mRNA结合的彩易福彩组 莱山岛 mexicana:进入古代寄生虫的新遗传洞察力*

      莱山岛寄生虫感染,被称为Leishmaniases,导致全球性的传染病负担。寄生虫的生命周期体现了三个主要阶段,需要精确地协调基因调节,以在桑菲和哺乳动物宿主之间生存环境变化。 KinetoplastID寄生虫中的组成型转录意味着基因调节是压倒性地依赖于转录后机制,但很少有人惊人莱山岛 trans - 已知。使用优化的交联和深度量化的质谱,我们综合分析了来自三个主要的1400 mRNA结合蛋白(MRBPS)和全细胞彩易福彩莱山岛生命周期阶段。支持有效性,尽管交联的RBPOME是更富集的大小,交联和非交联RBPOMES的彩易福彩标识几乎相同。此外,内源地标记了多个候选RBP,并以阶段特异性方式与离散mRNA靶池相关联。结果表明了L. Mexicana.寄生虫,mRNA水平不是编码蛋白的整个细胞表达或RNA结合潜力的强预测因子。证据包括转录物与相应的彩易福彩表达与彩易福彩表达的阶段特异性变异性低相关性相对RNA结合潜力。不陈旧的是,RNA结合彩易福彩富集强烈地与特定生命周期阶段的相对复制效率强烈相关。我们的研究是第一个定量定义和比较KinetoplastID寄生虫的多个阶段MRBPOME。它提供了新颖的,深入的洞察力trans - 推翻mRNA:彩易福彩(MRNP)复合物驱动莱山岛寄生虫生命周期进展。

      图形概要

      莱山岛 spp. parasites are the causative agent of leishmaniasis, a neglected disease that represents the ninth largest global infectious disease burden (
      WHO。 WHO。全球Leishmaniaisis更新,2006-2015:Leishmaniasis监视的转折点。
      )。这些原生动物具有掺奇的生命周期,该生命周期在哺乳动物免疫细胞的吞噬细胞吞噬细胞的吞噬子组中的多个突起载体之间转换(
      • De Pablos L.M.
      • ferreira t.r.
      • Walrad P.B.
      莱山岛生命周期进展的发育分化:转录后控制进行管弦乐队。
      )。不同的环境条件(pH,温度,营养有效性)用作发育事件的触发器。对于寄生虫生命周期进展,迁移发生(对METCACECLIC PREARIGOTE)和AMASTIGOONSESS(MESCACLIC PREASTIGOTE到AMASTIGOTE)的分化过程需要紧密协调的基因调节(
      • De Pablos L.M.
      • ferreira t.r.
      • Walrad P.B.
      莱山岛生命周期进展的发育分化:转录后控制进行管弦乐队。
      )。迄今为止,很多 CIS. - 但很少有人惊人 trans - 推荐人牵连 莱山岛 发展进展(
      • residaud f.
      • Muller M.
      • CERQUYIRA G.C.
      • 史密斯米
      • rochette A.
      • el-说n.m.
      • Papadopoulou B.
      • Ghedin E.
      大型追查家族的成员是莱山西岛转录后基因表达的决定因素。
      ,
      • 瓦斯德D.R.
      • Ramirez L.
      • IBORRA S.
      • Soteriadou K.
      • Gonzalez v.M.
      • 等等。
      3'未翻转区域在细胞周期中的关键作用调节Leishmania Infantum组蛋白H2A基因的表达:5'未翻转区域的轻微协同效应。
      ,
      • 大卫M.
      • Gabdank I.
      • 本大卫米
      • Zilka A.
      • ORR I.
      • 等等。
      HSP83在Leishmania的优先翻译需要在3'UTR中富有热敏聚丙烯酰胺的元素,涉及扫描5'UTR。
      ,
      • Paape D.
      • Barrios-Llerena M.E.
      • 勒碧汉T.
      • 麦凯L.
      • Aebischer T.
      凝胶免费分析彩易福彩细胞内吉尔曼墨西哥彩易福彩组。
      ,
      • 拉哈维
      • Sivam D.
      • VOLPIN H.
      • ronen m.
      • 楼郡
      • 绿色A.
      • 荷兰N.
      • Kuzyk M.
      • 博赫斯C.
      • Zilberstein D.
      • Myler P.J.
      多水平的基因调控介导细胞内病原菌利山蛋白酶的分化。
      ,
      • Cloutier S.
      • LaverDiere M.
      • Chou M.N.
      • 淮北山
      • C.
      • Papadopoulou B.
      利什曼亚洲分化过程中通过EIF2Alpha磷酸化的翻译控制。
      ,
      • vascomcelos e.j.
      • Terrao M.C.
      • Ruiz J.C.
      • Vencio R.Z.
      • Cruz A.K.
      在Leishmania基因组中保守的闭合序列的硅鉴定:解除推定载有顺式调节元件。
      ,
      • 欺骗A.
      • Dumas C.
      • Papadopoulou B.
      Alba-域蛋白有助于Leishmania的Amastin转录物的阶段调节稳定性。
      ,
      • Padmanabhan P.K.
      • Zghidi-abouzid O.
      • Samant M.
      • Dumas C.
      • Aguiar B.G.
      • estaquier J.
      • Papadopoulou B.
      DDX3死箱RNA Helicase在Leishmania的线粒体彩易福彩质量控​​制中起着重要作用。
      )。识别 莱山岛 trans - 以阶段特异性的方式结合mRNA的调节剂对促进和使寄生物存活的细胞过程来说至关重要。
      基因表达的调节需要进行微调的协调机制,这些机制响应转移环境条件。 Kinetoplastid寄生虫几乎完全依赖于转录后基因调节机制,因为它们的Pol II驱动的聚际基因阵列组成型转录(
      • De Pablos L.M.
      • ferreira t.r.
      • Walrad P.B.
      莱山岛生命周期进展的发育分化:转录后控制进行管弦乐队。
      )。因此,RNA结合蛋白(RBPS)
      使用的缩写是:RBP
      RNA结合蛋白
      MRNP.
      mRNA核糖核蛋白
      PCA.
      主要成分分析
      PCF.
      procyclic promastigotes.
      荟萃
      Meticalclic Promastigotes.
      ama.
      amastigotes.
      XL.
      交联
      noxl.
      非交联
      厕所
      整个细胞。
      1使用的缩写是:RBP
      RNA结合蛋白
      MRNP.
      mRNA核糖核蛋白
      PCA.
      主要成分分析
      PCF.
      procyclic promastigotes.
      荟萃
      Meticalclic Promastigotes.
      ama.
      amastigotes.
      XL.
      交联
      noxl.
      非交联
      厕所
      整个细胞。
      在这些生物的彩易福彩组中呈超过它们作为主要基因调节剂的作用。这样的 trans - 重新抑制的Rbps与mRNA形成核糖核蛋白复合物(mRNP)的mRNA形成,该核糖蛋白复合物(mRNP)调节从合成到腐烂的mRNA分子的运输和加工(
      • gehring n.h.
      • Wahle E.
      • 菲舍尔U.
      解读MRNP代码:转录后基因调控的RNA绑定的决定簇。
      )。环境压力刺激MRNP定位,组成和功能的SWIFT变化,以加速mRNA翻译,衰减或螯合到响应的细胞内颗粒的速率(
      • Fritz M.
      • Vanselow J.
      • Sauer N.
      • 拉米尔S.
      • Goos C.
      • Siegel T.N.
      • Subota I.
      • Schlosser A.
      • Carrington M.
      • 克拉姆斯S.
      通过使用锥虫的微管骨架作为分子筛来进入RNP颗粒的新颖洞察。
      )。
      先前的mRNA结合彩易福彩蛋白的大规模分离已经确定了酵母,苍蝇,小鼠和人类的候选调节剂(
      • Beckmann下午
      • Horos R.
      • Fischer B.
      • Castello A.
      • Eichelbaum K.
      • Alleaume上午
      • Schwarzl T.
      • 蜷缩
      • Foehr s.
      • Huber W.
      • Krijgsveld J.
      • 无尽的M.W.
      来自酵母的RNA结合彩易福彩蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白彩易福彩。
      ,
      • 无尽的M.W.
      • Castello A.
      • Schwarzl T.
      • Preiss T.
      一个勇敢的RNA结合彩易福彩。
      )。最近,Kinetoplastid寄生虫MRNP调查产生了155个RBP 锥虫瘤布鲁斯群 单体血流形式和128 莱山岛 donovani ackenicAmastigote形式的RBPS(
      • Lueong S.
      • Merce C.
      • Fischer B.
      • Hoheisel J.D.
      • Erben E.D.
      基因表达调控网络在锥虫瘤Brucei:洞察MRNA结合彩易福彩组的作用。
      ,
      • 南丹D.
      • 托马斯S.A.
      • Nguyen A.
      • 月亮K.M.
      • 福斯特L.J.
      • einer n.e.
      蛋白酶捕获综合鉴定Leishmania Donovani的mRNA结合蛋白。
      )。这些研究的范围仅为一个生命周期阶段,但重要的是确认在肺骨架细胞中的mRNA绑定因子包括没有规范RNA结合基序的彩易福彩(
      • Beckmann下午
      • Horos R.
      • Fischer B.
      • Castello A.
      • Eichelbaum K.
      • Alleaume上午
      • Schwarzl T.
      • 蜷缩
      • Foehr s.
      • Huber W.
      • Krijgsveld J.
      • 无尽的M.W.
      来自酵母的RNA结合彩易福彩蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白彩易福彩。
      ,
      • 无尽的M.W.
      • Castello A.
      • Schwarzl T.
      • Preiss T.
      一个勇敢的RNA结合彩易福彩。
      ,
      • Lueong S.
      • Merce C.
      • Fischer B.
      • Hoheisel J.D.
      • Erben E.D.
      基因表达调控网络在锥虫瘤Brucei:洞察MRNA结合彩易福彩组的作用。
      ,
      • 南丹D.
      • 托马斯S.A.
      • Nguyen A.
      • 月亮K.M.
      • 福斯特L.J.
      • einer n.e.
      蛋白酶捕获综合鉴定Leishmania Donovani的mRNA结合蛋白。
      ,
      • Castello A.
      • Horos R.
      • Stein C.
      • Fischer B.
      • Eichelbaum K.
      • Steinmetz L.M.
      • Krijgsveld J.
      • 无尽的M.W.
      RNA互联蛋白捕获RNA结合蛋白的综合鉴定。
      )。
      在这里,我们呈现mRNA绑定以及全细胞彩易福彩彩易福彩 L. Mexicana. Procyclic Promastigote(“PCF”),MetalyClic Promastigote(“Meta”)和Amastigote(“AMA”)阶段寄生虫。我们已经鉴定了由UV交联(XL)和非交联(NONXL)样品中的至少两种独特肽表示的1400 mRNA结合的彩易福彩(RBP),XL样品由于增强的共价键,浓缩的总富集的幅度较高互动。分离的mRNA-结合的彩易福彩谱差异富集,超过250个RBPS表现出阶段特异性表达。此外,这些阶段的整个细胞彩易福彩也是一式三份的,以适用于本研究的比较用途,并代表了一个基本资源 莱山岛 和真核研究界。在8144个预测彩易福彩中,我们的分析鉴定了2400多个,具有至少2种高质量的独特肽,其中在整个生命周期中的表达水平几乎半波动。感兴趣的,生物信息学和生物化学分析表示仅少数鉴定的彩易福彩显示表达模式,如它们的编码转录物。此外,mRNA结合蛋白的表达与RNA结合不相关。重要的是,这些发现可能致力于翻译后修改在RNA结合潜力的波动和候选人的相对稳定性 trans - 以及整体蜂窝翻译能力和活动。

      实验步骤

       寄生虫培养和纯化

      早期通过(P2-P3)PCF形式 L. Mexicana. 菌株M379(MNYC / BZ / 62 / M379)与日志相分离(3-6e6 在26℃(pH7.2)中的细胞/ ml)在26℃(
      • McKean P.G.
      • 丹尼P.W.
      • KNUEPFER E.
      • 敏锐的J.K.
      • 史密斯D.F.
      与Leishmania阶段调节基因家族的缺失和过表达相关的表型变化。
      )。如前所述产生了富含富含富含的培养物(
      • 罗杰斯米
      • Kropf P.
      • Choi B.S.
      • 狄龙r.
      • 波迪诺夫斯卡亚米。
      • 贝茨P.
      • Mülleri。
      嗜血管症感染的砂岩脱节的彩易福彩酚蛇蝇靶向宿主巨噬细胞的L-精氨酸代谢,以促进寄生虫存活。
      )。简而言之,PCF在1.5×10中形成无罪的恩典媒体(10%HIFC,1%PEIFCS,1倍BME维生素,pH 5.5)5 细胞/ ml并在26℃下培养7天。对于J774.2巨噬细胞(Sigma;(Sigma))感染测定,通过耐受20%人血清(Sigma)的补体介导的晶体(Sigma)在37℃下进行30分钟并验证通过验证培养物 expression (
      • 解雇D.L.
      • da silva r.p.
      感染阶段Leishmania主要癌症的产生与细胞表面表达和发育调节糖脂的释放有关。
      ,
      • 删除D.P.
      • 埃文斯K.J.
      • ivens a.c。
      • Aziz N.
      • 马戏团A.
      • Kaye下午
      • 史密斯D.F.
      莱山岛的比较表达分析:物种与不同宿主遗传背景中基因表达的调节。
      )。
      被离心验证的Meta寄生虫并重新悬浮于完全DMEM培养基(10%HIFC,1%青霉素/链霉素,2米M L.-Glutamine)并用于在15:1寄生虫/平均/平均比率(1.25×10)处感染J774.2MØ培养物(1.25×107 Mø/板)在34°C下洗涤3倍,在3×与预级PBS进行3℃,在34℃下在DMEM培养基中孵育18小时,紫外线照射(或不),破坏MØS和感染后24小时的分离( pi)使用45%percoll或蔗糖梯度,细胞内的Amastigote形式(AMA(mø))如所述(
      • Paape D.
      • Barrios-Llerena M.E.
      • 勒碧汉T.
      • 麦凯L.
      • Aebischer T.
      凝胶免费分析彩易福彩细胞内吉尔曼墨西哥彩易福彩组。
      )。

       小鼠感染

      孤立AMA(LD)寄生虫 体内,1×107 血清处理的元 L. Mexicana. 细胞注射在8-12周龄BALB / C小鼠(Charles River,UK)的群中。 4个月后,处死小鼠并按照描述收获的病变(
      • Paape D.
      • Barrios-Llerena M.E.
      • 勒碧汉T.
      • 麦凯L.
      • Aebischer T.
      凝胶免费分析彩易福彩细胞内吉尔曼墨西哥彩易福彩组。
      ,
      • COOMBS G.H.
      • HART D.T.
      • Capaldo J.
      莱山岛 mexicana: drug sensitivities of promastigotes and transforming amastigotes.
      )。出于道德原因,仅针对XL MRNP样品收获AMA(LD)。

       莱山岛 mRNA结合彩易福彩蛋白的分离

      对于mRNA互蛋白酶捕获实验,所有条件都相当于 莱山岛 生命周期在XL和NONXL样本之间形成PCF,META,AMA(MØ)和AMA(LD),除了辐照。 体内 使用LT40“MINITRON”系统(UV03 LTD.)进行UV交联(
      • 格兰曼S.
      • Petfalski E.
      • Swiatkowska A.
      • Tollervey D.
      通过系统分析RNA-彩易福彩交联裂解40S核糖体亚基结构。
      )。细胞在5×106 辐照细胞/ mL汇合(〜0.6 od)120s(Fig. 2B; ~1.6 mj / cm2)最佳 体内 RBP:RNA(MRNP)与优异的mRNA完整性和可忽略的热应激与将细胞暴露于100倍的标准绞喉粘连(~150mJ / cm2)(
      • 格兰曼S.
      • Petfalski E.
      • Swiatkowska A.
      • Tollervey D.
      通过系统分析RNA-彩易福彩交联裂解40S核糖体亚基结构。
      )。 AMA(MØ)和AMA(LD)均在宿主中辐照,然后均质化以释放寄生虫以进行梯度纯化,如上所述。
      图缩略图GR2.
      Fig. 2mRNA互联族捕获工作流程的概述。 A, 莱山岛 来自验证的生命周期阶段的细胞是UV照射的 体内 在交联的mRNA和结合彩易福彩之间产生共价键(XL) 相对 非交联细胞(非X1)。然后纯化细胞,使用寡核苷酸(DT) - 标记的磁珠分离裂解和MRNP络合物。分离的Rbps被沉淀并加工用于无标记的定量质谱。数字表示鉴定过滤的彩易福彩,用于三份一致的,高质量的读数,具有至少2个独特的肽。 B,120“或180”紫外线照射后的生长曲线和细胞形态,优化设备。 C,相对RNA恢复 18S鼻儿 寡聚(DT)磁珠MRNA后的转录物在XL,NONX1和WC裂解物中纯化,PCF(紫色),META(绿色)和AMA(MØ; RENG)样品。
      ~5×10的三份样品9 每个生命周期阶段(XL和NONX1)的细胞重悬于15mL裂解缓冲液中(
      • Walrad P.
      • Paterou A.
      • Acosta-Serrano A.
      • 马修k.r.
      CCCH蛋白的差动锥虫表面涂层调节与原霉素mRNA顺式元素共同关联。
      )(20米m Tris-HCl,PH7.5,500米m LiCl, 0.5% LDS, 1 mm EDTA and 5 mm DTT与完全的无核蛋白酶抑制剂 TM值 (Roche))在0°C下10分钟,通过25g针直至清除,以4000×10分钟离心10分钟 g 并与oligo孵育(dt)25 在4°C(新英格兰Biolabs)的珠子30分钟。如上所述进行聚(a)RNA分离的剩余步骤(
      • Castello A.
      • Horos R.
      • Stein C.
      • Fischer B.
      • Eichelbaum K.
      • Steinmetz L.M.
      • Krijgsveld J.
      • 无尽的M.W.
      RNA互联蛋白捕获RNA结合蛋白的综合鉴定。
      )。通过TCA沉淀沉淀mRNA - 结合的彩易福彩,并使用微BCA彩易福彩测定试剂盒(Thermo)测量所得彩易福彩浓度。

      无标记定量质谱分析

       胰蛋白酶消化

      将三份生物样品溶解在纽扣LDS样品缓冲液(寿命技术)中,在70℃下加热10min,并在200V的7cm NOVEX 10%BIS-TRIS凝胶(Life Technologies)上以6min。在用纯水溶解1小时之前,用SafeBlue蛋白染色(NBS生物学)染色1小时凝胶。在用碘乙酰胺用二氧化氢酚和S-氨基甲酰化还原后进行凝胶胰蛋白酶消化。用50%(V:V)含有25米的50%(V:V)乙腈水溶液洗涤凝胶片两次m 碳酸氢铵,然后用乙腈一次浓缩,真空浓缩20分钟。序列级,改性猪胰蛋白酶(Promega)溶解在50米中m 乙酸并用25米稀释m 碳酸氢铵,给出最终胰蛋白酶浓度为0.02g / l。用25L胰蛋白酶溶液再水化凝胶片,孵育10分钟然后25米m 加入碳酸氢铵溶液以覆盖凝胶片。将摘要在37℃下在过夜孵育过夜。通过用含有0.1%(V:V)三氟乙酸的50%(V:v)乙腈水溶液洗涤三次,在浓缩真空并在0.1%(V:V)三氟乙酸中重构之前,用50%(V:V)乙腈水溶液萃取肽。通过取等于所有样品的等分试样来创建一个常见的样本池。

       LC-MS / MS

      将样品装载到配备有薄膜100Åc18,5μm捕集柱(300μm×5mm Thermo)和Pepmap,2μm,100Å,C18 easyNano纳米咖啡柱(75米×150 mm; thermo)。捕获溶剂是0.05%(V:V)三氟乙酸水溶液;捕获流量为15μl/ min。在切换到毛细管柱之前,将捕集物洗涤3分钟。分离使用两种溶剂的梯度洗脱:溶剂A,1%(V:V)甲酸水溶液;溶剂B,80%(V:V)乙腈含有1%(V:V)甲酸。毛细管柱的流速为300 nL / min,塔温为40℃。线性多步梯度谱是:3-10%B超过7分钟,10-35%B超过30分钟,35-99%B超过5分钟,然后用99%溶剂B洗涤4分钟。柱子返回到初始条件并在随后注射之前重新平衡15分钟。纳米系统用侧侧融合界面接口TM值 HybridTM值 具有EasyNano电离源(Thermo)的质谱仪(Thermo)。使用Xcalibur软件(版本4.0,Thermo)获取正ESI-MS和MS2光谱。仪器源设置是:离子喷涂电压,1900 V;扫气,0 arb;离子转移管温度; 275°C。 MS 1光谱是在侧面融合中获得的TM值 有:120,000分辨率,扫描范围: m/z 375-1500; AGC目标,4E5;最大填充时间,100毫秒。使用1 S循环以顶速模式执行数据相关的采集,选择具有充电状态的最强烈的前体。 Easy-IC用于内部校准。对50秒的前体选择进行动态排除,并在5e处设定了碎片的最小阈值3。在线性离子阱中获取MS2光谱,具有:扫描速率,涡轮增压;四极孤立,1.6 m/z;激活型,HCD;激活能量:32%; AGC目标,5E3;第一个质量,110 m/z;最大填充时间,100毫秒。通过Xcalibur排列采集,用于注入所有可用的并行时间。

       融合PCR和N Termini的内源3xHA标记

      对于3xHA n标记的细胞系,原始模块化PPOTV2向量(
      • 染料P.
      • 迪恩斯
      • 苏德J.
      在锥虫瘤Brucei中的高通量基因标记。
      )被修改。 TY-GFP-TY标签被切除(HINDIII / BAMHI)并用3×H标签代替。如前所述进行融合PCR。用于转染,2×107 将PCF细胞重悬于TB-BSF缓冲液(100μl)中并转染(
      • 伯克德G.
      • Fragoso c.m.
      • 罗迪蒂I.
      高效稳定的血液形式的血管瘤Brucei。
      )。用10μg/ mL Blasticisin(Sigma)选择寄生虫。

       RNA CoimMunopectipitation和QRTPCR

      HA标记的Rbps从PCF或Meta裂解物免疫沉淀,使用抗HA磁珠(Thermo)通过QRTPCR使用上标IV逆转录酶,快速Sybr Green Master Mix和SquareStudio 3 PCR系统(Thermo Fisher)以先前提取并测量抗HA磁珠(Thermo)的Coimmunoppippipipipipipated RNA描述 (
      • Walrad P.
      • Paterou A.
      • Acosta-Serrano A.
      • 马修k.r.
      CCCH蛋白的差动锥虫表面涂层调节与原霉素mRNA顺式元素共同关联。
      )。通过2计算QRTPCR的相对水平-ΔΔct 使用 鼻儿 作为组成型控制(
      • 价格H.P.
      • Guther M.L.
      • Ferguson M.A.
      • 史密斯D.F.
      Myristoyl-CoA:彩易福彩N-Myristoyltransferase脱落在锥虫中导致无流动和内吞的缺陷。
      )。
      对于mRNA键的捕获实验,使用耗尽测量结果的质量(18S 核糖体基因)和非耗尽(鼻儿)寡核苷酸前后的相对mRNA值(DT)25 - 标记的磁珠净化。使用2测量相对水平-Δct. 方法,在mRNA纯化之前使用来自样品的总RNA作为参考。使用的完整引物列表 补充表S3.

       彩易福彩印迹和彩易福彩表达

      如上所述生长和纯化3xHA内源标记的细胞系的不同生命周期。寄生虫在Laemmli缓冲液中裂解,并通过SDS-PAGE分离的样品,转移到PVDF,用抗HA(1:10,000,Pierce)和抗小鼠IgG-HRP(1:50,000,Sigma)标记并使用ECL(GE卫生保健)。使用imagej软件量化相对蛋白表达。

       数据分析

      峰值列表以.raw格式导入到后代qi和lc-ms运行到通用示例池。前体离子强度归功于每次采集的总强度。组合的峰值列表以.mgf格式导出,用于数据库搜索 L. Mexicana. 含有常见彩易福彩组学污染物的序列(8365序列)。 Mascotdaemon(2.5.1版,矩阵科学)用于将搜索提交到吉祥物计划(矩阵科学有限公司,2.5.1版)的本地运行副本。指定的搜索标准:酶,胰蛋白酶;固定修饰,氨基甲酰基(C);可变修改,氧化(m);肽耐受,5 ppm; MS / MS耐受性,0.5 da;仪器,ESI-Trap。筛选搜索结果以最低预计得分为0.05。吉祥物.xml结果文件被导入与前体峰面积相关的后代Qi和肽鉴定。相对彩易福彩定量衍生自独特的肽前体离子强度。所接受的量化需要含有至少两个独特的肽。统计测试在Qi和Anova衍生的后期进行 p 使用Hochberg和Benjamini方法将值转换为多个测试校正的Q值。最终量化结果被剥离了非莱山岛 SPP。简洁的标识。

      生物信息学分析

       预测与孤立的RBPOMES的比较

      使用手动策策和搜索项“RNA绑定”从Interpro数据库编制了一个特征的已发布的RNA绑定域。 1407孤立的RBP候选者(1638 LC MS / MS彩易福彩身份) L. Mexicana. 将XL-RBPOME与Tritrypdb.org上的编译列表进行比较(08/2018)(
      • aslett m.
      • Aurrecoechea C.
      • Berriman M.
      • Brestelli J.
      • Brunk B.P.
      • Carrington M.
      • 删除D.P.
      • 菲舍尔S.
      • Gajria B.
      • 高X.
      • 加德纳M.J.
      • Gingle A.
      • 格兰特G.
      • Harb O.S.
      • Heiges M.
      • Hertz-Fowler C.
      • 休斯顿R.
      • Innamorato F.
      • Iodice J.
      • Kissinger J.C.
      • Kraemer E.
      • 李W.
      • 洛根F.J.
      • 米勒J.A.
      • Mitra S.
      • Myler P.J.
      • Nayak V.
      • 彭宁顿C.
      • Phan I.
      • Pinney D.F.
      • ramasamy g.
      • 罗杰斯M.B.
      • Roos D.S.
      • 罗斯C.
      • Sivam D.
      • 史密斯D.F.
      • Srinivasamoorthy G.
      • Stoeckert JR,C.J.
      • Subramanian S.
      • Thibodeau R.
      • Tivey A.
      • 治理C.
      • Velarde G.
      • 王H.
      Tritrypdb:锥虫的功能基因组资源。
      )使用“交叉”(新的搜索/彩易福彩特征和属性/口译域)的条件“Interpro域”功能。在编译的清单和整体之间也完成了相同的比较方法 L. Mexicana. 彩易福彩编码基因组。使用Microsoft Excel 2013,Corel Draw 2017和Inkscape 0.92.3软件创建图表。

       Venn图

      将每个阶段的WC和XL彩易福彩彩易福彩部分过滤,包括每个条件强度≥10的3个重复的每一个具有平均强度值的彩易福彩6。这些彩易福彩用于使用Matplotlib V.1.5.3和Matplotlib-Venn封装版本0.11.5在Python 2.7中产生Venn图。

       基因本体论术语分析

      分子函数GO术语相对于预测的孤立MRBPome显着富集 L. Mexicana. 使用Tritrypdb.org衍生彩易福彩组(04.2017)(
      • aslett m.
      • Aurrecoechea C.
      • Berriman M.
      • Brestelli J.
      • Brunk B.P.
      • Carrington M.
      • 删除D.P.
      • 菲舍尔S.
      • Gajria B.
      • 高X.
      • 加德纳M.J.
      • Gingle A.
      • 格兰特G.
      • Harb O.S.
      • Heiges M.
      • Hertz-Fowler C.
      • 休斯顿R.
      • Innamorato F.
      • Iodice J.
      • Kissinger J.C.
      • Kraemer E.
      • 李W.
      • 洛根F.J.
      • 米勒J.A.
      • Mitra S.
      • Myler P.J.
      • Nayak V.
      • 彭宁顿C.
      • Phan I.
      • Pinney D.F.
      • ramasamy g.
      • 罗杰斯M.B.
      • Roos D.S.
      • 罗斯C.
      • Sivam D.
      • 史密斯D.F.
      • Srinivasamoorthy G.
      • Stoeckert JR,C.J.
      • Subramanian S.
      • Thibodeau R.
      • Tivey A.
      • 治理C.
      • Velarde G.
      • 王H.
      Tritrypdb:锥虫的功能基因组资源。
      )。 Revigo软件用于改进和可视化丰富的术语(Revigo.irb.hr)(
      • Supek F.
      • Bosnjak M.
      • Skunca N.
      • Smuc T.
      Revigo总结并可视化了基因本体论术语的长列表。
      )。

       火山图

      使用Matplotlib v.1.5.3和MPLD3.js v.1.0在Python 2.7中生成Volcano图以进行交互式可视化。通过在条件之间采用平均强度值+ 1的比率的Log 2值来计算每种彩易福彩的2个折叠变化值。独立的 t - 使用每个条件的3个重复的每个条件中的每个条件都使用强度值进行#tests。生成 p Volcano图中使用的值。

       全细胞蛋白酶与转录组(
      • Fiebig M.
      • 凯莉斯。
      • Gluenz E.
      比较生命周期转录组织对Leishmania墨西哥语言组注释进行了反转,并将染色体复制与脊椎动物的寄生刺激联系起来。
      )数据相关性

      通过使用Q值≤0.05的基因平均Q值≤0.05的基因来进行WC彩易福彩组和转录组相关性。这是为WC彩易福彩组完成的 相对 整个转录组,以识别任何总体相关性,以及每个特定阶段。对于WC彩易福彩组和转录组比较,计算每个重复的PCF与AMA(Mø)强度的比率,平均,然后对2 转变。然后将从WC彩易福彩组获得的基因与先前发现的转录物进行比较,以在AMA(MØ)和初始术之间差异表达日志 stages (
      • Fiebig M.
      • 凯莉斯。
      • Gluenz E.
      比较生命周期转录组织对Leishmania墨西哥语言组注释进行了反转,并将染色体复制与脊椎动物的寄生刺激联系起来。
      )。然后使用GGPLOT2 R封装彼此相互绘制两个数据集之间的相交基因,并安装了回归 Fig. 5A 基于衍生统计数据的黄土线性模型进行了建模 表I. below.
      图缩略图GR5.
      Fig. 5比较 L. Mexicana. WC和XL彩易福彩转录组数据。 A,黄土算法的GLM(广义线性模型)拟合显示滑动窗口方法,以可视化WC(紫色)和XL(绿色)彩易福彩组学数据之间的相对相关性相对于发布 L. Mexicana. 转录组数据(
      • Supek F.
      • Bosnjak M.
      • Skunca N.
      • Smuc T.
      Revigo总结并可视化了基因本体论术语的长列表。
      )在ama(mø) 相对 PCF生命周期阶段。灰色阴影= s.e.提供的相关统计数据 . B,线性回归适合符合XL / WC比率的所有彩易福彩,LM [WC〜×L]。表达的彩易福彩更可能在PCF中结合mRNA,与AMA中间体相比meta。表达彩易福彩结合RNA的可能性与每个生命周期阶段的复制和翻译效率相结合。
      表I.RNA结合与全细胞蛋白酶统计和参数。与WC和MRNA相关的统计数据相关(XL)PCF,META和AMA生命周期阶段的彩易福彩组比较 L. Mexicana. parasites (Fig 5B)
      生命周期阶段紫外线交联彩易福彩组对全细胞蛋白酶(基于XL VS WC相关性的简单线性模型)
      标准错误(D.F.)调整后的R2.p value
      所有阶段3.959(4,219) 0.00667.05E-08.
      PCF.2.956(1,405)0.01182.64E-05.
      荟萃4.051(1,405)0.1325< 2.2E-16
      ama.3.486(1,405)0.01783.11e-07.
      在此之后,然后将来自彩易福彩组学数据的表达值与XL和WC条件中的每个生命周期阶段进行比较。如前所述,强度值在复制之间取平均值,并且使用GGPLOT2绘制,但是,它们恰好地用简单的线性回归模型适合,因为黄土模型没有改善适合数据。

       实验设计与统计理由

      所有阶段的每个彩易福彩组样品(WC,XL和NONX1)的生物三倍体(PCF,META,AMA(MØ)和AMA(LD))被定量评估肽离子富集。数据被搜索到TritryPDB 莱山岛 mexicana 彩易福彩组(版本8.1-10SEP 2014年9月30日,8250次序列; 5,180,224个残基)与115个常见的彩易福彩组学污染物替换,包括胰蛋白酶和人角蛋白(38,188个残基)。酶搜索参数需要完全胰蛋白酶特异性(切割C末端至K或r先前的k或r),并允许直到一个错过的裂解。通过针对反向数据库进行验证估计2.4%的鉴定假发现率,并比较匹配的相对比例,限制每个MS2查询的顶部评分鉴定,并且需要每种可接受的彩易福彩的至少两个独特的肽。

      结果

       L. Mexicana生命周期阶段的隔离和验证

      用于研究不同MRNA结合彩易福彩蛋白酶(MRBPOMES)的研究 L. Mexicana. 生命周期,对应于3个主要生命周期阶段的4个生物样品被分离和分子验证。这些是低通段( <P3),M199媒体培养衍生的Procyclic Promastigotes(“PCF”),Grace的媒体文化衍生的阶段春季春季(“META”),24小时后感染后(24小时PI)巨噬细胞衍生的AMASTIGOTES(“AMA(MØ)” ) 和 体内 Lesion衍生的Amastigotes(“AMA(LD)”; Fig. 1A)。使用不同分子标记物和生物区别特征的特定生命周期阶段验证寄生虫细胞,包括细胞周期复制状态,对人血清裂解和标记基因表达的抗性(Fig. 1B1D)。 PCF细胞培养的细胞周期分析在5×10中的中间日志6 细胞/ mL显示出高复制效率(S:19%,G2 / M:35%),对人血清的敏感性孵育并加强 组蛋白H4 (h4)转录表达( Fig. 1B, 1C, 和 1D)。我们介绍 组蛋白H4 (lmxm.36.0020)这里作为PCF阶段的新转录标记 L. Mexicana. 寄生虫,因为它在桑蝇衍生中的特异性表达 L.主要 PCF. cells (
      • Inbar E.
      • Hughitt V.K.
      • Dillon L.A.
      • Ghosh K.
      • el-说n.m.
      • 解雇D.L.
      莱山岛主要发育阶段的转录组在自然沙子飞行矢量中。
      )。在〜4×10处收获静止的Meta形式寄生虫7 细胞/ ml 7天在恩典的媒体中Postincation(如上所述)(
      • 罗杰斯米
      • Kropf P.
      • Choi B.S.
      • 狄龙r.
      • 波迪诺夫斯卡亚米。
      • 贝茨P.
      • Mülleri。
      嗜血管症感染的砂岩脱节的彩易福彩酚蛇蝇靶向宿主巨噬细胞的L-精氨酸代谢,以促进寄生虫存活。
      )通过减少复制和彩易福彩合成(
      • 解雇D.L.
      • da silva r.p.
      感染阶段Leishmania主要癌症的产生与细胞表面表达和发育调节糖脂的释放有关。
      )(S:3%; g2 / m:19%),对人体补体裂解的抗性(
      • Puentes S.M.
      • da silva r.p.
      • 解雇D.L.
      • 锤子c.h.
      • 木匠K.A.
      血清抗性阶段阶段Leishmania主要癌症是由于C5B-9的释放。
      )和提高表达 transcript (
      • 删除D.P.
      • 埃文斯K.J.
      • ivens a.c。
      • Aziz N.
      • 马戏团A.
      • Kaye下午
      • 史密斯D.F.
      莱山岛的比较表达分析:物种与不同宿主遗传背景中基因表达的调节。
      )(Fig. 1B, 1C, 和 1D)。细胞内的Amastigote-阶段寄生虫24小时感染后24小时(24小时,24小时)培养的J774.2巨噬细胞,AMA(MØ),或接种后4个月的小鼠臀部病变(
      • COOMBS G.H.
      • HART D.T.
      • Capaldo J.
      莱山岛 mexicana: drug sensitivities of promastigotes and transforming amastigotes.
      ),AMA(LD),具有抗性Meta细胞和如所述梯度纯化(实验程序)(
      • Paape D.
      • Barrios-Llerena M.E.
      • 勒碧汉T.
      • 麦凯L.
      • Aebischer T.
      凝胶免费分析彩易福彩细胞内吉尔曼墨西哥彩易福彩组。
      )。 24 H.P.I.选择定时作为RNA水平被改造并分化为溶酶体环境中的AMA(Mø)形式几乎完成(
      • Fiebig M.
      • 凯莉斯。
      • Gluenz E.
      比较生命周期转录组织对Leishmania墨西哥语言组注释进行了反转,并将染色体复制与脊椎动物的寄生刺激联系起来。
      )。通过电子显微镜(数据未显示)验证纯化的氨状阶段寄生虫,加强 amastin. (lmxm.08.0840.)mRNA表达和细胞循环分析,其显示相对于元细胞的复制效率提高(Fig. 1B1D)。值得注意的是,AMA(MØ)和AMA(LD)的FACS分析显示出近乎相同的细胞周期曲线,PCF之间的中间体和元复制效率(Fig. 1B)。
      图缩略图GR1.
      Fig. 1隔离和验证 L. Mexicana. lifecycle stages. A,累积增长曲线 L. Mexicana. 在M199(紫色)和Grace的媒体(绿色)。对阶段特异性测试了收获的丙炔(PCF,紫色圆圈)和富含富集的初始春季培养物(Meta,绿色圆圈)。富含富集的培养物用于感染永生化的巨噬细胞(J774.2MØS)和小鼠以产生AMA(Mø)和AMAS(LD)Amastigote形式。 AMASTIGOTES形式(24小时感染后(PI)为AMA(MØ)和4个月的AMA(LD)的PI)是梯度纯化的。 B,FACS分析比较PCF,Meta,AMA(Mø)和AMA(LD)细胞的DNA谱。细胞循环型材证明PCF具有高增殖性,META是相对静态的,并且不同的AMA群体显示出近相同的中间复制能力。 C,人的血清抗性表达寄生虫活性百分比(y 用人血清(H.S)或热灭活的人血清(H.I)处理的PCF(紫色)和Meta(绿色)寄生虫的轴)。 D,每个孤立的验证 L. Mexicana. 通过提高mRNA表达的阶段 组蛋白H4, amastin. 关系到 鼻儿 呈现为平均值±s.e的转录水平。从3个实验重复。进行单程Anova和Tukey的测试后; **p < 0.01, ***p < 0.001.

       在L. Mexicana Rbps的体内捕获

      Fig. 2A 图示了用于隔离MRBOMES的过程。实际上,高达91%的细胞显示出野生型形态后UV交联(XL),其中一小部分非交联(NONXL)寄生虫能够在120秒照射后恢复培养生长(Fig. 2B)。因此,选择该紫外线暴露的长度为mRNA互蛋白捕获实验,随后如前所述的mRNA(
      • Castello A.
      • Horos R.
      • Stein C.
      • Fischer B.
      • Eichelbaum K.
      • Steinmetz L.M.
      • Krijgsveld J.
      • 无尽的M.W.
      RNA互联蛋白捕获RNA结合蛋白的综合鉴定。
      )。针对大规模收获优化了所有实验条件,以分离足够的mRNA结合的蛋白(RBP)以进行每次重复的可靠,定量质谱。为了围绕这些分析,将MRBPOMES的相对富集与全细胞进行比较(
      • 郑h
      • 汤普森D.
      • 画家J.
      • O'Mara T.
      • Gorman M.
      • 马丁L.
      • Palles C.
      • 琼斯阿。
      • Buchanan D.D.
      • 赢得A.K.
      • 料斗J.
      • Jenkins M.
      • 林林
      • Newcomb P.A.
      • Gallinger S.
      • CONTI D.
      • 舒马赫F.
      • 凯西G.
      • 吉尔斯G.G.
      • Pharoah P.
      • Peto J.
      • Cox A.
      • Swerdlow A.
      • 沙发F.
      • Cunningham J.M.
      • 善良的E.L.
      • 温赫姆S.J.
      • Lambrechts D.
      • Fasching P.
      • Burwinkel B.
      • Brenner H.
      • Brauch H.
      • 常克劳德J.
      • Salvesen H.B.
      • 克里斯滕森五。
      • Darabi H.
      • 李杰。
      • 刘涛。
      • Lindblom A.
      • 大厅P.
      • de polanco m.e.
      • SANS M.
      • 卡拉克省A.
      • Castellvi-Bel S.
      • Rojas-Martinez A.
      • Aguiar JNR,S。
      • Teixeira M.R.
      • 催天上午
      • 丹尼斯J.
      • 奥顿G.
      • Proietto T.
      • Holliday E.
      • attia J.
      • 阿什顿K.
      • 斯科特r.j.
      • MCEVOY M.
      • Dowdy S.C.
      • Fridley B.L.
      • 韦尔斯小时。
      • Trovik J.
      • njolstadt.s.
      • 谢谢
      • 薄荷米
      • runnebaum i.
      • Hillemanns P.
      • DörkT.
      • amant f.
      • Schrauwen S.
      • 赫恩A.
      • Beckmann M.W.
      • Ekici A.
      • 南己K.
      • Meindl A.
      • Bolla M.K.
      • Michairidou K.
      • Tyrer J.P.
      • 王Q.
      • 艾哈迈德S.
      • HEALEY C.S.
      • 沙姆
      • Annibali D.
      • depeeuw J.
      • al-tassan n.a.
      • 哈里斯r.
      • Meyer B.F.
      • Whiffin N.
      • hosking f.j.
      • Kinanderley B.
      • Farrington S.M.
      • Timofeeva M.
      • Tenesa A.
      • 坎贝尔H.
      • Haile R.W.
      • Hodgson S.
      • Carvajal-Carmona L.
      • Cheadle J.P.
      • 伊斯顿D.
      • 邓禄普米
      • 哈尔斯顿r.
      • 痉颤A.
      • Tomlinson I.
      Genome-宽协会研究的荟萃分析鉴定了SH2B3和TSHZ1附近的结直肠癌和子宫内膜癌的常见敏感性多态性。
      )来自每个生命周期阶段的彩易福彩组; PCF,Meta,AMA(MØ)。所有肽池均在侧圈融合的一式三份中同时评价TM值 质谱仪定量地确定MRBPOMES和WC彩易福彩蛋白蛋白肽的相对强度。通过相对洗脱评估寡核苷酸(DT)的纯度(DT)的XL和NONX1 mRNA 18S 与组成型表达的核糖体RNA相比 n-myristoyltransferase. (鼻儿; LMXM.31.0080)MRNA作为总体mRNA恢复的参考(Fig. 2C)(
      • 价格H.P.
      • Guther M.L.
      • Ferguson M.A.
      • 史密斯D.F.
      Myristoyl-CoA:彩易福彩N-Myristoyltransferase脱落在锥虫中导致无流动和内吞的缺陷。
      )。结果显示出可忽略不计的放大 18S RRNA相对于输入和大部分 鼻儿 MRNA在聚RNA分离后恢复。

       全蜂窝和RNA结合的主要Leishmania生命周期阶段

      通过高分辨率质谱法分析捕获的RBP肽,通过每种彩易福彩鉴定为每种彩易福彩的2个独特肽的过滤器并使用肽前体离子强度定量(p ≤0.05)。在XL样品中鉴定了1407个RBP(PCF,Meta,AMA(Mø),AMA(LD)),其中294个彩易福彩显着富集在不同的阶段,而1403 Rbps与非X肽样品中分离(PCF,Meta, AMA(Mø)),具有216个彩易福彩显示特定阶段的关联(Fig. 2A)。此数字与其他真核生物系统中的当前RBP编号一致(
      • 无尽的M.W.
      • Castello A.
      • Schwarzl T.
      • Preiss T.
      一个勇敢的RNA结合彩易福彩。
      )。 4个不同的RBPomes 莱山岛 生命周期阶段已被汇总;相当于4种不同的哺乳动物细胞类型,我们的实验方法消除了离子标记引入的潜在竞争和定量限制(实验程序)。此外,全细胞的质谱(
      • 郑h
      • 汤普森D.
      • 画家J.
      • O'Mara T.
      • Gorman M.
      • 马丁L.
      • Palles C.
      • 琼斯阿。
      • Buchanan D.D.
      • 赢得A.K.
      • 料斗J.
      • Jenkins M.
      • 林林
      • Newcomb P.A.
      • Gallinger S.
      • CONTI D.
      • 舒马赫F.
      • 凯西G.
      • 吉尔斯G.G.
      • Pharoah P.
      • Peto J.
      • Cox A.
      • Swerdlow A.
      • 沙发F.
      • Cunningham J.M.
      • 善良的E.L.
      • 温赫姆S.J.
      • Lambrechts D.
      • Fasching P.
      • Burwinkel B.
      • Brenner H.
      • Brauch H.
      • 常克劳德J.
      • Salvesen H.B.
      • 克里斯滕森五。
      • Darabi H.
      • 李杰。
      • 刘涛。
      • Lindblom A.
      • 大厅P.
      • de polanco m.e.
      • SANS M.
      • 卡拉克省A.
      • Castellvi-Bel S.
      • Rojas-Martinez A.
      • Aguiar JNR,S。
      • Teixeira M.R.
      • 催天上午
      • 丹尼斯J.
      • 奥顿G.
      • Proietto T.
      • Holliday E.
      • attia J.
      • 阿什顿K.
      • 斯科特r.j.
      • MCEVOY M.
      • Dowdy S.C.
      • Fridley B.L.
      • 韦尔斯小时。
      • Trovik J.
      • njolstadt.s.
      • 谢谢
      • 薄荷米
      • runnebaum i.
      • Hillemanns P.
      • DörkT.
      • amant f.
      • Schrauwen S.
      • 赫恩A.
      • Beckmann M.W.
      • Ekici A.
      • 南己K.
      • Meindl A.
      • Bolla M.K.
      • Michairidou K.
      • Tyrer J.P.
      • 王Q.
      • 艾哈迈德S.
      • HEALEY C.S.
      • 沙姆
      • Annibali D.
      • depeeuw J.
      • al-tassan n.a.
      • 哈里斯r.
      • Meyer B.F.
      • Whiffin N.
      • hosking f.j.
      • Kinanderley B.
      • Farrington S.M.
      • Timofeeva M.
      • Tenesa A.
      • 坎贝尔H.
      • Haile R.W.
      • Hodgson S.
      • Carvajal-Carmona L.
      • Cheadle J.P.
      • 伊斯顿D.
      • 邓禄普米
      • 哈尔斯顿r.
      • 痉颤A.
      • Tomlinson I.
      Genome-宽协会研究的荟萃分析鉴定了SH2B3和TSHZ1附近的结直肠癌和子宫内膜癌的常见敏感性多态性。
      ) L. Mexicana. 每个阶段的彩易福彩部分(PCF,Meta,AMA(Mø))产生2403个彩易福彩,其中1174个在一个生命周期阶段显着富集(Fig. 2A)。这些数据可用 补充表S1。确认使用源自独特肽强度的相对彩易福彩定量的主要成分分析(PCA)用于检查不同生物样品与复制之间的可变性之间的相关性(Fig. 3A)。值得注意的是,XL,NONXL和WC彩易福彩中的离散生命周期内的三份彩易福彩组学样本簇在复制和结果的再现性之间显示出低差异(Fig. 3A)。这些数据可在每个生命周期阶段推断可靠和不同的彩易福彩富集和身份。按照FACS分析 Fig. 1B,AMA(LD)XL mRNA结合彩易福彩组的PCA值最像AMA(mø)XL的那样,验证AMA(Mø)的使用以进行后续MRNP分析。当组合时,WC彩易福彩组单独群集与XL和nonXL mRBPomes相比,表明分离的限制性商业惯例表示从整个细胞的彩易福彩组具有不同相对强度的富集级分(补充图S1A)。支持MRBPome的有效性,PCA分析表明,无论生命周期阶段如何,肽阶段更像肽标识和强度比任何mRNA选定的彩易福彩素(MRBPOMES)更像彩易福彩素。
      图缩略图GR3.
      Fig. 3彩易福彩素之间的可变性和富集富集。 A,使用来自独特肽强度的相对彩易福彩定量的主成分分析(PCA)用于检查不同生物样品与复制之间的变异性之间的相关性。值得注意的是,在离散的生命周期内聚集在XL,非XL和WC彩易福彩中的三次彩易福彩组学样本簇,其在重复和结果的再现性之间显示出低方差。颜色表示样品的生命周期阶段:PCF(红色),元(绿色),AMA(MØ)(蓝色)和AMA(LD)(黑色)。 XL样本(X)是PX = PCF XL,MX = Meta XL,AX = AMA(MØ)XL和LX = AMA(LD)XL。 NONXL样品(O)是PN = PCF NONXL,Mn = Meta NONXL和AN = AMA(MØ)非XL。 WC样品(δ)是 p = PCF WC,M = Meta WC和A = AMA(MØ)WC。 B,在特定的234 RBPS基因本体中(GO)术语富集分析再次表明这一具体情况 L. Mexicana. 通过以下顺序:核糖体的结构组分(p = 4.67e−10),RNA结合(p = 1.25e−6),核酸结合(p = 7.2e−4)表示特定于此的分子函数子级 L. Mexicana. RBPOME在与RNA相关的术语中压倒性地富集。红线表示 p ≤ 0.05.
      我们的RNA结合彩易福彩组(XL,NONX1)的特异性相对于全细胞(
      • 郑h
      • 汤普森D.
      • 画家J.
      • O'Mara T.
      • Gorman M.
      • 马丁L.
      • Palles C.
      • 琼斯阿。
      • Buchanan D.D.
      • 赢得A.K.
      • 料斗J.
      • Jenkins M.
      • 林林
      • Newcomb P.A.
      • Gallinger S.
      • CONTI D.
      • 舒马赫F.
      • 凯西G.
      • 吉尔斯G.G.
      • Pharoah P.
      • Peto J.
      • Cox A.
      • Swerdlow A.
      • 沙发F.
      • Cunningham J.M.
      • 善良的E.L.
      • 温赫姆S.J.
      • Lambrechts D.
      • Fasching P.
      • Burwinkel B.
      • Brenner H.
      • Brauch H.
      • 常克劳德J.
      • Salvesen H.B.
      • 克里斯滕森五。
      • Darabi H.
      • 李杰。
      • 刘涛。
      • Lindblom A.
      • 大厅P.
      • de polanco m.e.
      • SANS M.
      • 卡拉克省A.
      • Castellvi-Bel S.
      • Rojas-Martinez A.
      • Aguiar JNR,S。
      • Teixeira M.R.
      • 催天上午
      • 丹尼斯J.
      • 奥顿G.
      • Proietto T.
      • Holliday E.
      • attia J.
      • 阿什顿K.
      • 斯科特r.j.
      • MCEVOY M.
      • Dowdy S.C.
      • Fridley B.L.
      • 韦尔斯小时。
      • Trovik J.
      • njolstadt.s.
      • 谢谢
      • 薄荷米
      • runnebaum i.
      • Hillemanns P.
      • DörkT.
      • amant f.
      • Schrauwen S.
      • 赫恩A.
      • Beckmann M.W.
      • Ekici A.
      • 南己K.
      • Meindl A.
      • Bolla M.K.
      • Michairidou K.
      • Tyrer J.P.
      • 王Q.
      • 艾哈迈德S.
      • HEALEY C.S.
      • 沙姆
      • Annibali D.
      • depeeuw J.
      • al-tassan n.a.
      • 哈里斯r.
      • Meyer B.F.
      • Whiffin N.
      • hosking f.j.
      • Kinanderley B.
      • Farrington S.M.
      • Timofeeva M.
      • Tenesa A.
      • 坎贝尔H.
      • Haile R.W.
      • Hodgson S.
      • Carvajal-Carmona L.
      • Cheadle J.P.
      • 伊斯顿D.
      • 邓禄普米
      • 哈尔斯顿r.
      • 痉颤A.
      • Tomlinson I.
      Genome-宽协会研究的荟萃分析鉴定了SH2B3和TSHZ1附近的结直肠癌和子宫内膜癌的常见敏感性多态性。
      )通过基因本体学(GO)富集分析进一步证实彩易福彩组,其证明了富集的术语(p ≤0.05)来自分子函数子集可靠地RNA相关;仅限于核糖体成分,RNA结合和核酸结合与翻译相关因素的含量略微略微少(Fig. 3B)。尽管有些避免的注释比例 L. Mexicana. 彩易福彩组有1410个Rbps的519个假设彩易福彩,分离的总MRBPOME内的已知彩易福彩标识表明适当的富集。
      XL.内RBP的人数和标识 相对 非XL MRBPOME样品显着相似,但相对肽强度差异富集(补充图。S2)。这种差异富集是因为X1样品中的RBP缔合的强度基于直接氨基酸:MRNA相互作用时形成的共价键(254nm),而NONXL彩易福彩:mRNA关联依赖于相对亲和力mRNA的每个RBP(
      • 格兰曼S.
      • Petfalski E.
      • Swiatkowska A.
      • Tollervey D.
      通过系统分析RNA-彩易福彩交联裂解40S核糖体亚基结构。
      )。因此,尽管相对于非XL样品大大富集(≥10倍)的整体XL彩易福彩,但是富含NONXL RBPOME用于RNA螺旋酶,其在夹紧构象中表现出特别强的结合(
      • iwasaki s.
      • 地板S.N.
      • Ingolia N.T.
      涂料将死箱蛋白EIF4A转化为序列选择性的翻译压缩机。
      )。彩易福彩身份在XL和NONXL RBPOM之间压倒性地保守的事实支持我们的结果和偏离先前的酮孢子体研究,这些研究使用非Xl样品作为阴性对照(
      • Lueong S.
      • Merce C.
      • Fischer B.
      • Hoheisel J.D.
      • Erben E.D.
      基因表达调控网络在锥虫瘤Brucei:洞察MRNA结合彩易福彩组的作用。
      )。精致的紫外线交联结合了围灰融合的高灵敏度TM值 质谱系统可以更深,量化的非XL的识别,而不竞争更丰富的XL RBPOME。重要的是,独立运行每个样品,无标记和同时防止用于离子标签和信号淬火的肽竞争,尽管XL的总体强度显着提高了定量比较。 相对 非XL MRBPOME样品。我们通过缺乏污染rRNA水平进一步验证了所有mRNA收获(WC,XL和NONXL)的严格性(Fig. 1C)。

       彩易福彩组学比较揭示了阶段特异性的区别

      使用LOG比较每个阶段的过滤的WC,NONXL和XL彩易福彩组2 持续肽离子强度的变化≥106 生物样品中,分离阶段的阶段的因素(补充图。S2)。重要的是,通过强度过滤能够可视化不同的彩易福彩富集,但可能排除在该阈值以下功能相关的彩易福彩。 WC彩易福彩蛋白的比较产生69,50和27个彩易福彩,其分别在PCF,Meta或AMA(Mø)阶段寄生虫中特异性富集,其中大多数是所有生命周期阶段的常见。相反,大多数mRNA结合彩易福彩对所有生命周期阶段不常见,但在非氧化物和XL RBPOMES中差异富集和阶段调节(补充图。S2A)。提供了一种互补的检查该数据的方法 补充图。S2B;比较每个生命周期阶段的WC,XL和NONXL彩易福彩的相同彩易福彩富集分析(补充图。S2B)。
      预测的含RBD彩易福彩组之间的比较 L. Mexicana. 基因组(Tritrypdb.org)和孤立的RBPOME(XL)突出了一些有趣的区别(Fig. 4A)。在分离的RBPOME中显而易见的锌指结构域蛋白的显着减少; CCCH结构域彩易福彩富集的50%降低了8%至4%。这与质谱中锌指蛋白的相对“沉默”一致。支持我们数据的特异性,从高度复制的PCF阶段隔离的MRBOMES显示出基础翻译机械的RBP数量大幅增加。总体而言,在我们的RBPOMO中检测到整个基因组中具有RBD的预测蛋白的31%。对此的最可能解释是其中的多个时间点 L. Mexicana. 生命周期和 体内 超出本研究范围的条件。
      图缩略图GR4.
      Fig. 4L. Mexicana. 生命周期整个细胞和RBPOME比较. A,预测中含有常见的RNA结合结构域(RBD)的彩易福彩数量 L. Mexicana. 提出了彩易福彩组(Tritrypdb.org)和XL-RBPOME。在总彩易福彩组中的8144个基因中的494个基因中的8144个基因,XL-RBPome中的1407个蛋白中的155个含有已知的RBD。标记为“其他”的域类代表具有额外的彩易福彩,未在图中单独列出的彩易福彩,或者在已知的RBD和“基础”蛋白的弱保护中,并且“基础”彩易福彩具有与平移和拼接机械的同源性。 RBPOME RBD总计高于识别的RBP的数量,因为单个彩易福彩中存在多个域类。 B,Volcano地块是在Python使用的 p 通过进行独立的T检验而导出的值(在第1阶段3重复 相对 3阶段2)复制。由于数据可视化,因此没有进行多次测试。日志2(FC)is log2((平均exp。条件2 + 1)/(平均表达条件1 + 1))。红线表示 p ≤0.05;上述彩易福彩标识显着富集在一个生命周期阶段。蓝色圆圈表示在此阈值以下的身份,绿色上方。红色圆圈表示-5的彩易福彩< log2(FC)<5和橙色圆圈表示具有强度≥10的高度表达因素6.
      更紧密地比较生命周期之间的mRNA结合的彩易福彩彩易福彩,而不排除具有较低强度的RBP,使用日志检查每个阶段的XL彩易福彩2 折叠肽离子强度的变化(Fig. 4B)。火山图代表了丰富的变化(x 轴) 相对 significance (y 在XL生物样本中捕获的个体RBPS的轴)(Fig. 4B)。强度≥10的彩易福彩6 分析了 Fig. 4A 可以在橙色中观察到 相对 剩下的身份。显而易见的是,这些强度≥10的彩易福彩6 弥补整体少数彩易福彩标识,用上面的红线上方与比较生命周期之间的mRNA显着不同。绿色的身份减少强度(≤106)彩易福彩与mRNA结合的彩易福彩更大的阶段特异性变化(日志2(FC)< −5 or >5)。与PCF级的高分率特征一致(Fig. 1B),PCF特定的XL RBPOME是相对于静态元阶段XL MRBPOME的平移中隐含的因素。有趣的是,在富含元富集的XL RBPomes之间观察到相对富集中的大小区别 相对 AMA(MØ),仅24小时暂时分开。这些RBP可能隐含在分化潜力中(
      • ada ad ..
      • Afanasiev S.
      • AIDALA C.
      • ajitanand n.n.
      • Akiba Y.
      • 等等。
      在激进的高分性3He + Au碰撞中的椭圆和三角流量的测量(S(nn))= 200 gev。
      )和发酵AMA(mø)的Amastigogenesis。值得注意的是,尽管不成时生的巨噬细胞系列的宿主环境不同,AMA阶段样本尽管存在不同的寄主环境,但是XL MRBPOMES的最小区别 相对 一个 体内 损伤4个月后感染后(Fig. 4B)。该发现对比高度富集的AMA(MØ)和AMA(LD)RBPOMES的VENN图比较(Fig. 4A)并建议虽然少数高度丰富因素的身份(强度> 106)是不同的,AMA(MØ)和AMA(LD)的总体RBPOME非常相似。结合近乎相同的细胞周期曲线(Fig. 1B),AMA(MØ)和AMA(LD)的火山绘图谱(Fig. 4B)支持培养的巨噬细胞(Møs)作为调查潜力的有用模型 trans-regulator L. Mexicana. 差异化 体内.

       mRNA和彩易福彩表达与RBP的RNA结合活性

      为了验证彩易福彩组学结果,生物化学结果,特定的感兴趣的RBP是内源性HA标记的,以检查由内源3'UTRS控制的表达动态。 Western印迹确认特异性蛋白表达,其对应于RBP16和UBP1的质谱结果(补充图S3)。与mRNA表达相比,这些RBP的蛋白表达显示了有趣的差异。虽然DRBD2显示转录物和彩易福彩水平之间的相对紧密相关性,但SUB2,RBP16,DRBD3和UBP1蛋白的水平对编码转录水平不相应良好(补充图S3)。
      这导致全面检查先前观察到的现象 莱山岛 SPP。彩易福彩和mRNA水平不对(
      • 拉哈维
      • Sivam D.
      • VOLPIN H.
      • ronen m.
      • 楼郡
      • 绿色A.
      • 荷兰N.
      • Kuzyk M.
      • 博赫斯C.
      • Zilberstein D.
      • Myler P.J.
      多水平的基因调控介导细胞内病原菌利山蛋白酶的分化。
      )。鉴于我们的彩易福彩组学结果的规模,我们能够使用黄土算法的GLM(广义线性模型)配合滑动窗口方法来可视化我们的WC(紫色)和XL(绿色)彩易福彩组学数据相对于已发表的转录组之间的电位相关性数据 (
      • Fiebig M.
      • 凯莉斯。
      • Gluenz E.
      比较生命周期转录组织对Leishmania墨西哥语言组注释进行了反转,并将染色体复制与脊椎动物的寄生刺激联系起来。
      )在AMA(MØ)和PCF生命周期阶段(Fig. 5A)。由于可用的转录组数据,这种比较仅限于两个生命周期阶段(
      • Fiebig M.
      • 凯莉斯。
      • Gluenz E.
      比较生命周期转录组织对Leishmania墨西哥语言组注释进行了反转,并将染色体复制与脊椎动物的寄生刺激联系起来。
      )但是,较低的整体Pearson的相关值表明整个细胞(r2 = 0.14)和RNA绑定(r2 = 0.0057)彩易福彩组强度对应于转录物表达的水平。虽然转录组和全细胞彩易福彩组学数据之间的相关性在PCF阶段细胞中明显明显,但比AMA更加平移(Fig. 1B),RNA结合蛋白的转录表达与其随后与RNA相关性之间存在可忽略的联系(Fig. 5A)。这些结果表明了 L. Mexicana. 寄生虫,RNA水平不是全细胞表达的强预测因子或彩易福彩的RNA结合潜力。
      这种比较刺激了WC RBP表达如何与RNA结合电位(XL)相关的问题。 Fig. 5B 图示了线性回归配合(LM [WC〜3]),用于检查在我们的全细胞蛋白表达中量化的彩易福彩的RNA结合电位(XL RBPOME; X轴)(WC RBPOME; y 轴)符合XL / WC比率LM [WC ~XL]。由于我们的方法不排除我们调查中的翻译机械的隔离,所以翻译因子的高表达水平影响了该彩易福彩组学分析。虽然具有高复制率的阶段表明彩易福彩表达之间的相关性更强(
      • 郑h
      • 汤普森D.
      • 画家J.
      • O'Mara T.
      • Gorman M.
      • 马丁L.
      • Palles C.
      • 琼斯阿。
      • Buchanan D.D.
      • 赢得A.K.
      • 料斗J.
      • Jenkins M.
      • 林林
      • Newcomb P.A.
      • Gallinger S.
      • CONTI D.
      • 舒马赫F.
      • 凯西G.
      • 吉尔斯G.G.
      • Pharoah P.
      • Peto J.
      • Cox A.
      • Swerdlow A.
      • 沙发F.
      • Cunningham J.M.
      • 善良的E.L.
      • 温赫姆S.J.
      • Lambrechts D.
      • Fasching P.
      • Burwinkel B.
      • Brenner H.
      • Brauch H.
      • 常克劳德J.
      • Salvesen H.B.
      • 克里斯滕森五。
      • Darabi H.
      • 李杰。
      • 刘涛。
      • Lindblom A.
      • 大厅P.
      • de polanco m.e.
      • SANS M.
      • 卡拉克省A.
      • Castellvi-Bel S.
      • Rojas-Martinez A.
      • Aguiar JNR,S。
      • Teixeira M.R.
      • 催天上午
      • 丹尼斯J.
      • 奥顿G.
      • Proietto T.
      • Holliday E.
      • attia J.
      • 阿什顿K.
      • 斯科特r.j.
      • MCEVOY M.
      • Dowdy S.C.
      • Fridley B.L.
      • 韦尔斯小时。
      • Trovik J.
      • njolstadt.s.
      • 谢谢
      • 薄荷米
      • runnebaum i.
      • Hillemanns P.
      • DörkT.
      • amant f.
      • Schrauwen S.
      • 赫恩A.
      • Beckmann M.W.
      • Ekici A.
      • 南己K.
      • Meindl A.
      • Bolla M.K.
      • Michairidou K.
      • Tyrer J.P.
      • 王Q.
      • 艾哈迈德S.
      • HEALEY C.S.
      • 沙姆
      • Annibali D.
      • depeeuw J.
      • al-tassan n.a.
      • 哈里斯r.
      • Meyer B.F.
      • Whiffin N.
      • hosking f.j.
      • Kinanderley B.
      • Farrington S.M.
      • Timofeeva M.
      • Tenesa A.
      • 坎贝尔H.
      • Haile R.W.
      • Hodgson S.
      • Carvajal-Carmona L.
      • Cheadle J.P.
      • 伊斯顿D.
      • 邓禄普米
      • 哈尔斯顿r.
      • 痉颤A.
      • Tomlinson I.
      Genome-宽协会研究的荟萃分析鉴定了SH2B3和TSHZ1附近的结直肠癌和子宫内膜癌的常见敏感性多态性。
      )和RNA结合(XL),总体相关性低于预期(Fig. 5B)。数据来自 图。 1B4B 还显示与平移活动相关的影响,因为AMA细胞是PCF和META之间的中介在复制和转化效率之间,RNA结合蛋白表达几乎没有相关性(
      • 郑h
      • 汤普森D.
      • 画家J.
      • O'Mara T.
      • Gorman M.
      • 马丁L.
      • Palles C.
      • 琼斯阿。
      • Buchanan D.D.
      • 赢得A.K.
      • 料斗J.
      • Jenkins M.
      • 林林
      • Newcomb P.A.
      • Gallinger S.
      • CONTI D.
      • 舒马赫F.
      • 凯西G.
      • 吉尔斯G.G.
      • Pharoah P.
      • Peto J.
      • Cox A.
      • Swerdlow A.
      • 沙发F.
      • Cunningham J.M.
      • 善良的E.L.
      • 温赫姆S.J.
      • Lambrechts D.
      • Fasching P.
      • Burwinkel B.
      • Brenner H.
      • Brauch H.
      • 常克劳德J.
      • Salvesen H.B.
      • 克里斯滕森五。
      • Darabi H.
      • 李杰。
      • 刘涛。
      • Lindblom A.
      • 大厅P.
      • de polanco m.e.
      • SANS M.
      • 卡拉克省A.
      • Castellvi-Bel S.
      • Rojas-Martinez A.
      • Aguiar JNR,S。
      • Teixeira M.R.
      • 催天上午
      • 丹尼斯J.
      • 奥顿G.
      • Proietto T.
      • Holliday E.
      • attia J.
      • 阿什顿K.
      • 斯科特r.j.
      • MCEVOY M.
      • Dowdy S.C.
      • Fridley B.L.
      • 韦尔斯小时。
      • Trovik J.
      • njolstadt.s.
      • 谢谢
      • 薄荷米
      • runnebaum i.
      • Hillemanns P.
      • DörkT.
      • amant f.
      • Schrauwen S.
      • 赫恩A.
      • Beckmann M.W.
      • Ekici A.
      • 南己K.
      • Meindl A.
      • Bolla M.K.
      • Michairidou K.
      • Tyrer J.P.
      • 王Q.
      • 艾哈迈德S.
      • HEALEY C.S.
      • 沙姆
      • Annibali D.
      • depeeuw J.
      • al-tassan n.a.
      • 哈里斯r.
      • Meyer B.F.
      • Whiffin N.
      • hosking f.j.
      • Kinanderley B.
      • Farrington S.M.
      • Timofeeva M.
      • Tenesa A.
      • 坎贝尔H.
      • Haile R.W.
      • Hodgson S.
      • Carvajal-Carmona L.
      • Cheadle J.P.
      • 伊斯顿D.
      • 邓禄普米
      • 哈尔斯顿r.
      • 痉颤A.
      • Tomlinson I.
      Genome-宽协会研究的荟萃分析鉴定了SH2B3和TSHZ1附近的结直肠癌和子宫内膜癌的常见敏感性多态性。
      )和RNA关联(XL)在翻译抑制的静态荟萃寄生虫(Fig. 5B)。这些数据表明RNA结合蛋白的表达(
      • 郑h
      • 汤普森D.
      • 画家J.
      • O'Mara T.
      • Gorman M.
      • 马丁L.
      • Palles C.
      • 琼斯阿。
      • Buchanan D.D.
      • 赢得A.K.
      • 料斗J.
      • Jenkins M.
      • 林林
      • Newcomb P.A.
      • Gallinger S.
      • CONTI D.
      • 舒马赫F.
      • 凯西G.
      • 吉尔斯G.G.
      • Pharoah P.
      • Peto J.
      • Cox A.
      • Swerdlow A.
      • 沙发F.
      • Cunningham J.M.
      • 善良的E.L.
      • 温赫姆S.J.
      • Lambrechts D.
      • Fasching P.
      • Burwinkel B.
      • Brenner H.
      • Brauch H.
      • 常克劳德J.
      • Salvesen H.B.
      • 克里斯滕森五。
      • Darabi H.
      • 李杰。
      • 刘涛。
      • Lindblom A.
      • 大厅P.
      • de polanco m.e.
      • SANS M.
      • 卡拉克省A.
      • Castellvi-Bel S.
      • Rojas-Martinez A.
      • Aguiar JNR,S。
      • Teixeira M.R.
      • 催天上午
      • 丹尼斯J.
      • 奥顿G.
      • Proietto T.
      • Holliday E.
      • attia J.
      • 阿什顿K.
      • 斯科特r.j.
      • MCEVOY M.
      • Dowdy S.C.
      • Fridley B.L.
      • 韦尔斯小时。
      • Trovik J.
      • njolstadt.s.
      • 谢谢
      • 薄荷米
      • runnebaum i.
      • Hillemanns P.
      • DörkT.
      • amant f.
      • Schrauwen S.
      • 赫恩A.
      • Beckmann M.W.
      • Ekici A.
      • 南己K.
      • Meindl A.
      • Bolla M.K.
      • Michairidou K.
      • Tyrer J.P.
      • 王Q.
      • 艾哈迈德S.
      • HEALEY C.S.
      • 沙姆
      • Annibali D.
      • depeeuw J.
      • al-tassan n.a.
      • 哈里斯r.
      • Meyer B.F.
      • Whiffin N.
      • hosking f.j.
      • Kinanderley B.
      • Farrington S.M.
      • Timofeeva M.
      • Tenesa A.
      • 坎贝尔H.
      • Haile R.W.
      • Hodgson S.
      • Carvajal-Carmona L.
      • Cheadle J.P.
      • 伊斯顿D.
      • 邓禄普米
      • 哈尔斯顿r.
      • 痉颤A.
      • Tomlinson I.
      Genome-宽协会研究的荟萃分析鉴定了SH2B3和TSHZ1附近的结直肠癌和子宫内膜癌的常见敏感性多态性。
      )不是其RNA结合(XL)的强指标。重要的是,这意味着另一种调节水平调节或改变RBP的RNA结合潜力。鉴于该系统中阶段监管后翻译后修改的强有力证据(
      • 楼郡
      • Gherardini p.f.
      • Helmer-Citterich M.
      • spath g.f.
      • Myler P.J.
      • Zilberstein D.
      莱山岛分化的调节动态:解构信号和鉴定磷酸化趋势。
      ),PTM可能有助于RNA结合潜力。

       验证L. Mexicana的新型RNA结合蛋白

      为了在功能上验证我们的MRBPOME,先前无声的多个RBP候选者 莱山岛 mexicana 内源性标记(Fig. 6A),测序RNA免疫沉淀(RIP)和关联转录物(数据未显示)。每次RBP的顶级预算目标转录物被验证并通过额外的次裂口进行特定于舞台特定协会(Fig. 6A)和随后的全细胞QRTPCR(Fig. 6B) 相对 RBP相关的转录水平(Fig. 6C)在PCF和Meta阶段寄生虫中。正如预期的那样,候选RBPS与特定的转录靶池相关联,该关联可以是阶段调节的。感兴趣的是,一些转录物靶标在RBPS和mRNA - 亲和力的阶段特异性波动之间可以是目标特异性的。值得注意的是,在PCF和Meta阶段寄生虫之间以相对恒定的水平表达了更有趣的RBP候选者GAPDH蛋白,但在这些阶段中选择了不同的转录物靶池。这可能表明,可以以定制的方式改变给定RBP至结合mRNA的可用性,以通过特异性方式调节其特异性,而不是RNA结合能力的简单波动。或者,并且不排他地,可能是MRNA内的调节元件的结构和暴露在生命周期期间的mRNA靶向变化。总体而言,该分子数据支持并扩展我们的生物信息结果,即给定生命周期阶段中RNA结合蛋白的整个细胞表达并不能保证其与靶转录物的关系。相反,RBP表达仅仅建立了结合和调节mRNA的可能性,然后进行细胞上下文。
      图缩略图GR6.
      Fig. 6验证小说 L. Mexicana. RBPs. A,内源标记的RBP候选的全细胞裂解物(输入)和免疫沉淀(洗脱)的彩易福彩印迹(抗HA)和免疫沉淀(洗脱)显示了PCF和Meta阶段的特异性分离。 B,候选转录靶标的全细胞表达显示在PCF和Meta阶段,标准化为 鼻儿 转录表达。 C,Ha-RBP RIP-SECTRING MRNA水平相对于WC水平显示(B)对于每个靶标RNA。所有QRTPCR数据都显示为平均值±S.E.从3个生物重复。日志和固定相样品之间的双向ANOVA测试和Bonferroni表示一些与某些RBPS的目标转录物的阶段调节关联; *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001。 nd =未检测到。

      讨论

      基因调节 莱山岛 SPP。寄生虫是压倒性后转录,因为基因组成型在多级串联阵列中(
      • De Pablos L.M.
      • ferreira t.r.
      • Walrad P.B.
      莱山岛生命周期进展的发育分化:转录后控制进行管弦乐队。
      )。尽管强烈强调 trans调节因子作为主要基因调节剂,在这些寄生虫中的表征或验证了很少。在这里,我们呈现了MRNA结合彩易福彩蛋白酶的全面定量列表以及3个主要生命周期阶段的全细胞彩易福彩; procyclic promastigotes.,阶段春季春季和amastigote阶段 L. Mexicana.。我们通过公开标准分离和分子验证了不同的阶段,包括定制介质的生长,复制效率,对人血清相对抗性和阶段特异性基因标志物的提高(
      • 罗杰斯米
      • Kropf P.
      • Choi B.S.
      • 狄龙r.
      • 波迪诺夫斯卡亚米。
      • 贝茨P.
      • Mülleri。
      嗜血管症感染的砂岩脱节的彩易福彩酚蛇蝇靶向宿主巨噬细胞的L-精氨酸代谢,以促进寄生虫存活。
      ,
      • 解雇D.L.
      • da silva r.p.
      感染阶段Leishmania主要癌症的产生与细胞表面表达和发育调节糖脂的释放有关。
      ,
      • 删除D.P.
      • 埃文斯K.J.
      • ivens a.c。
      • Aziz N.
      • 马戏团A.
      • Kaye下午
      • 史密斯D.F.
      莱山岛的比较表达分析:物种与不同宿主遗传背景中基因表达的调节。
      ,
      • Puentes S.M.
      • da silva r.p.
      • 解雇D.L.
      • 锤子c.h.
      • 木匠K.A.
      血清抗性阶段阶段Leishmania主要癌症是由于C5B-9的释放。
      )。因此,我们提出了一个全面的更新方法,用于获得大量验证,不同的验证 L. Mexicana. 生命周期阶段为研究界提供有用的见解。不同阶段的彩易福彩蛋白彩易福彩表现出显着的蛋白表达多样性,与他们居住的不同环境。细胞型特异性基因表达在寄生中特别常见,作为一个生存在一个生命周期阶段的键的彩易福彩可以代表下一个脆弱性。我们在此出现最重要的综合RNA结合(XL,NONXL)和全细胞(
      • 郑h
      • 汤普森D.
      • 画家J.
      • O'Mara T.
      • Gorman M.
      • 马丁L.
      • Palles C.
      • 琼斯阿。
      • Buchanan D.D.
      • 赢得A.K.
      • 料斗J.
      • Jenkins M.
      • 林林
      • Newcomb P.A.
      • Gallinger S.
      • CONTI D.
      • 舒马赫F.
      • 凯西G.
      • 吉尔斯G.G.
      • Pharoah P.
      • Peto J.
      • Cox A.
      • Swerdlow A.
      • 沙发F.
      • Cunningham J.M.
      • 善良的E.L.
      • 温赫姆S.J.
      • Lambrechts D.
      • Fasching P.
      • Burwinkel B.
      • Brenner H.
      • Brauch H.
      • 常克劳德J.
      • Salvesen H.B.
      • 克里斯滕森五。
      • Darabi H.
      • 李杰。
      • 刘涛。
      • Lindblom A.
      • 大厅P.
      • de polanco m.e.
      • SANS M.
      • 卡拉克省A.
      • Castellvi-Bel S.
      • Rojas-Martinez A.
      • Aguiar JNR,S。
      • Teixeira M.R.
      • 催天上午
      • 丹尼斯J.
      • 奥顿G.
      • Proietto T.
      • Holliday E.
      • attia J.
      • 阿什顿K.
      • 斯科特r.j.
      • MCEVOY M.
      • Dowdy S.C.
      • Fridley B.L.
      • 韦尔斯小时。
      • Trovik J.
      • njolstadt.s.
      • 谢谢
      • 薄荷米
      • runnebaum i.
      • Hillemanns P.
      • DörkT.
      • amant f.
      • Schrauwen S.
      • 赫恩A.
      • Beckmann M.W.
      • Ekici A.
      • 南己K.
      • Meindl A.
      • Bolla M.K.
      • Michairidou K.
      • Tyrer J.P.
      • 王Q.
      • 艾哈迈德S.
      • HEALEY C.S.
      • 沙姆
      • Annibali D.
      • depeeuw J.
      • al-tassan n.a.
      • 哈里斯r.
      • Meyer B.F.
      • Whiffin N.
      • hosking f.j.
      • Kinanderley B.
      • Farrington S.M.
      • Timofeeva M.
      • Tenesa A.
      • 坎贝尔H.
      • Haile R.W.
      • Hodgson S.
      • Carvajal-Carmona L.
      • Cheadle J.P.
      • 伊斯顿D.
      • 邓禄普米
      • 哈尔斯顿r.
      • 痉颤A.
      • Tomlinson I.
      Genome-宽协会研究的荟萃分析鉴定了SH2B3和TSHZ1附近的结直肠癌和子宫内膜癌的常见敏感性多态性。
      )彩易福彩彩易福彩可以使用 莱山岛 寄生虫作为研究界的重要资源。
      几种出版物以前描述了生命周期的彩易福彩素 莱山岛 spp. parasites (
      • Paape D.
      • Barrios-Llerena M.E.
      • 勒碧汉T.
      • 麦凯L.
      • Aebischer T.
      凝胶免费分析彩易福彩细胞内吉尔曼墨西哥彩易福彩组。
      ,
      • 拉哈维
      • Sivam D.
      • VOLPIN H.
      • ronen m.
      • 楼郡
      • 绿色A.
      • 荷兰N.
      • Kuzyk M.
      • 博赫斯C.
      • Zilberstein D.
      • Myler P.J.
      多水平的基因调控介导细胞内病原菌利山蛋白酶的分化。
      )。值得注意的是,睡眠 等等。 以前发表的彩易福彩蛋白酶源自对数孕球和巨噬细胞衍生的神话阶段 L. Mexicana. 寻找潜在的毒力因子(
      • Paape D.
      • Barrios-Llerena M.E.
      • 勒碧汉T.
      • 麦凯L.
      • Aebischer T.
      凝胶免费分析彩易福彩细胞内吉尔曼墨西哥彩易福彩组。
      )。本研究确定了3'内的浓缩章鱼UTR.S可能有助于特异性阶段的彩易福彩表达。此外,由Lahav直接比较 等等。 观察到轴静脉的转录组 L. Donovani. Promastigotes和Amastigotes与彩易福彩组学数据没有对应于彩易福彩组学数据,除非在轴静脉内发生的第一小时(
      • 拉哈维
      • Sivam D.
      • VOLPIN H.
      • ronen m.
      • 楼郡
      • 绿色A.
      • 荷兰N.
      • Kuzyk M.
      • 博赫斯C.
      • Zilberstein D.
      • Myler P.J.
      多水平的基因调控介导细胞内病原菌利山蛋白酶的分化。
      )。我们的数据(Fig. 5A)支持这一发现虽然在更广泛的时间表上比每次课程和不同的时间 莱山岛 物种,表明这种mRNA和蛋白表达之间的相关性可能是常见的 莱山岛。当然是转录物表达增强剂 莱山岛 彩易福彩表达,从而提供了对基因表达的有用洞察力,这是对目前彩易福彩组学水平的昂贵和实验挑战的基因表达的有用洞察力
      • Inbar E.
      • Hughitt V.K.
      • Dillon L.A.
      • Ghosh K.
      • el-说n.m.
      • 解雇D.L.
      莱山岛主要发育阶段的转录组在自然沙子飞行矢量中。
      )。
      最近,有两种在Kinetoplastid寄生虫中的RBPOME研究,其来自致胆衍生的Amastigotoots阶段(AXA)中分离128个RNA结合的彩易福彩 L.DONOVANI. (
      • 南丹D.
      • 托马斯S.A.
      • Nguyen A.
      • 月亮K.M.
      • 福斯特L.J.
      • einer n.e.
      蛋白酶捕获综合鉴定Leishmania Donovani的mRNA结合蛋白。
      )和155个RBP t.brudei. 单体纤细的血液形式(BSF)寄生虫(
      • Lueong S.
      • Merce C.
      • Fischer B.
      • Hoheisel J.D.
      • Erben E.D.
      基因表达调控网络在锥虫瘤Brucei:洞察MRNA结合彩易福彩组的作用。
      )。这些研究各自检查寄生虫的单一哺乳动物感染形式。鉴于细胞内的差异性大的分歧,RBPomes之间的直接比较具有警告。(莱山岛) 相对 extracellular (t.brudei.)细胞和不同的隔离方法。作为PCF,AXA和BSF是全增殖阶段,隐含在细胞复制中的翻译因子是所有这些RBPOMES的常见。我们的数据通过使用最重要的质谱技术通过生命周期进展检查RBPOME关联动态。该策略揭示了RBP的阶段特异性调节:MRNA关联,其指示高度定制的转录靶选择,其与表达水平无关。实际上,这使得传统的RBP:转录目标范例以有意义的,有趣的方式与转录背景的相似性相满。
      我们为我们的调查使用的规模和过滤器选择了与mRNA结合的最丰富的彩易福彩。因此,除了具体 trans - 除了基因调节剂,我们已经隔离了每个生命周期阶段的翻译机械。因此,每个生命周期阶段的相对复制和平移效率强烈影响了我们的许多RBPOME比较;包括观察到彩易福彩组学表达与mRNA关联之间的相关性。虽然超出了本研究的范围,但我们的数据提供了重要的方向 莱山岛 核糖体分析。平移机制中的实际上依赖于阶段依赖的区别可能会影响一般机制,但这些分析的主要目的是鉴定调节基因表达的mRNA染色因子并促进与人感染形式的分化。那是, trans - 调节促进发育和毒力促进调节件的RBP。
      鉴于我们彩易福彩组学的深度和敏感性,我们不能排除我们的一些因素可能间接地束缚与直接结合的RBP的紧密彩易福彩/彩易福彩相互作用。这可以解释非规范RNA相关因子的存在;其有效性由来自其他生物的RBPOMES中的一致隔离支持以及目前的RNA结合域列表并非详尽无遗(
      • Beckmann下午
      • Horos R.
      • Fischer B.
      • Castello A.
      • Eichelbaum K.
      • Alleaume上午
      • Schwarzl T.
      • 蜷缩
      • Foehr s.
      • Huber W.
      • Krijgsveld J.
      • 无尽的M.W.
      来自酵母的RNA结合彩易福彩蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白彩易福彩。
      ,
      • Lueong S.
      • Merce C.
      • Fischer B.
      • Hoheisel J.D.
      • Erben E.D.
      基因表达调控网络在锥虫瘤Brucei:洞察MRNA结合彩易福彩组的作用。
      ,
      • 南丹D.
      • 托马斯S.A.
      • Nguyen A.
      • 月亮K.M.
      • 福斯特L.J.
      • einer n.e.
      蛋白酶捕获综合鉴定Leishmania Donovani的mRNA结合蛋白。
      ,
      • Castello A.
      • Fischer B.
      • Eichelbaum K.
      • Horos R.
      • Beckmann下午
      • Stein C.
      • Davey N.E.
      • humphreys d.t.
      • Preiss T.
      • Steinmetz L.M.
      • Krijgsveld J.
      • 无尽的M.W.
      从哺乳动物mRNA结合蛋白的地图中欣赏RNA生物学。
      )。我们的方法和结果的一致性和质量在从两者衍生的mRNA中分离的近似匹配的近似匹配的身份中是显而易见的 体内 所有生命周期阶段的交联和非交联细胞,否定紫外线交联的造成艺术RNA结合。我们的分析比较了整个细胞内因素的相对富集 相对 mRNA-结合的彩易福彩蛋白和发现高度丰富的彩易福彩,其也结合mRNA似乎限于核糖体因子。因此,我们得出结论,无特异性背景蛋白在我们的屏幕中没有孤立。
      数据来自 Fig. 4B 证明特定于特定的因素在大丰度中结合RNA,与PCF不同,富含富含PCF和AMA的RBP。这一阶段的相对静态(如上所证明的 图。 1B5B,额外重视富含元的RNA结合蛋白的潜在重要性作为哺乳动物宿主的促进剂和与AMA形式的分化(
      • Capewell P.
      • 和尚
      • Ivens A.
      • MacGregor P.
      • 槟榔村
      • Walrad P.
      • residaud f.
      • 史密斯T.K.
      • 马修k.r.
      在其哺乳动物宿主的开发过程中调节锥虫瘤总和多瘤MRNA。
      )。实际上,如果元阶段细胞不能正确地响应哺乳动物吞噬细胞的环境线索并分化为AMA阶段,则生命周期停止并且没有感染或疾病(
      • De Pablos L.M.
      • ferreira t.r.
      • Walrad P.B.
      莱山岛生命周期进展的发育分化:转录后控制进行管弦乐队。
      )。同样感兴趣的是区分荟萃寄生虫的RNA结合因子,因为前者在后者处于AMASTIGERASES的同时占有区分(Fig. 5B)。类似地,富含AMA(Mø)的MRBP相对于AMA(LD)细胞可以提供进一步的候选者 trans控制Amastigogenesis作为AMA(Mø)的调节剂仍在过程中,而AMA(LD)已经通过此生命周期阶段的多个复制循环长期。
      预测的含RBD彩易福彩组的比较 L. Mexicana. 孤立的RBPOME的基因组突出了一些有趣的区别,包括一些锌 - 手指结构域蛋白和基底翻译机械的比例减少,特别是在复制阶段。有几个,非专有的潜在解释。这些RBPOMES的时间定义隔离可能限制范围。虽然RBPOME具有4个不同的生命周期阶段的数据,但至少有3个生命周期(Nectomonad,LeptOmonad和Haptomonad Promastigotes),并且这里未检查的多个分化事件,其中不隔离的RBP可能瞬时表达。锌指蛋白特征显示通过质谱显示降低检测。分离和检查缺失的生命周期阶段和分化时间课程的研究可以检测额外的RBP,但是从质谱所需的数量下的粉末中的这些少次定义阶段隔离是实验令人望而却的。尽管存在这些警告,但本研究表明,在KinetoplastID中迄今为止RBPS的最大规模隔离,具有关于与这些寄生虫中mRNA相关的彩易福彩类型的有价值的信息。这些彩易福彩介绍了对动态蜂窝环境的洞察力 莱山岛 trans - 再抑制RNA,以及控制RBP行为和功能的潜在修饰酶。
      这项工作的重要发现包括彩易福彩表达的低相关性 相对 转录表达,蛋白表达的阶段特异性变化 相对 RNA结合潜力,以及RNA结合彩易福彩富集的调节 莱山岛 寄生虫生命周期。这是第一研究,用于检查阶段癌癌寄生虫的整个细胞或mRNA结合彩易福彩,对人体传播,感染性和生命周期进展至关重要。我们内源性标记并分子验证了多个RBP候选者与不同的阶段调节的转录靶池的关联。候选监管机构的功能调查无疑将分离寄生虫生命周期进展,生存能力和传输至关重要的因素。由于大多数KinetoplastID蛋白不是与其他系统的同源,包括哺乳动物, trans - 使寄生虫能够在不同环境中适应和存活的调节剂可以为抗利什曼治疗提供可行的目标。

      数据可用性

      彩易福彩组学数据集可从大规模(MSV000083023)和Proteomexchange(PXD011340)下载。所有彩易福彩组学数据已提交给TriTryPDB( http://tritrypdb.org/),通过Eupathdb,Genedb和传染病研究中心(CIDR)之间的协作努力是可能的。

      致谢

      所有彩易福彩组学工作和部分生物信息分析都在生物科技设施(//www.york.ac.uk/biology/technology-facility)在约克大学。大卫托罗韦和桑德兰克曼建议了紫外线交联。我们要感谢Deborah Smith,Alvaro Acosta-Serrano和Dawn Coverley对此稿件的有用评论。

      补充材料

      参考

      1. WHO。 WHO。全球Leishmaniaisis更新,2006-2015:Leishmaniasis监视的转折点。
        谁每周流行病。 rec。 2017; 92: 557-572
        • De Pablos L.M.
        • ferreira t.r.
        • Walrad P.B.
        莱山岛生命周期进展的发育分化:转录后控制进行管弦乐队。
        Curr。拍摄。微生物。 2016; 34: 82-89
        • residaud f.
        • Muller M.
        • CERQUYIRA G.C.
        • 史密斯米
        • rochette A.
        • el-说n.m.
        • Papadopoulou B.
        • Ghedin E.
        大型追查家族的成员是莱山西岛转录后基因表达的决定因素。
        PLOS POAROG。 2007; 3: 1291-1307
        • 瓦斯德D.R.
        • Ramirez L.
        • IBORRA S.
        • Soteriadou K.
        • Gonzalez v.M.
        • 等等。
        3'未翻转区域在细胞周期中的关键作用调节Leishmania Infantum组蛋白H2A基因的表达:5'未翻转区域的轻微协同效应。
        BMC MOL。 BIOL。 2009; 10: 48
        • 大卫M.
        • Gabdank I.
        • 本大卫米
        • Zilka A.
        • ORR I.
        • 等等。
        HSP83在Leishmania的优先翻译需要在3'UTR中富有热敏聚丙烯酰胺的元素,涉及扫描5'UTR。
        RNA。 2010; 16: 364-374
        • Paape D.
        • Barrios-Llerena M.E.
        • 勒碧汉T.
        • 麦凯L.
        • Aebischer T.
        凝胶免费分析彩易福彩细胞内吉尔曼墨西哥彩易福彩组。
        摩尔。生物学习。寄生酚。 2010; 169: 108-114
        • 拉哈维
        • Sivam D.
        • VOLPIN H.
        • ronen m.
        • 楼郡
        • 绿色A.
        • 荷兰N.
        • Kuzyk M.
        • 博赫斯C.
        • Zilberstein D.
        • Myler P.J.
        多水平的基因调控介导细胞内病原菌利山蛋白酶的分化。
        Faseb J. 2011; 25: 515-525
        • Cloutier S.
        • LaverDiere M.
        • Chou M.N.
        • 淮北山
        • C.
        • Papadopoulou B.
        利什曼亚洲分化过程中通过EIF2Alpha磷酸化的翻译控制。
        Plos一个。 2012; 7: e35085
        • vascomcelos e.j.
        • Terrao M.C.
        • Ruiz J.C.
        • Vencio R.Z.
        • Cruz A.K.
        在Leishmania基因组中保守的闭合序列的硅鉴定:解除推定载有顺式调节元件。
        摩尔。生物学习。寄生酚。 2012; 183: 140-150
        • 欺骗A.
        • Dumas C.
        • Papadopoulou B.
        Alba-域蛋白有助于Leishmania的Amastin转录物的阶段调节稳定性。
        摩尔。微生物。 2014; 91: 548-561
        • Padmanabhan P.K.
        • Zghidi-abouzid O.
        • Samant M.
        • Dumas C.
        • Aguiar B.G.
        • estaquier J.
        • Papadopoulou B.
        DDX3死箱RNA Helicase在Leishmania的线粒体彩易福彩质量控​​制中起着重要作用。
        细胞死亡者。 2016; 7: e2406
        • gehring n.h.
        • Wahle E.
        • 菲舍尔U.
        解读MRNP代码:转录后基因调控的RNA绑定的决定簇。
        趋势生物化学。 SCI。 2017; 42: 369-382
        • Fritz M.
        • Vanselow J.
        • Sauer N.
        • 拉米尔S.
        • Goos C.
        • Siegel T.N.
        • Subota I.
        • Schlosser A.
        • Carrington M.
        • 克拉姆斯S.
        通过使用锥虫的微管骨架作为分子筛来进入RNP颗粒的新颖洞察。
        核酸RES。 2015; 43: 8013-8032
        • Beckmann下午
        • Horos R.
        • Fischer B.
        • Castello A.
        • Eichelbaum K.
        • Alleaume上午
        • Schwarzl T.
        • 蜷缩
        • Foehr s.
        • Huber W.
        • Krijgsveld J.
        • 无尽的M.W.
        来自酵母的RNA结合彩易福彩蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白蛋白彩易福彩。
        NAT。安排。 2015; 6: 10127
        • 无尽的M.W.
        • Castello A.
        • Schwarzl T.
        • Preiss T.
        一个勇敢的RNA结合彩易福彩。
        NAT。 Rev. mol。细胞生物。 2018; 19: 327-341
        • Lueong S.
        • Merce C.
        • Fischer B.
        • Hoheisel J.D.
        • Erben E.D.
        基因表达调控网络在锥虫瘤Brucei:洞察MRNA结合彩易福彩组的作用。
        摩尔。微生物。 2016; 100: 457-471
        • 南丹D.
        • 托马斯S.A.
        • Nguyen A.
        • 月亮K.M.
        • 福斯特L.J.
        • einer n.e.
        蛋白酶捕获综合鉴定Leishmania Donovani的mRNA结合蛋白。
        Plos一个。 2017; 12: E0170068
        • Castello A.
        • Horos R.
        • Stein C.
        • Fischer B.
        • Eichelbaum K.
        • Steinmetz L.M.
        • Krijgsveld J.
        • 无尽的M.W.
        RNA互联蛋白捕获RNA结合蛋白的综合鉴定。
        方法mol。 BIOL。 2016; 1358: 131-139
        • McKean P.G.
        • 丹尼P.W.
        • KNUEPFER E.
        • 敏锐的J.K.
        • 史密斯D.F.
        与Leishmania阶段调节基因家族的缺失和过表达相关的表型变化。
        细胞微生物。 2001; 3: 511-523
        • 罗杰斯米
        • Kropf P.
        • Choi B.S.
        • 狄龙r.
        • 波迪诺夫斯卡亚米。
        • 贝茨P.
        • Mülleri。
        嗜血管症感染的砂岩脱节的彩易福彩酚蛇蝇靶向宿主巨噬细胞的L-精氨酸代谢,以促进寄生虫存活。
        PLOS POAROG。 2009; 5: E1000555.
        • 解雇D.L.
        • da silva r.p.
        感染阶段Leishmania主要癌症的产生与细胞表面表达和发育调节糖脂的释放有关。
        J.Immunol。 1987; 139: 3099-3106
        • 删除D.P.
        • 埃文斯K.J.
        • ivens a.c。
        • Aziz N.
        • 马戏团A.
        • Kaye下午
        • 史密斯D.F.
        莱山岛的比较表达分析:物种与不同宿主遗传背景中基因表达的调节。
        Plos off。倾斜。解释。 2009; 3: e476
        • COOMBS G.H.
        • HART D.T.
        • Capaldo J.
        莱山岛 mexicana: drug sensitivities of promastigotes and transforming amastigotes.
        J. Antimicrob。化学其他。 1983; 11: 151-162
        • 格兰曼S.
        • Petfalski E.
        • Swiatkowska A.
        • Tollervey D.
        通过系统分析RNA-彩易福彩交联裂解40S核糖体亚基结构。
        Embo J. 2010; 29: 2026-2036
        • Walrad P.
        • Paterou A.
        • Acosta-Serrano A.
        • 马修k.r.
        CCCH蛋白的差动锥虫表面涂层调节与原霉素mRNA顺式元素共同关联。
        PLOS POAROG。 2009; 5: E1000317.
        • 染料P.
        • 迪恩斯
        • 苏德J.
        在锥虫瘤Brucei中的高通量基因标记。
        j Vis exp。 2016; 12 (八月)
        • 伯克德G.
        • Fragoso c.m.
        • 罗迪蒂I.
        高效稳定的血液形式的血管瘤Brucei。
        摩尔。生物学习。寄生酚。 2007; 153: 220-223
        • 价格H.P.
        • Guther M.L.
        • Ferguson M.A.
        • 史密斯D.F.
        Myristoyl-CoA:彩易福彩N-Myristoyltransferase脱落在锥虫中导致无流动和内吞的缺陷。
        摩尔。生物学习。寄生酚。 2010; 169: 55-58
        • aslett m.
        • Aurrecoechea C.
        • Berriman M.
        • Brestelli J.
        • Brunk B.P.
        • Carrington M.
        • 删除D.P.
        • 菲舍尔S.
        • Gajria B.
        • 高X.
        • 加德纳M.J.
        • Gingle A.
        • 格兰特G.
        • Harb O.S.
        • Heiges M.
        • Hertz-Fowler C.
        • 休斯顿R.
        • Innamorato F.
        • Iodice J.
        • Kissinger J.C.
        • Kraemer E.
        • 李W.
        • 洛根F.J.
        • 米勒J.A.
        • Mitra S.
        • Myler P.J.
        • Nayak V.
        • 彭宁顿C.
        • Phan I.
        • Pinney D.F.
        • ramasamy g.
        • 罗杰斯M.B.
        • Roos D.S.
        • 罗斯C.
        • Sivam D.
        • 史密斯D.F.
        • Srinivasamoorthy G.
        • Stoeckert JR,C.J.
        • Subramanian S.
        • Thibodeau R.
        • Tivey A.
        • 治理C.
        • Velarde G.
        • 王H.
        Tritrypdb:锥虫的功能基因组资源。
        核酸RES。 2010; 38: D457-D462
        • Supek F.
        • Bosnjak M.
        • Skunca N.
        • Smuc T.
        Revigo总结并可视化了基因本体论术语的长列表。
        Plos一个。 2011; 6: e21800
        • Fiebig M.
        • 凯莉斯。
        • Gluenz E.
        比较生命周期转录组织对Leishmania墨西哥语言组注释进行了反转,并将染色体复制与脊椎动物的寄生刺激联系起来。
        PLOS POAROG。 2015; 11: E1005186.
        • Inbar E.
        • Hughitt V.K.
        • Dillon L.A.
        • Ghosh K.
        • el-说n.m.
        • 解雇D.L.
        莱山岛主要发育阶段的转录组在自然沙子飞行矢量中。
        MBIO。 2017; 8: E00029-17.
        • Puentes S.M.
        • da silva r.p.
        • 解雇D.L.
        • 锤子c.h.
        • 木匠K.A.
        血清抗性阶段阶段Leishmania主要癌症是由于C5B-9的释放。
        J.Immunol。 1990; 145: 4311-4316
        • 郑h
        • 汤普森D.
        • 画家J.
        • O'Mara T.
        • Gorman M.
        • 马丁L.
        • Palles C.
        • 琼斯阿。
        • Buchanan D.D.
        • 赢得A.K.
        • 料斗J.
        • Jenkins M.
        • 林林
        • Newcomb P.A.
        • Gallinger S.
        • CONTI D.
        • 舒马赫F.
        • 凯西G.
        • 吉尔斯G.G.
        • Pharoah P.
        • Peto J.
        • Cox A.
        • Swerdlow A.
        • 沙发F.
        • Cunningham J.M.
        • 善良的E.L.
        • 温赫姆S.J.
        • Lambrechts D.
        • Fasching P.
        • Burwinkel B.
        • Brenner H.
        • Brauch H.
        • 常克劳德J.
        • Salvesen H.B.
        • 克里斯滕森五。
        • Darabi H.
        • 李杰。
        • 刘涛。
        • Lindblom A.
        • 大厅P.
        • de polanco m.e.
        • SANS M.
        • 卡拉克省A.
        • Castellvi-Bel S.
        • Rojas-Martinez A.
        • Aguiar JNR,S。
        • Teixeira M.R.
        • 催天上午
        • 丹尼斯J.
        • 奥顿G.
        • Proietto T.
        • Holliday E.
        • attia J.
        • 阿什顿K.
        • 斯科特r.j.
        • MCEVOY M.
        • Dowdy S.C.
        • Fridley B.L.
        • 韦尔斯小时。
        • Trovik J.
        • njolstadt.s.
        • 谢谢
        • 薄荷米
        • runnebaum i.
        • Hillemanns P.
        • DörkT.
        • amant f.
        • Schrauwen S.
        • 赫恩A.
        • Beckmann M.W.
        • Ekici A.
        • 南己K.
        • Meindl A.
        • Bolla M.K.
        • Michairidou K.
        • Tyrer J.P.
        • 王Q.
        • 艾哈迈德S.
        • HEALEY C.S.
        • 沙姆
        • Annibali D.
        • depeeuw J.
        • al-tassan n.a.
        • 哈里斯r.
        • Meyer B.F.
        • Whiffin N.
        • hosking f.j.
        • Kinanderley B.
        • Farrington S.M.
        • Timofeeva M.
        • Tenesa A.
        • 坎贝尔H.
        • Haile R.W.
        • Hodgson S.
        • Carvajal-Carmona L.
        • Cheadle J.P.
        • 伊斯顿D.
        • 邓禄普米
        • 哈尔斯顿r.
        • 痉颤A.
        • Tomlinson I.
        Genome-宽协会研究的荟萃分析鉴定了SH2B3和TSHZ1附近的结直肠癌和子宫内膜癌的常见敏感性多态性。
        SCI。代表。 2015; 5: 17369
        • iwasaki s.
        • 地板S.N.
        • Ingolia N.T.
        涂料将死箱蛋白EIF4A转化为序列选择性的翻译压缩机。
        自然。 2016; 534: 558-561
        • ada ad ..
        • Afanasiev S.
        • AIDALA C.
        • ajitanand n.n.
        • Akiba Y.
        • 等等。
        在激进的高分性3He + Au碰撞中的椭圆和三角流量的测量(S(nn))= 200 gev。
        物理。 rev. lett。 2015; 115: 142301
        • 楼郡
        • Gherardini p.f.
        • Helmer-Citterich M.
        • spath g.f.
        • Myler P.J.
        • Zilberstein D.
        莱山岛分化的调节动态:解构信号和鉴定磷酸化趋势。
        摩尔。细胞。彩易福彩组学。 2014; 13: 1787-1799
        • Castello A.
        • Fischer B.
        • Eichelbaum K.
        • Horos R.
        • Beckmann下午
        • Stein C.
        • Davey N.E.
        • humphreys d.t.
        • Preiss T.
        • Steinmetz L.M.
        • Krijgsveld J.
        • 无尽的M.W.
        从哺乳动物mRNA结合蛋白的地图中欣赏RNA生物学。
        细胞。 2012; 149: 1393-1406
        • Capewell P.
        • 和尚
        • Ivens A.
        • MacGregor P.
        • 槟榔村
        • Walrad P.
        • residaud f.
        • 史密斯T.K.
        • 马修k.r.
        在其哺乳动物宿主的开发过程中调节锥虫瘤总和多瘤MRNA。
        Plos一个。 2013; 8: e67069