TM值T.标签为群众:稳健且具有成本效益,解决方案彩易福彩方法*[S]

  • Jana Zecha.
    隶属关系
    来自德国德国技术大学奥蛋白质组学和生物分析椅子,德国弗雷斯;
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  • Shankha Satpathy
    隶属关系
    §布兰克斯斯特雷斯工业研究所和哈佛,剑桥,马;
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  • Tamara Kanashova.
    隶属关系
    ¶maxdelbrück分子医学中心在亥姆霍尔兹协会,德国柏林;
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  • Shayan C. Avanessian.
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    §布兰克斯斯特雷斯工业研究所和哈佛,剑桥,马;
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  • M. Harry Kane.
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    §布兰克斯斯特雷斯工业研究所和哈佛,剑桥,马;
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  • K arl R. Clauser.
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    §布兰克斯斯特雷斯工业研究所和哈佛,剑桥,马;
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  • Philipp Mertins.
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    §布兰克斯斯特雷斯工业研究所和哈佛,剑桥,马;

    ¶maxdelbrück分子医学中心在亥姆霍尔兹协会,德国柏林;

    ‖伯林卫生研究院,德国柏林;
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  • 史蒂文A. Carr.
    一致
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    §布兰克斯斯特雷斯工业研究所和哈佛,剑桥,马;
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  • Bernhard Kuster.
    一致
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    来自德国德国技术大学奥蛋白质组学和生物分析椅子,德国弗雷斯;

    **巴伐利亚生物分子质谱中心(Baybioms),Tum,Freising,德国
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  • 作者脚注
    *这项工作是由国家癌症研究所(NCI)临床蛋白质组学肿瘤分析联盟(GRANTS NIH / NCI U24-CA210986和NIH / NCI U01CA214125和NIH 1U24DK112340到SAC)和德国理学基金会(德国科学基金)的补助金SFB1321到BK)。 B.K.是Omicscouts的创始人和股东。他在公司没有业务作用。
    [S] 本文含有补充材料补充表I和II和图2。 S1-S3。
    1 所用的缩写是:左旋菌色谱酰胺谱光谱凝结脉冲抗菌性NHSN-羟基琥珀酰亚胺,衍生的异种植物衍生的异卵植物胚浦谱匹配匹配的PhasetedMTANDEM质量标签。
      使用例如串联质量标签(TMTS)越来越多地应用于大规模蛋白质组学研究的同位素稳定同位素彩易福彩。专注于药物时间过程或扰动研究或大患者队列中的蛋白质OFORM分析的实验极大地受益于样品中单肽的可重复定量。然而,这些研究通常需要彩易福彩数百微克肽,使得彩易福彩试剂的成本代表了对实验总体成本的主要贡献。在这里,我们描述并评估了TMT彩易福彩的强大和经济高效的协议,将所需彩易福彩试剂的数量减少8倍并实现完全彩易福彩。通过在不同8:1至1:2的肽数量之间系统地评估从组织和细胞系的复合物和细胞系和细胞系中源自组织和细胞系和细胞系的肽和综合彩易福彩。在不同的情况下,TMT - 肽比(WT / WT)在不同的情况下TMT和肽浓度。当反应量减少以维持至少10米的TMT和肽浓度 m 和2g / L分别,TMT-肽比例为1:1(wt / wt),导致彩易福彩效率>99%和出色的内部和谐再现性。在针对TMT供应商推荐的标签程序基准测试的患者衍生的异种移植肿瘤组织的深度蛋白质组和磷脂蛋白组分析中进一步证明了优化方案的效用。最后,我们探讨了彩易福彩反应参数对基于N-羟基琥珀酰亚胺的化学的影响,并为采用不同肽量的高效彩易福彩方案提供指导。

      图形概要

      在自下而上的蛋白质组学中,可以遵循各种策略来确定蛋白质丰富和后期改性的定量差异(PTM)(
      • Bantscheff M.
      • Lemeer S.
      • Savitski m.m.
      • Kuster B.
      蛋白质组学中的定量质谱:2007年至今的批判性评论更新。
      )。其中,使用等异质标签(TMT)等异质​​试剂(例如串联质量标签(TMT)的稳定同位素彩易福彩能够复用最多11个样品(
      • 汤普森A.
      • SchäferJ.
      • Kuhn K.
      • Kienle S.
      • Schwarz J.
      • 施密特G.
      • Neumann T.
      • 哈蒙克
      串联质量标签:MS / MS的复合蛋白混合物比较分析的新量化策略。
      )。这些11标签中的每一个可用于通过与NHS酯基反应性基团的反应来彩易福彩肽消化中的伯胺。随后,将所有样品汇集并进一步处理在一起,从而降低了实验工作流程的技术变化。在质谱仪内部,标签的等异质性质导致来自MS1光谱中的所有彩易福彩和组合样品的每个肽信号的总和。在肽片段化后,不同质量充电的特定样品的报告离子(m / z.由于报告离子中存在的重质碳和氮同位素的不同组合,从不同标签产生的值。这使得来自相同MS2扫描中的所有条件的肽的分化和相对定量。以这种方式多路复用大大减少了每个TMT实验中缺失的肽量化值的数量。此外,定量再现性对液相色谱(LC)的性能变化不太敏感

      使用的缩写是:

      LC.
      液相色谱法
      小姐
      质谱
      NCE.
      归一化碰撞能量
      NHS.
      N-羟基琥珀酰亚胺
      PDX.
      患者衍生的异种移植物
      PSM
      肽谱匹配
      rp.
      逆阶段
      TM值T.
      串联质量标签。
      和质谱(MS)系统比无彩易福彩测量。此外,TMT试剂的复用能力使得能够在合理的测量时间内实现多个样品的深蛋白质组覆盖。这些优点使得对基于MS的植物研究有吸引力的表现具有吸引力的标签,包括依赖于跨条件下单肽的鲁棒定量的后翻译修饰分析(
      • Zecha J.
      • 孟康
      • ZOLG D.P.
      • 萨马拉斯诗
      • Wilhelm M.
      • Kuster B.
      肽级别周转测量能够研究蛋白质形式动力学。
      )。最近对乳腺癌的患者衍生的异种移植(PDX)模型进行了深度蛋白质组和磷脂蛋白酶分析的高型蛋白质和磷脂蛋白酶分析的高互联性再现性
      • Mertins P.
      • 唐人
      • 克鲁格克。
      • 克拉克D.J.
      • 格里尼科米。
      • 陈L.
      • 克劳瑟K.R.
      • Clauss T.R.
      • 莎第P.
      • Gillette M.A.
      • petyuk v.a.
      • 托马斯S.N.
      • MANI D.R.
      • Mundt F.
      • 摩尔r.j.
      • 胡Y.
      • 赵立
      • Schnaubelt M.
      • Keshishian H.
      • Monroe M.E.
      • 张Z.
      • Udeshi N.D.
      • 玛尼D.
      • 戴维斯S.R.
      • Townsend R.R.
      • Chan D.W.
      • 史密斯r.d.
      • 张H.
      • 刘涛。
      • carr s.a.
      液相色谱 - 质谱法的多重深度蛋白质组和肿瘤组织磷脂蛋白酶体分析的可重复工作流程。
      ),并促使TMT彩易福彩用于分析较大的患者队列(
      • Archer T.C.
      • Ehrenberger T.
      • Mundt F.
      • 金M.P.
      • 克鲁格克。
      • mah c.k.
      • mahoney e.l.
      • 丹尼尔C.J.
      • 莱纳尔A.
      • ramamoorthy d。
      • Mertins P.
      • MANI D.R.
      • 张H.
      • Gillette M.A.
      • 克劳瑟K.
      • 贵族
      • 唐人
      • Pierre-FrançoisJ.
      • 硅铁J.
      • 詹森J.
      • Tamayo P.
      • Korshunov A.
      • Pfister s.m.
      • kool m.
      • 诺斯科特P.A.
      • 西尔斯r.c ..
      • Lipton J.O.
      • carr s.a.
      • Mesirov J.P.
      • Pomeroy S.L.
      • Fraenkel E.
      蛋白质组学,翻译后修饰和整合分析显示Medulloblastoma亚组内的分子异质性。
      )。
      通过同位彩易福彩的一种大量的定量缺点是试剂的高成本。我们和其他人以前报告过议定书,其中卖方推荐的TMT试剂减少(
      • BöhmG.
      • Precop P.
      • 塞尔特S.
      • Mitra V.
      • 布里顿D.
      • Kuhn K.
      • 派克I.
      • 汤普森A.H.
      具有TMT的复合肽消化的低pH固相氨基彩易福彩改善了多重全球磷酸肽分析的肽鉴定率。
      ,
      • 爱德华兹A.
      • 哈斯W.
      用于高通量综合蛋白质组织人细胞系的多路复用定量​​蛋白质组学。
      ,
      • Ruprecht B.
      • Zecha J.
      • ZOLG D.P.
      • Kuster B.
      高pH反相微柱,用于蛋白质组的简单,敏感和有效分级和(TMT彩易福彩)磷酸磷蛋白酶体消化。
      ,
      • Navarreete-Perea J.
      • 俞Q.
      • Gygi S.P.
      • 保罗J.A.
      简化的串联质量标签(SL-TMT)协议:使用串联质量标签 - 同步前体选择-S30的定量(磷酸)蛋白质组分析的有效策略。
      ,
      • Stepanova E.
      • Gygi S.P.
      • 保罗J.A.
      基于过滤的蛋白质消化(FPD):用于TMT工作流的无洗涤剂和基于脚手架的策略。
      )并成功地应用了这种经济优化的标签工作流程,以解决各种生物学问题(
      • Zecha J.
      • 孟康
      • ZOLG D.P.
      • 萨马拉斯诗
      • Wilhelm M.
      • Kuster B.
      肽级别周转测量能够研究蛋白质形式动力学。
      ,
      • koch h.
      • Wilhelm M.
      • Ruprecht B.
      • 贝克斯。
      • Frejno M.
      • Klaeger S.
      • Kuster B.
      磷脂体谱揭示生长因子介导的EGFR过表达癌细胞中生长因子介导的激酶抑制剂抗性的分子机制。
      ,
      • 保罗J.A.
      • O'Connell J.D.
      • everley r.a.
      • o'brien J.
      • gygi m.a.
      • Gygi S.P.
      基于定量的质谱基复用将5000s酿酒酵母蛋白的丰度与10个碳源进行比较。
      ,
      • Mirzaei M.
      • Gupta V.B.
      • 鸡爪。
      • Greco T.M.
      • 吴y.
      • Chitranshi N.
      • 墙r.v.
      • 磨练E.
      • 邓兰
      • Dheer Y.
      • Abbasi M.
      • Rezaeian M.
      • 辫子N.
      • 你是y。
      • salekdeh g.h.
      • Haynes P.A.
      • Molloy M.P.
      • 马丁斯r.
      • 克里斯特芹。
      • Gygi S.P.
      • 格雷厄姆S.L.
      • Gupta V.K.
      与人葡萄糖眼的视网膜和玻璃体蛋白质组中鉴定的年龄相关的神经变性疾病相关途径。
      )。然而,关于反应物的数量和浓度的细节在公开的文献中差异很大,并且据我们所知,没有系统评估降低TMT对肽比对整体彩易福彩性能的影响。
      在本研究中,我们系统地评估了彩易福彩反应参数的影响,并建立了一种稳健而有效的TMT彩易福彩方案,其使用八倍的TMT试剂达到肽中的肽的完全彩易福彩,而不是供应商的推荐。我们展示了实验室之间的协议的可转换性,提供了关于采用不同肽量的优化方法的指导,并表明改进方案对深入蛋白质组学和磷蛋白酶分析的适用性。

      实验步骤

       实验设计与统计理由

      在各个结果部分中更详细地描述了实验设计的基本原理,并在补充中列出了包括量,缓冲剂和溶剂的量,体积和溶剂的彩易福彩条件的详细概述。在三个独立实验中,使用相同的TMT浓度和量(100或800μg)彩易福彩增加肽量(12.5至800μg),包括总共11个条件,作为技术,脑内复制或三份酸盐。此外,在三个实验中彩易福彩了17个样品,作为单片酸盐,施加不同的TMT(40至400μg)和肽(40或200μg)量和浓度,以探讨这些参数对标签性能的影响,并检查优化方案的适应性参数降低肽量。为了评估稳定性的鲁棒性,四个彩易福彩实验,其中TMT量滴定(50至400μg)抵抗恒定的肽量(100μg),以在三个独立的实验室中进行两种或三个重复。分析了方法优化的所有实验,作为单次LC-MS / MS运行。为了评估优化的彩易福彩方案的效用于高度分馏的样品,如前所述进行深度(磷酸)蛋白质组分析(
      • Mertins P.
      • 唐人
      • 克鲁格克。
      • 克拉克D.J.
      • 格里尼科米。
      • 陈L.
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      • Clauss T.R.
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      • Gillette M.A.
      • petyuk v.a.
      • 托马斯S.N.
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      • Mundt F.
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      • 张Z.
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      • 玛尼D.
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      • Townsend R.R.
      • Chan D.W.
      • 史密斯r.d.
      • 张H.
      • 刘涛。
      • carr s.a.
      液相色谱 - 质谱法的多重深度蛋白质组和肿瘤组织磷脂蛋白酶体分析的可重复工作流程。
      )但使用优化的协议(IE。 使用8x较少的TMT试剂)并将其与原始标签协议进行比较。简而言之,在TMT10-PLEX实验中,在五次重复中彩易福彩了源自基础(B)和腔乳腺癌(L)乳腺癌PDX模型(WHIM2和WHIM16)的肽(WHIM2和WHIM16)(B- l-b-b-l-b-l-l-b-L)和使用高pH rp色谱法分离。通过LC-MS / MS测量汇集和磷酸富集,24个全蛋白质组和12个磷酸蛋白酶组分。

       细胞培养,裂解和蛋白质消化

      Hela和Jurkat细胞分别在DMEM和RPMI 1640培养基中培养,补充有10%FBS(GIBCOTM值)和1%抗生素,抗催化溶液(Sigma)。如前所述,产生了WHIM2和WHIM16基础和腔乳腺癌PDX模型(
      • 李S.
      • 沉d.
      • 邵杰。
      • 粉碎r.
      • 刘W.
      • PRAT A.
      • 他X.
      • 刘S.
      • HOOOG J.
      • 鲁C.
      • 丁L.
      • Griffith O.L.
      • 米勒C.
      • Larson D.
      • 富尔顿R.S.
      • 哈里森米
      • 默尼T.
      • McMichael J.f.
      • 罗杰。
      • 陶y
      • r.calves r.
      • Schlosberg C.
      • Hiken J.F.
      • 撒谎L.
      • 桑切斯C.
      • Giuntoli T.
      • 贝麻粉
      • 库珀C.
      • 厨房r.t.
      • 林A.
      • Phommaly C.
      • 戴维斯S.R.
      • 张继夫
      • K avuri M.S.
      • Mceachern D.
      • 董义Y.
      • 苹果电脑。
      • Pluard T.
      • Naughton M.
      • Bose R.
      • Suresh R.
      • McDowell R.
      • Michel L.
      • Aft R.
      • Gillanders W.
      • Deschryver K.
      • 威尔逊r.k.
      • 王S.
      • 磨坊G.B.
      • Gonzalez-angulo A.
      • 爱德华兹J.R.
      • 马赫C.
      • perou c.m.
      • Mardis e.r.
      • ellis m.j.
      抗乳腺癌衍生的异种移植物的基因组表征揭示的内分泌治疗耐ESR1变体。
      )。细胞,PDX和鼠肝组织在8中裂解 m urea in 40 mm Tris-HCl,pH 7.6(Hela),或75米m NaCl and 50 mm TRIS,pH 8.0(Jurkat,肝,PDX组织),含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂鸡尾酒。将裂解物在冰上温育15至30分钟,然后以20,000×离心离心 g 在4℃下10至15分钟以除去不溶的碎片。通过皮尔斯确定上清液的蛋白质浓度TM值 Coomassie或BCA蛋白质测定试剂盒(热化学)。使用10米减少二硫化物桥m DTT在30℃下30分钟(Hela)或5米m DTT在37℃下1小时(Jurkat,小鼠肝,PDX组织)。使用50米在黑暗中在室温下进行烷基化m 氯乙酰胺30分钟(Hela)或10米m 碘乙酰胺45分钟(Jurkat,小鼠肝,PDX组织)。裂解物被稀释为< 2 m urea using 40 mm Tris-HCl,pH 7.6(Hela),或50米m Tris-HCl,pH 8.0(Jurkat,小鼠肝,PDX组织)。通过将胰蛋白酶(Promega)以1:50酶 - 基底比添加并在37℃和600rpm(Hela)中孵育过夜来进行消化,或者在使用1:50 Lysc( Wako)2小时和1:50胰蛋白酶过夜(Jurkat,小鼠肝,PDX组织)。通过将纯甲酸(Fa)加入1%以离心以酸化以酸化以酸化,并使用TC18 RP固相萃取盒(Waters Corp)脱盐;洗涤溶剂:0.1%Fa或TFA;洗脱溶剂:0.1 %Fa在50%乙腈(ACN)中)。将洗脱液在-80℃冷冻并通过真空离心干燥。

       TM值T.彩易福彩,肽分级和磷酸富集

      在0.1%的FA和肽浓度使用皮尔斯测定脱盐肽TM值 BCA蛋白质测定试剂盒。对于工作流程优化实验,将肽溶液相应地等分(12.5至200μg肽),在-80℃冷冻,并通过真空离心干燥。肽在50米中重构m 从溶解在100%无水ACN中的股中加入HEPES(pH8.5)和TMT10-PLEX试剂(Thermofer Serian)的混合物。在结果部分和补充中指定了各自的体积和浓度。将肽-TMT混合物在25℃和400rpm下孵育1小时,并通过向终浓度加入0.4%或8μl的终浓度来终止彩易福彩反应。 m TRIS,pH8和在25℃和400rpm下孵育15分钟。在干燥或在-80℃下直接冷冻,用45%(v / v)在10%ACN中酸化肽溶液,在-80℃下直接冷冻并通过真空离心干燥。对于深入(磷酸)蛋白质组分析,如Mertins中所述加工源自Lys-C /胰蛋白酶消化的肽和基础PDX肿瘤的肽 等等。 (
      • Mertins P.
      • 唐人
      • 克鲁格克。
      • 克拉克D.J.
      • 格里尼科米。
      • 陈L.
      • 克劳瑟K.R.
      • Clauss T.R.
      • 莎第P.
      • Gillette M.A.
      • petyuk v.a.
      • 托马斯S.N.
      • MANI D.R.
      • Mundt F.
      • 摩尔r.j.
      • 胡Y.
      • 赵立
      • Schnaubelt M.
      • Keshishian H.
      • Monroe M.E.
      • 张Z.
      • Udeshi N.D.
      • 玛尼D.
      • 戴维斯S.R.
      • Townsend R.R.
      • Chan D.W.
      • 史密斯r.d.
      • 张H.
      • 刘涛。
      • carr s.a.
      液相色谱 - 质谱法的多重深度蛋白质组和肿瘤组织磷脂蛋白酶体分析的可重复工作流程。
      )但遵循优化的TMT彩易福彩协议。简而言之,将300μg肽溶解在60μl50μm中m 通过加入300μgTMT试剂开始(15μl56.7m)开始甲烯(pH8.5)和彩易福彩反应m (20μg/μl)100%无水ACN中的TMT股)。将样品在25℃和1,000rpm下孵育1小时,并使用5μl5%羟胺(15分钟; 25℃; 1,000rpm)淬灭彩易福彩反应。将肽溶液合并,在-80℃下冷冻,并通过真空离心干燥。随后,使用TC18,RP固相提取碳粉(Waters Corp)脱谷彩易福彩样品(水合溶剂;洗涤溶剂:0.1%TFA;洗脱溶剂:0.1%Fa在50%AcN中),在-80℃下冷冻,干燥通过真空离心。使用Zorbax 300延伸-C18柱(3.5μm,4.6×250mm; Agilent)通过高pH rp色谱法分离TMT彩易福彩的肽。将肽合并成24个级分,其中将5%干燥,以进行全蛋白质组测量,并使用固定化金属亲和色谱法将残留的95%进一步汇集为12个级分,用于磷酸肽富集。使用含有铁(III)离子的Ni-硝基乙酸超流琼脂糖珠(QIAGEN)进行富集。随后,使用自填充的沉淀物(洗涤溶剂:0.1%Fa;洗脱溶剂:0.1%Fa),在-80℃冷冻,通过真空离心干燥,并通过真空离心干燥。

       LC.-MS / MS测量

      在易于NLC 1200或Ultimate 3000 RSLCNANO系统上分析了一次性分析的胰蛋白酶肽,耦合到Q-Exactive Plus,Q-Exactive HF-X或Fusion Lumos TribrId质谱仪(Thermof Serior Scientific)。在0.1%Fa中重构后,注射了对应于500ng肽的量。 补充表I. 提供不同实验的LC-MS / MS参数详细概述。简而言之,在Ultimate3000系统上,在75μm×45cm分析柱上分离肽(用3μmC18树脂包装内部; Reprosil Gold,Maisch博士),施加300 nl / min的流速和a在LC溶剂A1中的8至34%LC溶剂B1(0.1%FA,ACN中的5%DMSO中的0.1%FA,5%DMSO)(0.1%FA在5%DMSO中)的20分钟的线性梯度。 Easy-NLC系统配备75μm×20至22厘米柱(Picofrit,Nem目标,Inc。;内部有1.9μmc18树脂包装; Reprosil Gold,Maisch)并以流量运行在A2(3%ACN,0.1%Fa)中,将20%或200 NL / min施加20分钟的线性梯度,从3至55%溶剂B2(90%ACN,0.1%FA),17分钟三步梯度在A2中的5至60%溶剂B2,或从A2中的4至60%溶剂B2的97分钟的三步梯度。质谱仪以数据依赖性和正电离模式操作。在Q辐射加上,使用3E6或1E6电荷的自动增益控制(AGC)目标值和5ms或50ms的最大喷射时间(MAXIT)以70k的分辨率以70k的分辨率记录MS1光谱。在通过更高的能量碰撞解离肽片段后,使用AGC靶值5e4的AGC靶值和50或120ms的MAXIT在17.5k至70k分辨率下获得高达10个前体的MS2光谱。如上所述进行使用Q辐射HF-X的MS测量,随后进行以下修改:使用10ms的MAXIT以60k的分辨率记录MS1光谱。使用30ms的MAXIT以30K分辨率在30K分辨率下获得片段光谱。使用以下修改的Q辐射HF-X操作融合LUMOS:使用4E5电荷的AGC目标值来获得MS1光谱。使用22ms的MAXIT在15K分辨率下记录每循环最多20个肽前体的MS2光谱。如前所述测量深度(磷酸)蛋白质组分析的肽(
      • Mertins P.
      • 唐人
      • 克鲁格克。
      • 克拉克D.J.
      • 格里尼科米。
      • 陈L.
      • 克劳瑟K.R.
      • Clauss T.R.
      • 莎第P.
      • Gillette M.A.
      • petyuk v.a.
      • 托马斯S.N.
      • MANI D.R.
      • Mundt F.
      • 摩尔r.j.
      • 胡Y.
      • 赵立
      • Schnaubelt M.
      • Keshishian H.
      • Monroe M.E.
      • 张Z.
      • Udeshi N.D.
      • 玛尼D.
      • 戴维斯S.R.
      • Townsend R.R.
      • Chan D.W.
      • 史密斯r.d.
      • 张H.
      • 刘涛。
      • carr s.a.
      液相色谱 - 质谱法的多重深度蛋白质组和肿瘤组织磷脂蛋白酶体分析的可重复工作流程。
      )使用Easy-NLC耦合到融合Lumos。简而言之,使用如上所述的22cm柱以200nl / min的5.2%溶剂B2在84分钟的线性梯度中以84分钟的线性梯度分离出肽。使用4E5的AGC目标值以60K分辨率记录MS1光谱。使用6E4的AGC目标值和105ms的MAXIT以50k分辨率获得MS2光谱。循环时间设置为2秒。

       数据库搜索

      MaxQuant:对于肽和TMT滴定实验,使用MaxQuant(1.6.3.3)与其内置搜索引擎,Andromeda()进行肽鉴定和定量。
      • Cox J.
      • Neuhauser N.
      • Michalski A.
      • 施泰米r.a.
      • 奥尔森J.V.
      和romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
      ,
      • Tyanova S.
      • Temu T.
      • Cox J.
      基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
      )。搜索串联质谱抗议蛋白酶(2018年10月12日上载的UP000005640,95,936个条目)和/或鼠标参考蛋白质组(2018年10月12日下载的62,407个参赛作品)补充有普通污染物。进行单独的搜索以检查底层和兼容。对于底层标签评估,TMTZERO或TMT10被规定为赖氨酸和肽N Termini的可变改性。对于综合彩易福彩评估,TMTzero或TMT10被指定为报告离子MS2实验中的初级胺上的固定标签,并且另外,作为组氨酸或丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸的可变改性。对于所有搜索,氨基甲酰化半胱氨酸被设定为甲硫氨酸和N-末端蛋白乙酰化的固定改性和氧化,作为可变改性。胰蛋白酶/ p被指定为允许蛋白水解酶,允许两个错过的裂解位点。前体耐受设定为±4.5ppm,并将片段离子容差至±20 ppm。对于修饰的肽,分别用于分别用于Antromeda得分和Delta评分的默认截止值。使用逆转蛋白质序列将结果调节至使用目标 - 诱饵方法的肽光谱匹配水平对1%的假发现率。

       数据库搜索 - 光谱磨

      搜索分级(磷酸)蛋白质蛋白质的原料文件,其含有37,592名人和27,289名小鼠条目的人和小鼠Refseq数据库(Refseq.20160914_human_mouse_Cusc_hg19_mm10_customprodbnr_mito_150contams)使用Spectrum Mill套件VB.06.02(广泛的研究所和安捷伦技术)。简而言之,四周期固定/混合修改搜索策略在每轮中使用不同的修改集进行四次连续搜索,然后产生单个集成输出。四个循环如下:全部未修饰,肽N末端和赖氨酸彩易福彩,仅彩易福彩的赖氨酸,并且仅彩易福彩的肽N末端。半胱氨酸和硒细胞的氨基甲酰化被设定为额外的固定改性。 N-末端蛋白乙酰化,甲硫氨酸氧化,倒氨基的去酰胺,脯氨酸羟基化(当用过的甘氨酸时),分别对吡葡酸(Pyroglu)和氨基甲酰半胱氨酸的肽N-末端谷氨酰胺和氨基甲酰氨基甲基半胱氨酸的环化和丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸的TMT综合性(限于含组氨酸肽)被设定为可变改性。对于磷脂蛋白酶体分析,丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸的磷酸化被允许作为额外的可变改性,而天冬酰胺的去酰胺被限制为N,然后甘氨酸,并且不允许脯氨酸综合彩易福彩和脯氨酸的羟基化。胰蛋白酶允许P被指定为允许蛋白水解酶,最多允许四个错过的裂解位点。对于蛋白质组分析,允许的前体质量偏移范围为-18至262Da,以允许Pyroglu和最多一种额外的TMT和每种肽两种Met-OX。对于磷脂蛋白酶组分析,该范围膨胀至-18至272Da,以允许最多三种磷酸化和每种肽两种磷酸盐。前体和产品质量公差设定为±20ppm,PSM级虚假发现率<使用逆转蛋白序列使用目标诱饵方法的1%。为了更好地描述人和小鼠来源的蛋白质,使能谱研磨机中的亚组特异性蛋白质分组选项,先前描述的细节(
      • 黄克-L。
      • 李S.
      • Mertins P.
      • Cao S.
      • Gunawardena H.P.
      • Ruggles K.v.
      • MANI D.R.
      • 克劳瑟K.R.
      • Tanioka M.
      • 等级J.
      • kavuri s.m。
      • 谢L.
      • yoon c.
      • 乔J.W.
      • 手表J.
      • wyczalkowski m.a.
      • erdmann-gilmore p。
      • Snider J.E.
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      • 辛格P.
      • 牛B.
      • 郭Z.
      • 太阳S.Q.
      • Sanati S.
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      • Malovannaya A.
      • 举行。
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      • 苹果电脑。
      • Reid Townsend R.
      • 陈X.
      • carr s.a.
      • ellis m.j.
      • 丁L.
      蛋白素聚合揭示乳腺癌异种移植物中的治疗靶标。
      )。

       生物信息分析

      用于估计蛋白质消化中官能团的摩尔性, 在Silico. 使用太平洋西北国家实验室释放的蛋白质消化模拟器进行人参考蛋白质组的摘要(//omics.pnl.gov/software/protein-digestion-simulator)。为了获得肽N末端对伯胺的保守估计,将切割设定为胰蛋白酶/ p,没有错过的切割位点。将最小和最大片段质量设置为400和6,000da,包括给定蛋白质的重复序列。单同质肽质量的平均值用于在100μg消化中计算氨基酸的摩擦力。对于所有MS数据分析,删除了对反向和污染数据库的命中。对于底层彩易福彩分析,只有在所有赖氨酸侧链上用TMT改性的肽序列并自由(IE。 不乙酰化)肽N Termini被计算为“完全彩易福彩”。不承受任何TMT的肽被注释为“未彩易福彩”,而含有至少一个TMT但未完全彩易福彩的肽被归类为“部分彩易福彩”。将N-末端乙酰化精氨酸肽排除在底线分析之外。鉴定为在综合彩易福彩搜索中至少一种丝氨酸,苏氨酸或酪氨酸的TMT彩易福彩的肽被计算为综合彩易福彩。为了分析分馏的PDX(磷酸)蛋白质蛋白,对同位素杂质进行校正报道离子信号,并且仅考虑用至少两个独特的肽鉴定的人和小鼠蛋白质进行分析。使用与蛋白质或磷酸化位点匹配的所有PSM的TMT报告器离子强度比率的中值测定蛋白质和磷酸化位点的相对丰度。 PSM缺乏TMT标签,具有前体离子纯度<排除了50%,或具有负二角度的前瞻性转速(所有假阳性识别的一半)被排除在外。为了使TMT10-PLEX实验正常化定量数据,TMT强度除以每种磷酸化位点和蛋白质的所有10 TMT通道的中值强度。通过中位数和中位绝对偏差缩放进一步规范化比率。

      结果

       使用标准方案的彩易福彩效率的比较评价与高蛋白输入的降低的试剂 - 肽比例

      分别施用肽N末端和赖氨酸侧链上的α-和ε-氨基的量,得到100μg肽中衍生自有效消化的人类样品的100μg肽的伯胺(表I.)。制造商提供的TMT标签协议建议添加800μg彩易福彩试剂,其等于2.32μmol的TMT(在TMTZERO的情况下为2.36μmol),源自25至100μg蛋白质的消化蛋白。因此,标准方案使用至少20倍摩尔过量的彩易福彩试剂。即使考虑到一定程度的试剂水解和骨体,TMT试剂仍然很多(表I.)。基于这些理论考虑,我们假设可以使用800μgTMT试剂彩易福彩大于100μg肽的量大于100μg肽。为了测试该假设,使用从100至800μg鼠肝肽的肽量进行三次肽滴定实验,导致TMT - 肽比(WT / WT)为8:1至1:1。在彩易福彩反应中,总反应体积和因此TMT浓度保持恒定(16.5米m 在彩易福彩期间TMT),而蛋白质浓度随着肽输入量的增加而增加(Fig. 1A)。通过添加Tris,pH8,终浓度为50μm的反应m.
      表I.官能团的理论摩尔在100μg人蛋白质中的完全消化中的官能团。估计基于平均肽长度,并从文献中取出PKA值(
      • 格里姆斯利G.R.
      • Scholtz J.M.
      • 速度c.n.
      折叠蛋白质中可电离基团的测量PK值的概述。
      ,
      • 英国人S.W.
      • Downer N.W.
      • Teitelbaum H.
      氢交换。
      )
      功能小组Nmol的量(100μg肽)PKA.
      α-胺在n术语上787.7±0.5
      ε-胺在LYS上3810.5±1.1
      主要胺116
      在Tyr.的羟基2510.3±1.2
      羟基在Ser76∼16
      羟基上49∼16
      羟基150
      咪唑上的咪唑246.6±1.0
      图缩略图GR1.
      Fig. 1使用供应商建议的肽滴定实验(A-C.)和一个下缩小的(D-F.)TMT标签协议。 (A)显示TMT10-Plex试剂(蓝色)和肽(灰色)混合物的量和浓度用于增加TMT供应商(PEP:肽)推荐的彩易福彩体积中的肽量。使用50米淬火TMT反应m TRIS,pH8(最终浓度)。 (B)使用在(左右)中显示的彩易福彩协议描绘了识别底层和完全彩易福彩的肽的PSMS。A)。 (C分配给综合彩易福彩的O-酰化肽和丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸的分布的PSM的数量被示出为在(A)。 (D) 与...一样 (A)但使用TMTZERO和较小的肽数量减少(PEP:肽)。使用0.4%羟胺(终浓度)淬灭TMT反应。 (D) 与...一样 (B)但是对于显示的肽滴定行(D)。 (F) 与...一样 (C)但对于所描绘的肽滴定行(D)。
      单次LC-MS / MS分析导致鉴定8,081和8,807个肽序列,随着TMT - 肽比率的降低而略有增加(图S1A)。在整个测试的肽量范围内,至少98.7%的PSMS对应于完全彩易福彩的肽(Fig. 1B)。因此,观察到很少有非彩易福彩或部分彩易福彩的肽(其中未彩易福彩的赖氨酸侧链或肽N末端)(除了对应于200μg肽的一个异常样品的所有异常样品,少于PSM的0.7%)。此外,大多数底​​层PSM(77-100%)含有至少一个TMT改性。相应的综合彩易福彩分析显示,当使用100至400μg肽进行彩易福彩反应时,10.4至14.6%的PSM含有至少一个TMT彩易福彩的丝氨酸,苏氨酸或酪氨酸残基(Fig. 1C)。有趣的是,在800μg肽样品中,分配给综合肽的PSM的级分降低至小于3%,仅伴随部分彩易福彩的PSM。对于较低的肽量,综合彩易福彩主要影响丝氨酸残基(高达叠加的PSM的74.2%),而使用较低的TMT - 肽比率(高达67.3%的叠键PSMS的PSMS; Fig. 1C)。值得注意的是,55.5%至78.1%的叠键含有组氨酸残留物(Fig. 1C)。为了排除该观察是由假TMT本地化创建的伪像,我们重新搜索数据,允许TMT作为组氨酸的可变修改。将1.5%的光谱分配给含有TMT彩易福彩的组氨酸的肽,其中高达95.7%的这些也含有丝氨酸,苏氨酸或酪氨酸残基(未显示的数据)。这表明假TMT本地化不是一个实质性问题。综合彩易福彩肽的强度分布与正确彩易福彩的肽相当,而未彩易福彩的肽显示出显着较低的强度(图S1B.)。连胜,这表明推荐的800μgTMT试剂可以彩易福彩比供应商协议在伴随不需要的氨基酸残基的综合彩易福彩的伴随的伴随的肽中彩易福彩至少4倍的肽。

       使用优化彩易福彩参数缩小TMT量

      通过上述研究结果鼓励,我们随后检查了是否可以使用较少的TMT试剂有效地彩易福彩较少的肽数量,而不是供应商的推荐(用于所有实验的概述,参见 补充表II)。从化学反应动力学和大规模作用规律中,彩易福彩反应的效率不仅取决于所用的彩易福彩试剂的绝对量,而且更重要的是,在反应物的摩尔浓度上, IE。 TMT和肽或更精确地,肽上的相关官能团。因此,为了保持类似于初始肽滴定实验的条件,除了降低TMT和肽数量之外,还还将反应体积降低以保持相对高浓度。
      使用100μgTMT试剂和12.5至200μgHela肽进行初始实验,同时将反应体积降低5.6(Fig. 1D)。因此,在11.8米的TMT浓度下进行彩易福彩m,试剂与肽比例在8:1至1:2中变化。这一次,通过将羟胺加入终浓度为0.4%,终止反应。复制分析证明,高达100μg肽有效彩易福彩,得到7,005至7,906个完全TMT彩易福彩的肽,PSM彩易福彩效率为99.8至99.9%(单次LC-MS / MS分析; Fig. 1E)。 TMT - 肽比率越低,获得的肽鉴定越高(图S1C.)。对于200μg肽(1:2的TMT-肽的比率),对应于部分或非彩易福彩肽的PSM的比例急剧增加至平均14.9%(Fig. 1E),影响赖氨酸残留物的ε-胺,比肽n末端(占所有赖氨酸残基的18%) 相对 <所有N Termini的4%;看 补充表II)。再次发现底部标签肽的MS1强度总是低于正确彩易福彩的肽的强度,而综述肽显示出相当的强度(图S1D.)。 TMT彩易福彩的丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸残基在平均10.8%的鉴定光谱中存在于TMT - 肽比例为8:1。对于肽比分别为1:1和1:2的试剂 - 肽比例降至6.3%和1.5%(Fig. 1F)。丝氨酸占所有肽量的覆谱氨基酸的约三分之二。同样,大多数综合彩易福彩的肽含有组氨酸(Fig. 1F)。根据第一实验序列,允许组氨酸的搜索通过TMT分配的TMT彩易福彩为4.6%的PSM与具有TMT彩易福彩的组氨酸残基的肽,并且高达99%的这些肽也包括至少一个丝氨酸,苏氨酸或酪氨酸残基(数据未显示)。
      上述发现在使用鼠肝组织的独立实验中得到了证实。使用100μgTMT的三次实验揭示了平均彩易福彩的肽,平均为100μg肽的99.7%,占200μg肽的42.7%的PSM(补充表II)。使用来自Jurkat细胞和PDX消化的200μg肽的另外的实验显示使用200μgtmt以同一TMT浓度为11.8米的完全彩易福彩m (>99.4%的PSM鉴定出正确彩易福彩的肽;看 补充表II)。我们得出结论,对于100μg或更多的肽量,肽可以以1:1的TMT - 肽比和11.8米的TMT和肽浓度有效地彩易福彩肽。m 和4克/升。我们在TMT - 肽比率在8:1至1:1和不同TMT(1.4至29.5米处m)和肽浓度(0.5至2.2g / L;见 补充表II 有关详细信息)。光谱彩易福彩效率>在采用TMT-肽比例为至少2:1的所有实验中获得99.6%。对于6.6米的TMT-to-Peptide比为1:1m TMT和2.2g / L肽,98.2%的PSMS鉴定了完全彩易福彩的肽,但在较低的TMT和肽浓度下,该部分基本上降至82.1%和75.7%(补充表II)。这说明,如果相应地适应TMT和肽浓度,则可以使用低于100μg的肽量。

       评估优化标签协议的互上彩易福彩再现性

      已经确定TMT-肽比为1:1(wt / wt)足以有效地彩易福彩蛋白质组,我们试图表明使用相同彩易福彩工作流程时可以在不同的实验室中复制结果。为了实现这一点,从冻干的患者衍生的乳腺癌异种移植肿瘤中的吞噬肽分布在我们的三个实验室中,并用50至400μgTMTzero试剂彩易福彩为100-μg肽等分试剂的重复,从4起跨越TMT - 肽比例1至1:2同时保持恒定的反应体积(Fig. 2A)。这次,我们选择增加TMT量和浓度,以便能够评估,如果这样做,与先前的肽滴定实验相比,可以导致过度或底层的差异。通过将羟胺加入终浓度为0.4%,终止彩易福彩反应。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2TM值T.滴定试验在实验室中使用下缩小的TMT标签策略进行实验。 (A用于增加恒定彩易福彩体积(PEP:肽)的TMTZERO试剂(蓝色)和肽(灰色)的量和浓度。使用0.4%羟胺(终浓度)淬灭TMT反应。 (B)显示识别底部彩易福彩和完全彩易福彩的肽的PSM用于( A)。 (C)显示在这些光谱中显示出综合彩易福彩,O-酰化肽和丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸的分布的PSM的数量被显示为(A)。
      根据上述结果,单次LC-MS / MS测量结果证明了使用TMT - 肽比例为4:1至1:1的所有反应中的PDX肽的有效彩易福彩(Fig. 2B)。尽管实验室之间的识别数量差异差异,但由于不同的LC设置和LC / MS仪器性能(3,877至7,197种改性肽序列,尽管 图S2A)平均99.7%的PSM始终鉴定完全彩易福彩的肽。此外,所有实验中的底层的百分比是< 0.5% of PSMs (Fig. 2B)。然而,将TMT - 肽的比率降低到1:2导致PSM的显着底层,这取决于实验室(Fig. 2B)。同样,分配给综合肽的鉴定光谱的分数不同,实验室之间的差异不同,并且在有效彩易福彩的样品中的范围为2.6%至13.3%(Fig. 2C)。该部分在实验中仅使用50μg肽的实验中缩小了两到三个。同样,丝氨酸是主要的O-酰化氨基酸(参见 Fig. 2C)但是,虽然我们在单一实验中观察到纵向肽中的TMT彩易福彩的丝氨酸和酪氨酸残留部分的差异(另见 图。 1C1F补充表II)。尽管评估了可能影响综合彩易福彩的几个潜在参数(参见讨论),但我们无法为这些差异建立良好的解释。如已经在肽滴定实验中观察到的,高达98%的综合彩易福彩肽也含有序列中的组氨酸(Fig. 2C)。与我们的先前观察结果一致,与正确彩易福彩的肽相比,底部彩易福彩的肽表现出始终如一的MS1强度,而综合彩易福彩的肽显示出与略高的信号相当(图。S2B.)。当比较TMT滴定到肽滴定实验时,可以确定由较高的TMT浓度与较高的肽浓度相比造成的较高TMT浓度的尺寸或综合性趋势的明显差异。

       基于深度TMT10-PLEX(磷)蛋白质组学分析的优化方案

      在我们在几种实验中建立并跨实验室,TMT - 肽比为1:1的TMT-to-Peptide比率以获得通过单次LC-MS / MS / MS分析判断的高彩易福彩效率,我们接下来评估了深度的优化方案-scale(磷酸)蛋白质组研究。这里,将来自基础和腔乳腺癌PDX模型的五种重复的肽组合成TMT10-PLEX实验,并分成24个全细胞蛋白质组和12种磷酸蛋白酶组分。我们采用了与Mertins中所述相同的工作流程 等等。 (
      • Mertins P.
      • 唐人
      • 克鲁格克。
      • 克拉克D.J.
      • 格里尼科米。
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      • 克劳瑟K.R.
      • Clauss T.R.
      • 莎第P.
      • Gillette M.A.
      • petyuk v.a.
      • 托马斯S.N.
      • MANI D.R.
      • Mundt F.
      • 摩尔r.j.
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      • 张Z.
      • Udeshi N.D.
      • 玛尼D.
      • 戴维斯S.R.
      • Townsend R.R.
      • Chan D.W.
      • 史密斯r.d.
      • 张H.
      • 刘涛。
      • carr s.a.
      液相色谱 - 质谱法的多重深度蛋白质组和肿瘤组织磷脂蛋白酶体分析的可重复工作流程。
      )但调整了TMT彩易福彩步骤,使得使用推荐的TMT试剂量只有1/8。具体地,在最终体积为75μl的最终体积的300μg的TMT试剂和300μg肽彩易福彩,并使用2,400μgTMT试剂对原始方案基准测试,以彩易福彩300μg的总体积为423μL的肽(Fig. 3A)。产生并在同一实验室中产生并分析这些样品。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3基于深度(磷酸)蛋白质组学分析的优化方案。 (A)使用五种复制来自基础和腔乳腺癌PDX模型的每种肽和遵循这里显示的两种不同彩易福彩协议的肽进行TMT10-PLEX实验。标准显示每个通道使用的TMT10-PLEX试剂(蓝色)和肽(灰色)的量和浓度(
      • Mertins P.
      • 唐人
      • 克鲁格克。
      • 克拉克D.J.
      • 格里尼科米。
      • 陈L.
      • 克劳瑟K.R.
      • Clauss T.R.
      • 莎第P.
      • Gillette M.A.
      • petyuk v.a.
      • 托马斯S.N.
      • MANI D.R.
      • Mundt F.
      • 摩尔r.j.
      • 胡Y.
      • 赵立
      • Schnaubelt M.
      • Keshishian H.
      • Monroe M.E.
      • 张Z.
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      • 玛尼D.
      • 戴维斯S.R.
      • Townsend R.R.
      • Chan D.W.
      • 史密斯r.d.
      • 张H.
      • 刘涛。
      • carr s.a.
      液相色谱 - 质谱法的多重深度蛋白质组和肿瘤组织磷脂蛋白酶体分析的可重复工作流程。
      )和优化的标签协议(
      • Zecha J.
      • 孟康
      • ZOLG D.P.
      • 萨马拉斯诗
      • Wilhelm M.
      • Kuster B.
      肽级别周转测量能够研究蛋白质形式动力学。
      ; PEP:肽)。 (B)表列出了全细胞和磷脂蛋白酶和磷蛋白酶组分析的全部和部分彩易福彩的肽的总PSMS,PSMS的数量,并在(A)。 (C)条形图说明蛋白质(上部面板)和磷酸水(较低的面板)被识别或仅在(A)。在括号中给出映射到人类数据库的蛋白质和磷酸化位点。 (D)Pearson相关系数绘制用于TMT10-Plex实验(intraplex)和TMT10-Plex实验(Interpleple, IE。 在(A)。
      毫不奇怪,对于分级的TMT10-PLEX实验,观察到的彩易福彩效率略低于(Fig. 3B[与上述单次分析相比,因为分馏步骤能够识别更多较低丰富和结底的肽。收集的MS2光谱,PSM,不同(磷酸)肽和彩易福彩效率的总数在两个彩易福彩方案之间相当(Fig. 3B)。标准方案的肽N末端的底部彩易福彩为2%,降低TMT协议的3%,而赖氨酸的底层分别为0.5%和0.6%。在标准(11.4%)和优化的方案(11.6%的PSM,见PSM的11.6%,纵向丝氨酸,苏氨酸和酪氨酸残基的含有组氨酸肽和酪氨酸残基的含量也可比较 图S3)。两种实验中鉴定了超过12,000个蛋白质,其中>8,400人是人类蛋白质,蛋白质标识显示出大重叠(>实验之间的90%(Fig. 3C)。平均而言,检测〜42,000个磷酸化位点(>35,000人的人口),并在两种工作流程中确定了四分之三(Fig. 3C)。我们观察了一个优异的intraprinter相关性(Pearson>0.8)人类和鼠蛋白和磷酸肽,用于彩易福彩方案的腔腔和基底Quintulicates(Fig. 3D)。同样地,蛋白质和磷酸肽相关良好(Pearson>0.7)两台工作流程(Fig. 3D)。重要的是,这种跨网络流的相关性与先前报告的两个相同的TMT10-Plex实验相当,使用供应商推荐的TMT试剂量(
      • Mertins P.
      • 唐人
      • 克鲁格克。
      • 克拉克D.J.
      • 格里尼科米。
      • 陈L.
      • 克劳瑟K.R.
      • Clauss T.R.
      • 莎第P.
      • Gillette M.A.
      • petyuk v.a.
      • 托马斯S.N.
      • MANI D.R.
      • Mundt F.
      • 摩尔r.j.
      • 胡Y.
      • 赵立
      • Schnaubelt M.
      • Keshishian H.
      • Monroe M.E.
      • 张Z.
      • Udeshi N.D.
      • 玛尼D.
      • 戴维斯S.R.
      • Townsend R.R.
      • Chan D.W.
      • 史密斯r.d.
      • 张H.
      • 刘涛。
      • carr s.a.
      液相色谱 - 质谱法的多重深度蛋白质组和肿瘤组织磷脂蛋白酶体分析的可重复工作流程。
      )。总之,这证明了优化的TMT协议的效用,用于对深度蛋白质组学和磷蛋白酶研究的原始TMT原始量的1/8。

      讨论

      使用不同的TMT和肽浓度,数量和比率显示的彩易福彩实验允许我们系统地评估这些参数对彩易福彩反应的影响。随着大规模行动规律需要,较小的反应体积和较高的TMT和肽浓度对于彩易福彩效率是有利的。此外,TMT与肽的比率越小,试剂和肽的浓度越强。这可以很容易地通过彩易福彩初级胺的竞争反应和TMT试剂的水解在水性条件下的竞争反应来解释,这在较少浓缩的蛋白质和TMT溶液中有助于较低的效率彩易福彩。因此,对于1:1(wt / wt)的试剂 - 肽比,我们建议使用10米的TMT和肽浓度m (3.4μg/μl)和2克/升,以确保有效彩易福彩。重要的是,肽浓度应直接在TMT彩易福彩之前直接测定(如本研究中所做的),因为从经验中,在消化和随后的脱盐过程中可能会丢失30%至50%,并且这些损失可能会在样品类型之间变化和实验室。
      此外,当使用低TMT - 肽比时,仔细处理TMT试剂的仔细处理是不可避免的(如制造商方案中所述),以避免由于来自环境空气吸收的水的水解而丧失活性试剂。当需要存储TMT剩菜时,这是特别相关的。在我们的经验中,未使用的TMT试剂可以容易地在-20°C或-80°C的无水ACN中保持至少3个月,而不会在彩易福彩效率下降。对于长期存储,我们建议在惰性气氛中调味TMT,并将其储存在水下并排除水。这可以通过在填充有氩气的箱中进行等分试样过程来容易地实现,并且等分试样可以在氩气下或干燥剂保持。通过这种方式,我们已经将等分的TMT试剂储存,长达一年,没有彩易福彩性能下降。
      尽管我们的方案原则上可以通过适当地降低反应量,处理非常小的体积,特别是TMT试剂在100%ACN中的肽量,但是,虽然我们的协议可以适应低微克范围内的肽量,但是不太实用,并且可以导致不准确的差距。因此,建议肽量的肽量增加到50μg以下的相对反应体积,并补偿较低的TMT和肽浓度(例如 5 mm TMT和1g / L肽)通过同时增加TMT - 肽比(例如 到2:1)。对于低于10μg的肽量,可能需要更高的试剂 - 肽比(
      • 德格拉夫E.L.
      • Pellegrini D.
      • McDonnell L.A.
      小型样品量的一套新型自动化定量微蛋白酶方案及其在肾组织亚结构上的应用。
      )。或者,可以想到,较高的ACN浓度可以对彩易福彩效率(由于较低的试剂水解)具有阳性作用,特别是对于较少的浓缩样品或低绝对样品量,并且有助于使用所需的TMT - 肽比为1 :1。虽然该研究包括不同ACN浓度的彩易福彩实验,但这些始终还涉及其他参数的变化,例如TMT或肽浓度。因此,对ACN对彩易福彩反应对彩易福彩反应的影响的系统评估将优先使用小肽数量的进一步实验。
      反应缓冲液的pH的小变化也可以影响彩易福彩效率和叠饰。通常,由于水解,更多碱性pH值促进NHS酯的灭活(
      • anjaneyulu p.s.r.
      • Staros J.v.
      N-羟基氟嘧啶嘧啶亚胺活性酯的反应。
      )。当过量的彩易福彩试剂有限时,这特别相关。例如,TMT-肽比为1:1大致对应于在完美消化的人蛋白质组中初发胺的估计摩尔的2.5×摩尔过量的TMT试剂。因此,必须适当地控制肽溶液的pH(和纯度)以确保可再现的结果。同时,pH值低于pK a 赖氨酸和肽N Termini的伯胺的值导致较高程度的质子化,在平衡时阻碍了与TMT的反应。因为我们在pH 8.5进行彩易福彩,所以通过较高的非彩易福彩赖氨酸残基的较高分数说明了这种效果(PK a ~10.5)与n termini相比(pK a ~7.7)在所有样本中,在单次分析中显示出显着的底层。相比之下,我们和其他人已经使用不同的TMT,肽和ACN浓度观察到N Termini优先在pH8.5中优先巩固的相反趋势,特别是在靠近完全彩易福彩的样品中(
      • Mertins P.
      • 唐人
      • 克鲁格克。
      • 克拉克D.J.
      • 格里尼科米。
      • 陈L.
      • 克劳瑟K.R.
      • Clauss T.R.
      • 莎第P.
      • Gillette M.A.
      • petyuk v.a.
      • 托马斯S.N.
      • MANI D.R.
      • Mundt F.
      • 摩尔r.j.
      • 胡Y.
      • 赵立
      • Schnaubelt M.
      • Keshishian H.
      • Monroe M.E.
      • 张Z.
      • Udeshi N.D.
      • 玛尼D.
      • 戴维斯S.R.
      • Townsend R.R.
      • Chan D.W.
      • 史密斯r.d.
      • 张H.
      • 刘涛。
      • carr s.a.
      液相色谱 - 质谱法的多重深度蛋白质组和肿瘤组织磷脂蛋白酶体分析的可重复工作流程。
      ,
      • 德格拉夫E.L.
      • Pellegrini D.
      • McDonnell L.A.
      小型样品量的一套新型自动化定量微蛋白酶方案及其在肾组织亚结构上的应用。
      )。这可以通过更高的p的事实来解释K a ε-胺的值也通常(取决于溶剂)对应于质子化状态的较高亲核性,因此对TMT的反应性较高。由此,在某些条件下,赖氨酸残基的彩易福彩可以在肽N末端上的动力学。然而,哪种反应条件决定了ε-或α-胺的优先底层仍然难以捉摸,需要进一步调查。值得注意的是,已经显示出高达8.5的pH值,即两种伯胺的反应性的增加超过NHS酯的加速水解速率(
      • Mädlers.
      • Bich C.
      • touboul d.
      • Zenobi R.
      与NHS酯的化学交联:对氨基酸重组的系统研究。
      ,
      • 杨w.-c。
      • Mirzaei H.
      • 刘X.
      • Regnier F.E.
      电喷雾电离质谱法提高氨基酸检测和定量。
      ),提供在pH8.5下进行TMT彩易福彩反应的基础。
      考虑到pK a 赖氨酸和酪氨酸的侧链的值相似(
      • 格里姆斯利G.R.
      • Scholtz J.M.
      • 速度c.n.
      折叠蛋白质中可电离基团的测量PK值的概述。
      ),人们期望酪氨酸的反应性也会在升高的pH升高时增加,使其更容易在更碱性pH值中与TMT反应。然而,研究使用NHS酯研究氨基酸和肽彩易福彩的几项研究报告说,酰化酪氨酸残基的丰度仅在更酸性的pH下增强,而更多的碱性pH值赞成N-酰化(
      • Mädlers.
      • Bich C.
      • touboul d.
      • Zenobi R.
      与NHS酯的化学交联:对氨基酸重组的系统研究。
      ,
      • 杨w.-c。
      • Mirzaei H.
      • 刘X.
      • Regnier F.E.
      电喷雾电离质谱法提高氨基酸检测和定量。
      ,
      • Leavell M.D.
      • 诺瓦克P.
      • Behrens C.R.
      • Schoeniger J.s.
      • Kruppa G.H.
      酪氨酸和赖氨酸残留物的选择性化学交联策略。
      )。这可以通过酪氨酸酰化在基本条件下的较低稳定性来解释,这可以通过添加羟胺来利用以反转综合彩易福彩,从而增加90以上的pH以淬灭彩易福彩反应(
      • 杨w.-c。
      • Mirzaei H.
      • 刘X.
      • Regnier F.E.
      电喷雾电离质谱法提高氨基酸检测和定量。
      ,
      • 米勒B.T.
      • 柯林斯T.J.
      • 唠叨G.T.
      • Kurosky A.
      促进促丙素释放激素和类似物生物素化期间O-酰化的发生。反应性丝氨酸的证据。
      ,
      • Wiktorowicz J.E.
      • 英语R.D.
      • 吴Z.
      • Kurosky A.
      伊特拉克肽改性的模型研究:依赖依赖性反应特异性。
      ,
      • Regnier F.E.
      • julka s.
      主要胺编码为对比较蛋白质组学的途径。
      )。通过羟胺的综解反转也可以考虑使用12.5至200μg肽在滴定实验中观察到的较高TMT - 肽比以使用100-800μg肽的比较,以在滴定实验中观察到的较高TMT-肽比的整体较低分数。在后一系列实验中,使用pH8的TRIS缓冲液代替羟胺来淬灭彩易福彩反应。
      考虑到它们非常高的p,TMT彩易福彩的丝氨酸和苏氨酸残留的高患病率可能是令人惊讶的K a values (
      • 英国人S.W.
      • Downer N.W.
      • Teitelbaum H.
      氢交换。
      ),其必须在pH8.5下产生高度的它们的羟基质量,因此,与TMT反应的低敏感性。实际上,研究NHS酯对氨基酸的NHS酯的反应性的早期研究无法检测pH7.4的丝氨酸和苏氨酸衍生物(
      • anjaneyulu p.s.r.
      • Staros J.v.
      N-羟基氟嘧啶嘧啶亚胺活性酯的反应。
      )。相比之下,当组氨酸密切,特别是在-2或+ 2位,彩易福彩的氨基酸(HX- [STY]中,肽中肽中肽中含羟基氨基酸对NHS酯反应性朝向NHS酯是反应性的。 sty] -xh)(
      • Mädlers.
      • Bich C.
      • touboul d.
      • Zenobi R.
      与NHS酯的化学交联:对氨基酸重组的系统研究。
      ,
      • 米勒B.T.
      • 柯林斯T.J.
      • 唠叨G.T.
      • Kurosky A.
      促进促丙素释放激素和类似物生物素化期间O-酰化的发生。反应性丝氨酸的证据。
      ,
      • Wiktorowicz J.E.
      • 英语R.D.
      • 吴Z.
      • Kurosky A.
      伊特拉克肽改性的模型研究:依赖依赖性反应特异性。
      ,
      • 米勒B.T.
      • Kurosky A.
      线性肽三合组中α-XAA-Ser或Ser-XAA-His中的甲基羟基的内在反应性升高。
      )。这意味着pK a 值可以根据氨基酸的分子环境大幅变化。实际上,在我们的数据中,综述肽也在组氨酸中富集,并且当它们是HX-[Sty]主题的一部分时,丝氨酸,苏氨酸或酪氨酸残基在TMT彩易福彩状态下鉴定3至11倍。 。 P.K a 组氨酸低于n末端(
      • 格里姆斯利G.R.
      • Scholtz J.M.
      • 速度c.n.
      折叠蛋白质中可电离基团的测量PK值的概述。
      ),原则上,这将促进TMT的组氨酸改性。事实上,已经提出了在略微酸性条件下的固相彩易福彩方案中发生这种情况(
      • BöhmG.
      • Precop P.
      • 塞尔特S.
      • Mitra V.
      • 布里顿D.
      • Kuhn K.
      • 派克I.
      • 汤普森A.H.
      具有TMT的复合肽消化的低pH固相氨基彩易福彩改善了多重全球磷酸肽分析的肽鉴定率。
      )。然而,对于我们的溶液彩易福彩方案(在基本pH下进行),数据库搜索的结果允许TMT作为组氨酸的可变修饰不提供组氨酸本身普遍彩易福彩的可粘性证据。这是根据研究报告的研究,在中性下的组氨酸下的组氨酸变性,与碱性条件具有自发水解的形成的N-酰基咪唑,其在分钟范围内半衰期(
      • anjaneyulu p.s.r.
      • Staros J.v.
      N-羟基氟嘧啶嘧啶亚胺活性酯的反应。
      ,
      • Leavell M.D.
      • 诺瓦克P.
      • Behrens C.R.
      • Schoeniger J.s.
      • Kruppa G.H.
      酪氨酸和赖氨酸残留物的选择性化学交联策略。
      )。这还可以通过组氨酸的初始衍生化和N-酰基咪唑中间体与近端含羟基氨基酸的初始衍生化,解释含组氨酸含肽的优先叠加,通过局部浓度的局部浓度和N-酰基咪唑中间体与近端羟基氨基酸的反应(
      • Mädlers.
      • Bich C.
      • touboul d.
      • Zenobi R.
      与NHS酯的化学交联:对氨基酸重组的系统研究。
      )。此外,组氨酸还可以通过侧链之间的氢键合导致朝向TMT的反应性较高的氢键来增加羟基氨基酸的亲核性增加(
      • 米勒B.T.
      • Kurosky A.
      线性肽三合组中α-XAA-Ser或Ser-XAA-His中的甲基羟基的内在反应性升高。
      )。值得注意的是,在邻酰化的肽序列中的组氨酸富集可能还占据了与正确和结底肽相比观察到的综合彩易福彩肽的较高强度。无论绝对丰度如何,由于其气相碱度的改善的电离,含组氨酸的肽通常表现出比含非组氨酸含量的含量高的强度。
      有趣的是,通过在赖氨酸和肽N末端对滴定实验的所有搜索中断降低TMT - 肽比例,我们注意到光谱鉴定率的弱而一致地增加。正如Böhm所建议的那样 等等。 (
      • BöhmG.
      • Precop P.
      • 塞尔特S.
      • Mitra V.
      • 布里顿D.
      • Kuhn K.
      • 派克I.
      • 汤普森A.H.
      具有TMT的复合肽消化的低pH固相氨基彩易福彩改善了多重全球磷酸肽分析的肽鉴定率。
      ),鉴定率的这种增加可以归因于覆骨肽的级分的减少,我们同时注意到在降低的TMT - 肽比率下。米勒制造了类似的观察 等等。,他检测到更高的改性酪氨酸残基,具有更高的试剂 - 肽比例(
      • 米勒B.T.
      • 柯林斯T.J.
      • 唠叨G.T.
      • Kurosky A.
      促进促丙素释放激素和类似物生物素化期间O-酰化的发生。反应性丝氨酸的证据。
      )。这可能是TMT水解率和与原发性胺的反应的结果 相对 羟基。已经发现O-酰化比N-酰化慢20倍(
      • Leavell M.D.
      • 诺瓦克P.
      • Behrens C.R.
      • Schoeniger J.s.
      • Kruppa G.H.
      酪氨酸和赖氨酸残留物的选择性化学交联策略。
      ,
      • 米勒B.T.
      • 柯林斯T.J.
      • 唠叨G.T.
      • Kurosky A.
      促进促丙素释放激素和类似物生物素化期间O-酰化的发生。反应性丝氨酸的证据。
      )至少当没有组氨酸时紧密地存在。因此,采用相对低的试剂量,可以通过与所有伯胺反应完全消耗的试剂量以及一些试剂水解的算法将抑制O-酰化,从而减少叠饰。虽然未在此研究,但缩短反应时间可能进一步最小化纵向彩易福彩。
      总之,我们优化的溶液彩易福彩程序减少了八倍相对于供应商的协议有效彩易福彩肽所需的TMT试剂的量,因此提出了先前公布的彩易福彩方案的进一步改进(
      • BöhmG.
      • Precop P.
      • 塞尔特S.
      • Mitra V.
      • 布里顿D.
      • Kuhn K.
      • 派克I.
      • 汤普森A.H.
      具有TMT的复合肽消化的低pH固相氨基彩易福彩改善了多重全球磷酸肽分析的肽鉴定率。
      ,
      • 爱德华兹A.
      • 哈斯W.
      用于高通量综合蛋白质组织人细胞系的多路复用定量​​蛋白质组学。
      ,
      • Ruprecht B.
      • Zecha J.
      • ZOLG D.P.
      • Kuster B.
      高pH反相微柱,用于蛋白质组的简单,敏感和有效分级和(TMT彩易福彩)磷酸磷蛋白酶体消化。
      ,
      • Navarreete-Perea J.
      • 俞Q.
      • Gygi S.P.
      • 保罗J.A.
      简化的串联质量标签(SL-TMT)协议:使用串联质量标签 - 同步前体选择-S30的定量(磷酸)蛋白质组分析的有效策略。
      )。该方案具有成本效益,而没有任何彩易福彩效率或稳健性的牺牲。如这里所示,可以容易地采用并集成在分析细胞系或组织蛋白质蛋白质的工作流程中的方案。我们注意到,本研究中研究的相同原理和参数也可能适用于其他NHS酯反应,包括ITRAQ彩易福彩,生物素化或交联。

      数据可用性

      小姐蛋白质组学原始数据和完整的MaxQuant搜索结果已被沉积在Proteomexchange联盟(http://www.proteomexchange.org/)通过具有数据集标识符PXD012703的骄傲(32)伙伴存储库。鉴定在单肽匹配的基础上鉴定修饰的肽和蛋白质的光谱可以在包括在最大的软件中的MaxQuant观察者中观察,该MaxQuant软件也被沉积在同一位置。

      致谢

      我们感谢GuillaumeMédard,苏珊克拉,Sam Myers和Namrata Udeshi有用的讨论。

      补充材料

      参考

        • Bantscheff M.
        • Lemeer S.
        • Savitski m.m.
        • Kuster B.
        蛋白质组学中的定量质谱:2007年至今的批判性评论更新。
        肛门。生物分析化学。 2012; 404: 939-965
        • 汤普森A.
        • SchäferJ.
        • Kuhn K.
        • Kienle S.
        • Schwarz J.
        • 施密特G.
        • Neumann T.
        • 哈蒙克
        串联质量标签:MS / MS的复合蛋白混合物比较分析的新量化策略。
        肛门。化学。 2003; 75: 1895-1904
        • Zecha J.
        • 孟康
        • ZOLG D.P.
        • 萨马拉斯诗
        • Wilhelm M.
        • Kuster B.
        肽级别周转测量能够研究蛋白质形式动力学。
        摩尔。细胞蛋白质组学。 2018; 17: 974
        • Mertins P.
        • 唐人
        • 克鲁格克。
        • 克拉克D.J.
        • 格里尼科米。
        • 陈L.
        • 克劳瑟K.R.
        • Clauss T.R.
        • 莎第P.
        • Gillette M.A.
        • petyuk v.a.
        • 托马斯S.N.
        • MANI D.R.
        • Mundt F.
        • 摩尔r.j.
        • 胡Y.
        • 赵立
        • Schnaubelt M.
        • Keshishian H.
        • Monroe M.E.
        • 张Z.
        • Udeshi N.D.
        • 玛尼D.
        • 戴维斯S.R.
        • Townsend R.R.
        • Chan D.W.
        • 史密斯r.d.
        • 张H.
        • 刘涛。
        • carr s.a.
        液相色谱 - 质谱法的多重深度蛋白质组和肿瘤组织磷脂蛋白酶体分析的可重复工作流程。
        NAT。 protoc。 2018; 13: 1632-1661
        • Archer T.C.
        • Ehrenberger T.
        • Mundt F.
        • 金M.P.
        • 克鲁格克。
        • mah c.k.
        • mahoney e.l.
        • 丹尼尔C.J.
        • 莱纳尔A.
        • ramamoorthy d。
        • Mertins P.
        • MANI D.R.
        • 张H.
        • Gillette M.A.
        • 克劳瑟K.
        • 贵族
        • 唐人
        • Pierre-FrançoisJ.
        • 硅铁J.
        • 詹森J.
        • Tamayo P.
        • Korshunov A.
        • Pfister s.m.
        • kool m.
        • 诺斯科特P.A.
        • 西尔斯r.c ..
        • Lipton J.O.
        • carr s.a.
        • Mesirov J.P.
        • Pomeroy S.L.
        • Fraenkel E.
        蛋白质组学,翻译后修饰和整合分析显示Medulloblastoma亚组内的分子异质性。
        癌细胞。 2018; 34: 396-410.E398.
        • BöhmG.
        • Precop P.
        • 塞尔特S.
        • Mitra V.
        • 布里顿D.
        • Kuhn K.
        • 派克I.
        • 汤普森A.H.
        具有TMT的复合肽消化的低pH固相氨基彩易福彩改善了多重全球磷酸肽分析的肽鉴定率。
        J.蛋白质组。 2015; 14: 2500-2510
        • 爱德华兹A.
        • 哈斯W.
        用于高通量综合蛋白质组织人细胞系的多路复用定量​​蛋白质组学。
        在: 驯鹿J. 系统生物学中的蛋白质组学:方法和协议。 春家纽约, 纽约2016: 1-13
        • Ruprecht B.
        • Zecha J.
        • ZOLG D.P.
        • Kuster B.
        高pH反相微柱,用于蛋白质组的简单,敏感和有效分级和(TMT彩易福彩)磷酸磷蛋白酶体消化。
        在: Comai L. Katz J.E. Mallick P. 蛋白质组学:方法和协议。 春家纽约, 纽约2017: 83-98
        • Navarreete-Perea J.
        • 俞Q.
        • Gygi S.P.
        • 保罗J.A.
        简化的串联质量标签(SL-TMT)协议:使用串联质量标签 - 同步前体选择-S30的定量(磷酸)蛋白质组分析的有效策略。
        J.蛋白质组。 2018; 17: 2226-2236
        • Stepanova E.
        • Gygi S.P.
        • 保罗J.A.
        基于过滤的蛋白质消化(FPD):用于TMT工作流的无洗涤剂和基于脚手架的策略。
        J.蛋白质组。 2018; 17: 1227-1234
        • koch h.
        • Wilhelm M.
        • Ruprecht B.
        • 贝克斯。
        • Frejno M.
        • Klaeger S.
        • Kuster B.
        磷脂体谱揭示生长因子介导的EGFR过表达癌细胞中生长因子介导的激酶抑制剂抗性的分子机制。
        J.蛋白质组。 2016; 15: 4490-4504
        • 保罗J.A.
        • O'Connell J.D.
        • everley r.a.
        • o'brien J.
        • gygi m.a.
        • Gygi S.P.
        基于定量的质谱基复用将5000s酿酒酵母蛋白的丰度与10个碳源进行比较。
        J.蛋白质组学。 2016; 148: 85-93
        • Mirzaei M.
        • Gupta V.B.
        • 鸡爪。
        • Greco T.M.
        • 吴y.
        • Chitranshi N.
        • 墙r.v.
        • 磨练E.
        • 邓兰
        • Dheer Y.
        • Abbasi M.
        • Rezaeian M.
        • 辫子N.
        • 你是y。
        • salekdeh g.h.
        • Haynes P.A.
        • Molloy M.P.
        • 马丁斯r.
        • 克里斯特芹。
        • Gygi S.P.
        • 格雷厄姆S.L.
        • Gupta V.K.
        与人葡萄糖眼的视网膜和玻璃体蛋白质组中鉴定的年龄相关的神经变性疾病相关途径。
        科学报告。 2017; 7: 12685
        • 李S.
        • 沉d.
        • 邵杰。
        • 粉碎r.
        • 刘W.
        • PRAT A.
        • 他X.
        • 刘S.
        • HOOOG J.
        • 鲁C.
        • 丁L.
        • Griffith O.L.
        • 米勒C.
        • Larson D.
        • 富尔顿R.S.
        • 哈里森米
        • 默尼T.
        • McMichael J.f.
        • 罗杰。
        • 陶y
        • r.calves r.
        • Schlosberg C.
        • Hiken J.F.
        • 撒谎L.
        • 桑切斯C.
        • Giuntoli T.
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        • 林A.
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        • 戴维斯S.R.
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        • K avuri M.S.
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        • Pluard T.
        • Naughton M.
        • Bose R.
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        • Aft R.
        • Gillanders W.
        • Deschryver K.
        • 威尔逊r.k.
        • 王S.
        • 磨坊G.B.
        • Gonzalez-angulo A.
        • 爱德华兹J.R.
        • 马赫C.
        • perou c.m.
        • Mardis e.r.
        • ellis m.j.
        抗乳腺癌衍生的异种移植物的基因组表征揭示的内分泌治疗耐ESR1变体。
        细胞代表。 2013; 4: 1116-1130
        • Cox J.
        • Neuhauser N.
        • Michalski A.
        • 施泰米r.a.
        • 奥尔森J.V.
        和romeda:肽搜索引擎集成到最大环境中。
        J.蛋白质组。 2011; 10: 1794-1805
        • Tyanova S.
        • Temu T.
        • Cox J.
        基于质谱的霰弹枪蛋白质组学的MaxQuant计算平台。
        NAT。 protoc。 2016; 11: 2301
        • 黄克-L。
        • 李S.
        • Mertins P.
        • Cao S.
        • Gunawardena H.P.
        • Ruggles K.v.
        • MANI D.R.
        • 克劳瑟K.R.
        • Tanioka M.
        • 等级J.
        • kavuri s.m。
        • 谢L.
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        • 乔J.W.
        • 手表J.
        • wyczalkowski m.a.
        • erdmann-gilmore p。
        • Snider J.E.
        • HOOOG J.
        • 辛格P.
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        • 举行。
        • Gillette M.A.
        • Fenyöd。
        • kinsinger c.r.
        • Mesri M.
        • Rodriguez H.
        • 戴维斯S.R.
        • perou c.m.
        • 苹果电脑。
        • Reid Townsend R.
        • 陈X.
        • carr s.a.
        • ellis m.j.
        • 丁L.
        蛋白素聚合揭示乳腺癌异种移植物中的治疗靶标。
        NAT。安排。 2017; 8: 14864
        • 德格拉夫E.L.
        • Pellegrini D.
        • McDonnell L.A.
        小型样品量的一套新型自动化定量微蛋白酶方案及其在肾组织亚结构上的应用。
        J.蛋白质组。 2016; 15: 4722-4730
        • anjaneyulu p.s.r.
        • Staros J.v.
        N-羟基氟嘧啶嘧啶亚胺活性酯的反应。
        int。 J. Pept。蛋白质RES。 1987; 30: 117-124
        • Mädlers.
        • Bich C.
        • touboul d.
        • Zenobi R.
        与NHS酯的化学交联:对氨基酸重组的系统研究。
        J.质谱。 2009; 44: 694-706
        • 杨w.-c。
        • Mirzaei H.
        • 刘X.
        • Regnier F.E.
        电喷雾电离质谱法提高氨基酸检测和定量。
        肛门。化学。 2006; 78: 4702-4708
        • 格里姆斯利G.R.
        • Scholtz J.M.
        • 速度c.n.
        折叠蛋白质中可电离基团的测量PK值的概述。
        蛋白质SCI。 2009; 18: 247-251
        • Leavell M.D.
        • 诺瓦克P.
        • Behrens C.R.
        • Schoeniger J.s.
        • Kruppa G.H.
        酪氨酸和赖氨酸残留物的选择性化学交联策略。
        J.IM。 SOC。质谱。 2004; 15: 1604-1611
        • 米勒B.T.
        • 柯林斯T.J.
        • 唠叨G.T.
        • Kurosky A.
        促进促丙素释放激素和类似物生物素化期间O-酰化的发生。反应性丝氨酸的证据。
        J. Biol。化学。 1992; 267: 5060-5069
        • Wiktorowicz J.E.
        • 英语R.D.
        • 吴Z.
        • Kurosky A.
        伊特拉克肽改性的模型研究:依赖依赖性反应特异性。
        J.蛋白质组。 2012; 11: 1512-1520
        • Regnier F.E.
        • julka s.
        主要胺编码为对比较蛋白质组学的途径。
        蛋白质组学。 2006; 6: 3968-3979
        • 英国人S.W.
        • Downer N.W.
        • Teitelbaum H.
        氢交换。
        安努。 Rev. Biochem。 1972; 41: 903-924
        • 米勒B.T.
        • Kurosky A.
        线性肽三合组中α-XAA-Ser或Ser-XAA-His中的甲基羟基的内在反应性升高。
        生物学习。 Biophys。 res。安排。 1993; 196: 461-467