清剥夺(0.1%FBS培养基)或紫杉醇(100米m Paclitaxel)。 B,使用Celltiter96®AQ测定NCCit细胞对凋亡刺激的响应 ueoues 一种溶液细胞增殖测定。 od.490 值(后台减法)表示代谢活性细胞的比例。

      讨论

      在本研究中,我们展示了对全精子发生的人类睾丸的磷脂蛋白酶综合分析。基于MS的方法的进步使磷蛋白酶成为目前在定义的生物系统中的信令网络的全局分析中最强大的技术(
      • MACEK B.
      • 奥尔森J.V.
      全球和特异性定量磷蛋白蛋白酶:原则和应用。
      )。在雄性繁殖领域中,磷蛋白酶被用于解开精子运动的分子机制(
      • Amaral A.
      • 卡斯蒂略J.
      • Ramalho-Santos J.
      • Oliva R.
      组合人精子蛋白质组:细胞途径和对基础和临床科学的影响。
      ,
      • parte p.p.
      • Rao P.
      • redij s.
      • Lobo V.
      • d'souza s.j.
      • Gajbhiye R.
      • Kulkarni V.
      通过超级性能液相色谱分析的精子磷脂蛋白组分析,然后进行数据独立分析(LC-MS(e))揭示了哮喘患者的改变蛋白质组学签名。
      )。然而,到目前为止,没有进行人体睾丸中的磷调节的深入研究。通过使用TiO的磷肽富集2 方法与LC-MS / MS结合,我们已经确定了来自2661个蛋白质的8187种磷酸肽,导致人睾丸磷蛋白的最完整报告。重要的是强调本研究中进行的全球磷酸富集富集方法被证明是高度可重复和强大的(
      • 派尔斯队S.R.
      • knol J.C.
      • de Reus I.
      • 刹车M.
      • SAMPADI B.K.
      • PHAM T.V.
      • Ishihama Y.
      • verheul h.m.w。
      • JIMENEZ C.R.
      无标记磷蛋白质的可行性及结直肠癌细胞系的基线信号传导。
      )。因此,这里描述的三种供体之间的有限重叠用于鉴定磷酸肽和单个蛋白质,暴露不同供体之间的内在生物异质性。
      根据本文报道的结果,磷蛋白代表人体睾丸蛋白质组的32.9%,与男性Gonad中的高活性过程密切相关,例如转录和翻译规则,细胞骨架组织,DNA包装,细胞周期和凋亡。值得注意的是,在本研究中进行的去浓缩分析中也发现精子发生的术语超过了。这将与32%的人睾丸磷酸磷蛋白酶中包含的事实一起证实,蛋白激酶的磷测温是从精子分化到精子的细胞分化中的高活性。
      有趣的是,磷蛋白在人体精子发育中的功能性涉及就像啮齿动物精子发生,因为之前在小鼠睾丸磷蛋白酶中观察到了可比的功能注释(
      • QI L.
      • 刘Z.
      • 王J.
      • 崔Y.
      • 郭y.
      • 周T.
      • 周Z.
      • 郭X.
      • 薛Y.
      • 沙J.
      鼠标睾丸中磷蛋白酶组和激酶底物网络的系统分析。
      )。然而,协调该调节的主要蛋白激酶似乎在鼠标和人之间存在不同。虽然在小鼠睾丸中发现鼠标样激酶(刮块)非常活跃(
      • QI L.
      • 刘Z.
      • 王J.
      • 崔Y.
      • 郭y.
      • 周T.
      • 周Z.
      • 郭X.
      • 薛Y.
      • 沙J.
      鼠标睾丸中磷蛋白酶组和激酶底物网络的系统分析。
      ),在这项研究中的激酶排名后,在前20位中没有发现人类局。相反,我们发现MAPK1和MAPK3(分别称为ERK2和ERK1)作为人类睾丸中最活跃的激酶中最活跃的激酶,由其磷酸肽的丰富和它们的激酶活化环中存在磷酸水的存在。这些数据与报告MAPK1和-3在精子发生中发挥关键作用的几个出版物一致。具体地,已知它们参与调节有丝分裂,减数分裂和塞托利 - 塞托利和塞托利 - 生殖器界面(
      • 黄C.H.
      • 程C.Y.
      丝裂原激活蛋白激酶,粘附结动力学和精子发生:近期数据的综述。
      ,
      • Walker W.H.
      睾酮和精子发生的非古典作用。
      ,
      • 夏W.
      • 程C.Y.
      TGF-β3通过RAS / ERK信号通路调节大鼠睾丸的血管上皮内的锚定结动力学:体内研究。
      )。此外,MAPK1和-3通过丝氨酸/苏氨酸 - 蛋白激酶D1(PRKD1)激活后调节细胞增殖(
      • Jadali A.
      • Ghazizadeh S.
      蛋白激酶D涉及对小鼠角质形成细胞的原发性培养物中的可逆致力于分化。
      ),也鉴定在人体睾丸激酶排名中。
      已知人类睾丸中的其他高度突出的激酶参与在不同细胞类型中的mRNA剪接的调节,例如前mRNA处理因子4b(prpf4b)和细胞周期蛋白依赖性激酶CDK12和CDK13(
      • 陈H.-h.
      • 王Y.-c.
      • fann m.-j.
      替代剪接调节中涉及的CDK12 / cyclin L1复合物的鉴定和表征。
      ,
      • 陈H.H.
      • 黄Y.H.
      • Geneviere上午。
      • Fann M.J.
      CDK13 / CDC2L5与L型调节相互作用并调节替代剪接。
      ,
      • 软猪D.P.
      • 霍莉A.C.
      • 拉哈西S.
      • 德莱尔G.
      连接斑点:拼接激酶及其在肿瘤内酯和治疗反应中的作用。
      ,
      • 施耐德M.
      • Hsiao H.H.
      • 将c.l.
      • Giet R.
      • Urlaub H.
      • Lührmannr.
      在抗乳糖体B复合物形成期间稳定的三-SnRNP结合需要人PrP4激酶。
      )。替代剪接允许单个基因编码不同或多种蛋白质(
      • Andreadis A.
      • Gallego M.E.
      • NADAL-GINARD B.
      通过替代拼接产生蛋白质同种型多样性:机械和生物学意义。
      )这对于需要紧张调节的复杂细胞分化过程尤为重要,因此精子发生中的情况(
      • 黄X.
      • 李杰。
      • Lu L.
      • 徐M.
      • 肖J.
      • 尹l。
      • 朱H.
      • 周Z.
      • 沙J.
      通过cDNA微阵列鉴定的人睾丸中的新型发展相关的替代接头。
      ,
      • 威纳斯J.P.
      睾丸中的替代拼接。
      )。事实上,睾丸是一种组织,其具有最高水平的体内替代剪接,与脑和肝脏一起(
      • yeo g.
      • 霍尔斯特D.
      • Kreiman G.
      • 击败C.B.
      人体组织替代剪接的变异。
      ),这与人类睾丸磷蛋白剖面中该途径的过度陈述一致。进一步 在Silico.,对CDK12蛋白质 - 蛋白质相互作用的分析也表明了CDK12在雄性腺中的作用,以及转录调节和细胞周期的潜在参与。 CDK12是细胞周期蛋白依赖性激酶,其需要与细胞周期蛋白调节伙伴的相互作用变得活跃,例如细胞周期蛋白k(
      • 陈H.-h.
      • 王Y.-c.
      • fann m.-j.
      替代剪接调节中涉及的CDK12 / cyclin L1复合物的鉴定和表征。
      ,
      • 陈H.H.
      • 黄Y.H.
      • Geneviere上午。
      • Fann M.J.
      CDK13 / CDC2L5与L型调节相互作用并调节替代剪接。
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      • Blazek D.
      • Kohoutek J.
      • Bartholomeeusen K.
      • 约翰森E.
      • Hulinkova P.
      • 罗Z.
      • cimermancic p.
      • j.
      • Peterlin B.M.
      细胞周期蛋白K / CDK12复合物通过调节DNA损伤反应基因的表达来保持基因组稳定性。
      ,
      • Loyer P.
      • 颤抖的J.H.
      • 卡托纳R.
      • kidd v.j.
      • 拉赫蒂吉。
      CDK / cyclin复合物在转录和RNA剪接中的作用。
      )。事实上,通过其他人发现CDK12 / cyclin K复合物通过哺乳动物细胞中RNA聚合酶II的C-末端结构域的磷酸化来调节DNA损伤响应基因(
      • 陈H.-h.
      • 王Y.-c.
      • fann m.-j.
      替代剪接调节中涉及的CDK12 / cyclin L1复合物的鉴定和表征。
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      • 罗Z.
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      • j.
      • Peterlin B.M.
      细胞周期蛋白K / CDK12复合物通过调节DNA损伤反应基因的表达来保持基因组稳定性。
      )。有趣的是,其他人也提出了细胞周期蛋白K在精子发生中的潜在作用。特别地,已知细胞周期蛋白k以发育调节的方式在啮齿动物睾丸组织中表达,并以成人睾丸的原代精子细胞(
      • Xiang X.
      • 邓兰
      • 张继夫
      • 张X.
      • 莱蒂。
      • 栾G.
      • 杨C.
      • 萧Z.X.
      • 李问:
      • 李问:
      哺乳动物睾丸中细胞周期蛋白K的不同表达模式表明在精子发生中的功能性作用。
      )。在这里,我们发现CDK12与来自丧亲CIFIA和同事提出的阶段分类的阶段分类,与人类中期嗜血烯精子细胞的特定结构相关联的CDK12与副XII(
      • 丧马里亚B.
      • BOITANI C.
      • Berloco B.P.
      • NUDO F.
      • Spadetta G.
      • 斯蒂芬尼M.
      • de Rooij D.G.
      • Vicini E.
      基于型副型发育的人精子发生的新阶段分类1。
      )。然而,后减少后的步骤转录活性会显着降低,这可能表明该激酶在人体睾丸中的额外作用。因此,由于其在人类睾丸中的狭窄表达,以及其在其他细胞类型和组织中的功能,可以在雄性腺中的CDK12设想两种本地化:(1)与细胞骨骼的关系储存RNA和RNA结合蛋白的特定细胞器并在精子发生中起着至关重要的作用,例如转座子元素的调节(
      • Yokota S.
      细微蛋白质:免疫电子显微镜显微镜揭示的原始细胞亚细胞结构中的定位。
      ,
      • Onohara Y.
      • Yokot S.
      减数分裂 - 分子机制和细胞遗传学多样性。
      ,
      • soper s.f.c.
      • 范德赫登G.W.
      • Hardiman T.C.
      • 睡不着伙伴
      • 马丁斯。
      • 德布尔P.
      • Bortvin A.
      小鼠Maelstrom是细胞的组成部分,对于MeIosis的精子发生和转座子抑制至关重要。
      )或(2)与亲毒囊泡相关结构的关系,例如GOLGI装置。为了确定CDK12的定位,我们进行了免疫荧光分析,其揭示了Golgi装置标记GM130周围CDK12的特定定位,而没有用细微成分DDX4观察到共定位。在哺乳动物中,Golgi结构在精子发生的最后阶段中发展到副骨骼中,这是一种独特的细胞器,其含有各种水解酶的各种水解酶,当分泌时,允许精子渗透卵母细胞Zona Pellucida(
      • Berruti G.
      • Paiardi C.
      真皮生物发生。
      ,
      • Leuchtenberger C.
      • 施拉德F.
      雄性生殖细胞中副骨质的化学性质。
      )。此外,根据其他人报告的结果(
      • 王H.
      • 万H.
      • 李X.
      • 刘W.
      • 陈问:
      • 王Y.
      • 杨L.
      • 唐H.
      • 张X.
      • 段E.
      • 赵X.
      • 高F.
      • 李W.
      在小鼠中的精子发生期间,拟躯体生物发生需要ATG7。
      ),人类睾丸中的CDK12表达似乎仅限于可能被鉴定为促杀剂颗粒的结构。因此,尽管CDK12的潜在累及在启发性的生物生成需求更深的研究中,但在本研究中观察到的结果,与人类蛋白质地图集中明的其他组织相比,睾丸的高表达与睾丸相比,将提出一个这种激酶在精子发育和功能中的决定因素。因此,CDK12可能是调节男性生育能力的药物的潜在药理候选者。
      由于它们在许多疾病中调节信号传导途径的能力,蛋白激酶是大量的追求药物开发的目标。特别有吸引力的候选者是调节细胞存活和细胞死亡的那些激酶,其中许多在本研究中已经确定在人类睾丸中的高度丰富。其中一种是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶pak4,Pak家族的II族成员(
      • 琼斯G.E.
      II族PAK的新兴重要性。
      )。虽然睾丸环境中从未研究过PAK4作用,但本研究的结果表明在精子发育中细胞骨骼动力学和细胞存活中的潜在作用。此外,发现pak4在人体精子中唯一地表达,这表明该激酶在精子发生的增殖阶段中的累及。因此,PAK4可能参与精子发育的启动,并且其消融将在此过程中诱导改变。此外,已知Pak4保护细胞免受细胞凋亡的细胞,防止胱天蛋白酶激活两种不同的机制:(1)通过促凋亡蛋白质的磷酸化,这导致细胞色素-3释放的失活和阻挡Caspase Cascade(
      • 甘露那
      • 曲J.
      • 心灵A.
      丝氨酸/苏氨酸激酶PAK4可防止胱天蛋酶活化并保护细胞免受凋亡。
      ); (2)通过以激酶 - 独立的方式抑制Caspase-8(
      • 甘露那
      • 心灵A.
      死亡受体诱导的引发剂胱天蛋白酶8的活化由丝氨酸/苏氨酸激酶pak4拮抗。
      )。以类似的方式,PAK4还可以保护癌细胞免受凋亡,因此代表治疗恶性肿瘤的潜在治疗靶标。事实上,Pak4是唯一被认为是致癌的Pak家族成员,并且已经发现在几种肿瘤细胞系中过表达,例如来自乳房和前列腺的肿瘤细胞(
      • 琼斯G.E.
      II族PAK的新兴重要性。
      ,
      • 征集M.G.
      • Clairvoyant F.
      • 朱S.
      • Schryver B.
      • 唠叨D.B.
      • Bischoff J.R.
      • jallal b.
      • 窒息
      在锚定无关的人体癌细胞系中的PAK4要求。
      )。类似地,在这里,我们表明pak4缺陷的胚胎癌细胞较少能够抵抗凋亡刺激,导致代谢活性细胞的数量减少。共同认为,PAK4抑制剂将为治疗睾丸癌提供有趣的药理靶标。
      在一起,对人体睾丸磷蛋白酶组的综合分析有助于我们对人精子发育的分子知识,并使我们鉴定参与精子发生的磷素的主要蛋白激酶。由于来自健康肥沃男性的人类睾丸组织用于研究目的的稀缺且难以获得,人类睾丸的磷蛋白蛋白质描述在睾丸样品中进行,虽然显示形态正常的精子发生,但不代表健康肥沃男性的人口和年龄。现在需要进一步的研究来鉴定年龄衍生的变化,以及将这里描述的结果与精子的施肥能力相关,这也受细胞的遗传和表观遗传学和睾丸后方法的影响。此外,这些结果打开窗口以验证已在人类睾丸中鉴定为雄性生育或睾丸癌症中药理学干预的潜在候选者的窗口以验证CDK12,PAK4和另外的预测活性激酶。

      数据可用性

      通过骄傲伙伴存储库将质谱数据已提交给ProteomexChange联盟(47),数据集标识符PXD010246(//www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD010246 )。

      致谢

      我们感谢Leendert H. Looijenga博士(Erasmus MC,大学医疗中心Rotterdam,Rotterdam,荷兰),用于提供NCOIT胚胎癌细胞系。

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